Microbiologia

Industrial
Experimental
Espectrofotometria
Gustavo Naame
Joo Almeida
Matheus Rosestolato

1. Objetivo

Este relatrio consiste em um experimento que visa: familiarizao dos alunos

com a utilizao de tcnicas espectrofotomtricas, elaborao de uma curva padro
de concentrao x absorbncia para solues aquosas de fermento biolgico
prensado, alm da determinao da concentrao de leveduras em solues
desconhecidas de acordo com suas absorbncias.
2. Introduo

A espectrofotometria a tcnica analtica que utiliza a absoro de luz pela

matria e a forma mais usual de identificar e determinar quantitativamente a
concentrao

de

compostos

presentes

em

soluo.

Isto

feito

pelo

espectrofotmetro, onde uma intensidade de radiao transmitida por uma soluo

amostra pode ser medida em comparao com uma soluo de referncia (branco)
[1].
Os espectrofotmetros, em geral, contm cinco componentes principais:
fontes de radiao, monocromador, recipientes para conter as solues (cubetas),
detectores (espectrofotmetro) e indicadores de sinal [1].
Fontes de radiao

Monocromador

Compartimento
Amostra/padro

Dispositivo de processamentos de dados

Sistema detector

Figura 1: Esquema dos componentes principais de um espectrofotmetro

A espectrofotometria amplamente utilizada em laboratrios de rea bsica,

bem como em anlises clnicas. A maioria dos mtodos utilizados em bioqumica
clnica envolve a determinao espectrofotomtrica de compostos corados

(cromforo) obtidos pela reao entre o composto a ser analisado e o reagente

(reagente cromognico), originando um produto colorido. Os mtodos que se
baseiam nesse princpio so denominados mtodos colorimtricos, os quais
geralmente so especficos e muito sensveis [2].
A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se ao fato de eles
absorverem luz visvel (regio visvel do espectro eletromagntico). Por meio da
espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma soluo podem ser
identificados e quantificados por seus espectros caractersticos ao ultravioleta,
visvel, ou infravermelho, funcionando da seguinte forma:
Espectrmetro UV (ultravioleta): utiliza a luz na faixa ultravioleta (185 - 400
nm) do espectro de radiao eletromagntica [3].
Espectrmetro visvel RGB (red-green-blue): utiliza a luz na faixa do visvel
(400 700 nm) do espectro de radiao eletromagntica [3].
Espectrmetro IR (infravermelho): utiliza a luz na faixa do infravermelho (700
- 15000 nm) do espectro de radiao eletromagntica [3].
O mecanismo de funcionamento dos espectrofotmetros ocorre em etapas
para se obter os dados. constituda: por uma fonte de luz, um colimador, um
monocromador, um seletor de comprimento de onda, um recipiente contendo a
soluo de amostra, um detector fotoeltrico, e um mostrador digital, que
representada pela figura 2 abaixo [2]:

Figura 2: Representao bsica da estrutura de um espectrmetro [4].

Primeiramente espectrofotmetro produz atravs de uma lmpada uma gama

desejada de comprimento de onda de luz. Depois um colimador (lente) transmite um

feixe reto de luz (ftons) que passa por um monocromador (prisma ou grade de
difrao) para dividi-lo em comprimentos de onda componentes diversos (espectro).
Em seguida, um seletor de comprimento de onda (fenda) permite que seja
transmitida apenas os comprimentos de onda desejada, que dirigido para a
soluo contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz absorvida e
parte transmitida. A reduo da intensidade luminosa medida pelo detector
depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal eltrico amplificado e
visualizado no galvanmetro em nmeros lido como uma absorbncia e
proporcional concentrao da substncia absorvente existente na cubeta [4].
Desta forma, consegue-se obter os dados e assim com a espectrofotometria
utiliza-se uma quantidade denominada Absorbncia (A ou Abs), relacionada
intensidade de radiao absorvida pela soluo e que definida pela relao [1]:

, sendo

denominado transmitncia (T) [1].

A absorbncia (Abs) de uma soluo proporcional concentrao da

soluo (C) e a distncia (d) percorrida pelo feixe luminoso atravs da soluo
segundo a lei de Lambert-Beer, no qual o fundamento da espectrofotometria [1].
Abs = Kcd, onde K o coeficiente de extino, absoro ou absortividade e
corresponde absorbncia de uma soluo de concentrao unitria, por unidade
de distncia percorrida [1].
A lei de Lambert afirma que "A intensidade da luz emitida decresce
exponencialmente medida que a espessura do meio absorvente aumenta
aritmeticamente". Ou seja, quando um feixe de luz monocromtico, atravessa um
meio transparente homogneo, cada camada deste meio absorvia igual frao de
luz que atravessa, independentemente da intensidade da luz que incidia [5].
J a lei de Beer afirma que A intensidade de um feixe de luz monocromtico
decresce exponencialmente medida que a concentrao da substncia absorvente
aumenta aritmeticamente". Ou seja, uma soluo absorve a luz proporcionalmente
concentrao molecular do soluto que nela encontra [5].

Ento essas duas leis so tratadas simultaneamente, processo no qual a

quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada soluo depende
da concentrao do soluto e da espessura da soluo [5].
Porm, nem todas as reaes colorimtricas seguem a lei de Lambert-Beer,
sendo esta vlida para condies restritas, em que [2]:
A luz utilizada aproximadamente monocromtica;
As solues a serem analisadas estejam diludas (baixas concentraes);
No devem estar presentes na mesma soluo mais de uma substncia
absorvente de luz.
Realizando a tcnica espectrofotomtrica pode-se obter a curva-padro, que
corresponde relao grfica entre os valores de absorbncia (A) e os de
concentrao. Com base na anlise grfica possvel verificar a linearidade da
reao e calcular um fator de converso de valores de absorbncia em
concentrao. Quando se quer saber a concentrao de uma soluo encontrada
a densidade tica, levando este mesmo dado a curva, encontrando de imediato a
sua concentrao [2].
Devido alta sensibilidade desta tcnica e do alto grau de preciso em suas
medidas, possuindo uma larga aplicao na indstria qumica onde envolvem
anlises de gua: potvel, caldeiras, resfriamento, e na preparao de gua
desmineralizada, onde se tem a determinao de ferro, sulfatos, fosfatos e outros.
Esta tcnica muito usada tambm em laboratrios de controle de qualidade,
pesquisa e desenvolvimento de anlises clnicas e toxicolgicas, tambm usada na
identificao do princpio ativo de frmacos entre outras aplicaes. Na
microbiologia utiliza-se tambm a espectrofotometria para traar a curva de
crescimento de uma populao microbiana, calcular a taxa especfica de
crescimento e o tempo de gerao ou de duplicao dos microorganismos, que pode
ser feito pelo mtodo indireto [6].

3. Materiais e Reagentes

Balo volumtrico de 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500mL; 1000mL;

Bquer 50 mL;
Cubetas retangulares de 1 cm de largura;
Pipeta de 1 mL;
Basto de vidro;
Balana analtica;
Esptula;
gua da torneira;
Espectrofotmetro;
Fermento biolgico fresco Fleischmann;
Software Scydavis;

4. Procedimentos

Experimento: Espectrofotometria
Auxiliado por uma balana analtica pesou-se 15,01 g de Fermento biolgico
fresco Fleischmann em um vidro de relgio, logo aps transferiu-se o fermento para
um bquer de 50 mL com ajuda de um basto de vidro. Em seguida, preparou-se
uma suspenso no bquer com os 15,01 g de fermento e 10 mL de gua da torneira.
Coletou-se 5 quantidades de 1mL da suspenso preparada e diluiu-se em bales
volumtricos de 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL e 1000 mL.
Na primeira cubeta utilizou-se a gua da torneira como branco para termos
comparativos com as outras cubetas contendo as solues diludas. Programou-se o
espectrofotmetro para comprimentos de onda de 570 nm e anotou-se a
absorbncia para cada soluo obtida. Logo aps, fez-se os mesmos procedimentos
para as duas suspenses de concentraes desconhecidas A e B. Em seguida, com
os dados obtidos, plotou-se a curva padro pelo software Scydavis.

Resultados e Discusses

Partindo de uma suspenso de 15g de fermento biolgico em 10 ml de gua,

podemos calcular a concentrao da suspenso:
C = 15/0,01= 1500 g/L
Desta suspenso foram retiradas 5 alquotas de 1 ml cada para fazer as
diluies desejadas de 1/50, 1/100, 1/250, 1/500 e 1/1000.
Fazendo uma regra de trs simples podemos saber a quantidade de fermento
biolgico de cada alquota:
15g 10ml
x 1ml

x=1,5g

Com isso calculamos os valores das concentraes de cada amostra diluda a

partir da frmula:
C=massa de fermento em g/L de gua
Aplicando os valores de cada diluio foram encontrados os valores das
concentraes de acordo com a tabela 1 abaixo:
Tabela 1: Concentrao de cada amostra analisada.
Amostra
1 (1ml/50ml)

Concentrao (g/L)
30

2 (1ml/100ml)

15

3 (1ml/250ml)

4 (1ml/500ml)

5 (1ml/1000ml)

1,5

6 (desconhecida A)

7 (desconhecida B)

Com as diluies prontas, estas foram levadas ao espectrofotmetro para

anlise da absorbncia de cada uma a 570 nm. A absorbncia de cad diluio foi
anotada de acordo com a tabela 2 abaixo.
Tabela 2: Absorbncias relativas cada concentrao.
Concentrao (g/L)

Absorbncia
7

30
15
6
3
1,5
A
B

2,447
2,052
1,441
0,990
0,626
1,741
1,997

Com os valores da tabela 2, foi possvel construir o grfico 1: Absorbncia x

Concentrao, no comprimento de 570 nm.

3
2.5

f(x) = 0.06x + 0.86

R = 0.87

2
1.5
Linear ()
1
0.5
0
0

10

15

20

25

30

35

Grfico 1: Absorbncia x Concentrao a 570 nm utilizando 5 pontos.

Analisando o grfico 1, os dados mostram que quanto maior a concentrao,
maior a absorbncia, sendo assim possvel a equao Abs = K.C.d, sendo d o
tamanho da cubeta que igual a 1 cm.
Porm, devido a um erro experimental o grfico 1 que foi gerado no foi de
boa confiana, pois possui um valor de r ruim de 0,8719.
Desta forma, comparando esta equao com a equao da reta gerada pelo
grfico 1:
Abs = K.C + 0 e y = ax + b, onde Abs = y e K = a (coeficiente angular da reta).

Sendo y = 0,0591x + 0,8552 a equao da reta encontrada, chegou-se ento

ao valor de K = a = 0,0591 L/g.cm.
Tendo

conhecimento

da

equao

da

reta,

podem-se

calcular

as

concentraes das suspenses desconhecidas:

A Abs = 0,0591CA + 0,8552
1,741 = 0,0591CA + 0,8552
CA = 14,99 g/L
B Abs = 0,0591CB + 0,8552
1,997 = 0,0591CB + 0,8552
CB = 19,32 g/L
Percebendo que os 2 pontos referentes s maiores concentraes so os que
destoam mais da tendncia dos 3 pontos das menores concentraes, foi feito um
outro grfico (Grfico 2) desconsiderando estes pontos das maiores concentraes.

1.6
1.4

f(x) = 0.18x + 0.4

R = 0.98

1.2
1
0.8

Linear ()

0.6
0.4
0.2
0
1

Grfico 2: Absorbncia x Concentrao a 570 nm utilizando os 3 pontos de

menor concentrao.

Analisando este grfico 2, podemos verificar que a equao da reta gerada

de melhor confiana comparada ao grfico 1, pois possui um valor de r melhor de
0,9836.
Desta forma, refazendo os clculos para esta nova equao:
Sendo y = 0,1767x + 0,4005 a equao da reta encontrada, chegou-se ento
ao valor de K = a = 0,1767 L/g.cm.
Usando

esta

segunda

equao,

as

concentraes

das

suspenses

desconhecidas ficam:
A Abs = 0,1767CA + 0,4005
1,741 = 0,1767CA + 0,4005
CA = 7,59 g/L
B Abs = 0,1767CB + 0,4005
1,997 = 0,1767CB + 0,4005
CB = 9,04 g/L
Ao fazer um novo grfico com as trs maiores concentrices, obtemos o
gfico abaixo:

Grfico 3: Absorbncia x Concentrao a 570 nm utilizando os 3 pontos de

maior concentrao.

10

Analisando este grfico 3, podemos verificar que a equao da reta gerada

de melhor confiana comparada ao grfico 1, pois possui um valor de r de 0,93055,
melhor que a do grfico 1 e inferior a do grfico 2 0,9836.
Desta forma, refazendo os clculos para esta nova equao:
Sendo y = 0,0403x + 1,2944 a equao da reta encontrada, chegou-se ento ao
valor de K = a = 0,0403 L/g.cm.
Usando

esta

terceira

equao,

as

concentraes

das

suspenses

desconhecidas ficam:
A Abs = 0,0403 CA + 1,2944
1,741 = 0,0403 CA + 1,2944
CA = 11,08 g/L
B 1,997 = 0,0403 CB + 1,2944
CB = 17,43 g/L
Ao tentar ajustar o grfico com diferentes funces, obteve-se o grfico abaixo:

11

Grfico 4: Absorbncia x Concentrao a 570 nm utilizando diferentes tipos de

ajustes.
Os valores de r encontrados esto dispostos na tabela abaixo:
Tabela 3: valores de r para cada ajuste dos dados.
Ajuste
Linear
Polinomial
Decaimento Exponencial 1 Ordem
Decaimento Exponencial 2 Ordem

r
0,8719
0,9841
0,9966
1

6. Concluses
Com este experimento pode-se observar na prtica os conhecimentos
tericos sobre as tcnicas espectrofotomtricas.
Viu-se como a absorbncia aumenta proporcionalmente concentrao de
fermento da soluo e a partir da posse dos valores da absorbncia de 5 amostras
de concentraes diferentes obteve-se a equao da reta da absorbncia em funo
da concentrao. Abs = K.C.d que no caso mostrada como y = ax + b, sendo a
relativo a absortividade (K), x relativo a concentrao (C) e d o comprimento do
caminho percorrido pela luz, que nada mais que o tamanho da cubeta, no caso 1
cm, alm disso foi encontrado um valor para b nesta equao da reta, teoricamente
este valor deveria ser igual a 0, mas na prtica isto no foi observado, b apresentou
um valor significativo quando correlacionado aos valores de K.C das diferentes
concentraes, essa inconsistncia pode ter sido gerada por fatores que influenciam
na absorbncia por erro de tcnica ou por desvios da lei de Lambert-Beer, como [5,
6]: uso de gua no destilada como solvente, presena de substancias que possam
interferir na uniformidade da absorbncia do espectro de luz, erros de tcnica de
pipetagem e limpeza de vidrarias e cubetas, mas provvel que a principal fonte de
erro seja o Limite de linearidade, que representa o limite de concentrao para a
qual a lei de Lambert-Beer vlida. Para concentraes superiores ao limite de
linearidade observado no desvio da lei de Lambert-Beer, deixa de existir a
proporcionalidade linear entre concentrao e absorbncia, a literatura e os os
principais fabricantes de espectrofotmetros citam uma menor faixa de concentrao

12

para resultados dentro do intervalo de confiana [7, 8]. Talvez por conta do que foi
acima citado obteve-se um valor de r = 0,8719, que aceitvel apenas pelo carter
didtico do experimento, no sendo vlido para consenso cientfico.
Aps encontrar a equao da reta oriunda da curva concentrao X
absorbncia,

pode-se

estipular

concentrao

de

quaisquer

solues

desconhecidas apenas aplicando o valor da absorbncia da soluo medida pelo

espectrofotmetro, mas isto deve ser utilizado com cautela, de acordo com a
literatura esta s deve ser aplicada para valores de absorbncia entre o mnimo e o
mximo medido nas amostras padro para resultados mais fidedignos.
Ao utilizar as menores concentraes para traar o grfico e fazer o ajuste
linear, o valor de r = 0,8719 foi mais prximo do aceitvel e o valor de a ficou na
mesma grandeza de b, mas ainda inferior a ele.
J com as trs maiores concentraes o r foi igual a 0,8719, mesmo sendo
maior que o do ajuste com todos os pontos, ele no deve ser considerado, j que
esperado um valor maior pelo uso de menos pontos, o que deve ser levado em
considerao o aumento do valor de b em relao ao valor de a.
Outros ajustes foram feitos a fim de obter um melhor valor de r, ao fazer o
ajuste por decaimento exponencial de 2 ordem obteve-se o r = 1, o que bastante
satisfatrio do ponto de vista experimental, mas talvez seja inadequado precisar que
este o ajuste que corresponde ao ponto onde a no obedece a linearidade.
Por fim, conclumos que os objetivos do experimento foram alcanados com
xito, sugerindo para experimentos futuros uma maior diluio do fermento biolgico
em gua, conforme visto experimentos similares, foi utilizada uma diluio 10 vezes
maior apresentando valores de r mais prximos do aceitvel [9]. Este experimento
pode servir de base para o entendimento dos mtodos espectrofotomtricos, que
so extremamente importante e utilizada na analise quantitativa em diversas reas,
incluindo o foco da pesquisa, que a microbiologia.

13

7. Referncias Bibliogrficas

1. PIMENTA, Flvia Duta, 2016, Microbiologia Industrial Experimental Espectrofotometria, Roteiro Experimental. SENAI CETIQT.
2. <http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/> Acesso em 18/02/2016
3. LOPES, Lincoln, 2015, Colorimetria, Apostila de Aula. SENAI CETIQT.
4. <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfIGEAK/espectrometrosespectrofotometros> Acesso em 18/02/2016.
5. VOGEL, A. I., & MENDHAM, J.Vogel's textbook of quantitative chemical
analysis. (5th ed.), Harlow, Prentice Hall 1989. New York.
6. HARRIS, Daniel C. Quantitative Chemical Analysis. (8th ed.), W.H. Freeman
and Co, 2007. New York.
7. PAVIA, D.L.; LAMPMAN, G.N.; KRIZ, G.S. e VYVYAN, K.J. Introduo
Espectroscopia, 1a ed. Editora Cengage Learning, - Traduo da Quarta
Edio Americana, 2010.
8. Manual espectrofotmetro Konica- Minolta.
<http://sensing.konicaminolta.com.br/products/lcs111/support/LCS_IV_Manual_E
nglish%20.pdf> acessado em 18/02/2016.
9. GONALVES, Marcia Monteiro Machado. Prtica 1 Espectofotometria.
Biotecnologia Experimental. Roteiro Experimental. UERJ.
<https://docs.google.com/viewer?
a=v&pid=sites&srcid=bWFudWFsZG9wZXF1ZW5vZW5nZW5oZWlyby5jby5jY3xt
YW51YWx8Z3g6NzNjMGM2YzhhNThiZjM4OA> acessado em 18/02/2016.

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5. Objetivo

Este relatrio consiste em um experimento que visa: familiarizao dos alunos

com a utilizao de tcnicas espectrofotomtricas, elaborao de uma curva padro
de concentrao x absorbncia para solues aquosas de fermento biolgico
prensado, alm da determinao da concentrao de leveduras em solues
desconhecidas de acordo com suas absorbncias.

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