PREPARO DE LMINAS HISTOLGICAS

Ana Lcia Tosta Ribeiro, Anderson Carrijo da Costa,

Cntia Ruiz Denadai, rika Maria Antonino Fonseca,
Fabiana Peghim, Janayne Aparecida Pentino,
Luiz Alves Rodrigues, Priscila Maria Antonini,
Teresinha de Jesus Borin de Carvalho,
Vanessa Cristina Mazzi
Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos

INTRODUO
O mtodo mais comum usado em histologia vegetal permite a obteno
de preparados histolgicos permanentes (lminas) para estudo ao microscpio
ptico. Nesse instrumento os objetos so examinados por transparncia e
como rgos muito delgados so raros, a maioria precisa ser reduzida a cortes
finos, suficientemente transparentes para serem examinados ao microscpio.
Estes cortes so feitos com um micrtomo, mas antes de serem cortados os
tecidos devem passar por uma srie de tratamentos.
Obviamente, o que se deseja levar ao microscpio um preparo no qual
os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma

estrutura e composio qumica que possuam quando vivos. Mas apesar dos
cuidados tomados, esse ideal no alcanado plenamente, observando-se em
todos os cortes histolgicos certos artefatos decorrentes do processamento que
sofreram.
A fim de evitar a destruio das clulas por suas prprias enzimas, ou
por bactrias, os tecidos removidos devem ser adequadamente tratados
imediatamente aps a sua retirada. Esse tratamento denominado fixao. A
principal funo dos fixadores insolubilizar as protenas dos tecidos.
Para obteno dos cortes, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos
por substncia de consistncia firme. As substncias mais usadas para essa
finalidade (meios de incluso) so a parafina e as resinas plsticas.
Os

tecidos

devem

sofrer

uma

srie

de

tratamentos

antes

da

impregnao. Na primeira etapa do processo, denominada desidratao, a

gua extrada dos tecidos pela passagem dos mesmos em banhos de
concentraes crescentes de etanol, geralmente de 70%, at etanol puro
(100%).
Em seguida, o etanol substitudo por um lquido miscvel e geralmente
usa-se xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substncias tornam-se
translcidos,

razo

por

que

essa

etapa

denominada

clareamento.

Mergulham-se, ento, os tecidos em parafina fundida numa estufa a 60C.

Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam, e os espaos anteriormente
ocupados pela parafina ficam livres. Coloca-se o tecido num recipiente
contendo um pouco de parafina fundida e deixa-se solidificar, formando-se um
bloco de parafina com o tecido no seu interior (incluso).
Os blocos de parafina, contendo os tecidos includos, so seccionados pela
navalha de ao do micrtomo, obtendo-se geralmente cortes de 6 a 8 m de
espessura.
A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao
microscpio ptico. Devido a isso, foram introduzidos mtodos para a

colorao dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis e

destacados uns dos outros.
A maioria dos corantes usados em histologia comporta-se como cidos
ou bases e tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes
nos tecidos.
A hematoxilina comporta-se como um corante bsico, ligando-se s
estruturas basfilas dos tecidos. A hematoxilina cora em azul os ncleos
celulares e outras estruturas de natureza cida, como regies do citoplasma
ricas em RNA e espessamentos celulares de celulose.
Ao estudar um corte histolgico no microscpio, preciso ter em mente
que a estrutura das clulas e tecidos est alterada pela tcnica histolgica. As
etapas

da

tcnica

clareamento,

histolgica,

impregnao

subseqentes

colorao),

tambm

fixao

(desidratao,

introduzem

algumas

modificaes nos tecidos, que no devem dificultar a caracterizao das

estruturas estudadas.
Alm disso, a delgada espessura dos cortes cria um obstculo ao estudo
tridimensional dos tecidos e rgos. Para se chegar a compreender a
arquitetura tridimensional de um rgo ou tecido, torna-se necessrio o estudo
de cortes realizados em diferentes direes.

MATERIAIS E MTODOS
Para a realizao dos cortes histolgicos, foram cortados e retirados
segmentos no 1/3 proximal da regio laminar, retirando cerca de 1 cm2 cada
pea nas folhas de Hibiscus rosacinencis L. com auxlio de uma rgua e
tesoura. Estes pedaos de folhas foram submetidos s seguintes metodologias:

Metodologia I:

Utilizou-se a mesma tcnica para os cortes histolgicos de tecido animal,

procedendo desidratao, clareamento, impregnao, incluso e a colorao
com o auxilio de cassete (Lupe), pinas, bqueres, cronmetro, proveta,
estufa, geladeira, micrtomo, lminas, lamnulas, resina Permount (Fisher
Scientific)

microscpio

para

visualizao

dos

cortes

preparados.

Consistindo-se na passagem dos cassete (Lupe) (onde contm a pea da

planta) nas seguintes substncias e nos tempos indicados:
DESIDRATAO:
lcool 70%

30 minutos

lcool 75%

30 minutos

lcool 80%

30 minutos

lcool 85%

30 minutos

lcool 90%

30 minutos

lcool absoluto I

30 minutos

lcool absoluto II

30 minutos

lcool absoluto / xilol

30 minutos

CLAREAMENTO:
Xilol I

20 minutos

Xilol II

20 minutos

Xilol III

20 minutos

IMPREGNAO:
Parafina I

30 minutos

Parafina II

30 minutos

Parafina III

30 minutos

Aps estes procedimentos, realizou-se a incluso da pea no molde de

parafina, onde ela inclusa no centro do molde at completa solidificao,
resfriada e levada a geladeira por no mnimo 40 minutos. A pea moldada de
acordo com o tamanho do micrtomo, sendo realizado os cortes de 7 m que
so levados ao banho-maria na temperatura entorno de 50C. Os cortes so
colocados na lmina e corados com a hematoxilina (HE), seguindo os tempos
necessrios:
Xilol I

7 minutos

Xilol II

7 minutos

lcool absoluto I

passagem

lcool absoluto II

passagem

lcool 90%

passagem

lcool 70%

passagem

gua

2 minutos

Hematoxilina

2 minutos

gua

2 minutos

lcool 70%

passagem

lcool absoluto I

passagem

lcool absoluto II

passagem

Xilol I

passagem

Xilol II

passagem

Xilol III

passagem

Feita a colorao, as lamnulas foram fixadas nas lminas com permount,

estando pronta para a visualizao no microscpio.
METODOLOGIA II:
Aplicou-se a tcnica anterior mudando somente o tempo de permanncia
do xilol no clareamento, de 20 minutos para 10 e 5 minutos. Na colorao, de

7 minutos para 3 e posteriormente para 1minuto, seguindo normalmente as

outras etapas at visualizao.
METODOLOGIA III:
Quando as peas das plantas foram removidas, elas ficaram por cerca de
12 horas no formol para que fosse realizada a fixao e prosseguiu-se
normalmente com a desidratao, clareamento, impregnao e colorao da
metodologia anterior.
METODOLOGIA IV:
As peas foram colocadas por 10 minutos na gua destilada, 20 minutos
no xilol, incluidas no molde de parafina e ento foram feitos os cortes no
micrtomo.
METODOLOGIA V:
As

peas

contidas

no

cassete

(Lupe)

passaram

pelos

seguintes

procedimentos:
gua destilada

10 minutos

Xilol

20 minutos

Descansou at que o xilol tenha escorrido.

Xilol

20 minutos
Depois foram colocadas em parafina e levadas para a estufa a 56C. Fez-

se a incluso nos moldes, esperou-se secarem e foram levadas para a

geladeira. As peas foram moldadas no micrtomo e feitos os cortes, tiradas
do banho-maria e passadas para as lminas, fazendo-se a colorao nas
seguintes substncias:
Hipoclorito

7 minutos

Hematoxilina

1 minuto

gua de torneira

lavagem

Lugol

1 minuto

As lamnulas foram fixadas nas lminas com Permount (Fisher

Scientific) e visualizadas ao microscpio.
METODOLOGIA VI:
Utilizou-se o procedimento da desidratao, clareamento, impregnao e a
incluso da metodologia I, e cortes no tamanho de 20, 25 e 40 m.
Para a colorao foram usadas as seguintes substncias e tempos:
Xilol

1 minuto

Xilol

II

1 minuto

lcool absoluto I

passagem

lcool absoluto II

passagem

lcool 90%

passagem

lcool 70%

passagem

gua de torneira

lavagem

Hipoclorito

5 minutos

gua de torneira

lavagem

Lugol

1 minuto

Hematoxilina

38 segundos

gua de torneira

lavagem

lcool 70%

passagem

lcool 90%

passagem

lcool absoluto I

passagem

Xilol

passagem

Xilol

II

passagem

Xilol

III

passagem

Aps a colorao as lamnulas foram colocadas nas lminas com Permount

(Fisher Scientific) e visualizadas ao microscpio.

METODOLOGIA VII:
Fez-se

mesmo

procedimento

da

metodologia

substncias e tempos na colorao:

Xilol

3 minutos

Xilol

II

3 minutos

lcool absoluto I

passagem

lcool absoluto II

passagem

lcool 90%

passagem

lcool 70%

passagem

gua de torneira

lavagem

Lugol

5 minutos

Hematoxilina

38 segundos

gua de torneira

lavagem

lcool 70%

passagem

lcool 90%

passagem

lcool absoluto I

passagem

lcool absoluto I

passagem

Xilol

passagem

Xilol

II

passagem

Xilol

III

passagem

Foram colocadas as lamnulas e visualizadas ao microscpio.

RESULTADOS

V,

mudando

as

Todas as Metodologias I a VI descritas e testadas, no produziram cortes

bons, montados em lminas para visualizao ao microscpio ptico adequadas,
tornando-se difcil a distino dos tecidos a serem estudados.
As figuras abaixo mostram os cortes obtidos com a Metodologia VII que
mostrou-se a mais indicada para o estudo de cortes da regio laminar de
folhas de vegetais.
Figura 1
Figura 2
Figura 3

Dependendo da finalidade a que se destina pode-se montar os cortes em

lminas para observao imediata ou em lminas ditas permanentes. Neste
estudo obtivemos os melhores cortes semi-permanentes com a Metodologia
VII.
Outra dificuldade encontrada no estudo da histologia decorreu do fato de
que, quando se cora um preparado histolgico, dependendo da tcnica
empregada, apenas alguns aspectos das estruturas teciduais so evidenciados.
difcil o preparo de uma lmina que mostre todos componentes celulares e
todos os detalhes dos tecidos.

Leia mais sobre a produo de lminas vegetais em:

a) Junqueira, L. C.; Carneiro, J.; Histologia Bsica, 8 edio, Editora
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995.

b) Esau, K., Anatomia das Plantas com Sementes; Editora Edgard Blucher,
S.P.,1974.

Figuras e legendas

Figura 1: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com lugol no tamanho de 20 m.

Figura 2: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.

Figura 3: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.