UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

AÇÃO DE EXTRATOS AQUOSO E ALCOÓLICO DE PRÓPOLIS SOBRE

Malassezia spp ISOLADAS DO CONDUTO AUDITIVO DE CÃES

ANA CAMILA TURINI RIBEIRO

Dissertação apresentada junto ao

Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária para obtenção do
título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Flávio Quaresma

Moutinho
 ii

Nome do Autor: Ana Camila Turini Ribeiro

Título: AÇÃO DOS EXTRATOS AQUOSO E ALCOÓLICO DE PRÓPOLIS SOBRE

Malassezia spp ISOLADAS DO CONDUTO AUDITIVO DE CÃES

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Flávio Quaresma Moutinho

Presidente e Orientador
Departamento de Clínica
FMVZ – UNESP – Botucatu/SP

Prof. Luiz Henrique de Araújo Machado

Membro
Departamento de Clínica
FMVZ – UNESP – Botucatu/SP

Prof. Dr. Carlos Artur Lopes Leite

Membro
Departamento de Medicina Veterinária
UFLA – Lavras/MG

Data da Defesa: 25 de julho de 2008.

 iii

Aos meus pais, ao meu marido Juliano, ao meu orientador

Prof. Dr. Flávio Quaresma, ao Prof. Dr. Carlos Artur
Lopes Leite e ao Prof. Dr. Geraldo Márcio da Costa,
dedico.
 iv

AGRADECIMENTOS:

Meus Pais: Apesar de não poderem frequentar escolas, souberam salientar

a importância dos estudos aos seus filhos e, acima de tudo, ensinaram a matéria
mais importante da vida que é a honestidade, a dignidade, a humildade e,
principalmente, o amor ao próximo.
Deus: O que seria do ser humano sem os ensinamentos Dele? As graças
que recebo diariamente e o dom de cuidar com amor dos animais devo a Ele.
Meu querido Juliano: Quem mais poderia mudar seus planos para realizar
sonhos de outra pessoa? Sempre me apoiou em tudo, e me fortaleceu nos
momentos mais difíceis sendo, além de marido, companheiro e amigo.
Irmãos, Cunhados, Sobrinhos e Sogros: A maior riqueza de uma pessoa é
ter uma família feliz, vivendo em harmonia e apoiando em todos os momentos da
vida.
Ao meu Bebê: Sei que está por vir, mas já quero deixar o agradecimento
pela sua existência e digo que faço tudo em minha vida pensando no seu futuro e
no orgulho que terá de mim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Flávio Quaresma: Você aceitou me orientar
depositando toda sua confiança em mim. Obrigada por tudo. Pretendo nunca
desapontá-lo.
Prof. Dr. Carlos Artur Lopes Leite (Prof. Cacá): Mesmo sem palavras para
expressar tudo o que você fez por mim, quero agradecer todo o apoio. Nunca
pensei em seguir uma carreira acadêmica, mas você abriu meus olhos para isso e
te devo todo esse projeto. Você e a Juliana são pessoas abençoadas por Deus e
sempre estarão em meus pensamentos e coração.
Prof. Dr. Geraldo Márcio da Costa e Dircéia: Tiveram toda a paciência
comigo ajudando em todo o processo laboratorial do meu projeto. Obrigada,
queridos amigos.
A toda família “Toca dos Bichos”: Que me ajudaram toda vez que precisei
me ausentar da clínica. Vocês são pessoas muito especiais.
 v

Meus queridos animais: O sonho de ser veterinária iniciou pelo amor que
senti por uma cachorrinha chamada “Lili”. Ela me ensinou o que é amar sem
querer nada em troca. Hoje, continuo meu crescimento intelectual graças a Pepita,
Bombom, Julieta, Chica, Nina, Perrito, Félix e Safira.
Obrigada aos anjos de luz que me acompanham em toda parte e me guiam
para o melhor caminho. Ao Dr. Rogério e à Profa. Dra. Aguemi.
Por fim, quero agradecer aos meus clientes pelas palavras de incentivo e
por todos que ajudaram, direta ou indiretamente, nesse momento tão importante
na minha vida.
 vi

LISTA DE TABELAS

Pág.
Tabela 1 - Principais compostos químicos encontrados na própolis. .... 7

Tabela 2 - Protocolo de diluição seriada para preparo de soluções de

própolis. ................................................................................ 20

Tabela 3 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia

spp frente a diversas concentrações aquosas de própolis. . 24

Tabela 4 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia

spp frente a diversas concentrações alcoólicas de própolis.
20

LISTA DE QUADROS E GRÁFICOS

Pág.
Quadro 1 - Ação da própolis sobre microrganismos diversos. ............... 9

Gráfico 1 - Comportamento das medidas de diâmetro dos halos de

inibição em teste de difusão em ágar usando extrato
alcoólico de própolis frente a cepas de Malassezia spp. .....
27
 vii

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1 - Pesagem do pó de própolis para preparo da solução-mãe

a 10% e posterior diluição em álcool etílico 96º. .................. 19

Figura 2 - Padronização da densidade leveduriforme por meio de

turbidimetria direta usando o cartão de Wickerham (escala 21
3+ de MacFarland). ..............................................................

Figura 3 - Preenchimento dos orifícios das placas de Petri com

solução diluída de extrato de própolis. .................................
22

Figura 4 - Distribuição das diluições dos extratos aquoso e alcoólico

de própolis para o teste de difusão em ágar. ...................... 23

Figura 5 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato

aquoso de própolis da cepa de Malassezia sp #33.
Observar a ausência de halos de inibição em torno dos
25
orifícios. ................................................................................

Figura 6 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato

alcoólico de própolis da cepa de Malassezia sp #27.
Observar os halos de inibição em torno de todos os
27
orifícios. ................................................................................
 viii

SUMÁRIO

Pág.

RESUMO ......................................................................................................... 1
ABSTRACT ..................................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 3
2. REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................... 4
2.1 - Própolis ................................................................................................. 4
2.1.1 - A história do uso da própolis ....................................................... 5
2.1.2 - Produção e consumo ................................................................... 6
2.1.3 - Composição ................................................................................. 6
2.1.4 - A própolis na nutrição humana ..................................................... 7
2.1.5 - Propriedades terapêuticas ........................................................... 8
A - Ação antimicrobiana ...................................................................................... 8
B - Ação anticancerígena .................................................................................... 8
C - Ação antioxidante .......................................................................................... 8
D - Ação cicatrizante e reparadora ...................................................................... 10
E - Ação anestésica e analgésica ........................................................................ 10
F - Ação imunestimulante .................................................................................... 10
G - Ação cardiovascular ...................................................................................... 10
H - Ação no tratamento dentário ......................................................................... 11
I - Ação no sistema respiratório ........................................................................... 11
J - Efeito repelente .............................................................................................. 11
H - Contra-indicações .......................................................................................... 11
2.1.6 - A própolis como antimicrobiano ................................................... 12
2.2 - Otite externa .......................................................................................... 13
2.3 - Malassezia spp e malasseziose ............................................................ 14
3. OBJETIVOS .................................................................................................. 18
3.1 - Principal ................................................................................................. 18
3.2 - Secundário ............................................................................................ 18
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 18
4.1 - Obtenção das culturas fúngicas ............................................................ 18
4.2 - Processamento inicial em laboratório ................................................... 18
 ix

Pág.

4.3 - Preparo da solução-mãe de própolis ..................................................... 19

4.4 - Diluições seriadas .................................................................................. 20
4.5 - Preparo das placas de Petri ................................................................... 20
4.6 - Teste de difusão em ágar ...................................................................... 20
4.7 - Preparo dos inóculos fúngicos ............................................................... 21
4.8 - Semeadura das cepas fúngicas e preenchimento dos orifícios ............. 22
4.9 - Mensuração dos halos de inibição e análise dos dados ........................ 22
5. RESULTADOS ............................................................................................. 23
6. DISCUSSÃO ................................................................................................ 28
7. CONCLUSÕES ............................................................................................ 30
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................... 30
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 31
 1

RIBEIRO, A.C.T. Ação de extratos aquoso e alcoólico de própolis sobre

Malassezia spp isoladas do conduto auditivo de cães. Botucatu, 2008. 47p.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Campus de Botucatu/SP, Universidade Estadual Paulista - UNESP.

RESUMO

A otite externa sempre foi um problema para cães, especialmente na

presença de quadros de malasseziose. As leveduras do gênero Malassezia são
patógenos oportunistas em potencial no microambiente ótico, podendo agravar
um quadro de otite externa quando as condições assim o permitirem. O controle
da população desses fungos normalmente é realizado com drogas de custo
razoável e por um período relativamente longo, podendo trazer efeitos colaterais
ao paciente. É nesse ponto que a medicina natural se faz relevante. A própolis,
um produto oriundo do processamento do pólen por abelhas da espécie Apis
melifera, possui notáveis efeitos sobre diversos microrganismos, incluindo fungos
leveduriformes. Por ser uma substância complexa e composta por diversas
frações antimicrobianas, é possível que sua ação também se estenda às
Malassezia spp. O objetivo desse trabalho foi verificar a eficácia de soluções
aquosa e alcoólica de própolis sobre Malassezia spp isoladas do ambiente ótico
de cães. Quarenta amostras de Malassezia spp foram avaliadas frente ao teste de
diluição em meio sólido, verificando-se o diâmetro dos halos de inibição e
correlacionando-os com um efeito inibitório sobre o crescimento. Conclui-se que
as soluções de própolis possuem efeito inibidor do crescimento in vitro de
Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães, sendo esta ação mínima no
extrato aquoso e maior em extrato alcoólico. Pode-se inferir, também, que o álcool
etílico 96º isoladamente possui efeito inibidor do crescimento in vitro de
Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães.

Palavras-chave: Própolis, Malassezia, Otite, Micologia, Cão.

 2

RIBEIRO, A.C.T. Action of aqueous and alcoholic propolis extracts on Malassezia

spp isolated from canine ear conduct. Botucatu, 2008. 47p. Dissertation (Master) –
Veterinary and Animal Science Medical Faculty, Campus Botucatu/SP, São Paulo
State University - UNESP, Brazil.

ABSTRACT

The external otitis has always been a problem for dogs, especially in the
presence of malasseziasis. The yeast of the genus Malassezia is a potential
opportunistic pathogen in the optical microenvironment and may aggravate the
external otitis when conditions so permit. The control of the population of these
fungi is usually done with reasonable cost of drugs, has a relatively long time and
may bring side effects to the patient. This is where natural medicine is relevant.
The propolis, a product comes from the processing of pollen by the bee Apis
melifera, has remarkable effects on different organisms, including yeast fungi. As a
substance composed of diverse and complex antimicrobial fractions, it is possible
that its action also extends to Malassezia spp. The aim of this study was to assess
the effectiveness of alcohol and aqueous solutions of propolis on Malassezia spp
isolated from the aural environment of dogs. Forty samples of Malassezia spp
were evaluated facing the test of agar dilution, whilst the diameter of halos of
inhibition and correlating them with an inhibitory effect on growth. It was concluded
that propolis extracts have inhibitory effect of the in vitro growth of Malassezia spp
from the canine ear conduct, with minimal action by the aqueous extract and more
accentuated action by alcohol extract. It is possible to infer also that the ethyl
alcohol 96º alone has inhibitory effect on the in vitro growth of Malassezia spp from
the canine ear conduct.

Key words: Propolis, Malassezia, Otitis, Micology, Dog

 3

1. INTRODUÇÃO

A otite externa é uma das afecções de maior prevalência na rotina clínica de

pequenos animais, possuindo características multifatoriais complexas e
estreitamente inter-relacionadas. A busca por um protocolo terapêutico ideal
ocorre de maneira uniforme e progressiva, variando desde métodos ortodoxos até
práticas de medicina não-convencional, como homeopatia e cromoterapia,
passando pela fitoterapia e terapia natural.
Apesar do desconhecimento do verdadeiro papel de levedura Malassezia em
ambientes óticos de cães sadios e otopatas, sabe-se que a sua superpopulação
impede a resolução de um quadro já instalado de otite (independentemente da
causa). Mesmo com o amplo arsenal antifúngico disponível no mercado, muitos
destes produtos possuem inconvenientes como alto custo, baixa segurança
biológica e/ou inocuidade devido à resistência do microrganismo.
É nesse ponto que o emprego da própolis, uma substância natural produzida
por abelhas, pode ser útil. Com reconhecidas funções terapêuticas e profiláticas
sobre diversos microrganismos, o uso de extratos de própolis pode proporcionar
auxílio no tratamento das otopatias em que Malassezia está presente. Todavia, se
faz necessário pesquisar a real eficácia desse produto contra leveduras,
vislumbrando um possível potencial no tratamento das otopatias em cães em que
a levedura se encontra presente.
 4

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 - Própolis

Nos últimos anos, a própolis tem conquistado faixas cada vez mais amplas
de adeptos, que a utilizam confiantes em seu poder terapêutico. Cientificamente
está comprovado que os produtos apícolas podem ser usados isoladamente ou
associados a produtos farmacêuticos, pois apesar de sua composição complexa,
eles se caracterizam por não apresentar substâncias tóxicas dada à capacidade
das abelhas em distinguir e só coletar substâncias naturais inofensivas
(SZEWCZAK & GODOY, 1982).
Segundo GHISALBERTI (1979) e BANKOVA et al (1989), dentre os
produtos apícolas como mel, geléia real e pólen, a própolis vem se destacando
tanto pelas suas propriedades terapêuticas (atividade antimicrobiana,
antiinflamatória, cicatrizante e anestésica) quanto pela possibilidade de aplicação
na indústria farmacêutica e alimentícia.
Os efeitos terapêuticos são atribuídos aos diversos compostos fenólicos
que compõem a própolis (GRANGE & DAVEY, 1990). Destes, os flavonóides
podem ser considerados os principais compostos, encontrando-se, ainda, alguns
ácidos fenólicos e seus ésteres, aldeídos fenólicos, álcoois e cetonas (BANKOVA
et al, 1983; BANKOVA et al, 1992).
De acordo com BANKOVA et al (1999) e MARCUCCI et al (2001), a
atividade antibacteriana da própolis é maior contra bactérias Gram-positivas, pela
ação dos flavonóides, ácidos e ésteres aromáticos presentes na resina, os quais
atuariam sobre a estrutura da parede celular desses microrganismos por meio de
um mecanismo de ação ainda não elucidado.
As propriedades biológicas da própolis estão diretamente ligadas à sua
composição química. Esse fato se torna o maior problema para o uso desta
substância em fitoterapia, tendo em vista que a sua composição química varia
com a flora da região e época da colheita, com a técnica empregada e com a
espécie da abelha produtora (RAMOS, 1995).
 5

As investigações sobre as propriedades antibióticas da própolis são

conduzidas na área médica e também veterinária, em que o produto tem
demonstrado uma eficiente atividade bacteriostática e bactericida em gêneros de
bactérias Gram-negativas e Gram-positivas diversas (BIANCHINI &
BEDENDO,1988).
ROJAS & LUGO (1988) demonstraram a presença de atividade antifúngica
do extrato alcoólico da própolis contra 23 amostras de leveduras do gênero
Candida isoladas de diferentes materiais biológicos, com ação fungistática na
concentração de 0,55mg/mL. Resultados similares também foram obtidos por
AZEVEDO et al (1999) ao trabalharem com Candida isolada da cavidade bucal de
pacientes humanos, hígidos e doentes.
A própolis é uma resina coletada por abelhas da espécie Apis mellifera de
diversas partes das plantas como botões florais, brotos, folhas e cascas das
árvores. Durante a coleta da própolis, as abelhas misturam a cera e a própolis
coletada, juntamente com enzimas presente na sua saliva, enriquecendo-a com
componentes próprios. Essa combinação tem propriedades antibacterianas e
produz efeitos fungicidas que servem para proteger a colméia contra doenças e
agentes climáticos (GREENWAY et al, 1990).
A própolis para consumo humano é extraída de colméias construídas de
madeira, em que o produto bruto sofre um processamento secundário para a
remoção da cera e de outras impurezas antes de ser aproveitado para os mais
diversos fins dentro da área de saúde (RAMOS, 1995).

2.1.1- A história do uso da própolis

A palavra própolis vem da língua grega pro (antes de) e polis (cidade), por
que os apicultores notaram que as abelhas construíam uma pequena parede de
própolis para proteger a entrada dianteira da colméia, que geralmente ficavam à
frente (antes de) das colônias (cidade) dos apicultores. Antigos textos gregos
referem-se à substância como um "curador para hematomas e chagas
suporadas". Em Roma, a própolis foi usada como emplastros para os mais
 6

diversos fins. A palavra própolis em dialeto hebraico é tzori, e suas propriedades

terapêuticas estão mencionadas por todo o Antigo Testamento. Registros
europeus datados do século XII descrevem preparados que tinham como sua
base principal a própolis para tratamento de infecções de boca e garganta, além
de cáries dentárias (GHISALBERTI, 1979).

2.1.2- Produção e consumo

Dentre os maiores produtores de própolis no mundo, podem ser incluídos a

China, o Brasil, os EUA, a Austrália e o Uruguai (RAMOS, 1995).
São tratadas por mês cerca de 200 toneladas de própolis finais para
consumo mundial. O Japão é um dos maiores consumidores de própolis como
complemento alimentar.
Na Nova Zelândia a produção anual de própolis é de 9,9 milhões de doses
diárias.

2.1.3- Composição

Pelo menos 180 compostos diferentes foram identificados até agora na

própolis. Uma lista das substâncias encontradas na própolis está descrita na
tabela 1.
Um dos elementos importantes farmacologicamente ativos presentes na
própolis são as flavonas, flavonol e flavanona (coletivamente chamados de
flavonóides), e vários compostos fenólicos.
Pelo menos 38 tipos de flavonóides são encontrados na própolis, incluindo
galangina, caempferol, quercetina, pinocembrina, artepeana e crisina (GRANGE &
DAVEY, 1990). Entre os fenólicos, podem ser encontrados álcool cinâmico, ácidos
anâmico e fenílico.
 7

Tabela 1 - Principais compostos químicos encontrados na própolis.

Classe de Composto Substâncias encontradas Quantidade (%)

Flavonóides, ácidos fenólicos e
Resinas 45-55
ésteres
Ceras e ácidos Cera e elementos de origem das
25-35
gordurosos plantas
Elementos essenciais
Voláteis 10
lubrificantes
Arginina e prolina (46%). Dezesseis
Pólen tipos de proteínas liberam os 5
aminoácidos
14 traços de elementos refrigerantes.
Outros elementos Ferro e zinco são os mais comuns.
orgânicos e Também são encontrados cetonas, 5
refrigerantes lactonas, quinonas, esteróides, ácido
benzóico, vitaminas e açúcares

A composição química da própolis é bastante variável devido à variedade

de vegetação produtora de pólen existente no momento do preparo.
Adicionalmente, a composição da própolis também é influenciada pelo tipo de
abelha que a produz (alguns constituintes da própolis, como os açúcares,
dependem do metabolismo dos próprios insetos).
De acordo com GREENWAY et al (1990), existem cerca de 67 espécies de
plantas principais que servem para a extração da própolis, como álamos, alders e
bétulas castanha e cinza, além de vários prunos e salgueiros. No Brasil ainda não
há uma descrição pormenorizada de floradas ou espécies vegetais constituintes
da própolis, estando cada própolis sujeita ao bioma em que as abelhas subsistem.

2.1.4 - A própolis na nutrição humana

A própolis possui valor nutricional direto, pois compreende pequenas

quantidades de proteínas, aminoácidos, elementos refrigerantes, açúcares e
vitaminas (A, B1, B2, B6, C e E). Porém, ela é utilizada na dieta de seres humanos
buscando-se o seu efeito terapêutico ou mesmo profilático (RAMOS, 1995).
 8

2.1.5 - Propriedades terapêuticas

A - Ação antimicrobiana

Devido à sua forte ação antimicrobiana, a própolis é utilizada como

"antibiótico natural". Estudos realizados por BANKOVA et al (1983), GRANGE &
DAVEY (1990) e BANKOVA et al (1999) demonstraram que a própolis possui
grande eficiência contra diversos microrganismos (quadro 1).

B - Ação anticancerígena

Desde 1992 estudos in vitro vêm sendo realizados com a própolis para o
combate e inibição do aumento do carcinoma de câncer de útero (RAMOS, 1995).
Em estudos in vitro empregando ratos, houve controle de células neoplásicas de
ovário, mama, colo uterino, pulmão e estômago.
A substância reagente isolada na própolis e responsável por esse efeito
modulador em neoplasias é conhecida como artepelina C, porém mais estudos
necessitam ser realizados para elucidar o verdadeiro papel dessa proteína na
gênese e desenvolvimento de neoplasias.

C - Ação antioxidante

Estudos da década de 1980 comprovaram que a própolis possui um

poderoso antioxidante natural, capaz de liberar radicais que protegem os lipídios e
compostos vitamínicos (como o ácido ascórbico) de serem oxidados ou destruídos
no organismo humano (RAMOS, 1995).
É provável que essa oxidação/destruição esteja envolvida em alterações
como doenças cardiovasculares, artrite, câncer, diabete melito, mal de Parkinson
e doença de Alzheimer.
 9

Quadro 1 - Ação da própolis sobre microrganismos diversos.

MICRORGANISMO AÇÃO
BACTÉRIAS

Bacillus subtilis Destruição da célula

Bacillus larvas Destruição da célula

Bacteroides nodosus Destruição da célula

Escherichia coli Inibição no crescimento

Helicobacter pylori Inibição no crescimento

Klebsiella pneumoniae Inibição no crescimento

Mycobacterium tuberculosis Inibição no crescimento

Salmonella spp Tratamento em potencial

Staphylococcus spp Inibição no crescimento

S. aureus Redução no crescimento

S. aureus multi-resistentes Inibição no crescimento

Streptococcus spp Inibição no crescimento

Streptomyces spp Inibição no crescimento

S. sobrinus,S. mutans, S.cricetus Inibição no crescimento

FUNGOS

Ascosphaera apis Inibição no crescimento

Aspergillus niger Inibição no crescimento

Botrytis cinerea Inibição no crescimento

Candida albicans Redução no crescimento

Saccharomyces cerevisiae Redução no crescimento

VÍRUS

Herpes Inibição no crescimento

Doença de Newcastle Redução no crescimento

Vírus da batata Inibição no crescimento

PROTOZOÁRIOS

Giardia lamblia Inibição no crescimento

 10

D - Ação cicatrizante e reparadora

A própolis tem se mostrado um grande estimulante para diversas enzimas

do corpo humano responsáveis pelo metabolismo, circulação sanguínea e
formação de colágeno. Também foi documentada a melhor recuperação de
feridas provocadas por queimaduras. Acredita-se que o resultado satisfatório nos
tratamentos reepitelizantes seja devido a uma substância encontrada na própolis
e denominada arginina (CRISAN et al, 1995).

E - Ação anestésica e analgésica

Alguns agentes contidos na própolis propiciam efeito anestésico. Isso

explica por que a própolis é usada há séculos no tratamento de dores de garganta
e feridas de qualquer extensão.
Essa substância é amplamente utilizada desde 1984, em forma de pomada
anestésica/analgésica, no tratamento dentário.

F - Ação imunestimulante

Estudos realizados no Japão demonstraram que a própolis ajuda a

estimular o sistema imunológico em seres humanos, ativando células que
produzem citocinas (GHISALBERTI, 1979).
Isso ajuda a explicar o efeito que a própolis produz na redução de tumores
e também como coadjuvante natural na repressão do vírus da imunodeficiência
adquirida humana (HIV).

G - Ação cardiovascular

A própolis tem ação redutora da pressão arterial e produz um efeito

 11

calmante. Os diidroflavonóides contidos na própolis auxiliam no combate à

hipertensão.
H - Ação no tratamento dentário

A própolis também é muito utilizada para tratamentos dentários, atuando

como uma proteção no esmalte dos dentes (além do seu efeito analgésico, citado
anteriormente).
Diluída em água e com seu uso feito através de bochechos, ela reduz o
crescimento de microrganismos bucais e promove a prevenção de cáries.
Também é bastante recomendada para o tratamento de gengivites,
reduzindo as hemorragias e auxiliando na remoção da placa bacteriana
(AZEVEDO et al, 1999).

I - Ação no sistema respiratório

A própolis também demonstrou efeitos positivos no tratamento de

bronquites crônicas, rinites alérgicas, faringites e rinofaringolaringites, além de
atuar como expectorante natural quando há formação de catarro (AZEVEDO et al,
1999).

J - Efeito repelente

Com os últimos surtos de dengue no Brasil, estudos realizados pelo biólogo

Gilvan Barbosa Gama (Florianópolis/SC), revelaram que a própolis, ao ser
ingerida em intervalos constantes pelo ser humano, possui efeito repelente do
vetor da doença, podendo ser útil no controle dessa endemia no país.

H - Contra-indicações

O uso da própolis não apresenta contra-indicações para seres humanos e

animais. (RAMOS, 1995).
São raríssimas as reações adversas à própolis e que estão documentadas
 12

na literatura mundial. Esse produto é considerado pela medicina, desde os tempos

remotos, como um agente benéfico para a saúde, sem a presença de efeitos
desagradáveis ou indesejáveis.

2.1.6 - A própolis como antimicrobiano

Existem diversas preparações de extratos de própolis descritas na literatura

científica e leiga, variando de acordo com o agente diluente, a concentração do
solvente e do soluto e o período de extração. Como não há uma padronização na
confecção desses extratos, os resultados obtidos com testes antimicrobianos são
os mais diversos e antagônicos possíveis.
Os trabalhos que testaram a eficácia dos efeitos da própolis utilizaram esse
produto em forma de tintura e, geralmente, em porcentagens altas (acima de 20-
30%).
Em 1999, FRANCO & BUENO propuseram que para a obtenção de um
extrato de própolis adequado, a concentração mais consistente é de 10%, tendo
como líquido extrator o álcool etílico 93,7º.
SZEWCZAK & GODOY (1982), através de estudos que utilizaram
preparações somente com etanol 96º em diferentes temperaturas, e preparações
que misturavam o etanol 96º com propilenoglicol e éter etílico, constataram que a
temperatura e a técnica de preparo das tinturas constituem fator importante na
ação inibidora da própolis ao Staphylococcus. Esses autores colocam, ainda, que
os solventes utilizados no preparo das tinturas não exerceram ação inibidora
sobre os microrganismos do estudo.
Em uma avaliação laboratorial buscando as propriedades antimicrobianas
da própolis sobre bactérias (especialmente Escherichia coli, Pseudomonas spp e
Staphylococcus aureus), ENDLER et al (2003) utilizaram extratos aquosos e
alcoólicos com diluições entre 15 e 30%. Os resultados obtidos naquela pesquisa
demonstraram que a solução alcoólica de própolis foi eficiente no controle de
bactérias patogênicas das vias respiratórias em ambas as diluições. Os autores
colocam, ainda, que o álcool isoladamente não exerceu influência na inibição da
 13

levedura, exceto quando presente associado à própolis.

No trabalho realizado por LONGHINI et al (2007), os resultados obtidos
mostraram que a própolis apresenta atividade antifúngica mesmo em quantidades
muito pequenas. Observou-se a inibição de vários tipos de leveduras até a
diluição de 1:256 (cerca de 0,04mg/mL), com concentrações de própolis variando
entre 5% e 30% e utilizando álcool etílico 93,7º.
Segundo CRUZ (1992), o extrato alcoólico de própolis apresenta atividade
antifúngica na concentração de 1,25g/mL, no entanto, apresenta apenas atividade
inibitória parcial para o desenvolvimento de leveduras nas concentrações
estudadas 1,25g/mL, 2,5g/mL e 5g/mL.
VARGAS NETO (2004), verificou o efeito antifúngico da própolis sobre
leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal. Nesse estudo foi
utilizada tintura de própolis a 30 % e dentre outros extratos fitoterápicos testados,
a própolis foi a mais eficaz, inibindo o crescimento de 72,2% das amostras.
A aplicação da própolis nos diversos segmentos da medicina é ampla,
porém não existem estudos conclusivos sobre a sua ação antifúngica em
Malassezia spp presente no conduto auditivo de cães. Uma pesquisa conduzida
por SILVA et al (2006) revelou ter a própolis um forte efeito inibitório sobre o
crescimento de Malassezia spp isoladas de condutos auditivos de cães, atingindo
concentração inibitória mínima (CIM) de 1:20 (extrato aquoso) e 1:40 (extrato
alcoólico). A diferença encontrada entre os dois extratos provavelmente se deu,
segundo os autores, devido à interferência do álcool sobre as leveduras.

2.2 - Otite externa

As otites, ou afecções do sistema vestibulococlear, são afecções comuns

na rotina veterinária de pequenos animais, respondendo por 5-20% dos casos
atendidos (MULLER et al, 1989). Dependendo do quadro clínico apresentado,
muitos pacientes padecem da enfermidade por anos, ou até mesmo são
conduzidos à eutanásia devido à gravidade da doença e a não-resposta da
otopatia frente aos procedimentos terapêuticos instaurados (CARLOTTI, 1991).
 14

A otite externa pode ser conceituada como uma inflamação (aguda ou

crônica) do meato acústico externo com o envolvimento de diferentes agentes
etiológicos (LEITE et al, 2003).
Segundo AUGUST (1993), existem três grupos de fatores relevantes em
otopatias que devem ser considerados, sendo eles: primários, predisponentes e
perpetuantes.
Os fatores perpetuantes são representados por agentes oportunistas ou
alterações estruturais progressivas do próprio sistema vestibulococlear. Os
principais representantes desse grupo são microrganismos como fungos
filamentosos (exceto o grupo dos dermatófitos) e leveduriformes, além de
bactérias diversas.
Os fungos estão presentes tanto na microbiota normal quanto na alterada
de caninos otopatas (LEITE, 1995). Dois grandes grupos são encontrados no
ambiente auricular: os fungos filamentosos e os leveduriformes (incluindo os
chamados fungos dimórficos). A flora fúngica do conduto auditivo enfermo de
caninos é variável (MULLER et al, 1989) e muita controvérsia tem sido levantada
com relação ao verdadeiro papel destes microrganismos na patogênese das
otites.
As otites fúngicas primárias são raras em animais domésticos, e quando
ocorrem, são causadas por Candida spp e Malassezia pachydermatis
(JUNGERMAN & SCHWARTZMAN, 1972). Outras leveduras e fungos dimórficos
também estão presentes no ambiente auricular de caninos otopatas.
SAPATERRA & LEITE (1997) apontaram Malassezia pachydermatis, Candida spp
e Geotrichum spp (este último um fungo dimórfico) como elementos microbianos
leveduriformes presentes em caninos não-otopatas.

2.3 - Malassezia spp e Malasseziose

As primeiras descrições do gênero Malassezia ocorreram há mais de um

século (EICHSTED, 1846). Essa levedura foi isolada pela primeira vez do meato
acústico externo de cães por Gustafson em 1955 (AKERSTEDT & VOLLSET,
 15

1996).
Em 1925, WEIDMAN isolou de lesões de pele de rinocerontes indianos
uma levedura lipofílica não-dependente com gemulação unipolar em formato de
"garrafa", sendo primeiramente denominada como Pityrosporum pachydermatis,
posteriormente P. canis e, atualmente, conhecida como Malassezia
pachydermatis (CHANG, 1998).
Em seres humanos, as leveduras do gênero Malassezia estão relacionadas
aos quadros patológicos como pitiríase versicolor, dermatite seborréica e
dermatite atópica, que anteriormente eram apenas associados à espécie
Malassezia furfur (SCHLOTTFELDT et al, 2002).
Os microrganismos do gênero Malassezia pertencem à família
Cryptococcaceae, classe Blastomyces e subdivisão Deuteromycotina. A
classificação taxonômica de Malassezia (inicialmente Pytirosporum) foi revista por
GUÉHO et al em 1996, possuindo atualmente sete espécies: M. furfur, M.
globosa, M. obtusa, M. pachydermatis, M. restricta, M. slooffiae e M. sympodialis.
A M. pachydermatis é considerada um habitante normal e patógeno
oportunista do meato acústico externo de mamíferos, também podendo ser
encontrada no reto, região interdigital, tegumento, sacos anais e vagina (KENNIS
et al,1996; BOND et al, 2000; NASCENTE et al, 2004).
As diferenças em sua densidade populacional em determinadas regiões do
organismo, podem ser reflexos de alterações impostas aos hospedeiros, como
mudanças nas condições físicas, químicas e/ou imunológicas do animal
(CRESPO et al, 2002). Dessa maneira, os principais fatores condicionantes da
malasseziose são terapia antibacteriana prolongada, uso de substâncias
glicocorticóides, estados de hipersensibilidade (alergias), distúrbios da
ceratinização (seborréia), distúrbios nutricionais ou hormonais e enfermidades
intercorrentes (como neoplasias).
A detecção de fungos leveduriformes pode ser feita pela observação
microscópica direta do material suspeito (WHITE, 1992) e cultura dos agentes em
meios especiais (HUANG & LITTLE, 1993).
SALCEDO (1980) e HUANG & LITTLE (1993) sugeriram que a cultura do
 16

fungo deve ser feita em meios contendo uma fonte lipídica como promotora de
crescimento, já que o fungo não se desenvolve satisfatoriamente em meios
micológicos simples. Esses autores aconselharam a adição de ácidos graxos
constituintes do cerúmen canino (ácidos esteárico, linoléico, margárico e oléico)
como lipídios preferenciais na preparação do meio de cultura. Para a produção de
energia, as leveduras do gênero Malassezia utilizam, preferencialmente, lipídios
como fontes de carbono, ou seja, são microrganismos lipodependentes. Isso faz
com que o substrato em que se desenvolvem seja caracterizado por uma alta
concentração de ácidos graxos de cadeias longas (COUTINHO, 2002). Entretanto,
M. pachydermatis é a única exceção no grupo, pois embora lipofílica, não é
lipodependente. O acréscimo de ácidos graxos ao meio de cultura usado para o
isolamento de M. pachydermatis apenas estimula o seu desenvolvimento, mas a
ausência dessas fontes lipídicas não impede o seu crescimento (COUTINHO,
2002).
O isolamento da levedura é realizado em meio de cultivo com ágar
Sabouraud ou ágar malte. A temperatura de incubação varia entre 25º e 41ºC por
24 a 48 horas (AKERSTEDT & VOLLSET, 1996). As colônias são opacas, de
coloração amarelo-creme, passando à marrom-alaranjado conforme o
envelhecimento; a superfície é redonda e a medida transversal é de 1-3mm; a
textura é seca, friável, granulosa e, algumas vezes, gordurosa (GUILLOT et al,
1996).
A detecção de Malassezia em exsudato de ouvidos enfermos é variável. As
diferenças entre os métodos de detecção do microrganismo fazem com que a
prevalência do fungo não seja a mesma nos diversos estudos. Entretanto, como
regra geral, a concentração dessa levedura no conduto auditivo é sempre mais
baixa naqueles caninos que não apresentam otopatia clinicamente detectável
(LEITE, 2003).
Por serem consideradas leveduras patogênicas oportunistas, Malassezia
spp possuem alto poder de infectividade, aumentando acentuadamente o número
de células fúngicas em animais que apresentem condições de umidade e calor no
meato acústico externo e na pele, assim como em casos de distúrbios
 17

imunológicos (FRASER, 1965; AIZAWA et al, 1999).

Considerando a complexidade do quadro clínico, é fundamental tratar a
causa-base, porém é importante um tratamento eficaz para a malasseziose para
essa não se tornar um fator perpetuante da otite externa (LOBELL et al, 1995;
MOTA et al, 2000; MACHADO et al, 2003; NASCENTE et al, 2005).
A Malassezia pachydermatis é uma levedura isolada de meato acústico
externo hígido de cães, assim como do inflamado, pois prolifera quando este
microambiente sofre alterações que permitam o seu desenvolvimento seletivo. As
condições que levam à produção excessiva de cerúmen ou aumento do pH no
interior do meato acústico (infecções bacterianas) favorecem o desenvolvimento
dessa levedura (WOODY & FOX, 1987).
O significado da Malassezia na etiologia da otite externa foi questionado
durante muito tempo, mas atualmente já se conhece melhor o seu papel na
patogênese dessa enfermidade (XAVIER E NASCENTE, 2003).
Embora a otite externa não represente uma ameaça à vida do animal, é
dolorosa e requer tratamento imediato. Porém, a resposta ao tratamento eleito
pode ser complicada devido à etiologia multifatorial que concorre para o
estabelecimento desta enfermidade. O sucesso no tratamento requer a
identificação e, se possível, a eliminação de todos os fatores envolvidos (BALBI &
RAMADINHA, 1994).
O uso indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos
tem levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a
esses compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma
alternativa eficaz e econômica (CRISAN et al, 1995). É nesse sentido que a
própolis pode ser benéfica como coadjuvante na terapia de otopatias externas
cujo envolvimento de M. pachydermatis esteja patente.
 18

3. OBJETIVOS

3.1 - Principal

Testar a capacidade antimicrobiana de extratos aquoso e alcoólico de

própolis sobre Malassezia spp isoladas do conduto auditivo de cães.

3.2 - Secundário

Verificar se o álcool utilizado no preparo dos extratos de própolis (como

agente de diluição da substância-base) possui alguma interferência na possível
eficácia contra Malassezia spp.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 - Obtenção das culturas fúngicas

Foram isoladas 40 amostras de Malassezia spp, obtidas a partir de

condutos auditivos de cães atendidos no Hospital Veterinário do Departamento de
Medicina Veterinária da Universidade Federal de Lavras (HV-DMV/UFLA), em
Lavras/MG.
O cerúmen foi colhido por meio de swabs estéreis, introduzidos no conduto
auditivo até a transição anatômica entre porções vertical e horizontal (“joelho” ou
“cotovelo” do ouvido). O material colhido foi imediatamente semeado em placas
com ágar Sabouraud modificado (ASM) acrescido de cloranfenicol (50µg/ml -1).

4.2 - Processamento inicial em laboratório

Ao chegar ao Laboratório de Micologia do DMV/UFLA, as placas semeadas

foram incubadas a 33°C por 48-72 horas, em busca de crescimento leveduriforme.
 19

As colônias compatíveis com Malassezia (colônias foscas, com aspecto cremoso

branco-fosco e textura macia e friável) foram repicadas em placas contendo ASM,
e novamente incubadas a 33°C por 48-72 horas.

4.3 - Preparo da solução-mãe de própolis

O extrato seco moído de própolis foi adquirido no Departamento de

Engenharia Florestal da Universidade Federal de Lavras (DEF/UFLA),
basicamente oriundo de florada de eucaliptos e mata nativa regional.
O pó de própolis foi diluído em álcool etílico 96° na proporção de 20mg de
pó para cada 120mL de álcool (solução-mãe a 10%), inicialmente por maceração
e depois com o auxílio de bastão de vidro (figura 1). Após um período de 24
horas, a solução passou por coagem em papel de filtro n°40 e posterior
estocagem em frascos de cor âmbar, mantidos sob refrigeração (4-6°C).

Figura 1 - Pesagem do pó de própolis para preparo da solução-mãe a 10% e posterior diluição em

álcool etílico 96º. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
 20

4.4 - Diluições seriadas

A solução de própolis passou por diluições de 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25 %
e 0,625%, distribuídas em tubos de ensaio estéreis 20x150mm, conforme disposto
na tabela 2.
Cada amostra leveduriforme foi testada frente a duas baterias distintas, de
acordo com o diluente utilizado: água destilada estéril ou álcool 96º.
O grupo-controle foi composto por tubos contendo álcool etílico 96° a 60%
e água destilada estéril.

Tabela 2 - Protocolo de diluição seriada para preparo

de soluções de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG,
2008.

CONCENTRAÇÃO PRÓPOLIS DILUENTE*

(%) (mL) (mL)
20 2,0000 8,0000
10 1,0000 9,0000
5 0,5000 9,5000
2,5 0,2500 9,7500
1,25 0,1250 9,8750
0,625 0,0625 9,9375
* Álcool ou Água Destilada

4.5 - Preparo das placas de Petri

Para realização do método de difusão em meio sólido, foram utilizadas

placas de Petri contendo 25mL de ASM, em cuja superfície foram confeccionados
sete orifícios de 5mm de diâmetro com o auxílio de uma pipeta de Pasteur estéril,
em espaçamento regular.

4.6 - Teste de difusão em ágar

O teste de difusão em ágar foi realizado de acordo com o método

recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute, com algumas
 21

modificações (CLSI, 2006).

Essa prova é baseada na presença ou ausência de um halo de inibição,
considerando o diâmetro do halo em milímetros. Esse método é rotineiramente
utilizado para determinar a sensibilidade de microorganismos patógenos aos
antibióticos.

4.7 - Preparo dos inóculos fúngicos

As cepas testadas foram provenientes de inóculos de 48 horas, oriundos das

culturas de estoque. Por meio de um alça de platina, foram realizadas diluições do
microrganismo em tubos de ensaio contendo salina fisiológica estéril, até se
alcançar a concentração 3+ da escala de McFarland utilizando o cartão de
Wickerham (figura 2). Esse procedimento visou padronizar a densidade fúngica,
evitando uma possível interferência do número de microrganismos na formação
do halo de inibição.

Figura 2 - Padronização da densidade leveduriforme por meio de

turbidimetria direta usando o cartão de Wickerham (escala 3+ de
MacFarland). DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.
 22

4.8 - Semeadura das cepas fúngicas e preenchimento dos orifícios

Com o auxílio de um swab estéril, cada inóculo de levedura foi semeado em

duplicata nas placas de Petri contendo ASM. Após a semeadura, e com o auxílio
de uma micropipeta, foram adicionados em cada orifício, 50 a 80µL das diluições
de própolis (figura 3). Para cada levedura semeada em duplicata, foi montada
uma placa com uma série alcóolica e outra com uma série aquosa (figura 4). Em
seguida, as placas foram incubadas por 48-72 horas à temperatura de 33ºC.

Figura 3 - Preenchimento dos orifícios das placas de Petri com

solução diluída de extrato de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.

4.9 - Mensuração dos halos de inibição e análise dos dados

Após incubação das placas, foi realizada a mensuração, em milímetros (por

meio de um escalímetro digital), dos halos de inibição de cada orifício e anotados
para posterior comparação.
Para maior fidelidade estatística, foram utilizados testes não-paramétricos,
pressupondo-se o desconhecimento da distribuição das variáveis na população
estudada (em qualquer nível de mensuração).
 23

As análises estatísticas foram realizadas pelo Teste do Qui-quadrado

(AYRES & AYRES Jr., 1987), utilizando quatro apresentações de acordo com o
número da amostra e de categorias, além das freqüências esperadas.

Sentido da leitura

0,625% Controle
1,25% composto apenas
2,5% por
5% água destilada
10% estéril
20% ou
Controle álcool 96º

Figura 4 - Distribuição das diluições dos extratos aquoso e alcoólico de própolis para o teste de
difusão em ágar. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.

5. RESULTADOS

Nas tabelas 3 e 4 estão dispostos os dados de mensuração dos halos de

inibição para as baterias aquosa e alcoólica, respectivamente.
O extrato aquoso de própolis exerceu efeito inibidor do crescimento em 23
amostras (57,5% da população) na concentração a 20%, e em duas cepas (5% da
população) na concentração a 10%; nas demais diluições de própolis, não houve
nenhuma interferência no crescimento da levedura. Na figura 5 pode-se observar
amostra que não apresentou nenhuma formação de halo de inibição, atestando a
ausência de efeitos das diluições aquosas de própolis usadas neste experimento
com relação às Malassezia spp.
 24

Tabela 3 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia spp frente a diversas
concentrações aquosas de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.

CONCENTRAÇÃO DE PRÓPOLIS (%)

CEPA
CTR-H 20 10 5 2,5 1,25 0,625
1 0 10 0 0 0 0 0
2 0 11 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0
4 0 11 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0
6 0 10 0 0 0 0 0
7 0 9 0 0 0 0 0
8 0 10 0 0 0 0 0
9 0 8 0 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0 0 0
11 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0
15 0 10 0 0 0 0 0
16 0 10 0 0 0 0 0
17 0 0 0 0 0 0 0
18 0 0 0 0 0 0 0
19 0 11 0 0 0 0 0
20 0 11 0 0 0 0 0
21 0 0 0 0 0 0 0
22 0 0 0 0 0 0 0
23 0 11 0 0 0 0 0
24 0 0 0 0 0 0 0
25 0 0 0 0 0 0 0
26 0 0 0 0 0 0 0
27 0 0 0 0 0 0 0
28 0 7 0 0 0 0 0
29 0 9 7 0 0 0 0
30 0 11 0 0 0 0 0
31 0 10 0 0 0 0 0
32 0 9 0 0 0 0 0
33 0 11 0 0 0 0 0
34 0 0 0 0 0 0 0
35 0 10 8 0 0 0 0
36 0 8 0 0 0 0 0
37 0 0 0 0 0 0 0
38 0 12 0 0 0 0 0
39 0 12 0 0 0 0 0
40 0 10 0 0 0 0 0
Média 0,00 8,50 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
DP 0,00 5,12 1,66 0,00 0,00 0,00 0,00
 25

CTR-H = Controle aquoso; DP = Desvio-padrão

Figura 5 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato

aquoso de própolis da cepa de Malassezia sp #33. Observar a
ausência de halos de inibição em torno dos orifícios. DMV/UFLA,
Lavras/MG, 2008.

As 40 amostras de Malassezia spp testadas foram inibidas pela solução

alcóolica de própolis, principalmente em altas concentrações (Figura 6). Apenas
oito amostras (20,0% do total) apresentaram crescimento em diluição de 1,25% e
12 amostras (30,0% da amostragem) apresentaram crescimento na solução de
própolis 0,625%.
Os halos de inibição apresentaram maior diâmetro conforme ocorria
aumento da porcentagem da solução alcóolica de própolis (gráfico 1). Em alguns
casos, ocorreram diâmetros maiores que os obtidos para o controle, constituído
apenas por álcool (figura 6).
 26

Tabela 4 - Diâmetro dos halos de inibição (em mm) de Malassezia spp frente a diversas
concentrações alcoólicas de própolis. DMV/UFLA, Lavras/MG, 2008.

CONCENTRAÇÃO DE PRÓPOLIS (%)

CEPA
CTR-A 20 10 5 2,5 1,25 0,625
1 13 18 13 13 11 10 9
2 11 13 13 11 9 10 0
3 8 12 11 9 9 10 8
4 8 14 13 13 11 11 10
5 9 11 10 10 12 9 0
6 10 15 11 10 10 11 11
7 8 13 10 11 10 0 0
8 9 17 14 11 12 0 0
9 7 12 12 11 9 7 0
10 10 15 12 10 9 13 10
11 10 17 12 11 10 9 11
12 8 14 9 9 8 0 0
13 9 14 11 9 10 0 0
14 8 12 10 10 9 8 0
15 11 15 11 10 12 0 0
16 8 15 13 13 11 9 10
17 9 17 14 15 12 0 10
18 8 16 10 10 11 9 9
19 9 14 12 12 12 10 11
20 10 15 12 12 12 9 9
21 10 12 12 10 10 10 8
22 10 14 10 10 8 10 10
23 7 14 10 10 11 9 9
24 7 14 12 9 10 0 0
25 7 12 8 9 9 0 0
26 9 14 8 8 7 8 7
27 8 14 12 8 8 8 7
28 7 14 11 10 10 7 0
29 10 15 11 11 7 9 10
30 8 15 13 11 9 10 8
31 7 13 10 11 8 8 0
32 7 14 13 13 8 11 8
33 8 12 11 12 9 9 9
34 7 15 12 12 8 8 9
35 7 13 12 14 11 6 7
36 8 12 10 10 8 8 8
37 8 12 11 13 8 7 7
38 9 15 14 13 11 10 9
39 8 15 14 15 10 10 10
40 10 17 16 11 8 8 9
Média 8,00 14,00 12,00 11,00 10,00 9,00 8,00
DP 1,39 1,68 1,69 1,74 1,51 3,90 4,39
 27

CTR-A = Controle alcóolico; DP = Desvio-padrão

Figura 6 - Leitura final do teste de difusão em ágar com extrato

alcoólico de própolis da cepa de Malassezia sp #27. Observar os
halos de inibição em torno de todos os orifícios. DMV/UFLA,
Lavras/MG, 2008.

Gráfico 1 - Comportamento das medidas de diâmetro dos halos de inibição em teste de difusão
em ágar usando extrato alcoólico de própolis frente a cepas de Malassezia spp. DMV/UFLA,
Lavras/MG, 2008.
 28

15
Diâmetro do halo (mm)

10

0 Concentração

6. DISCUSSÃO

A própolis tem sido utilizada pela população como um medicamento

alternativo à alopatia, de forma abusiva e sem indicação médica. Esse produto é
alvo constante de estudos com o objetivo de se obter o maior número de
informações ao seu respeito. O caráter crônico das otopatias e a dificuldade de
absorção das drogas disponíveis, aliados ao elevado custo dos antifúngicos
clássicos, são condições limitantes para o sucesso terapêutico nas malassezioses
óticas, justificando a busca por opções mais acessíveis.
O uso de diferentes concentrações da própolis, diluídas tanto em água
como em álcool, torna-se necessário para se descobrir o efeito do solvente
orgânico alcoólico na inibição do crescimento de Malassezia spp. Nesse sentido,
pode-se identificar o verdadeiro efeito da própolis sobre as leveduras,
desconsiderando uma possível interferência com o álcool.
No presente trabalho, o extrato de própolis foi preparado em uma solução
de estoque (solução-mãe) de 10%, utilizando o álcool etílico 96º como diluente e
líquido extrator. Dessa forma, obteve-se diluições-testes de soluções aquosas e
alcoólicas a 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25% e 0,625%. Observou-se que a diluição
do pó de própolis ocorreu sem problemas, de forma progressiva, rápida e sem
 29

deixar resíduos ou depósitos. Portanto, adicionalmente aos trabalhos de FRANCO

& BUENO (1999), sugere-se que o extrato de própolis possa ser preparado,
também, com álcool etílico 96º, apesar de não ser possível uma comparação
direta da eficácia entre as duas soluções que utilizaram alcoóis diferentes, devido
principalmente à dissimilaridade dos dados entre aquela pesquisa e esta
dissertação.
Ao se buscar uma análise geral dos resultados obtidos, verificou-se que o
maior percentual de sensibilidade de Malassezia spp ocorreu nos meios em que
foi acrescida solução alcoólica de própolis. Contrariamente às afirmações de
SZEWCZAK & GODOY (1982) e ENDLER et al (2003), provou-se, neste
experimento, que o álcool possui um efeito inibitório sobre o crescimento de
Malassezia spp, o que pode ser comprovado pelos halos de inibição presentes em
todos os orifícios-controles das placas em que os extratos alcoólicos foram
adicionados (tabela 4).
É interessante frisar que em 100% das amostras testadas frente ao extrato
alcoólico de própolis, o diâmetro dos halos de inibição foi maior na diluição de
20% (composto por álcool e própolis) que no orifício-controle (constituído apenas
de álcool), como atestado pelos dados da tabela 3. Esse fato permite afirmar que
ocorreu um efeito somatório na inibição de crescimento de Malassezia spp
quando o álcool e a própolis foram utilizadas na mesma solução.
O extrato aquoso de própolis não apresentou inibição em concentrações
baixas (tabela 4), porém essa inibição ocorreu à medida que a concentração de
solução de própolis foi elevada a 20%. Essa discrepância entre o efeito inibitório
dos extratos alcoólico e aquoso pode ser devido à própria natureza diluente de
substâncias orgânicas voláteis dos alcoóis, já que os componentes ativos da
própolis (fenólicos, flavonóides, ácidos e outros) não são solubilizados pela água,
conforme verificado por MARCUCCI et al (1999) e DANTAS et al (2000). É
provável que tal fato se deva, então, à saturação do líquido extrator e ao fato do
álcool dissolver bem mais a resina do que a mistura aquosa (LONGHINI et al,
2007).
A atividade antifúngica da própolis sobre Malassezia spp foi alta em
 30

extratos alcoólicos e baixa em extratos aquosos, não se podendo generalizar a

eficácia para qualquer extrato, como afirmam LONGHINI et al (2007). Os dados
dessa dissertação permitem uma comparação qualitativa com a pesquisa de
CRUZ (1992), que sugeriu concentrações pré-estabelecidas mais próximas das
trabalhadas no presente estudo. Mesmo assim, há diferenças metodológicas entre
os dois experimentos que, talvez, impeçam um grau de similitude maior.
VARGAS NETO (2004) verificou a grande eficácia da tintura de própolis a
30% sobre Candida spp isoladas da cavidade bucal. Mesmo não se podendo
comparar quantitativamente os resultados daquele experimento com os obtidos
nesta dissertação, pode-se inferir que a ação da própolis sobre o crescimento de
leveduras é um fato a ser destacado (e mais pesquisado).
As diferenças nos tamanhos dos halos de inibição observada no extrato
alcoólico se devem, provavelmente, a maior ou menor adaptação das leveduras
ao solvente (lembrando a alta tolerância das leveduras ao ambiente com a
presença de álcool, já que as mesmas possuem um caráter metabólico
fermentativo proeminente); porém, ao se comparar amostras dentro da mesma
diluição, não houve diferença estatística significativa (p<0,05).
Inferindo-se diretamente em uma das principais características do gênero
Malassezia, ou seja, sua lipoafinidade, pode-se suspeitar que o álcool etílico
possa ter removido a fonte de gordura do meio, dificultando (ou mesmo
impedindo) o metabolismo normal do microrganismo. Esse fato, também, pode
estar relacionado com os tamanhos dos halos de inibição discutidos no parágrafo
anterior.

7. CONCLUSÕES

Com base nos dados desta Dissertação, pode-se concluir que:

* as soluções de própolis possuem efeito inibidor do crescimento in vitro de

Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães, sendo esta ação mínima no
 31

extrato aquoso e maior em extrato alcoólico;

* o álcool etílico 96º isoladamente possui efeito inibidor do crescimento in

vitro de Malassezia spp oriundas do conduto auditivo de cães.

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Infelizmente o volume de trabalhos versando sobre a ação de extratos de

própolis sobre Malassezia spp é insuficiente para se tecer considerações a
respeito da real eficácia desta substância sobre a levedura.
Muito se tem para fazer nessa área, como estabelecer tipo de diluente
usado, temperatura de fabricação do extrato e tempo de extração dos princípios
ativos.
Todavia, os dois aspectos mais importantes nessa linha de pesquisa ainda
são determinar qual(is) a substância(s) química(s) responsável(is) pelo efeito
antileveduriforme (juntamente com seu modo de ação) e proceder aos testes in
vivo com extratos de própolis para se conhecer, em um verdadeiro teste de
campo, como se comporta um produto com reconhecida atividade antifúngica in
vitro, neste tipo de ambientação.
Projeto aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal
(protocolo nº 52/2006-CEEA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu.

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