UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMATICAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA

ESTUDO FITOQUMICO E BIOLGICO DE Posoqueria

latiflia

Projeto de Estgio Supervisionado II (QMC 5512)

apresentado ao Departamento de Qumica da
Universidade Federal de Santa Catarina.

MARCOS PEREIRA
PROF. DR. INS MARIA COSTA BRIGHENTE

Florianpolis
Junho/2015

Marcos Pereira

ESTUDO FITOQUMICO E BIOLGICO DE Posoqueria latifolia

Projeto de Estgio Supervisionado II (QMC 5512)

apresentado ao Departamento de Qumica da
Universidade Federal de Santa Catarina.

Florianpolis
Junho/2015
1

Marcos Pereira

ESTUDO FITOQUMICO E BIOLGICO DE Posoqueria latiflia

____________________________________
Prof. Dr. Ins Maria Costa Brighente

Banca Examinadora:

____________________________________
Dra. Lizandra Bretanha
____________________________________
Dra. Dalila Venzke

Florianpolis
Junho/2015

SUMRIO

1. INTRODUO......................................................................................

2. REVISO DA LITERATURA................................................................

2.1. Famlia Rubiaceae............................................................................

2.2. Gnero Posoqueria..........................................................................

2.3. Posoqueria latifolia..........................................................................

3. OBJETIVOS..........................................................................................

3.1. Objetivo Geral...................................................................................

3.2. Objetivos Especficos......................................................................

4. MATERIAIS E MTODOS....................................................................

10

4.1. Reagentes e Equipamentos.............................................................

10

4.2. Material Vegetal................................................................................

10

4.3. Fracionamento do Extrato Bruto....................................................

11

4.4. Fracionamento cromatogrfico da amostra vegetal.....................

12

4.5. Testes biolgicos.............................................................................

13

4.5.1. Determinao do potencial redutor.........................................

13

4.5.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH.........................................................................................................

14

4.5.3. Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase....................

14

5. RESULTADOS E DISCUSSO............................................................

16

5.1. Anlise da atividade biolgica........................................................

16

5.1.1. Atividade antioxidante..............................................................

16

5.1.1.1. Determinao do potencial redutor..................................

17

5.1.1.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH.........................................................................................................

18

5.1.2. Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase....................

18

5.2. Fracionamento cromatogrfico da frao insolvel de

Posoqueria latifolia..................................................................................

20

5.3. Elucidao estrutural dos compostos............................................

21

5.3.1. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-33......................

22

5.3.2. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-65......................

26

6. CONCLUSES.....................................................................................

35

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................

36

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Alcaloides de espcies de Rubiaceae........................................

Figura 2 - Posoqueria latifolia rvore e partes da planta.........................

Figura 3 - Estruturas dos iridoides encontrados em P. latiflia...................

Figura 4 - Fluxograma de particionamento lquido-lquido do EB das

folhas de P. latifolia.....................................................................................

11

Figura 5 - Marcha analtica.........................................................................

12

Figura 6 - Estruturas do radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazil..........................

18

Figura 7 - Espectro de RMN de 1H da FIn em CD3OD (200 MHz) ................ 21

Figura 8 - Estrutura do composto sitosterol........................................... 22
Figura 9 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em CDCl3
(200 MHz) ..................................................................................................

23

Figura 10 - Ampliaes do espectro de RMN de 1H do composto PlaINS-33 em CDCl3 (200 MHz) ...................................................................... 24
Figura 11 - Espectro infravermelho do composto Pla-INS-65....................

26

Figura 12 - Estrutura do composto cido urslico......................................

27

Figura 13 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 em

piridina-D5 (200MHz) .................................................................................

28

Figura 14 - Regies ampliadas do espectro de RMN de 1H do composto

Pla-INS-65 em piridina-D5 (200MHz) ........................................................

29

Figura 15 - Espectro de RMN 13C do composto Pla-INS-65 em piridinaD5................................................................................................................ 31

Figura 16 - Espectro de DEPT 90 do composto Pla-INS-65 em piridinaD5................................................................................................................ 31
Figura 17 - Espectro de DEPT 135 do composto Pla-INS-65 em piridinaD5................................................................................................................ 32

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificao botnica de P. latifolia..........................................

Tabela 2 - Massa obtida para as fraes da planta P. latiflia atravs da

extrao lquido-lquido..............................................................................

16

Tabela 3 - Resultados dos testes de poder redutor, determinao da ao

sequestradora do radical livre DPPH e inibio da acetilcolinesterase
com o extrato bruto e as fraes de P. latifolia............................................

20

Tabela 4 - Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33

em comparao com a literatura................................................................

26

Tabela 5 - Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65

em comparao com a literatura................................................................
Tabela 6 - Dados espectrais de RMN de

13C

junto aos de DEPT 90 e

DEPT 135 do composto Pla-INS-65 em piridina-D5...................................

Tabela 7 - Dados do espectro de RMN de

13C

30

33

do composto Pla-INS-65

em comparao com a literatura................................................................

34

LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviaes
Abs Absorbncia
AcOEt Acetato de Etila
br s - Simpleto de sinal amplo
CCD - cromatografia em camada delgada
d - Dupleto
DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DPPH - 1,1-difenil-2-picril-hidrazil
DTNB - cido 5,5ditio-bis-2-nitrobenzico
EB - Extrato Bruto
EtOH - Etanol
FAe - Frao acetato de etila
FAq - Frao aquosa
FHe - Frao hexano
FIn - Frao Insolvel
FRA - Frao rica em alcaloides
IV - Infravermelho
g - Grama
Hz Hertz
J Constante de acoplamento
KBr Brometo de potssio
m - Multipleto
mg - Micrograma
ppm - Partes por milho
RMN de 1H - Ressonncia magntica nuclear de Hidrognio
RMN de 13C - Ressonncia magntica nuclear de Carbono 13
s - Simpleto
UV - Luz ultravioleta
UV-Vis - Luz ultravioleta e luz visvel
L Microlitro
g - Micrograma
7

RESUMO
Posoqueria latifolia, conhecida como laranja-de-macaco, pertence famlia
Rubiaceae, encontrada desde o norte da Amrica do Sul at o Rio Grande do
Sul no Brasil. Na medicina tradicional esta planta relatada como antissptica e
cicatrizante. Existem poucos estudos biolgicos sobre a espcie e um estudo
fitoqumico, onde este relatou
Considerando

os

diversos

a presena de diterpenos iridodicos.

compostos

obtidos

da

famlia

Rubiaceae,

principalmente os alcaloides, este trabalho visou um estudo fitoqumico com a

expectativa de isolamento de novos compostos, assim como a avaliao das
atividades antioxidante e inibidora da enzima acetilcolinesterase do extrato e
fraes de P. latifolia. A planta foi coletada no morro da Lagoa da Conceio,
Florianpolis. As folhas foram secas, trituradas e extradas com etanol 96%,
obtendo-se o extrato bruto (EB). O EB foi solubilizado em uma soluo de cido
clordrico em etanol 20% a pH~2,0 e armazenado em geladeira por 24 horas.
Obteve-se um precipitado denominado de frao insolvel (FIn). O filtrado
resultante foi particionado com solventes orgnicos de diferentes polaridades,
rendendo as fraes hexano (FHe) e acetato de etila (FAe). A frao aquosa
restante foi alcalinizada com hidrxido de amnio at pH~10 e extrada
novamente com acetato de etila, obtendo-se a frao rica em alcaloides (FRA),
A frao restante foi neutralizada, gerando a frao aquosa (FAq). A partir do
fracionamento cromatogrfico da FIn, foram isolados o esteroide -sitosterol e o
triterpeno cido urslico, que tiveram sua estrutura elucidada atravs de tcnicas
espectroscpicas de RMN baseadas na literatura. A FRA mostrou a maior
atividade antioxidante avaliada pelo teste do potencial redutor. O teste relativo a
captura de radicais livres com DPPH teve resultados no significantes quanto a
atividade antioxidante. O EB e fraes de P. latifolia apresentaram uma fraca
inibio da enzima acetilcolinesterase, com um valor mximo de 53% para a FAe
na concentrao de 100 g/mL. Os testes biolgicos no apresentaram
resultados to promissores, mas a presena dos compostos -sitosterol e cido
urslico em P. latifolia incentivam a continuao dos estudos na busca de outros
compostos, alm da possibilidade de ainda serem encontrados alcaloides.
Palavras-chave: Posoqueria latifolia, antioxidantes, acetilcolinesterase

1. INTRODUO
O estudo dos compostos naturais obtidos de plantas tem fundamental
importncia na qumica, principalmente devido a sua ligao com a rea
medicinal. Pode-se explicar isto devido a capacidade de plantas produzirem
diversos compostos qumicos que esto presentes em qualquer espcie de
vegetal, pois so essenciais para sua sobrevivncia e desenvolvimento, os
chamados metabolitos primrios; alm de compostos que esto presentes
apenas em determinadas espcies e no so diretamente necessrios para a
sobrevivncia celular, mas que possuem grande importncia como meio de
proteo e sobrevivncia para a reproduo da planta, chamados metablitos
secundrios. Esta ltima classe de metablitos geralmente apresenta potencial
atividade biolgica para os seres humanos e cumprem funes altamente
especficas nas espcies onde ela est presente, como atrair insetos para a
transferncia do plen, agir como pesticidas naturais de defesa contra
herbvoros ou microrganismos patognicos, ter funo como agente aleloptico,
proteo contra a luz ultravioleta, entre outras diversas funes. Devido
variedade de atividade biolgica existente, percebe-se que muitos destes
compostos tm grandes chances quanto a sua insero no mercado atual de
frmacos e na indstria qumica.
Entre a diversidade de metablitos secundrios encontrados em plantas
podemos citar como exemplo a morfina, forte analgsico usado no tratamento
de pacientes com cncer em fase terminal, extrados da planta Papaver
somniferum; eugenol, utilizado como antissptico e anestsico, encontrado em
diversas plantas do gnero Cinnamomum; vanilina, aromatizante usado
largamente na indstria de alimentos, presente em sementes de algumas
espcies do gnero Vanilla; e o paclitaxel, com nome comercial de Taxol,
frmaco usado para tratamento de cncer de pulmo, mamas e ovrios, que foi
extrado primeiramente das cascas da espcie Taxus brevifolia.
Alm da descoberta direta de diversos compostos provenientes de plantas
que so biologicamente ativos em seres humanos, outros compostos obtidos
atravs da modificao estrutural de produtos naturais podem levar a novas
substncias e medicamentos que possuam menos efeitos colaterais que os
1

compostos que os originaram. Um exemplo clssico a modificao estrutural

da salicilina, proveniente da planta Salix alba, que aps hidrlise da ligao
glicosdica, oxidao do lcool salicilado e reao de acetilao com o cido
saliclico resultante, d origem ao cido acetilsaliclico, um dos remdios mais
conhecidos na atualidade, a Aspirina.
Assim, este projeto apresenta como proposta o estudo biolgico e
fitoqumico de uma espcie vegetal pouco descrita at o momento na literatura,
pertencente famlia Rubiaceae, a espcie Posoqueria latifolia.
.

2. REVISO DA LITERATURA
2.1. Famlia Rubiaceae
A famlia Rubiaceae, pertencente s Angiospermas, constituda por
rvores de grande, mdio e pequeno porte, arbustos, subarbustos e ervas anuais
ou perenes, distribudas em regies tropicais dos dois hemisfrios. composta
por 650 gneros e 13.000 espcies, sendo a quarta maior famlia de plantas
presente no Brasil, ficando atrs apenas das famlias Asteraceae, Orchidaceae
e Fabacea (ROBBRECHT et al., 2013). A famlia Rubiaceae tem grande
importncia econmica, pois representante de diversas espcies como o caf
(Coffea spp.), gro de onde produzida a bebida mais consumida no mundo; o
jenipapo, fruto de grande uso nos estados do nordeste brasileiro; Cinchona
pubescens, planta utilizada para a produo de quinina; e Ixora spp. (hortnsia
japonesa) e Mussaenda spp. (mussaenda), espcies de cunho ornamental
devido a quantidade de flores que suas plantas apresentam. As espcies de
Rubiaceae so encontradas com maior frequncia em reas tropicais e
subtropicais, mas por vezes tambm achada em reas temperadas
(CRONQUIST, 1981).
Em diversos estudos de suas espcies h relatos cientficos sobre a
presena de compostos como esteroides, flavonoides, iridoides, saponinas,
taninos e triterpenos (CHAO e SVOBODA, 1980; MARTINS et al., 2013;
MOREIRA et al., 2010; TAN et al., 2011; FERREIRA et al., 2012). Porm, o que
mais atrai os pesquisadores o fato da famlia Rubiaceae ter como metablitos
secundrios mais representativos os alcaloides (LORENZI,1982).
Os alcaloides, segundo a definio apresentada pela IUPAC, so
compostos que apresentam nitrognio bsico (na sua maioria heterocclicos) e
quase sempre tem origem no reino vegetal (IUPAC, 1987). Porm, sabe-se que
esta definio no abrange todas as classes de alcaloides, j que nem todos
possuem essas caractersticas. Dessa forma, os alcaloides podem ser melhor
definidos quando divididos em trs grupos; alcaloides verdadeiros, os quais so
derivados de aminocido e possuem um heterociclo com tomo de nitrognio
bsico; protoalcaloide, os quais so derivados de aminocido e possuem
nitrognio bsico fora de um heterocclico; e pseudoalcaloides, os quais
3

possuem nitrognio bsico na molcula, mas no so derivados de aminocidos.

Tambm podem ser classificados quanto a sua estrutura base, como os
alcaloides purnicos, que tem como base a estrutura da purina, alcaloides
pirrolizidnocos, com base pirrolizidina, alcaloides indolicos, com base de indol,
entre outros mais.
Entre os alcaloides encontrados na famlia Rubiaceae podemos citar
diversos exemplos. O gnero Coffea, principal representante da famlia e nativo
do continente africano, contm o alcaloide cafena (1), que usado como
estimulante do sistema nervoso central (JOLY, 1979); as espcies do gnero
Cinchona que produzem o alcaloide quinina (2) (NOGUEIRA et al., 2009),
utilizado no tratamento da malria e de arritmias cardacas; a Psychotria
ipecacuanha, conhecida popularmente como ipeca, possui em suas razes os
alcaloides cefaelina (3) e emetina (4) (HASEGAWA et al., 2002; EISENHUT et
al., 2005), que so usados na produo de xaropes expectorantes e vermfugos.
As estruturas destes alcaloides so mostradas na Figura 1.

Figura 1- Alcaloides de espcies de Rubiaceae

2.2. Gnero Posoqueria

Plantas do gnero Posoqueria podem ser encontradas em matas midas,
principalmente no Brasil (MACIAS, 1988). Elas so caracterizadas pela presena
de inflorescncias pndulas, com botes florais curvos no pice e anteras pilosas
(PEREIRA e BARBOSA, 2004). Atualmente h poucos estudos publicados sobre
o gnero na literatura. A espcie Posoqueria acutifolia, apontada na medicina
popular com propriedades antimicrobianas, cicatrizantes e anti-inflamatrias
(SOUZA et al., 2013), o extrato etanlico de suas frutas apresentou atividade
antioxidante (RIBEIRO et al., 2013). Na espcie Posoqueria grandiflora foi
constatado a presena de alcaloides no extrato de suas folhas (SOTO-SOBENIS
et al., 2001). Visando contribuir com a taxonomia deste gnero, estudaremos
neste projeto a espcie Posoqueria latifolia.
2.3 Posoqueria latifolia
A espcie Posoqueria latifolia pode ser encontrada no Mxico, Antilhas,
Colmbia, Venezuela, Guiana, Suriname, Guiana Francesa, Equador, Peru,
Bolvia e Brasil (TAYLOR et al., 2004). Distribui-se principalmente na mata
atlntica de encosta, floresta estacional semidecdua submontana, floresta de
restinga e mata ciliar em matas de cerrado (MACIAS e KINOSHITA, 2007).
Em Santa Catarina esta planta encontrada no interior de florestas
primrias situadas no incio das encostas e plancies aluviais, estando
preferivelmente entre o nvel do mar e 900 metros de altitude. No Brasil,
encontra-se em todos os estados (DELPETRI et al., 2005).
Posoqueria latifolia conhecida popularmente como baga de macaco,
aucena-do-mato, ara-da-praia, ara-de-coroa, bacupari-de-capoeira, florde-mico, maria-peidorreira, papa-terra, posoqueria e puro (FERREIRA, 1986).
uma rvore ornamental e pode atingir at 15 metros de altura com extremidade
dos ramos levemente achatada, estriada e glabra. As folhas so simples e
opostas. Suas flores so brancas e perfumadas. O fruto uma baga amarela
(Figura 2).

Figura 2 Posoqueria latifolia rvore e partes da planta.

P. latifolia apresenta a seguinte classificao botnica (Tabela 1).
Classificao Botnica
Reino

Plantae

Filo

Tracheophyta

Classe

Magnoliopsida

Ordem

Gentianales

Famlia

Rubiaceae

Gnero

Posoqueria

Espcie

Posoqueria latifolia

Tabela 1. Classificao botnica de P. latifolia

Na medicina popular esta espcie indicada como antissptica e
cicatrizante de feridas (FENNER et al., 2006), alm do uso como antidiarreico
(FORERO, 1980).
6

Um estudo fitoqumico em P. latifolia relatou a presena de dois iridoides,

posoquenin (5) e latifonin (6) (Figura 3) nos extratos de clorofrmio e de acetato
de etila, respectivamente (CHAO e SVOBODA, 1980). Apesar da ocorrncia de
iridoides na forma glicosilada em plantas da famlia Rubiaceae ser comum, estes
dois no foram encontrados na forma de glicosdeos.
Os iridoides so compostos pertencentes a classe de terpenos e so
formados por duas unidades de isopreno, com sua estrutura apresentando um
anel ciclopentano fundido a um anel heterociclo de seis membros com um
oxignio. A estrutura pode apresentar 10 carbonos, 9 ou o menos comum, 8
carbonos. A clivagem da ligao entre os carbonos 7 e 8 podem levar ao
chamado secoiridoide (SAMPAIO-SANTOS & KAPLAN, 2001).

Figura 3 Estruturas dos iridoides encontrados em P. latifolia.

O extrato das flores da planta, obtido atravs de extrao com Soxhlet, foi
analisado atravs de cromatografia gasosa acoplado a espectrmetro de
massas, onde se determinou a presena de hidrocarbonetos em sua maioria
(aproximadamente 50%) e compostos oxigenados na forma de steres (20%)
(ARIZA et al., 2007).
Em outro estudo (ELYA et al., 2012), o extrato etanlico das folhas de P.
latifolia foi submetido ao ensaio de uma marcha analtica. O ensaio composto
de diversos testes simples de bancada, usados para detectar a presena de
certas classes de compostos, onde este estudo apresentou resultado positivo
para a presena de terpenoides glicosdicos e taninos. O mesmo estudo tambm
mostrou que o extrato apresenta inibio da enzima -glicosidase semelhante
ao frmaco acarbose, usado no controle de diabetes (ELYA et al., 2012).
Os terpenos so compostos presentes em leos essenciais de plantas e
com grande diversidade estrutural. Muitas deles apresentam ligaes duplas
entre carbonos, podendo possuir tomos de oxignio ligados a carbonos que se
7

apresentam na forma de cadeia aberta ou anis. Apesar das diferentes

estruturas, os terpenos so conhecidos pela regra do isopreno, segundo o qual,
estes so formados por ligaes entre molculas de isopreno (2-metil-1,3butadieno). Os terpenos so classificados de acordo com o nmero de isoprenos
presentes, sendo chamado de monoterpeno, o composto formado por duas
unidades de isopreno, diterpeno, o composto formado por 4 unidades de
isopreno, triterpeno, aquele formado por 6 unidades de isopreno e assim em
diante (MCMURRY, 2008).
Os taninos so compostos fenlicos, que apresentam solubilidade em
gua e possuem habilidade de formar complexos insolveis com protenas ou
alcaloides quando em meio aquoso. So classificados em taninos hidrolisveis
e taninos condensados. Taninos hidrolisveis so formados por uma molcula
de acar no centro (frutose, glicose), onde suas hidroxilas so esterificadas com
cidos fenlicos. Foram assim chamados pois, estas ligaes esterificadas
podem sofrer hidrlise por enzimas ou em meio cido. Taninos condensados
incluem os outros taninos, onde suas molculas so mais resistentes a
fragmentao. Sua estrutura formada por polmeros de flavan-3-ol ou flanvan3,4-diol (MONTEIRO et al., 2005).
Um estudo sobre plantas da famlia Rubiaceae presentes no Panam
revelou que o extrato alcalodico de folhas e flores de P. latifolia apresentou
resultados positivos para a presena de alcaloides indlicos e no indlicos
(SOTO-SOBENIS et al., 2001). Porm esse teste contradiz o estudo de Elya e
colaboradores (2012), no qual no se observou a presena de compostos
alcalodicos na espcie.
Considerando-se os poucos estudos fitoqumicos at o momento para o
gnero Posoqueria, vamos desenvolver um projeto que visa o estudo da espcie
P. latifolia com o intuito de descobrir compostos inditos ou mesmo compostos
j identificados, contribuindo para a taxonomia do gnero. Espera-se tambm
encontrar alcaloides, j que os mesmos foram detectados analiticamente em
estudos realizados anteriormente.

3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
O objetivo geral deste projeto o estudo biolgico e fitoqumico de
Posoqueria latifolia na busca de compostos com atividade antioxidante e
inibidora da enzima acetilcolinesterase.
3.2. Objetivos Especficos:
3.2.1. Coletar e obter o extrato bruto das folhas da espcie Posoqueria
latifolia;
3.2.2. Aplicar uma marcha analtica preliminar ao extrato bruto de
Posoqueria latifolia;
3.2.3. Efetuar o particionamento lquido-lquido do extrato bruto usando
cido e base visando a obteno de uma frao alcalodica;
3.2.4. Aplicar os ensaios antioxidantes atravs do teste que avalia o poder
redutor e aquela que avalia a captura de radicais livres pelo DPPH ao extrato
bruto e diferentes fraes;
3.2.5. Aplicar o ensaio de inibio da enzima acetilcolinesterase ao extrato
bruto e as diferentes fraes;
3.2.6. Submeter aa frao insolvel obtida do fracionamento do extrato
bruto cromatografia em coluna de slica gel visando o isolamento dos
compostos majoritrios;
3.2.7. Estudar as anlises espectroscpicas de IV e de RMN
unidimensionais (1H,

13C

e DEPT) e bidimensionais (COSY, HMQC e HMBC),

conforme a necessidade, a fim de elucidar as estruturas dos compostos obtidos

atravs do estudo minucioso dos espectros dos respectivos compostos;
3.2.8. Preparar o relatrio final de estgio.

4. METODOLOGIA
4.1. Reagentes e Equipamentos
Os solventes utilizados foram lcool etlico, lcool metlico, acetona,
hexano, acetato de etila, diclorometano, cido actico e lcool de cereais, todos
obtidos comercialmente. Foi utilizado tambm sulfato de sdio anidro,
ferricianeto de potssio, DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil), cloreto frrico, cido
glico e cido ascrbico. Todos os reagentes usados foram de grau analtico,
sendo obtidos de diferentes fontes comerciais.
Na realizao deste projeto foram utilizados estufa, rota evaporador,
balana analtica, espectrofotmetro UV-VIS PERKIN ELMER Lambda2S,
cmara com luz UV e um aparelho digital Micro Qumica MQA PF 301 para
medir o ponto de fuso. Os espectros de IV foram analisados atravs de um
espectrmetro ABB FTLA 2000 e as anlises de RMN de

13C

e 1H foram

realizadas nos equipamentos VARIAN NMR AS 400 (400 MHz) e BRUKER

AC200 (200 MHz).
Para a cromatografia em camada delgada (CCD) analtica, usou-se
cromatoplacas de alumnio cobertas com slica gel 60 em uma camada de 0,2
mm de espessura (Merck). Como revelador foi utilizada uma soluo de
anisaldedo sulfrico 5% em metanol.
Para a realizao do ensaio de inibio da acetilcolinestera utilizou-se as
seguintes solues tampes: Tampo A soluo de Tris-HCl 50 mM pH = 8,0;
Tampo B soluo de Tris-HCl 50 mM pH = 8,0 acrescido de 0,1 % de soro
albumina bovina; Tampo C soluo de Tris-HCl 50 mM pH = 8,0 acrescido de
NaCl 0,1 M e MgCl2.6H2O 0,02 mol/L. Foram utilizados tambm solues de
iodeto de acetiltiocolina, reagente de Ellman (cido 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoicoDTNB) e a enzima acetilcolinesterase liofilizada (Tipo VI-S obtida de
Electroparius electricous). Todos estes reagentes foram obtidos da Sigma
Aldrich.
4.2. Material Vegetal
A espcie de Posoqueria latifolia foi primeiramente coletada no alto do
morro da Lagoa da Conceio, em Florianpolis, Santa Catarina, e identificada
10

pelo botnico taxonomista, professor Dr. Ademir Reis do Departamento de

Botnica da Universidade Federal de Santa Catarina. O material vegetal
recolhido foi seco por 3 dias a 50C, modo, e macerado em etanol 96% por trs
vezes seguidas com intervalos de 7 dias. Aps a evaporao do solvente, foi
obtido o extrato bruto (EB).
4.3. Fracionamento do Extrato Bruto
O extrato bruto das folhas da planta obtido foi ento particionado atravs
de extrao lquido-lquido, sendo inicialmente solubilizado em uma soluo de
HCl em H2O:EtOH 8:2, pH ~ 2,0 e armazenado em geladeira por 24 horas. Aps
esta etapa foi iniciada uma filtrao, de onde obteve-se uma frao insolvel
(FIn). O filtrado foi ento particionado atravs de extrao lquido-lquido, onde
primeiramente usou-se o solvente hexano e durante a segunda extrao o
solvente acetato de etila, obtendo-se a frao hexano (FHe) e a frao acetato
de etila (FAe). A soluo restante foi alcalinizada com NH4OH at pH~10 e
extrada novamente com acetato de etila, gerando assim a frao rica em
alcaloides (FRA). Por ltimo, a frao aquosa restante foi neutralizada com
Na2CO3, resultando na frao aquosa (FAq). O mtodo para a extrao
ilustrado atravs da Figura 4.

Figura 4 Fluxograma de particionamento lquido-lquido do EB das folhas de

P. latifolia.
11

Quando se trabalha com plantas, a diversidade de compostos presente

em folhas, caule ou razes muito grande. Dessa forma, pode-se aplicar testes
rpidos de bancada a partir diversos ensaios definidos previamente em literatura,
a fim de obter resultados positivos e negativos para classes de compostos
presentes em uma amostra vegetal. Assim, aplicamos a marcha analtica,
mtodo descrito previamente por Matos (1997), sobre o extrato bruto da planta,
tendo como objetivo detectar as principais classes de metablitos secundrios
que possam estar presentes em suas folhas. A figura 5 representa como ser
conduzida a marcha analtica e quais classes de compostos que podem ser
encontradas.

Legenda: A: gua; B: 1 HCl 1%, 2 filtrar; C: NH4OH, pH = 10, extrao com

clorofrmio; D: 1 Na2SO4, 2 secar; E: Extrao com clorofrmio/etanol (3:2);
F: 1 Na2SO4, 2 secar; G: 1 secar, 2 Etanol; H: 1 metanol/gua (1:1), 2
HCl, pH = 1, 3 extrao com ter etlico.
Figura 5 Marcha analtica
4.4. Fracionamento cromatogrfico da amostra vegetal
Com o objetivo de isolar compostos majoritrios, a frao insolvel foi
submetida a cromatografia em coluna de slica gel, usando-se assim eluentes de
12

diferentes polaridades para sua fase mvel, sendo estes o hexano, acetato de
etila e etanol, os quais foram aplicados de modo gradiente. Analisaram-se as
fraes obtidas atravs de cromatografia em camada delgada, onde foram juntas
aquelas que apresentaram perfil semelhante. A partir dessas fraes foram
utilizadas tcnicas de recristalizao visando a purificao dos compostos.
Conforme necessrio, foi repetido o fracionamento cromatogrfico em coluna em
slica gel ou foi aplicada a tcnica de cromatografia em coluna com slica flash
para a obteno de novas fraes.
Por fim, os compostos isolados foram submetidos anlises por
espectrometria de IV, e RMN unidimensionais (1H, 13C e DEPT) e bidimensionais
(COSY, HMQC e HMBC), conforme a necessidade.

4.5. Testes biolgicos

Baseando-se

que

diversos

compostos

descobertos

em

plantas

apresentam atividades biolgicas, o extrato bruto e as diferentes fraes obtidas

do particionamento lquido-lquido foram submetidos a ensaios biolgicos que
avaliam o poder redutor e a captura de radicais livres pelo DPPH de uma
amostra, alm do teste que avalia a atividade inibitria da enzima
acetilcolinesterase.
4.5.1. Determinao do potencial redutor
Para a anlise da atividade antioxidante atravs da determinao do
potencial redutor, foi seguido a metodologia de Moresco et al. (2012). Em
triplicata, preparou-se as misturas reacionais contendo 100 mL de soluo de
amostra vegetal diludas em metanol (1000 ppm), 8,5 mL de gua deionizada e
1,0 mL de uma soluo de FeCl3 0,1 mol/L em HCl 0,1 M. Aps trs minutos,
adicionou-se 1,0 mL de uma soluo de ferricianeto de potssio 0,008 mol/L.
Aps 15 minutos foi feita a leitura da absorbncia das misturas em
espectrofotmetro a 720 nm. O aparecimento da cor azul da Prssia indicativo
de potencial redutor. Como branco, utilizou-se uma soluo preparada conforme
o procedimento anterior, porm sem a amostra vegetal. Os dados finais foram
13

obtidos construindo-se uma curva de calibrao utilizando soluo de cido

ascrbico, onde o potencial redutor expresso equivalente a massa de cido
ascrbico (mg cido ascrbico/g de extrato ou frao).
4.5.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre
DPPH
A avaliao da ao sequestradora de radicais livres usando o DPPH
baseia-se no mtodo descrito por Moresco et al. (2012). Adicionou-se uma
alquota de 2 mL de soluo de DPPH em metanol (0,004%) a 1 mL de amostra
vegetal diluda em concentrao de 333 ppm (333 L/mL). A mistura em seguida
foi agitada e deixada repousar por 30 minutos. A absorbncia do DPPH nas
solues foi determinada em um espectrofotmetro a 517 nm. A absorbncia de
cada soluo com a amostra (Absamostra) foi convertida em porcentagem da
atividade antioxidante usando a frmula:
AA% = 100 [(Absamostra Absbranco)x100]/Abscontrole
Como branco (Absbranco), foram utilizadas solues de metanol (2 mL) junto
com as solues das amostras diludas (1 mL). Como controle (Abscontrole), foram
utilizadas solues com DPPH (2 mL) e metanol (1 mL). A anlise foi feita em
triplicata. Determinou-se a capacidade antioxidante das amostras com base na
diminuio da absoro da amostra controle comparada a cada soluo, onde
obteve-se um valor da porcentagem de atividade antioxidante (AA%) atravs da
equao demonstrada anteriormente.
4.5.3.Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase
A metodologia apresentada por Magina et al. (2012) foi usada para a
aplicao deste teste. Inicialmente, as amostras das fraes e extrato bruto
foram dissolvidas em etanol (100 g/mL), e ento uma frao de 100 L desta
foi adicionada com 325 L do tampo tris-HCl 50 mmol/L pH = 8 em uma cubeta,
seguida da adio de 25 L da enzima acetilcolinesterase. Aps 15 minutos,
acrescentou-se 75 L iodeto de acetiltiocolina e 475 L do reagente de Ellman.
14

A leitura foi efetuada em espectrofotmetro UV-Vis a 405 nm aps 30 minutos.

Como branco, usou-se apenas o tampo junto as amostras. Como controle
positivo, onde a atividade enzimtica inibida, foi utilizado o frmaco Reminyl na
concentrao de 0,01 mg/mL, o qual contm galantamina em sua composio.
Como controle negativo, onde a atividade enzimtica considerada 100%,
adicionou-se 100 L de etanol em vez das amostras. A taxa de inibio
calculada usando a frmula:
I(%)= 100 [(Aamostra-Abranco)/Acontrole]x100
Aamostra representa a absorbncia da amostra junto aos reagentes e enzima;
Abranco representa a absorbncia obtida do valor branco, o qual foi descontado
da absorbncia obtida das amostras; e Acontrole representa a absorbncia dos
controles negativos medidos para cada amostra. Os testes foram realizados em
triplicata e os valores de porcentagem de inibio foram determinados atravs
dos dados obtidos aplicados a equao representada anteriormente.

15

5. RESULTADOS E DISCUSSO

As folhas de Posoqueria latifolia, aps coletadas e secas em estufa,

renderam um valor de 538,0 gramas de planta seca. O procedimento para
obteno do extrato bruto (EB) rendeu a massa de 59,39 gramas. A partir deste,
temos como resultado um rendimento de 11,03% (m/m) sobre as folhas secas.
O procedimento da marcha analtica, segundo metodologia de Matos
(1997), o qual tem objetivo de detectar a presena de diferentes classes de
metablitos secundrios em P. latifolia, gerou resultados positivos para a
presena de alcaloides, esteroides, flavonoides, leucoantocianidinas e taninos
no EB obtido anteriormente. A presena de alcaloides j era esperada para esta
planta, tendo em vista a quimiotaxonomia discutida sobre a famlia Rubiaceae.
Na sequncia, o EB foi submetido a um particionamento lquido-lquido
com solventes de diferentes polaridades, fornecendo a frao insolvel (FIn),
frao hexano (FHe), frao acetato de etila (FAe), frao rica em alcaloides
(FRA) e frao aquosa (FAq), cujos rendimentos so apresentados na tabela 2.
Rendimentos (a)
Frao Massa obtida
28,80 g
54,92
FIn
49,9 mg
0,16
FHe
2,12 g
6,76
FAe
547,7 mg
1,74
FRA
11,425 g
36,42
FAq
Tabela 2 - Massa obtida para as fraes da planta P. latifolia atravs da
extrao lquido-lquido.
(a) % m/m a partir do extrato bruto
Devido ao alto rendimento obtido da FIn no procedimento de extrao,
esta foi a frao escolhida para o fracionamento cromatogrfico e isolamento de
compostos.
5.1. Anlise da atividade biolgica
5.1.1. Atividade antioxidante
Reaes envolvendo oxidao, as quais possuem um modelo de
transferncias de eltrons, so essenciais para a manuteno do funcionamento
16

de organismos em seres vivos aerbicos. Porm, isto pode se tornar um

problema quando h a formao de um excesso de eltrons desemparelhados
em molculas, os tambm chamados radicais livres. O grupo alcxi (RO), como
exemplo, altamente reativo e tem meia vida de poucos segundo, podendo
atacar rapidamente clulas prximas, causando danos a macromolculas como
lipdeos, protenas ou DNA (AMES et al., 1993). Sendo assim, a descoberta de
molculas com capacidade antioxidante se torna importante, uma vez que elas
podem retardar a velocidade de oxidao atravs de mecanismos de inibio de
radicais livres ou complexao de metais (PIETTA, 2000). Entre alguns
compostos naturais descobertos que possuem capacidade antioxidante
podemos citar o cido ascrbico, vitamina E e -caroteno (RICE-EVANS et al.,
1996).
5.1.1.1. Determinao do potencial redutor
Existem diversos mtodos capazes de avaliar a capacidade antioxidante
de uma amostra, onde cada ensaio apresenta mecanismos diferentes. O poder
redutor tem como objetivo detectar compostos com potencial de reduo de
valores menores que 0,7 V, de acordo com o potencial apresentado pelos ctions
de ferro (PRIOR et al., 2005). Este ensaio baseado na reao de reduo de
ons frricos (Fe+3) a ons ferrosos (Fe+2) pelo substrato, devido a presena de
compostos eltrons-doadores. Dessa forma, os ons ferricianeto so reduzidos
a ferrocianeto que, por sua vez, formam um complexo (Fe4[Fe(CN)6]3) de
colorao azul intensa (azul da Prssia) com os ons ferro III, apresentando pico
de absoro em 720 nm.
Atravs dos resultados obtidos para a espcie P. latifolia, identificados na
Tabela 3, pode-se observar que a frao acetato de etila apresentou a maior
capacidade redutora sobre ons frricos, resultando em valores de atividade
equivalentes a 52,28 mg de cido ascrbico/g de amostra.
Porm, quando estes resultados so comparados a outras plantas da
famlia Myrtaceae, por exemplo (MAGINA et al., 2010), P. latifolia apresentou
baixa atividade antioxidante.

17

5.1.1.2. Determinao da ao sequestradora do radical livre

DPPH
A atividade antioxidante do extrato e fraes da planta foi tambm
determinada utilizando o teste com o radical livre estvel DPPH (figura 5). Esta
molcula tem como caracterstica solubilidade em solventes orgnicos, no qual
sua soluo apresenta cor violeta intensa. Se uma substncia presente no
extrato ou fraes capaz de sequestrar o radical presente na molcula, ela
causa o descoramento da soluo. O sequestro de radical pode ser promovido
pela abstrao de um tomo de hidrognio pelo radical DPPH, promovendo
assim sua reduo. Dessa forma, consegue-se obter compostos mais estveis
que os presentes anteriormente, e a partir desse princpio, determinar a sua
atividade antioxidante atravs de espectroscopia de UV-VIS (517 nm).

Figura 6 Estruturas do radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazil

O teste foi realizado com as amostras do extrato bruto e fraes na

concentrao de 333 ppm. Os resultados referentes a porcentagem de atividade
antioxidante so apresentados na tabela 3. De acordo com a tabela, observa-se
que para espcie P. latifolia, a frao que apresentou a maior capacidade de
sequestro de radicais livres foi a FAe, com valor de 19,3% de atividade, seguida
da frao FRA, com 13,7%.
Como observado para os valores quanto a determinao do potencial
redutor, os valores obtidos para as concentraes foram baixos, demonstrando
que a espcie no tem, ou possui baixa atividade antioxidante.
5.1.2. Teste de inibio da enzima acetilcolinesterase
A doena de Alzheimer costuma aparecer em indivduos de idade mais
avanada e responsvel por grande parte dos casos de demncia nessa faixa
18

etria (FRANCIS et al., 1999). Ela est associada a diferentes rotas bioqumicas,
onde uma das suas causas mais aceitas relacionada a diminuio de
neurotransmissores no crebro, entre eles a acetilcolina (ZAROTSKY et al.,
2003). A acetilcolina, aps ser usada na sinapse nervosa, hidrolisada pela
enzima acetilcolinesterase, transformando-a em colina e um grupo acetil. Como
exemplo, o alcaloide galantamina (Reminyl) tem sido um excelente tratamento
para esta doena, inibindo a enzima acetilcolinesterase no crebro, retardando
o avano da doena e prolongando a vida do paciente (HEINRICH & TEOH,
2004).
Alm da galantamina, existem diversos inibidores da acetilcolinesterase
conhecidos no mercado, como os frmacos tacrina (Cognex), donepezil
(Aricept) e riastigmina (Exelon). Apesar destes frmacos apresentarem efeito
satisfatrio em pacientes, eles acabam sendo caros e alguns apresentam muitos
efeitos colaterais (VIEGAS JUNIOR et al., 2004). Por isso, se incentiva a busca
de produtos naturais que possam substitui-los, tendo-se uma opo de menor
custo com tratamento mais eficiente para a doena.
Assim, o extrato e fraes da espcie P. latifolia foram avaliados em
relao ao potencial inibidor sobre a enzima acetilcolinesterase. O teste para a
avaliao desta atividade baseado na hidrlise do substrato acetiltiocolina pela
enzima, gerando como produto a tiocolina, que reage com o DTNB cido 5,5
ditio-bis-2-nitrobenzico (reagente de Ellman), produzindo o nion 2nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e o cido 2-nitro-5-tiobenzico, sendo o nion
facilmente identificado pela colorao amarela. Deste modo, se houver na
amostra compostos que inibam a ao da enzima, esta no degradar a
acetiltiocolina e no formar um cromforo amarelo. Quanto mais intensa a
colorao amarela, maior a hidrlise do substrato realizada pela enzima e menor
a concentrao de compostos vegetais que possuem a propriedade de inibir a
enzima.
De acordo com os resultados obtidos para a espcie P. latiflia, podemos
observar que o teste obteve os melhores resultados para a frao acetato de
etila e frao insolvel, apresentando atividade acima de 50% na concentrao
de 100 g/mL, segundo os resultados apresentados na Tabela 3.

19

Frao Poder Redutor (a) % Ativididade Antioxidante (b) Acetilcolinesterase (c)

EB
24,44
10,8
49,3
Fin
18,83
10,4
50,75
FHe
16,35
6,00
46,21
FAe
52,28
19,3
53,84
FRA
9,10
13,7
38,5
FAq
17,09
0,03
39,88
Tabela 3 - Resultados dos testes de poder redutor, determinao da ao
sequestradora do radical livre DPPH e inibio da acetilcolinesterase com o
extrato bruto e as fraes de P. latifolia
(a)

mg de cido ascrbico/g amostra, (b) % AA (333 ppm), (c) % inibio (100

ppm)

5.2. Fracionamento
Posoqueria latifolia

cromatogrfico

da

frao

insolvel

de

Devido ao grande nmero de compostos que esto presentes no extrato e

fraes obtidos de plantas, so utilizados tcnicas de separao para que se
possa isol-los. Na espcie P. latifolia, esta tcnica foi utilizada com o objetivo
de obter compostos presentes na frao insolvel. Dessa forma, inicialmente foi
impregnado 25,09 g da frao em cerca de 50 g de slica gel. Uma coluna de
vidro de 5,5 cm de dimetro foi recheada com slica gel (cerca de 15 cm de
altura), e posteriormente eluda com os solventes hexano, acetato de etila e
metanol, obtendo-se um gradiente de polaridade. Foram coletadas 80 fraes de
100 mL cada. O fracionamento foi monitorado atravs de cromatografia em
camada delgada.
A frao 33 foi obtida em eluente de Hex:AcOEt 80:20, aps recristalizao
em metanol. Obteve-se um slido cristalino em forma de agulhas, com faixa de
ponto de fuso de 134,3-137,4C. Este slido foi encaminhado para anlises de
RMN de 1H e 13C e foi nomeado de Pla-INS-33.
As fraes 65-67 foram obtidas em um eluente de AcOEt:Hex 75:25. Elas
foram reunidas de acordo com o perfil na CCD e recristalizadas com metanol,
onde foi obtido um slido branco com faixa de ponto de fuso de 224-226C.
Este slido foi encaminhado para anlises de RMN e foi nomeado de Pla-INS65.

20

5.3. Elucidao estrutural dos compostos

Os compostos obtidos de P. latifolia tiveram suas estruturas elucidadas
atravs de tcnicas de espectrometria de IV e anlise com RMN unidimensionais
(1H, 13C e DEPT).
Previamente, foi analisado atravs de RMN de 1H a frao insolvel (FIn)
com o propsito de encontrar quais tipos de compostos esto presentes na
frao. O resultado est presente na figura 7.
4.78

Methanol-d4

1.0
0.9
0.8
Methanol-d4
3.23

Intensity

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3

1.51

5.26

0.1

0.69

0.2

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0
2.5
Chemical Shift (ppm)

2.0

1.5

1.0

Figura 7 - Espectro de RMN de 1H da FIn em CD3OD (200 MHz)

Os picos encontrados esto em sua maioria na faixa de 0,69 ppm a 1,51
ppm, o que sugere que os compostos nesta frao apresentem hidrognios
ligados a carbonos primrios e secundrios.
Em 5,26 ppm tambm pode ser visto picos na linha base do espectro.
Hidrognios que aparecem nessa faixa de espectro geralmente esto
relacionados a prtons ligados a carbonos com duplas ligaes, os quais, por
estarem mais desprotegidos, so facilmente alterados pelo campo magntico
aplicado pelo equipamento de RMN.
A seguir sero discutidas como foram feitas as elucidaes estruturais dos
compostos isolados atravs do fracionamento cromatogrfico da frao insolvel
de P. latifolia.

21

5.3.1. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-33

Este composto apresentou uma faixa de fuso tpica de esteroides e, assim
como previsto no resultado da marcha analtica, as anlises de RMN de 1H
confirmaram esta suspeita. Atravs dos espectros de RMN, foi observado que
se trata do esteroide -sitosterol (Figura 8). Este esteroide frequentemente
isolado em fraes de plantas atravs de cromatografia em coluna, onde
geralmente est presente em fraes menos polares, e tem sua estrutura citada
diversas vezes na literatura junto ao esteroide estigmasterol (CHATURVEDULA
& PRAKASH, 2012; KAMBOJ & SALUJA, 2011; YAHYA et al., 2011; AHMED et
al., 2013).

Figura 8 - Estrutura do composto sitosterol

Atravs do espectro de RMN de 1H, percebe-se que ele no se encontra
junto ao outro esteroide, j que pode ser destacado o multipleto em 3,54 ppm
referente ao hidrognio hidroximetnico em C3, que a prncipio poderia estar
presente em ambos os compostos e no entanto observa-se integrao para
apenas 1 tomo de hidrognio; o dupleto centrado em 5,36 ppm (J = 5,2 Hz),
atribudo ao hidrognio vinlico em C6 presente no -sitosterol, tambm com
integrao para 1 tomo de hidrognio; e a ausncia dos dois duplos dupletos
centrados em 5,01 ppm (J22-21 ~ 8,0 Hz; J22-23 ~ 15,0 Hz) e 5,17 ppm (J23-24 ~ 8,0
Hz; J23-22 ~ 15,0 Hz) atribudos aos hidrognios vinlicos do estigmasterol em C20
e C21, respectivamente. Na faixa entre 0,69 ppm e 1,02 ppm podem ser vistos
os picos referentes as metilas presentes na molcula. So encontrados 3
dupletos (0,93 ppm, J = 6,4 Hz; 0,85 ppm, J = 6,8 Hz e 0,82 ppm, J = 6,7 Hz)
referentes aos hidrognios presentes nos carbonos C19, C26 e C27,
respectivamente, e um tripleto (0,87 ppm, J = 7,2 Hz) em C24. As contantes de
22

acoplamento esto na faixa de 6,4 Hz e 7,2 Hz, de acordo com o esperado para
metilas ligadas a carbonos secundrios e tercirios. Em 0,69 ppm e 1,02 ppm
podem ser encontrados dois simpletos referentes aos hidrognios nos carbonos
C28 e C29, os quais tem valor de integrao de 3 hidrognios.
Todos os dados foram confirmados atravs de comparao com a literatura
citada anteriormente. A Figura 9 e 10 mostra o espectro de RMN de 1H obtido e
suas regies ampliadas e a Tabela 4 rene todos os dados obtidos destes
espectros em comparao com dados da literatura.

0.050

1.02

0.045
0.040

0.69

0.035

0.010

3.62
3.59
3.56
3.54
3.51
3.49
3.46

0.005

2.30
2.27
2.24
2.05
1.99
1.88
1.83

0.015

0.94
0.86
0.77

0.020

1.48
1.30
1.19
1.18

1.59

0.025

5.38
5.35

Intensity

0.030 Chloroform-d

0
-0.005
1.00
7.0

6.5

6.0

5.5

1.10
5.0

4.5
4.0
3.5
Chemical Shift (ppm)

1.83
3.0

2.5

1.822.81
2.0

2.97 2.87

1.5

1.0

Figura 9 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em CDCl3 (200

MHz)

23

0.5

Pla-INS-33 1H (200MHz)2.esp

3.51
3.49

3.59

0.0010

3.46

3.62

Normalized Intensity

3.56

0.0015

3.54

0.0020

0.0005

1.10
3.70

3.65

3.60

3.55
3.50
Chemical Shift (ppm)

3.45

3.40

3.35

0.0045 Pla-INS-33 1H (200MHz)2.esp

0.0040

5.35

5.38

0.0035

Normalized Intensity

0.0030
0.0025
0.0020
0.0015
0.0010
0.0005
0
-0.0005
1.12
5.40

5.35

5.30

5.25
5.20
Chemical Shift (ppm)

5.15

5.10

5.05

Figura 10 - Ampliaes do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em

CDCl3 (200 MHz)

24

1.02

PLA-INS-33 1H (200MHZ)2.ESP
0.040

0.69

0.035

0.86
0.85
0.84
0.83
0.80
0.89

0.020

0.91

0.94

0.025

0.88

0.77
0.77

1.19
1.18

1.30

0.010

1.26

0.015

1.23
1.22

Normalized Intensity

0.030

0.005

2.97
1.35

1.30

1.25

1.20

1.15

1.10

1.05
1.00
0.95
0.90
Chemical Shift (ppm)

2.87
0.85

0.80

0.75

0.70

0.65

Figura 10 - Ampliaes do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em

CDCl3 (200 MHz)

C
03
06
19
24
26

sitosterol
1H

1H (YAHYA et al.,
1H (AHMED et
(CHATURVEDULA
2011)
al., 2013)
& PRAKASH, 2012)
3,53(1H; m)
3,53 (1H; m)
3,51(1H; m)
5,36(1H; d;
5,36 (1H; t;
5,34(1H; d;
J=4,8Hz)
J=6,4HZ)
J=5,2Hz)
0,93 (3H; d;
0,93 (3H; d;
0,83 (3H; d;
J=6,6Hz)
J=6,5Hz)
J=6,0Hz)
0,87 (3H; t;
0,84 (3h; t;
0,85 (3H; d;
J=7,7Hz)
J=7,2Hz)
J=8,0Hz)
0,85 (3H; d;
0,83 (3H; d;
0,83 (3H; d;
J=7,0Hz)
J=6,4Hz)
J=7,2Hz)

1H Pla-INS-33
3,54(1H; m)
5,36 (1H; d;
J=5,2 HZ)
0,93 (d;
J=6,4Hz)
0,87 (t;
J=7,2Hz)
0,85 (d;
J=6,8Hz)

25

0,81 (3H d;
J=7,0Hz)
1,02 (3H; s)
0,69 (3H; s)

27
28
29

0,81 (3H; d;
J=6,4Hz)
0,68 (3H; s)
1,01 (3H; s)

0,79 (3H; d;
J=7,2Hz)
0,67 (3H; s)
1,00 (3H; s)

0,82 (d;
J=6,7Hz)
0,69* (3H; s)
1,02* (3H; s)

Tabela 4. Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-33 em

comparao com a literatura
*Os dois valores podem estar trocados para literaturas diferentes.
5.3.2. Elucidao estrutural do composto Pla-INS-65
O

composto

Pla-INS-65

foi

inicialmente

analisado

atravs

de

espectrometria por infravermelho em pastilha de KBr. Atravs dessa anlise

podemos ver uma banda larga entre 3300 cm-1 e 3600 cm-1, o qual corresponde
a um grupo funcional OH ligado a carbono saturado. Entre 2800 cm -1 e 2950 cm1 h

outra banda larga, referente a grupo CH alifticos. Em 1692 cm-1 temos uma

banda intensa e fina, representando um grupo C=O de cido carboxlico. O

espectro pode ser observado na figura 11.
72

64

56

40
3435.21

%Transmittance

48

32

24

1692.53

2871.04

16

8
2926.01

0
3600

3400

3200

3000

2800

2600

2400 2200 2000 1800

Wavenumber (cm-1)

1600

1400

1200

1000

800

600

400

Figura 11 - Espectro infravermelho do composto Pla-INS-65

De acordo com as anlises de infravermelho, RMN de 1H e

13C,

DEPT 90

e 135, o triterpeno cido urslico (Figura 12) foi elucidado como provvel
composto presente em Pla-INS-65, conforme explicado a seguir.

26

Figura 12 - Estrutura do composto cido urslico

No espectro de RMN de 1H deste composto pode-se observar um duplo
dupleto centrado em 3,46 ppm caracterstico de triterpenos, referente ao
hidrognio ligado ao C3 com integrao para 1 hidrognio e constante de
acoplamento J = 6,6 e 9,4 Hz. Este duplo dupleto o que os diferencia de
esteroides. Observa-se ainda um simpleto de sinal amplo em 5,49 ppm atribudo
a hidrognio vinlico ligado ao carbono C12, um dupleto em 2,64 ppm (J = 11,7
Hz) atribudo ao hidrognio metnico ligado ao carbono C18, cinco simpletos em
1,22; 1,05; 0,88; 1,02 e 1,24 ppm com valor de integrao para 3 hidrognios,
referentes s metilas ligadas a carbonos no hidrogenados (C23; C24; C25; C26;
C27) e dois dupletos em 1,00 ppm (J = 6,3 Hz) e 0,94 ppm (J = 5,5 Hz) referentes
a hidrognios ligados aos carbonos C29 e C30 repectivamente, caractersticos
de um esqueleto ursano.
No espectro de RMN de

13C

podem ser observados sinais para 30

carbonos, sendo destacados os sinais mais deslocados em 78,21 ppm referente

ao carbono hidroximetnico (C3), 139,30 ppm e 125,69 ppm referentes aos
carbonos sp2 (C12 e C13), o sinal em 179,95 ppm referente a carbono de cido
carboxlico (C28). Os picos referentes aos carbonos das metilas (C23, C24, C25,
C26, C27, C29 e C30) se se concentram em deslocamento qumico menores, na
faixa de 15,72 ppm a 28,86 ppm. Os carbonos secundrios se concentram na
faixa de 23,57 ppm at 39,11 ppm, enquanto os carbonos tercirios tm
deslocamento qumico na faixa de 39,44 ppm e 55,86 ppm.
Atravs do espectro de DEPT 90 e DEPT 135 possvel concluir que tipo
de carbonos esto presentes na molcula a ser elucidada. O DEPT 90 identifica

27

apenas os carbonos tercirios (-CH), sendo formado um pico referente a cada

13C.

carbono, de acordo com os valores obtidos pelo espectro de RMN de

espectro de DEPT 135 tem o mesmo princpio, porm so encontrados dois tipos
diferentes de picos, sendo os picos negativos referentes a carbonos secundrios
(-CH2) e os picos positivos referentes a carbonos tercirios (-CH) ou primrios (CH3). Como os carbonos tercirios foram encontrados atravs do espectro de
DEPT 90, consegue-se distinguir os carbonos primrios no espectro de DEPT
135. Os carbonos quaternrios no aparecem nos dois espectros e podem ser
localizados por simples comparao com o espectro de RMN de

13C.

Os

resultados obtidos das anlises de DEPT para o composto em Pla-INS-65 podem

ser encontrados na tabela 6.
Atravs dos espectros de infravermelho, RMN de 1H, RMN de

13C,

DEPT

90 e DEPT 135 em comparao com a literatura (SEEBACHER et al., 2003; LEE

et al., 2005; UDDIN et al., 2011; PREZ et al., 2014; BABALOLA & SHODE,
2013) foi possvel concluir a elucidao estrutural do composto Pla-INS-65 como
sendo coerente para o cido urslico.
As Figuras 13, 14, 15, 16 e 17 mostram, respectivamente, os espectros de
RMN de 1H e ampliaes, RMN de

13C,

DEPT 90 e DEPT 135. As Tabelas 5, 6

1.02

e 7 renem os dados espectromtricos em comparao com a literatura citada.

1.24

1.0

0.88

0.9
0.8

Pyridine-d5
Pyridine-d5

0.7

7.19

8.71

0.4

2.14
2.12
2.11

2.65
2.62
2.32

0.2

3.47
3.46
3.43

5.49

0.3

0.84

1.97
1.94
1.83
1.55
1.37

0.5

7.56

Intensity

Pyridine-d5
0.6

0.1
0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

1.05

1.04

5.5

3.5

5.0
4.5
4.0
Chemical Shift (ppm)

0.96 1.06
3.0

2.5

3.13 3.32
2.0

1.5

1.0

Figura 13 - Espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

(200MHz)
28

2.65
2.62

5.49

0.15

3.47

Intensity

3.46
3.45
3.43

0.10

0.05

0.96

1.04

1.05
4.5

5.0

3.0

3.5

4.0
Chemical Shift (ppm)

0.88

0.9

1.05

1.24
1.22

1.02

5.5

1.00

0.8

0.99
0.95
0.94

0.6

0.1

1.28

1.37
1.34

0.84

0.2

2.14
2.12
2.11
2.09

0.3

1.55
1.53

1.83

1.97
1.94

0.4

1.65
1.62

0.5

2.35
2.33
2.32
2.30

Intensity

0.7

0
1.06
2.4

2.3

3.13
2.2

2.1

2.0

1.9

1.8

1.7
1.6
1.5
1.4
Chemical Shift (ppm)

1.3

1.2

3.17
1.1

1.0

3.32 3.04
0.9

0.8

Figura 14 - Regies ampliadas do espectro de RMN de 1H do composto PlaINS-65 em piridina-D5 (200MHz)

29

0.7

1H (UDDIN et al.,
2011)

03

3,43 (1H; br s)

12

23
24
25
26
27

5,50 (1H; br s)
2,52 (1H; d;
J=11,0Hz)
1,24 (3H; s)
1,02 (3H; s)
0,93 (3H; s)
1,05 (3H; s)
1,22 (3H; s)

29

0,97 (3H; s)

30

0,99 (3H; d;
J=6,1Hz)

18

cido Urslico
1H (PEREZ et al., 1H (BABALOLA &
2014)
SHODE, 2013)
3,49 (1H; dd; J=6,0;
3,43 (1H; br s)
10,0Hz)
5,52 (1H; s)
5,50 (1H; br s)
2,68 (1H; d;
2,52 (1H; d;
J=11,0Hz)
J=11,0Hz)
1,27 (3H; s)
1,24 (3H; s)
0,91 (3H; s)
1,02 (3H; s)
1,08 (3H; s)
0,93 (3H; s)
1,05 (3H; s)
1,05 (3H; s)
1,25 (3H; s)
1,22 (3H; s)
1,03 (3H; d;
0,97 (3H; s)
J=6,0Hz)
0,98 (3H; d;
0,99 (3H; d;
J=6,0Hz)
J=6,0Hz)

1H PLA-INS-65
3,46 (1H; dd;
J=6,6; 9,4Hz)
5,49 (1H; br s)
2,64 (1H; d;
J=11,7Hz)
1,22 (3H; s)
1,05 (3H; s)
0,88 (3H; s)
1,02 (3H; s)
1,24 (3H; s)
1,00 (3H; d;
J=6,3Hz)
0,94 (3H; d;
J=5,5Hz)

Tabela 5 - Dados do espectro de RMN de 1H do composto Pla-INS-65 em

comparao com a literatura

30

Pyridine-d5

149.90

123.56

Pyridine-d5

1.0

0.8

135.59

Intensity

0.9

0.7
0.6
0.5

78.16

125.69

179.95

0.2

139.30

0.3

17.50
16.63
15.72

55.86
53.59
48.09
42.54
40.01
39.53
39.42
37.32
28.86
23.96

0.4

0.1

170

160

150

140

130

120

70

80
90
100
110
Chemical Shift (ppm)

60

50

40

20

30

Normalized Intensity

39.44

78.16

125.69

1.0

55.85
53.58
48.08

PLA-INS-65_PIRIDINA_DEPT90(2).ESP

39.52

Figura 15 - Espectro de RMN 13C do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

0.5

-0.5

180

160

140

120

100
80
Chemical Shift (ppm)

60

40

20

Figura 16 - Espectro DEPT 90 do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

31

16.64
15.73

23.96
21.48
28.86

48.08
39.53
39.45

55.86
53.59
78.16

1.0

125.69

PLA-INS-65_PIRIDINA_DEPT135(2).ESP

Normalized Intensity

0.5

-0.5
18.82
23.68
24.96
28.17
31.11
33.62
37.49
39.12

180

160

140

120

100
80
Chemical Shift (ppm)

60

40

20

Figura 17 - Espectro de DEPT 135 do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

13C Pla-INS-65
39,11
28,16
78,16
39,42
55,86
18,82
33,62
40,01
48,09
37,32
23,67

cido Urslico
DEPT 90
CH
CH
CH
-

DEPT 135
CH2
CH2
CH
CH
CH2
CH2
CH
CH2
32

12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

125,69
139,30
42,54
28,73
24,96
48,09
53,59
39,53
39,44
31,11
37,49
28,86
16,63
15,72
17,50
23,96
179,95
17,57
21,47

CH
CH
CH
CH
-

CH
CH2
CH2
CH
CH
CH
CH2
CH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3

Tabela 6 - Dados espectrais de RMN de 13C junto aos de DEPT 90 e DEPT 135
do composto Pla-INS-65 em piridina-D5

C (SEEBACHER
et al., 2003)
39,2
28,2
78,2
39,6
55,9
18,8
33,7
40,1
48,1
37,5
23,7
13

C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

cido Urslico
13C (BABALOLA &
SHODE, 2013)
38,4
28,1
78,1
38,4
55,8
18,8
33,6
40,0
48,3
37,4
23,6

13C Pla-INS65
39,11
28,16
78,16
39,42
55,86
18,82
33,62
40,01
48,09
37,32
23,67
33

12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

125,7
139,3
42,6
28,8
25,0
48,1
53,6
39,5
39,4
31,1
37,4
28,8
16,5
15,7
17,5
24,0
179,7
17,5
21,4

125,6
139,7
42,5
28,7
24,9
48,0
53,5
39,5
39,1
31,1
37,3
28,8
15,7
16,6
17,4
23,8
180,0
17,5
21,4

125,69
139,30
42,54
28,73
24,96
48,09
53,59
39,53
39,44
31,11
37,49
28,86
16,63
15,72
17,50
23,96
179,95
17,57
21,47

Tabela 7 - Dados do espectro de RMN de 13C do composto Pla-INS-65 em

comparao com a literatura
Portanto, a partir da frao insolvel obtida do extrato bruto hidroalcolico
de P. latifolia, pode-se isolar o esteroide -sitosterol e um triterpeno, o cido
urslico.

34

6. CONCLUSES
O estudo fitoqumico e biolgico de Posoqueria latifolia permitiu obter as
seguintes concluses:
1. Aps a aplicao da marcha analtica preliminar ao extrato bruto,
observou-se que a espcie forneceu resultados positivos para compostos da
famlia dos alcaloides, esteroides, flavonoides, leucoantocianidinas e taninos.
2. A atividade antioxidante concentrou-se na frao acetato de etila obtida
do particionamento lquido-lquido do extrato bruto. Quanto a frao insolvel, o
fato de isolar-se compostos que no tem alta atividade antioxidante prova porque
o teste no rendeu bons resultados para essa frao.
3. A ao inibitria da acetilcolinesterase foi mais acentuada na frao
acetato de etila e frao insolvel, exibindo uma atividade inibitria maior que
50%. As fraes demonstraram menor atividade quando comparado com o
frmaco galantamina, porm incentivida a aplicao de outros testes devido a
alta atividade apresentada.
4. O fracionamento cromatogrfico da frao insolvel permitiu o
isolamento e identificao do esteroide - sitosterol e do triterpeno cido
urslico.
Os estudos fitoqumicos promovidos at o momento sobre a planta
renderam novos compostos para a taxonomia da espcie, mas sem ainda
possibilitar a descoberta de alcaloides. Porm, o estudo da frao rica em
alcaloides pode representar novos compostos a serem isolados e elucidados na
continuao deste projeto. Quanto aos efeitos biolgicos, embora os testes
apresentados no sejam to promissores, incentiva-se a aplicao de novos
testes com objetivos diferentes, de modo a ser observada em P. latifolia uma
provvel aplicao biolgica.

35

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AHMED, Y.; RAHMAN, S.; AKHTAR, P.; ISLAM, F.; RAHMAN, M.; YAAKOB,
Z. Isolation of steroids from n-hexane extract of the leaves of Saurauia roxburghii,
International Food Research Journal, 20(5): 2939-2943. 2013
AMES, B. N.; SHIGENAGA, M. K.; HAGEN, T. M. Oxidants, antioxidants,
and the degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 79157922. 1993
ARIZA, O.A.; PARRA, E.D.R.; ARCHILA, J.A.; MORALES, J.M.;
STASHENKO, E.E. Determinacin mediante hs-spme/gc-ms, de la composicin
qumica de la fragancia y el absoluto de las flores de Posoqueria latifolia.
Scientia Et Technica, XIII(33): 59-61. 2007
BABALOLA I.T., SHODE F.O. Ubiquitous Ursolic Acid: A Potential
Pentacyclic Triterpene Natural Product. Journal of Pharmacognosy and
Phytochemistry, 2(2): 214-222. 2013
CHAO, P.D.L.; SVOBODA, G.H. Two new iridoids from Posoqueria
latifolia. J. Nat. Prod., 43: 571-576. 1980
CHATURVEDULA, V.S.P.; PRAKASH, I. Isolation of Stigmasterol and Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus, International
Current Pharmaceutical Journal, 1(9): 239-242. 2012
CRONQUIST, A. An Integrated System of Classification of Flowering
Plants. New York: Columbia University Press, 1981.
DELPETRI, P.G.; SMITH, L.; KLEIN, R.M. Rubiaceas. Flora Ilustrada
Catarinense, 2005.
EISENHUT, M.; OMARI, A.; MACLEHOSE, H.G. Intrarectal quinine for
treating Plasmodium falciparum malaria: a systematic review. Malaria Journal,
4: 24. 2005
ELYA, B.; BASAH, K.; MUN'IM, A.; YULIASTUTI, W.; BANGUN, A.;
SEPTIANA, E.K. Screening of -glucosidase inhibitory activity from some plants
of Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, and Rubiaceae. Journal of
Biomedicine and Biotechnology, v.2012, doi:10.1155/2012/281078, 2012
FENNER, R.; BETTI, A.H.; MENTZ, L.A.; RATES, S.M.K. Plantas
utilizadas na medicina popular com potencial atividade antifngica. Rev. Bras.
Cienc. Farm., 42: 369-394. 2006
36

FERREIRA, A.B.H. Novo Dicionrio da Lngua Portuguesa. Segunda

edio. Rio de Janeiro: Nova Fronteira, 1986. 41
FERREIRA, J.C.; LEMOS, R.P.L.; CONSERVA, L.M. Chemical
constituents from Spermacoce verticillata (Rubiaceae). Biochemical
Systematics and Ecology, 44: 208-211. 2012
FORERO, L.E. Etnobotnica de las comunidades indgenas Cuna y
Waunana, Choc (Colombia). Cespedesia, 9(33-34): 115-301. 1980
FRANCIS, P. T.; PALMER, A. M.; SNAPE, M.; WILCOCK, G. K. The
cholinergic hypothesis of Alzheimers disease: a review of progress. J. Neurol.
Neurosurg. Psychiatry, 66: 137. 1999
HASEGAWA, M.; SASAKI, T.; SADAKANE, K.; TABUCHI, M.; TAKEDA,
Y.; KIMURA, M.; FUJII, Y. Studies for the emetic mechanisms of ipecac syrup
(TJN-119) and its active components in ferrets: Involvement of 5hydroxytryptamine receptors. Japanese Journal of Pharmacology, 89(2): 113119. 2002
HEINRICH, M.; TEOH, H.L. Galanthamine from snowdrop-the
development of a modern drug against Alzheimers disease from local Caucasian
knowledge. Journal of Ethnopharmacology, 92: 147162. 2004
IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold
Book"). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific
Publications,
Oxford
(1997).
XML
on-line
corrected
version:
http://goldbook.iupac.org (2006-) created by M. Nic, J. Jirat, B. Kosata; updates
compiled by A. Jenkins. ISBN 0-9678550-9-8.doi:10.1351/goldbook.
JOLY, A.B. Botnica Introduo Taxonomia Vegetal. 5ed. So
Paulo: Companhia Editora Nacional, 1979. 777 p.
KAMBOJ, A.; SALUJA, A.K. Isolation of stigmasterol and -sitosterol from
petroleum ether extract of aerial parts of Ageratum conyzoides (asteraceae),
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1): 9496. 2011
LEE T.; JUANG S.; HSU F.; WU C. Triterpene Acids from the Leaves of
Planchonella duclitan (Blanco) Bakhuizan. Journal of the Chinese Chemical
Society, 52: 1275-1280. 2005
LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquticas,
parasitas, txicas e medicinais. Nova Odessa, SP: Edio do Autor, 1982. 27137

272
MACIAS, L.F.N. Reviso taxonmica do gnero Posoqueria Aubl.
(Rubiaceae), 1988, 164 f. Tese (Mestrado em Biologia Vegetal) Curso de PsGraduao em Biologia, Universidade Estaduas de Campinas. Campinas, SP:
Instituto de Biologia, UNICAMP; 1988.
MACIAS, L.; KINOSHITA, L.S. Rubiaceae. In: MELHEM T. S. A.;
WANDERLEY M. G. L.; MARTINS S. E.; JUNG-MENDAOLLI S. L.;
SHEPHERD G. J.; KIRIZAWA M. (eds). Flora Fanerogmica do Estado de So
Paulo. Vol. 5. So Paulo: Fapesp, 2007.
MAGINA, M.D.; GILIOLI, A.; MORESCO, H.H.; COLLA, G.; PIZZOLATTI,
M.G.; BRIGHENTE, I.M.C. Atividade antioxidante de trs espcies de Eugenia
(Myrtaceae). Latin American Journal of Pharmacy, 29(3): 376-382. 2010
MAGINA, M.D.A., DALMARCO, E.M.; DALMARCO, J.B.; COLLA, G.;
PIZZOLATTI, M.G.; BRIGHENTE, I.M.C. Bioactive triterpenes and phenolics of
leaves of Eugenia brasiliensis. Qum. Nova, 35(6): 1184-1188. 2012
MARTINS, D.; CARRION, L.L.; RAMOS, D.F.; SALOM, K.S; SILVA,
P.E.A.; BARISSON, A.; NUNEZ, C.V. Triterpenes and the Antimycobacterial
Activity of Duroia macrophylla Huber (Rubiaceae). Biomed Research
International, 2013.
MATOS, F.J.A. Introduo Fitoqumica Experimental. 2ed. Fortaleza:
UFC, 1997, 17-23.
MCMURRY, J., Qumica Orgnica vol. 1. Editora CENGAGE Learning.
Traduo da 6 Edio Norte Americana, 2008. 193-194
MONTEIRO, J.M.; ALBUQUERQUEI, U.P.; ARAJO, E.L.; AMORIM,
E.L.C. Taninos: uma abordagem da qumica ecologia. Qum. Nova, 28(5): 892896. 2005
MOREIRA, V.F.; OLIVEIRA, R.R; MATHIAS, L.; BRAZ-FILHO, R.; VIEIRA,
I.J.C. New Chemical Constituents from Borreria verticillata (Rubiaceae).
Helvetica Chimica Acta, 93(9): 1751-1757. 2010
MORESCO, H.H.; QUEIROZ, G.S.; PIZZOLATTI, M.G.; BRIGHENTE,
I.M.C. Chemical constituents and avaluation of the toxic and antioxidant activities
of Averrhoa carambola leaves. Revista Brasileira de Farmacognosia, 22(2):
319-324. 2012

38

NOGUEIRA, L.J.; MONTANARI, C.A.; DONNICIA, C.L. Histrico da

evoluo da qumica medicinal e a importncia da lipofilia: de Hipcrates e
Galeno a Paracelsus e as contribuies de Overton e de Hansch. Revista Virtual
de Qumica, 1(3): 227-240. 2009
PEREIRA, M.S.; BARBOSA, M.R.V. A famlia Rubiaceae na Reserva
Biolgica Guaribas, Paraba, Brasil. Subfamlias Antirheoideae, Cinchonoideae
e Ixoroideae. Acta Bot. Bras., 18: 305-318. 2004
PREZ A.H.; BAH M.; ALVARADO C.I.; CRUZ J.F.R.; MOLINA A.R.;
MOLINA J.I.R.; LUNA J.A.C. Aortic Relaxant Activity of Crataegus gracilior Phipps
and Identification of Some of Its Chemical Constituents. Molecules, 19: 2096220974. 2014
PIETTA, P.G. Flavonoids as antioxidants. J. Nat. Prod., 63(7) 1.035-1.042.
2000
PRIOR R.; WU X.; SCHAICH K. Standardized methods for the
determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary
supplements. J. Agr. Food Chem., 53: 4290-4302. 2005
RIBEIRO, A.B. et al. Antioxidant capacity, total phenolic content, fatty acids
and correlation by principal component analysis of exotic and native fruits from
Brazil. J. Braz. Chem. Soc., 24(5): 797-804. 2013
RICE-EVANS, C.; MILLER, N.J.; PAGANGA, G. Structure-antioxidant
activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Rad. Biol. Med.,
20(7): 933-956. 1996
ROBBRECHT, E.; BLOCK, P.D.; DESSEIN, S.; STOFFELEN, P. National
Botanic Garden of Belgium Research. Monographic and systematic studies in
Rubiaceae
[cited
2013
october,
06];
Available
from:
http://www.br.fgov.be/RESEARCH/PROJECTS/rubiaceae.php.
SAMPAIO-SANTOS, M.I.; KAPLAN, M.A.C. Biosynthesis significance of
iridoids in chemosystematics. J. Braz. Chem. Soc. 12(2): 144-153. 2001
SEEBACHER W.; SIMIC N.; WEIS R.; SAF R.; KUNERT O. Complete
assignments of H and C NMR resonances of oleanolic acid, 18a-oleanolic acid,
ursolic acid and their 11-oxo derivatives, Magn. Reson. Chem., 41: 636638.
2003
SOTO-SOBENIS, A.; CASTILLO, B.; DELGADO, A.; GONZLEZ, A.;
MONTENEGRO, R. Alkaloid Screening of Herbarium Samples of Rubiaceae from
39

Panama. Pharmaceutical Biology, 39(3): 161169. 2001

SOUZA, R.K.D.; MENDONCA, A.C.A.M.; DA SILVA, M.A.P. Aspectos
etnobotnicos, fitoqumicos e farmacolgicos de espcies de Rubiaceae no
Brasil. Rev. Cubana Plant. Med., 18(1): 140-156. 2013
TAN, S.N.; YOUNG, J.W; TEO, C.C.; GE, L.; CHAN, Y.W.; HEW, C.S.
Determination of metabolites in Uncaria sinensis by HPLC and GC-MS after
green solvent microwave-assisted extraction. Talanta, 83(3): 891-898. 2011
TAYLOR, C.M.; STEYERMARK, J.A.; DELPRETE, P.G.; VICENTINI, A.;
CORTS, R.; ZAPPI, D.; PERSSON, C.; COSTA, C.B.; ANUNCIAO, E.A.
Rubiaceae. In: STEYERMARK, J.A.; STEYERMARK, J.S.; BERRY, P.E.; HOLST,
B.K. (Eds.): Flora of the Venezuelan guayana, 8: 497-848. St. Louis, USA:
Missouri Botanical Garden Press, 2004
UDDIN G.; WALIULLAH; SIDDIQUI B.S.; ALAM M.; SADAT A.; AHMAD
A.; UDDIN A. Chemical Constituents and Phytotoxicity of Solvent Extracted
Fractions of Stem Bark of Grewia optiva Drummond ex Burret. Middle-East
Journal of Scientific Research, 8(1): 85-91. 2011
VIEGAS JUNIOR, C.; BOLZANII, V.S.; FURLANI, M.; FRAGAII, C.A.M.;
BARREIROII, E.J. Produtos naturais como candidatos a frmacos teis no
tratamento do Mal de Alzheimer. Qum. Nova, 27(4): 655-660. 2004
YAHYA, M.A.A.; YAACOB, W.A.; NAZLINA, I. Isolation of chemical
constituents from rhizomes of etlingera sphaerocephala var. Grandiflora, The
Malaysian Journal of Analytical Sciences, 15(1): 22-26. 2011
ZAROTSKY V.; SRAMEK J.J.; CUTLER N.R. Galanthamine hydrobromide:
an agent for Alzheimers disease. Am. J. Health-System Pharmacist, 60: 446452. 2003

40