UNIVERSIDADE ESTADUAL DE

FEIRADE SANTANA

ENGENHARIA DE ALIMENTOS BACHARELADO EM

CINCIAS BIOLGICAS

Manual da Disciplina
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Professora:
Elinalva Maciel Paulo

Carga Horria:
Terica 30 h
Prtica 30 h

Feira de Santana Bahia

2005.1

2. PLANO DE DISCIPLINA
2.1 EMENTA
Introduo microbiologia dos alimentos. Crescimento bacteriano. Tcnicas
microbiolgicas aplicadas microbiologia dos alimentos. Ecologia microbiana dos alimentos.
Contaminao e deteriorao dos alimentos. Toxinfeces alimentares. Conservao dos
alimentos. Controle microbiolgico de alimentos. Padres microbiolgicos e APPCC.
2.2.1. Objetivo Geral
Ao final do curso os alunos devero conhecer os fatores intrnsecos e extrnsecos que
controlam o desenvolvimento microbiano dos alimentos, os principais microrganismos
deteriorantes dos alimentos e a sua influncia na sade do consumidor,bem como os
mtodos de anlises.
2.2.2. Objetivos Especficos

Fornecer aos alunos conhecimentos sobre os tipos de microrganismos de interesse

em alimentos;
Mostrar os diferentes fatores que contribuem para a colonizao dos microrganismos
nos alimentos,
Conhecer os principais microrganismos deteriorantes e patognicos encontrados nos
alimentos,
Ressaltar a importncia da escolha do mtodo do controle do crescimento
microbiano no alimento.

2.3. CONTEDO PROGRAMTICO

PROGRAMA TERICO
I UNIDADE
01- Importncia dos microrganismos nos alimentos
02- Fatores extrnsecos que controlam o crescimento bacteriano
03- Fatores intrnsecos que controlam o crescimento bacteriano
04- Bactrias patognicas transmitidos prelos alimentos: Enterobactrias (Salmonella, Shigella
e
Escherichia), Vbrios, Yersnia,Campylobacter
05- Bactrias patognicas transmiotidas pelos alimentos: Listria, Staphylococcus aureus,
Clostridios, Bacillus
06- Protozorios transmitidos pelos alimento:
07- helmintos transmitidos pelos alimentos ,
08-vrus transmitidos pelos alimentos,
09- Micotoxinas
II UNIDADE
01- Microrganismo indicador- Amostragem, padres microbiolgicos
02.Deteriorao de carne, frango, ovos e pescados
03- Deteriorao microbiana de cereais, farinhas, produtos lcteos e doces
04- Conservao dos alimentos mtodos fsicos
05- Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos
06- Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos
07- GMP, PPHO, HACCP

PROGRAMA PRTICO
I UNIDADE
01- Montagem de materiais para esterilizao / Preparo de Meios de cultura
02- Reaes tintoriais: colorao de Gram,
03- Reaes tintoriais: colorao de esporos: Wirtz Conklin
04- Tcnicas de semeadura
05- Prepara de amostras de alimentos para anlises: diluio e plaqueamento
06- Contagem de Bactrias mesfilas, psicrotfilas e termfilas,
07- Esterilidade comercial
08- Contagem de bolor e levedura, Esterilidade comercial
II UNIDADE
01- Avaliao da qualidade do leite - (teste da fervura, teste do lcool teste do azul de
metileno)
02-Contagem de coliformes a 37 C e a 45 C
03- Contagem de Staphylococcus coagulase positiva
04- Contagem de Bacillus cereus
05- Contagem de Clostridios sulfito redutor
06- Deteco de Salmonella
07- Deteco de vibrios
08- Microrganismos presentes em produtos comerciais
2.4. MTODO
Aulas expositivas induzindo os alunos a discusso, pesquisas em artigos cientficos,
realizao de seminrios e realizao de prticas relacionadas com os assuntos tericos.
2.5. RECURSOS DIDTICOS
Para as aulas expositivas: quadro, transparncias e multimdia.
Para as aulas prticas: vidrarias, meios de cultura, corantes , reagentes e microrganismos
teste.
2.6. AVALIAO
Provas escritas com questes objetivas e subjetivas acerca do contedo terico
Relatrios das aulas prticas
Seminrio
2.7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
BSICA
FRANCO, B. G. M. Microbiologia dos Alimentos. So Paulo, ed. Atheneu, 1999
JAMES, M. J. Microbiologia moderna de los alimentos. Zaragoza(Espana): Acribia, 4 ed.
1994
SIQUEIRA, R.S. Manual de microbiologia de Alimentos, EMBRAPA. Centro Nacional se
Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos (Rio de Janeiro). Braslia: EMBRAPA.
SPI, Rio de Janeiro EMBRAPA_CTTA, 1995.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A. ;SILVEIRA, N. F. A. Manual de mtodos de anlise
microbiolgica de alimentos, So Paulo, Varela, 1997
COMPLEMENTAR
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods 3 ed. New York: Vanderzant, 1992.
FRAZIER, W. C.WESTHOF, D. C. Food Microbiology, 4o ed McGraW-Holl, p. 17-58, 1988.
BOURGEOIS, C. M E LARPENT, J. P. Microbiologia alimentaria. Zaragoza: acribia, 1995.
ICMSF. Mtodos de muestra para analisis microbiolgicas: principio e aplicaes
especficas. Zaragoza: Acrbia, 1995

3. PLANO DE AULA
N.AULA/DIA
01/02
11/10
11-15/10
03/04
18/10

CONTEDO
T Microrganismos de interesse em alimentos: prions, vrus, bactrias,
fungos, protozorios e helmintos

RECURSOS UTILIZADOS
Materiais: Quadro branco,
piloto,retroprojetor.

P Montagem de materiais para esterilizao / Preparo de Meios de Materiais: materiais de laboratrios

cultura
Materiais: Quadro branco,
T- Fatores extrnsecos que controlam o crescimento bacteriano
piloto,retroprojetor.

18-22/10
05/06
25/10

P Reaes tintoriais: colorao de Gram,

T Fatores intrnsecos que controlam o crescimento bacteriano

Materiais: materiais de laboratrios

Materiais: Quadro branco,
piloto,retroprojetor.

25-29/10
07/08
01/11

P Reaes tintoriais: colorao de esporos: Wirtz Conklin

Materiais: materiais de laboratrios

01-05/11
09/10
08/11
08-12/11
11/12
22/11

T- Toxinfeco alimentar: Enterobactrias (Salmonella, Shigella e

Escherichia), Vbrios, Yersnia, Campylobacter
P- Tcnicas de semeadura
T - Toxinfeco alimentar: Listria, Staphylococcus aureus, Clostridios,
Bacillus

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor, Data show.
Materiais: materiais de laboratrios
Materiais: Quadro branco, piloto,
retroprojetor. Data show.

P
Prepara de amostras de alimentos para anlises: diluio e
Materiais: materiais de laboratrios.
plaqueamento
T- Protozorios transmitidos pelos alimentos: helmintos transmitidos Materiais: Quadro branco,
piloto,retroprojetor. Data show.
pelos alimentos , vrus transmitidos pelos alimentos, Micotoxinas
P- Contagem de Bactrias mesfilas, psicrotfilas e termfilas,

Materiais: materiais de laboratrios

13/14

T I AVALIAO ESCRITA

29/11

P- Contagem de bolor e levedura, Esterilidade comercial

Materiais: Prova impressa

Materiais: materiais de laboratrios

15/16

T Microrganismo indicador- Amostragem, portaria RCD no 12- Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.
01/02/2001- (ANVISA)
Materiais: materiais de laboratrios

06/12

METODOLOGIA

Aula expositiva
Aula Prtica

Aula expositiva
Aula Prtica
Aula expositiva
Aula Prtica

Seminrio
Aula Prtica

Seminrio
Aula Prtica

Seminrio
Aula Prtica
Aplicao da prova
Aula Prtica
Seminrio
Aula Prtica

P Avaliao da qualidade do leite - (teste da fervura, teste do lcool

teste do azul de metileno)
- Esterilidade comercial
17/18
13/12

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.
P anlise microbiolgica de pratos prontos base de pescados crus
Materiais: materiais de laboratrios
(sushi, sashmi, etc.): Coliformes a 45 , Estaf. Coag.positiva, Vbrio
T Deteriorao de carne, frango, ovos e pescados

Seminrio
Aula Prtica

parahaemolyticus, Salmonella
19/20
20/12

21/22
07/02/06

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.
P- nlise microbiolgica de hortalias: Coliformes a 45 C, Salmonella
Materiais: materiais de laboratrios
sp., contagem de mesfilos

Seminrio
Aula Prtica

T Deteriorao microbiana de cereais, farinhas, produtos lcteos e Materiais: prova impressa

Materiais: materiais de laboratrios
doces

Prova escrita

T Deteriorao microbiana dos vegetais

P nlise microbiolgica da granola: B. cereus, coliformes a 45 C,

estaf. Coagulase positiva, Salmonella
T Conservao dos alimentos mtodos fsicos

Aula Prtica

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.
Materiais: materiais de laboratrios

Aula expositiva

T Conservao dos Alimentos mtodos qumicos e biolgicos

P- Anlise microbiolgica do queijo de coalho: Coliformes a 45 C,
Salmonella, Staphylococcus aureus

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.
Materiais: materiais de laboratrios

Aula expositiva
Aula Prtica

08/03

T GMP, PPHO, HACCP

P Microrganismos presentes em produtos comerciais

29/30

II AVALIAO ESCRITA

Materiais: Quadro branco,

piloto,retroprojetor.
Materiais: materiais de laboratrios
Materiais: Prova impressa
Materiais: materiais de laboratrios

23/24
14/02/06
25/26
21/02/06
27/28

15/03

P Anlise microbiolgica da lingia: Coliformes a 45 C, Salmonella,

Clostrdio sulfito redutor

Aula Prtica

Aula expositiva
Aula Prtica
Aplicao da prova
Aula Prtica

4. INSTRUES GERAIS DA DISCIPLINA E DO LABORATRIO

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Estudar previamente a aula prtica a ser realizada;

Ser pontual no horrio previsto para incio das aulas;
Trabalhar com ATENO, CALMA e seguir sempre o roteiro de aula;
Solicitar aos professores esclarecimentos sobre todas as dvidas;
Usar somente os materiais de sua prpria bancada;
Cuidado para no contaminar reagentes e solues;
Ter o mximo de cuidado para evitar acidentes consigo e com os colegas. Caso
ocorra, avise imediatamente o professor. O laboratrio no lugar para
brincadeiras;
obrigatrio o uso do jaleco (avental) em todas aulas prticas.

NORMAS DE BIOSSEGURANA APLICADAS DISCIPLINA

O fundamento bsico da biossegurana assegurar o avano dos processos tecnolgicos e
proteger a sade humana, animal e o meio ambiente (Ministrio do meio Ambiente).
O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejada previne a exposio
indevida a agentes considerados de risco sade e sem dvida evita acidentes. A esse
procedimento denominamos boas prticas de laboratrio. As prticas de biossegurana
baseiam-se na necessidade de proteo ao operador, seus auxiliares e a comunidade local
contra riscos que possam prejudicar a sade, assim como proteger o local de trabalho, os
instrumentos de manipulao e o meio ambiente.
Manipular com biossegurana, os organismos considerados contaminantes, so regidos por
leis federais, estaduais e municipais.
1-A permanncia dos alunos no laboratrio de aula prtica de microbiologia ser apenas
permitida mediante o uso de avental ou jaleco. O avental dever estar sempre devidamente
abotoado;
2-No trabalhar com calados abertos;
3 A entrada dos alunos no laboratrio ser apenas permitida aps a autorizao dos
professores responsveis;
4-No se alimentar, beber ou fumar no laboratrio;
5-Trabalhar com seriedade, evitando brincadeiras;
6-Nunca pipetar com a boca. Usar, sempre que possvel, pipetadores automticos ou pras
de borracha;
7-Evitar conversar durante a manipulao de cultura de microrganismos;
8-No usar microscpio, caso esteja com conjuntivite;
9- Comunicar imediatamente ao responsvel pela aula prtica, caso ocorra algum acidente
como derramamento de cultura bacteriana ou quebra de vidraria;
10-Observar os locais corretos para o descarte do material;
11-Lavar as mos ao termino da aula, mesmo que no tenha trabalhado com cultura de
microrganismos;
12- Em caso de dvida, em qualquer situao, solicitar orientao ao professor.
LABORATRIO E INSTRUMENTAL
1- Introduo
Todo laboratrio bacteriolgico, seja qual for a sua finalidade, deve obedecer a um conjunto de
normas gerais, as quais so sempre comuns.
Deve possuir amplitude suficiente para abrigar comodamente os mveis, aparelhos e
instrumental necessrio. Paredes e pisos devem ser recobertos de material impermevel, de
fcil limpeza e as mesas devem ser resistentes a ao de substncias qumicas. A iluminao
natural ou artificial tem que ser abundante e difusa. As correntes de ar devem ser evitadas e a
ventilao tem que ser controlada, a fim de que possa ser totalmente eliminada, quando
necessrio.

UEFS
2 - Instrumental
indispensvel o conhecimento do instrumental especializado
bacteriolgico, sendo a maioria de vidro e de outros materiais diversos.

exigido

no

trabalho

2.1 - Tubos de ensaio

Existem tubos de ensaio de diversos tamanhos e formatos: Tubos grossos (20 x 200 mm), tubos
finos (12 x 180 mm), tubos de hemlise (10 x 90 mm), Tubo de Durham (5 x 30 mm).
2.3 Pipetas (graduadas , de Pasteur e micropipetas)
2.4 Frascos
Bales, Erlenmeyer, Kitasato, frascos tipo conta gotas, provetas, clice (vasos cnicos), Becker
(copo graduado), garrafa de Roux
2.5 Vidrarias Diversas
Placas de Petri, ala de Drigalsky, Funil, Gral e pistilo, lmina de vidro, lmina escavada,
lamnula, cristalizadores, basto de vidro, lmpada a lcool, etc.
2.6 Instrumental
Ala de platina, Fio ou agulha de platina, estantes para tubos de ensaio, galerias ou placa de
Malassez, swab, esptulas, pinas, etc.
2.7 Aparelhos
Balana simples, balana de preciso ou analtica, estufa bacteriolgica, estufa de esterilizao,
autoclave, banho Maria, microscpio, centrifuga, potencimetro, contador de colnias, filtro
Seitz, bico de Bunsen, micro - incinerador, destilador.
indispensvel no laboratrio: capela de fluxo laminar, gua corrente, caneta vidrogrfica, gua
destilada, papel kraft, cordo, fita adesiva, algodo hidrfilo e hidrfobo.

UEFS
ROTEIRO 1
PREPARO DE MATERIAIS PARA USO NOS TRABALHOS DE MICROBIOLOGIA
Os materiais utilizados nos trabalhos do laboratrio de microbiologia, devem estar devidamente
limpos e esterilizados. Para tanto, faz-se necessrio o uso rigoroso de tratamentos que
possibilitem a perfeita esterilizao dos materiais, que vo desde sua lavagem at a
esterilizao propriamente dita.
LAVAGEM DE VIDRARIAS
As pipetas, frascos, placas de Petri, erlenmyers, etc. devem ser imersos em soluo
sulfocrmica concentrada, a qual capaz de dissolver qualquer sujeira, e depois lavadas com
sabo neutro ( a fim de no formar resduos que podero interferir no crescimento dos
microrganismos) e enxaguados com gua destilada ( para que no fixe os minerais presentes
na gua comum).
Lavagem de lminas e lamnulas
Ferver as lminas e as lamnulas com uma soluo de bicromato de potssio a 5% durante
cerca de 1/2 hora. Adicionando a cada 10 min. Um pouco de cido sulfrico concentrado. Lavar
o
abundantemente em gua destilada e conservar em lcool 95 at o momento do uso.
PREPARO DAS VIDRARIAS PARA ESTERILIZAO
As vidrarias depois de lavadas de maneira adequada, devem se esterilizadas, obedecendo os
seguintes procedimentos: os tubos, bales e outros devem ser embuchados com rolhas de
algodo hidrfobo (no absorve gua). A rolha de algodo deve ser suficientemente, porm no
muito apertada. Sobre os tampes de algodo coloca-se cartuchos de papel.
As tampas das placas de Petri devem ser munidas de um disco de papel de filtro. Traar com a
tampa da placa um crculo sobre o papel de filtro, corta-lo, aplica-lo contra a face interna da
tampa e ajusta-la bem. A funo deste papel de filtro, de absorver as gotculas de gua que se
evaporam da superfcie do meio de cultura. As placas de Petri devero ser envolvidas em papel
ou acondicionadas em recipientes apropriados. As pipetas devem ser providas de algodo na
extremidade destinada aspirao e enroladas em papel ou guardadas em recipientes
apropriados. Os outros objetos ( ala de Drigalsky, pina, bisturi, tesoura, basto de vidro,etc.)
devem ser mergulhados em uma soluo de lcool iodado e flambados no momento do uso,
repetindo este processo trs vezes.
ESTERILIZAO DE VIDRARIAS
o

As vidrarias sero esterilizadas no forno a 160 C , durante 2 horas ou 180/ 1 h. Deixar o forno
esfriar antes de abrir, pois o contrrio poder haver quebra de materiais devido a mudana
brusca de temperatura. Vidrarias especiais que no puderem ser esterilizadas pelo calor (bales
o
tarados e pipetas de preciso) sero tratadas por processos qumicos (sublimados a 1 /00 ou
soluo de formalina a 5% e depois lavadas em gua estril.
o
As vidrarias com o meio de cultura, devero ser esterilizadas na autoclave sob presso (121 /
o
15 min) ou em vapor fluente (100 C / 1 h , trs dias sucessivos.

UEFS
ROTEIRO 2

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

1 DEFINIO: So substncias ou complexos de substncias capazes de dar aos
microrganismos os elementos nutritivos necessrios ao seu desenvolvimento. Considerando
que as exigncias nutritivas das bactrias variam muito, existe um grande nmero de meio de
cultura.
2 CLASSIFICAO:
2.1 - Quanto ao estado fsico Lquidos, Slidos, Semi- slidos
2.2 Quanto aos componentes nutricionais
- Bsicos Permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazerem especialmente nenhuma
exigncia caractersticas.
- Especiais Cumprem as exigncias vitais de determinados microrganismos. Geralmente
so adicionados sangue, soro ou com outros nutrientes. Ex: gar sangue
2.3 - Quanto a procedncia Naturais Sintticos e Semi-sintticos
2.4 - Quanto a finalidade bacteriolgica:
Diferenciais Possuem substncias que evidenciam a utilizao de determinados substratos.
Estabelecem diferenas entre microrganismos de caractersticas parecidas. Ex: Mac Conkey e
Teague.
Seletivos permitem o crescimento de um tipo particular de microrganismos ou suprimem o
crescimento de outros tipos de microrganismos. Ex: gar SS e gar verde brilhante
Enriquecimento favorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento das
outras espcies presentes em uma populao mista.
Estoque - meio pobre em nutrientes, utilizado para manter as culturas armazenadas por um
determinado perodo de tempo.
3 COMPOSIO DE MEIOS BSICOS
Caldo Simples:
Agar Sabouraud ( para fungos )
Extrato de carne........................0,3%
Glicose ...........................................40g
Peptona.....................................1,0%
Peptona ..........................................10g
Cloreto de sdio.......................0,5%
gar gar ......................................15g
gua destilada......................100ml
gua destilada ............................1000 ml
3.1 - Etapas na preparao do meio
Pesar as substncias, juntar a gua, deixar dissolver, filtrar, ajustar se necessrio o pH para
7,2 a 7,4 usando cido lctico ou hidrxido de sdio com pipeta de 1ml, gotejando aos poucos,
antes da adio da gar gar. Distribuir em tubos se o meio for caldo simples. Para tornar o
meio slido acrescentar gar - gar e colocar o meio para fundir. O meio para o cultivo de
fungos o pH tem que ser ligeiramente cido (5.4)
4 FUNO DAS SUBSTNCIAS:
Extrato de carne: Contm substncias que estimulam a atividade bacteriana (fatores de
crescimento) e alimento plstico, pois vai integrar o protoplasma bacteriano. Fonte de
Carbono.
Peptona: fonte de nitrognio
Cloreto de sdio aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio.
garagar: uma substncia mucilaginosa extrada de vrias espcies de Gelidium e outras
algas afins. Tem somente funo de solidificar os meios, no sendo metabolizado pelas
bactrias.

UEFS
5 ESTERILIZAO
feita a 121C durante 15 minutos a 1 atmosfera de presso (autoclave). Deixar esfriar a 50c e
distribuir assepticamente em placas de Petri.
6 PROVA DE ESTERILIDADE
Os meios aps a esterilizao sero colocados na estufa de crescimento a 37c, durante 24h,
para comprovao da esterilidade.
7 PROVA DE FERTILIDADE
Inocular a cultura no meio esterilizado e incubar a 37 C por 24 - 48horas.
NOTA: Partindo-se dos meios bsicos podemos preparar meios com acares. Os meios
contendo aucares e protenas naturais no sero esterilizados pelo calor sobre presso e sim
pela tindalizao ou pela filtrao. Em se tratando de meios contendo aucares, podemos ainda
preparar solues concentradas destes, esteriliz-las por filtrao, na proporo de 1% ou 5%

ROTEIRO 3
COLORAO PELO MTODO DE GRAM
1 INTRODUO
A colorao um dos passos mais importantes para a identificao bacteriana. A finalidade
facilitar a observao microscpica das bactrias e diferenci-las quanto s suas caractersticas
morfotintoriais.
2 PREPARO DO ESFREGAO
Coloca-se no centro da lmina, com a ala de platina estril uma alada do material a ser
examinado e com movimentos circulares espalhamos cuidadosamente. Se o material estiver em
meio slido, colocamos previamente uma gota de soluo salina estril com a ala de platina no
centro da lmina e sobre esta uma alada do material, misturamos e espalhamos. O esfregao
deve ser fixado pelo calor, passando a lmina trs a quatro vezes pela chama do bico de
Bunsen. O aquecimento fixa e mata as bactrias do esfregao. Deixar a lmina esfriar.
3 COLORAO PELO MTODO DE GRAM
A colorao de Gram uma das mais importantes e rotineiras em Microbiologia, uma
colorao composta e diferencial, pois permite a diferenciao de bactrias em Gram positivas e
Gram negativas.
Tcnica
Cobrir o esfregao com cristal violeta durante 1 minuto, escorrer o corante e lavar rapidamente.
Cobrir a preparao com lugol, durante 1 minuto. Lavar em gua corrente.
Diferenciar com lcool etlico a 95% at que no se desprenda mais corante (cerca de 30
segundos). Lavar e escorrer o excesso de gua.
Cobrir a lmina com fucsina diluda durante 30 segundos, Lavar em gua corrente, escorrer,
secar com papel de filtro e passar rapidamente na chama do bico de Bunsen para terminar a
secagem.
Examinar em microscpio tico utilizando objetiva de imerso (100x), com o condensador alto e
o diafragma aberto

10

UEFS
ROTEIRO 4

TCNICA DE COLORAO DE ESPOROS (Endosporos)

MTODO DE WIRTZ-CONKLIN
1 INTRODUO
Esta colorao baseia-se no grau de afinidade que a estrutura do esporo possui ao corante,
comparada com o resto da clula bacteriana, tornando possvel a sua diferenciao.
O esporo bacteriano uma parede espessa formada no interior de algumas clulas bacterianas.
muito resistente ao calor e a outros agentes fsicos e qumicos; capaz de permanecer em
estado latente por longos perodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova clula
vegetativa.
2 FINALIDADE
Evidenciar a presena de esporos no interior do Bacillus sp.
3 MATERIAL
Cultura em agar de Bacillus sp.
Solues:
Verde malaquita a 5% em gua
Safranina a 1% em gua
Soluo fisiolgica
Lmina de microscopia e ala de platina
4 ESFREGAO
Espalha-se sobre uma lmina, com o auxlio da ala de platina, uma gota do material a ser
corado. Fixar pelo calor, passando-se a lmina (a superfcie sobre a qual foi feito o esfregao
voltada para cima) sobre a chama por 3 vezes.
5 PROCEDIMENTO TCNICO:
Preparar esfregao, secar a temperatura ambiente.
Cobrir com soluo de verde malaquita. Aquecer at o desprendimento de vapores por 6
minutos. (aquecer at a emisso de vapores e a partir da iniciar a marcao do tempo) No
deixar ferver ou secar.
Lavar em gua corrente, suavemente.
Cobrir com soluo de safranina durante 30 segundos.
Lavar em gua corrente e secar ao ar.
Examinar no microscpio com objetiva de imerso.
5 RESULTADO
O esporo se cora na de verde, porm o resto da clula ou a clula que no possui esporo se
tinge de vermelho ou rseo.
6 INTERPRETAO
Com a ao drstica do calor sobre a clula esporulada h penetrao do verde malaquita no
cerne do esporo e no h descoramento com a lavagem de gua; quando se coloca a safranina,
ela cora as estruturas da clula vegetativa que no conseguiram reter o verde malaquita.

11

UEFS
ROTEIRO 5

TCNICAS GERAIS DE SEMEADURA

1 DEFINIO
Semear um microrganismo coloc-lo em um ambiente adequado, em meio de cultura
apropriado ao seu desenvolvimento e reproduo. Ao semear um germe, preciso levar em
conta as tcnicas de assepsia nas manipulaes, esterilidade do instrumento e dos meios de
cultura empregados.
2 FINALIDADE
Isolar do material uma ou mais espcies microbianas, transplantar (repicar) uma cepa pura,
visando conserv-la ou estudar as suas caractersticas morfolgicas, culturais e bioqumicas.
A semeadura, plantio ou inoculao de bactrias em meios de cultura pode ser feita mediante
diversos procedimentos.
3 NATUREZA DO INCULO
Secreo, fluidos orgnicos, produtos patolgicos, fragmentos de tecidos, raspado de pele,
amostras retiradas de alimentos, etc.
Suspenso de bactrias provenientes de crescimento em meio de cultura slido.
Bactrias desenvolvidas em meio liquido.
Definir inculo
4 MEIOS DE CULTURA
Slido- em tubo ( em coluna e inclinado ), em placa e em garrafa de Roux
Lquido em balo, em tubo
Semi - slido em tubo
5 - TIPOS DE SEMEADURA E FINALIDADES
5.1 PLACA
Estrias simples e estrias compostas (Agar semeado com ala de platina) no crescem
colnias isoladas
Esgotamento por Estrias ( gar semeado com ala de platina ) Isolamento de colnias.
Disseminao ( gar semeado com ala de Drigalsky ou Swab ) Teste de sensibilidade
Obteno de Antgeno
Pour- plate ( gar fundido resfriado a 45c 50c semeado com pipeta, - Contagem de
colnias.
5.2 - TUBOS
Punctura ou picada (gar semi - slido, slido em coluna, semeado com agulha de platina)
Teste de Motilidade Conservao de bactrias
Shake tube (Agar fundido e resfriado a 45C- 50C, semeado com pipeta, ala de platina)
Estrias (Agar inclinado semeado com ala ou agulha de platina) Realizao de determinadas
provas bioqumicas, ativao das culturas, conservao dos microrganismos.
Meio Lquido (com ala ou pipeta) Testes Bioqumicos, ativao da cultura
6 LEITURA E INTERPRETAO DAS SEMEADURAS
Caractersticas do crescimento em meios lquidos - turvao, depsito, pelcula, pigmento.
Caractersticas do crescimento em meio semi-slido (tubo) - Observar se o crescimento ficou
restrito linha de inoculao (microrganismo imvel). Observar se o crescimento difundiu-se ao
longo da linha de inoculao (microrganismo mvel). Usualmente todo o meio encontra-se turvo.
Caractersticas do crescimento em meios slidos
Em tubo inclinado - Observar a quantidade de crescimento: abundante, escasso, nulo, presena
de pigmentos (cor) difusvel ou no.
Em placas - semeado por estrias: verificar o isolamento das colnias, estudar as caractersticas
em relao ao tamanho, forma, bordos, pigmentos, caracteres pticos, dentre outros; semeados
por disseminao - Crescimento confluente; semeados por "pour - plate" - contagem de
colnias.

12

UEFS
ROTEIRO 6

AVALIAO DA QUALIDADE DO LEITE

O Leite um excelente meio de cultura para vrios microrganismos. Ao ser produzido nos
alvolos, ele estril, mas medida que se desloca pelos canais da glndula, em direo
cisterna, pode contaminar-se com microrganismos da microbiota normal. Algumas vezes o
leite pode conter microrganismos patognicos (Salmonella, Coxiela burnetti, Mycpbacterium
bovis, M. tuberculosis, Brucella abotrus).A contaminao do leite pode continuar durante a
ordenha, o transporte e o armazenamento. Pessoas portadoras de infeces que participam da
manipulao do produto tambm podem representar fonte de contaminao. As condies de
transporte e?ou armazenamentos tambm contribuem para a multiplicao dos microrganismos
presentes no leite. Assim grandes populaoes de microrganismos degradadores
(Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus) podem estar
presentes no leite. A qualidade do leite pode ser avaliada em funo de sua microbiota,
fornecendo informaoes que refletem as condies sob as quais o alimento foi produzido,
beneficiado e/ou mantido (refrigerao e armazenamento inadequado).
PROCEDIMENTOS UTILIZADOS
1. Teste de fervura
Baseia-se no fato de que o aquecimento reduz o pH. Se um leite apresenta-se bastante
alterado(pH baixo), embora com aspecto fsico normal, ele coagular ao ser aquecido, pois
o pH baixa ainda mais.
colocar 5 mL de leite num tubo de ensaio
- Ferver
- Observar se h ou no coagulao (leite alterado ou normal respectivamente)
2. Teste do lcool
Este mtodo particularmente til na identificao de animais portadores de infeces
(Streptococcus) sem manifestaes clnicas. Animais infectados levam coagulao do
leite, neste teste, que pode aparecer rapidamente ou demorar de quatro a seis horas,
quando as alteraes so pequenas.
- Colocar 5 mL de leite num tubo de ensaio
- Adicionar 5 mL de lcool 70%
- Observar se h ou no coagulao (leite alterado ou normal, respectivamente)
3. Teste do azul de metileno
O crescimento de microrganismo no leite provoca o consumo do oxignio presente no
meio. Esse fenmeno leva produo de substncias redutoras, diminuindo o potencial
xido-redutor (O/R). Atravs de uma substncia indicadora, possvel acompanhar ou
medir essa diminuio do potencial O/R.
O corante azul de metileno um exemplo de substncia indicadora. Em sua forma
oxidada ele apresenta de cor azul, e, em sua forma reduzida, ele incolor (leuco azul
de metileno).Quando introduzido numa cultura bacteriana,ou em qualquer meio
contendo bactrias, o azul de metileno age como aceptor de eltrons, ou seja, sofre
reduo, tornando-se incolor. A velocidade dessa transformao diretamente
proporcional concentrao bacteriana no meio. possvel, dessa forma,avaliar a
concentrao bacteriana no meio pela adio desse corante e pela determinao do
tempo de descoramento.

13

UEFS
Tabela 3 Relao entre o tempo
aps a adio de azul de metileno
Tempo de descoramento
< 20 minutos
20 minutos 2 horas
2 horas 5,5 horas
> 5,5 horas

de descoramento do leite e o nmero de bactrias

UFC/mL
7
> 2,0 x 10
6
7
4 x 10 2,0x 20
5
6
5 x 10 4 x 10
5
< 5 x 10

Qualidade
pssima
m
regular
boa

- Pipetar para um tubo de ensaio 10 mL do leite a ser testado

- Juntar 1 mL de azul de metileno (0,02%)
- Misturar e colocar na estufa a 37 C. Anotar o horrio de incio.
- Fazer a primeira leitura aps 20 minutos e as seguintes a cada 30 minutos.
Considera-se um teste positivo quando a cor do fundo do tubo estiver branca
4. Contagem de bactrias aerbias mesfilas (pour plate)
No aspecto quantitativo procura-se avaliar a populao de um modo geral
5

- Preparar uma diluio decimal em srie at 10 .

3
5
- Inocular as placas em duas repeties com 1 mL das diluies de 10 a 10 .
- Verter nas placas o meio Agar padro para contagem (PCA) a 45 C
- Homogeneizar, deixar solidificar, inverter e incubar por 48h a 37 C.
- Proceder a contagem
Tabela 2 Limite de tolerncia para os diferentes tipos de leite. * Excludo na RDC 12
Tipo de leite

Salmonella sp

A
B
B

Ausncia em
25 mL
25/mL
25/mL

Coliformes
totais*
NMP/mL
1
4
10

Coliformes fecais
NMP/mL
Ausncia
1
2

Contagem padro em
placas*
UFC/mL
3
2 x 10 /mL
4
8 x 10 /mL
5
3 x 10 /mL

ROTEIRO 7

PREPARA DE AMOSTRAS DE ALIMENTOS PARA ANLISES: DILUIO E

PLAQUEAMENTO


AMOSTRAS LQUIDAS
1- Amostras lquidas em frascos com espao suficiente para agitao devem ser
misturadas antes da retirada da unidade analtica, invertendo-se a embalagem 25 vezes
2- Antes de abrir a embalagem, limpar a rea externa com etanol 75%, para remoo dos
contaminantes presentes
3- Amostra direta transferir assepticamente 1,0 mL ou 10 mL das amostras para o meio
em questo
-1
4- Amostra diluda - diluies seriadas: 10 transferir assepticamente uma poro de
1,0mL da amostra para 9,0 mL de diluente ( gua salina peptonada 0,1% ou tampo
-2
fosfato
pH 7,2), para a preparao da segunda diluio (10 ) , transferir
-1
assepticamente 1,0 mL da diluio 10 para 9,0mL de diluente. As diluies
3
-4
subseqente(10- , 10 etc.) so obtidas de maneira similar, transferindo-se 1,0 mL da
diluio anterior para 9,0 mL de diluente. Antes de retirar o volume a ser transferido,
agitar o tubo no agitador tipo vortex ou inverter o tubo 25 vezes. Usar sempre uma
pipeta diferente para cada diluio

AMOSTRAS SLIDAS
1- Antes de abrir a embalagem, limpar a rea externa com etanol 75%, para remoo
dos contaminantes presentes

14

UEFS
2- A unidade analtica utilizada na maioria dos alimentos slidos 25g. Retirar
assepticamente a amostra e transferir para um triturador (liquidioficador), contendo
225 mL do diluente. Triturar e homogeneizar por 60 segundos. Transferir o material
-1
diludo (!0 ) para um erlenmayer de 500mL e proceder as diluies subseqentes
2
-3
(10- , 10 etc ) utilizando tubos com 9,0mL do diluente.
OBS: O nmero de diluies requeridas depender do nvel de contaminao esperado.
Caso no haja possibilidade de se estimar o nvel de contaminao da amostra, deve-se
0
preparar e inocular amostra direta (10 em caso de amostra lquida ) seguindo a diluio
-1
-7
10 at a diluio 10
TCNICA DO PAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE POUR PLATE
1- Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular 1,0mL de cada diluio
em placas de Petri estreis. (realizar este procedimento em duplicatas)
2- Verter nas placas inoculadas 20 mL do agar requerido para a anlise, previamente
fundido e resfriado a 45 C. Misturar o inoculo com o meio de cultura movimentando
suavemente as placas, numa superfcie plana e seca, em movimentos circulares (4
vezes no sentido horrio, 4 vezes no sentido anti-horrio e 4 vezes na forma de oito).
3- Esperar solidificar o meio. Inverter as placas e incubar nas temperaturas requeridas

ROTEIRO 8

CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERBIOS

-1

-7

1. Preparar diluies de 10 ate 10 da amostra (No caso da amostra lquida

comear
0
com a amostra direta 10 )
2. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis. (realizar este
procedimento em duplicatas)
3. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar Padro para Contagem (PCA),
previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizar. Esperar solidificar
Contagem total de aerbios mesfilos
1. Incubar as placas invertidas a 35 C/48h. Contar todas as colnias
Contagem total de aerbios psicrotfilos
2. Incubar as placas invertidas a 7 C/10 dias . Contar todas as colnias
Contagem total de aerbios termfilos
3. Incubar as placas invertidas a 55 C/24 h . Contar todas as colnias
Contagem das colnias: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colnias.
Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ou grama ,
multiplicar pelo inverso da diluio inoculada .
-2

Ex: 100 colnias na diluio 10 = 100 x 10 = 10 000 = 1,0 x 10 UFC/g ou mL

Contagem de bolor e levedura
-1

-6

1. Preparar diluies de 10 ate 10 da amostra (No caso da amostra lquida

0
comear com a amostra direta 10 )
2. Inocular 0,1 mL de cada diluio nas placas contendo o meio solidificado Agar
batata dextrosado (PDA)

15

UEFS
3. Incubar as placas no invertidas a 25 C ou temperatura ambiente por 5 dias
(contar primeiro com 3 dias).
4. Contagem das colnias: Selecionar as placas que tenha entre 15 a 150
colnias. Calcular o nmero de unidades formadora de colnia (UFC) por mL ou
grama , multiplicar pelo inverso da diluio inoculada e depois por 10 (j que foi
inoculado 0,1 ml e no 1 ml)
-2

Ex: 100 colnias na diluio 10 = 100 x 10 = 10 000 x 10 = 1,0 x 10 UFC/g ou mL

ROTEIRO 9

CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento
de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento.
- PROCEDIMENTOS
- Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata glicose 2%
acidificado com cido tartrico a pH 3,5.
Com o auxlio de ala de Drigalski , espalhar o inculo cuidadosamente por toda a
superfcie do meio, at sua completa absoro.
Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir
-1
em duplicata 1 mL da diluio 10 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos
lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder
-1
diluio 10 .
- Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 C por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D.
- Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

ROTEIRO 10

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS (37 C)

E COLIFORMES FECAIS (45 C ou termotolerante)
A contagem de coliformes) baseada nas caractersticas do grupo: bastonete Gramnegativo, que produzem cido e gs a partir de lactose.
Coliformes Totais: Habitat intestinal e ambiental: Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter,
Klebsiella
Coliformes Fecais: Habitat excluisivamente intestinal: Escherichia coli
Procedimento:
Mtodo: tubos mltiplos (Nmero mais provvel NMP)
1. Teste presuntivo
Presume-se que os microrganismos que crescem e produzem gs a partir da lactose sejam
coliformes
Meio de enriquecimento: caldo lauryl sulfato triptose
- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldo
lauryl sulfato triptose (dupla concentrao) com 10 mL da amostra .
- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10 mL de caldo
lauryl sulfato tripose (concentrao normal) com 1m L da amostra.

16

UEFS
- Inocular trs tubos (tubos de Durham invertido no seu interior) contendo 10mL de caldo
lauryl sulfato triptose (concentrao normal) com 0,1 mL da amostra
- Incubar a bateria com as sries te tubos a 37 C/48h
- Fazer a leitura, considerando positivos os tubos com presena de gs no interior dos tubos
de Durham
3- Teste confirmativo
Coliformes Totais
Meio seletivo caldo lactosado bile verde brilhante. Neste meio, os sais de bile tm a
funo de inibir o crescimento de bactrias no entricas e o verde brilhante de inibir as
bactrias Gram-positivas,selecionando desta forma os coliformes.
- Imediatamente aps a leitura do teste presuntivo,transferir com uma ala de platina uma
alquota de cada tubo positivo para tubos ( tubos de Durham invertidos no seu interior)
contendo caldo lactosado bile verde brilhante.
- Incubar a 35 C por 48h
- Fazer a leitura identificando como positivos os tubos com gs.
- Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de coliformes totais
por grama ou mL.
Coliformes Fecais
Os coliformes fecais tm em seu ambiente natural (trato intestinal) temperaturas mais
elevadas. Eles so capazes de crescer a 44,5 C, possibilitando, assim,de uma forma
prtica, serem avaliados separadamente.
- Imediatamente aps a leitura do teste presuntivo, transferir com a ala de platina uma
poro de cada tubo positivo para tubos contendo caldo EC (Escherichia coli) (tubos
de Durham invertido no seu interior).
- Incubar a 44,5 (pescado) ou 45 C por 24h. Utilizar o banho-maria
Fazer leitura identificando como positivo os tubos com gs
Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de coliformes fecais/g
ou mL

ROTEIRO 11

PESQUISA de Salmonella sp
Todas as salmonelas so consideradas potencialmente patognicas para o homem.A nica via
de entrada destes microrganismos no corpo humano a oral, por isso de suma importncia a
anlise dos alimentos para detectar sua presena.
A metodologia recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de
alimentos

Pr- enriquecimento em caldo no seletivo; objetiva a recuperao de clulas injuriadas

-1
- Adicionar 25g ou mL da amostra em 225 mL do caldo de pr- enriquecimento (diluio 10 ).
Homogeneizar no liquidificador por 60 seg. Verter todo material em erlenmyer estril e incubar a
35 C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o caldo lactosado ou a gua peptonada 0,1%
tamponada e para produtos lcteos gua destilada verde brilhante.
Enriquecimento Seletivo: estimula a multiplicao de salmonelas e reduz ou inibe o
crescimento dos organismos competitivos, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas
- Transferir 1,0 mL para 10mL de caldo Tetrationato (TT) .Incubar a 35 C/24h.

17

UEFS
Plaqueamento seletivo diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de
colnias de Salmonella, com caractersticas tpicas que as distingam dos competidores, para
posterior confirmao sorolgica e bioqumica.
- Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alada do caldo tetrationato em placas
de Agar entrico de Hectoen (HE) e gar xilose lisina descarboxilado (XLD). Incubar as placas
invertidas a 35 C/24h. Verificar se h desenvolvimento de colnias tpicas de Salmonella:
Agar HE: colnias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto.
Agar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro,com ou sem centro preto.
Confirmao Preliminar das colnias tpicas de Salmonella
Com o auxlio de uma agulha de inoculao, remover uma poro da massa de clulas, do
centro da colnia tpica (no mnimo 2 colnia) e semear em tubos inclinados de Agar Lisina
Ferro (LIA) e gar Trplice Acar.. A semeadura deve ser feita por picada e estrias na rampa.
Incubar os tubos a 35 C/24h. Observar reao tpica:
TSI- rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo),com ou sem produo de H2S
(escurecimento do agar). Reao atpica que no deve ser descartada se as demais reaoes
em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos (amarelos), com ou sem produo de
H2S.
LIA fundo e rampa alcalinos(prpura, sem alterao da cor do meio), com ou sem produo de
H2S. Reao atpica, que no devem ser descartada se as demais reaoes em TSI se
apresentarem tpicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.
Teste bioqumico
. Meio SIM Transferir com uma agulha atravs de picada a cultura de colcia tpicado TSI para
o meio. Incubar 35 C/24h.
. Produo de H2S: escurecimento do agar. Salmonela pode produzir ou no H2S
. Motilidade : crescimento na regio da picada imvel
crescimento em todo agar ou ao redor da regio da picada: mvel. Salmonela
mvel
Aps a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou Kovacs no tubo.
Aparecimento de cor rsea: indol positivo.
Aparecimento de cor amarelado: indol negativo. Salmonela indol negativo
Teste do vermelho de metila (VM) 3 Voges-Proskauer (VP): Transferir uma alada com inoculo
da cultura em TSI, para dois tubo com caldo 3mL VM-VP e incubar a 35 C/48h para VP e 96h
VM. Aps o perodo de incubao , no tubo VP adicionar 1,8 mL de soluo de alfa naftol 5% e
agitar. Adicionar em seguida 0,6 mL de soluo KOH 40%, agitar. Observar at 1 hora.
Desenvolvimento de cor vermelha ou rosea teste positivo
Permanncia do meio na cor do reagente(amarelado ou ligeiramente esverdeado) teste
negativo. A maioria das Salmonelas so VP negativas
No tubo VM adicionar 5 gotas de soluo vermelho metila e observar imediatamente se o meio
adquire uma colorao vermelha teste positivo ou amarela _ teste negativo. A maioria das
cepas de Salmonela so VM positivas.
Teste do citrato:
Com uma agulha de inoculao, transferir um inoculo da cultura para um tubo de agar citrato de
Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a 35 C/ 96h. Observar o
crescimento:
Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de Salmonelas so citrato positivo
Cor do meio inalterado: citrato negativo
Teste de urease:
transferir uma alada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uria de Chistensen.
Incubar 35 C/24h. Observar crescimento
Cor do meio original (pssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas so ureases
negativa
Cor do meio rosa escuro: teste positivo
Teste da descarboxilao da lisina em caldo
Transferir uma alada da cultura em TSI para um tubo com caldo lisina ( previamente
desaerado). Cobrir a superfcie do caldo com 2 q 3 ml de parafina ou leo mineral estril.Incubar

18

UEFS
a 35 C /48h h. Observar:
Alterao do meio de esverdeado para prpura azulado : teste positivo- As cepas de
Salmonelas so lisinas positivas
. alterao do meio par cor amarela (cida): tesete negativo.
Reao sorolgica frente ao anti-soro polivalente O
Ressuspender o cultivo obtido em gar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em
aproximadamente 2 mL de soluo salina 0,85%.
Em lmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota
de soluo salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco.
Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspenso em teste.
Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminao sobre fundo escuro em 1 a 2
minutos.
Classificar a reao do seguinte modo:
Positiva: presena de aglutinao somente na mistura cultivo + anti-soro;
Negativa: ausncia de aglutinao em ambas as misturas;
No especfica: presena de aglutinao em ambas as misturas (formas rugosas).
ROTEIRO 12
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos, um relacionado com a
sade pblica, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicao alimentar, e outro
relacionado com o controle de qualidade higinico-sanitria dos processos de produo de
alimentos, condio em que S. aureus serve como indicador de contaminao ps-processo ou
das condies de sanificao das superfcies destinadas ao contato com alimentos.
Mtodo: Contagem direta em placa
Procedimento:
- Inocular 0,1 mL de cada diluio na superfcie de placas de agar Baird-Parker(BP). Espalhar o
inculo com uma ala de Drigalski, at que todo o excesso de lquido seja absorvido. Se as
contagens estimadas de S. aureus na amostra forem menores do que 100/g ou mL, inocular 1,0
mL da primeira diluio, distribuindo o volume por quatro placas , 3 com 0,3 e uma com 0,1 mL.
- Incubar invertidas a 37 C por 48h.
- Contar as colnias tpicas de S. aureus selecionando as placas que tenha entre 25 a 250
colnias.
Colnias tpicas: colnias circulares,pretas, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas,
massa de clulas esbranquiadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo
transparente se estendendo para alm da zona opaca.
Colnias atpicas: cinzentas, sem um ou ambos os halos tpicos.
Confirmao das colnias
- Selecionar no mnimo cinco colnias tpicas, para teste de coagulase, e havendo menos do
que cinco tomar todas. Se a placa apresentar colnias suspeitas de mais de um tipo, tpicas e
atpicas, selecionar pelo menos cinco de cada tipo.Transferir cada colnia para um tubo de
caldo infuso crebro corao (BHI), emulsionar bem a massa de clulas com o caldo, transferir
uma alada para um tubo com agar tripticase de soja (TSA) inclinado e incubar ambos os tubos
a 35 C/24h.
Teste da coagulase:
Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 mL de
plasma de coelho.
Incubar a 36 1C por 6 horas.
Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:
Reao negativa: no formao de cogulo;
Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado;
Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado;
Reao 3+ : cogulo grande e organizado;
Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender quando o

19

UEFS
tubo for invertido;
Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para
Staphylococcus aureus;
Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus
aureus.
Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo
contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas, para a
realizao dos testes complementares:
Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintes
provas confirmativas:
Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram.
A ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A
presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes
complementares.
Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios eqidistantes com cerca de 2 mm de dimetro no
gar para ensaio de termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente
preparadas.
Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15
minutos.
Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser analisado.
Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas.
O aparecimento, ao redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo
de clarificao no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de reao
positiva para termonuclease.
Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm. O
Staphylococcus aureus termonuclease positiva.
Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou Pipeta
de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para uma
lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.
Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.
A no formao de borbulhas indica prova negativa para
catalase.. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.
O Staphylococcus aureus catalase positiva.
RESULTADOS
Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias
selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em
considerao a diluio utilizada.
ROTEIRO 13

CONTAGEM DE Bacillus cereus

O Bacillus cereus aerbico formador de esporos e se encontra normalmente presente no solo,
poeira e gua e alimentos com baixo aw. Os alimentos envolvidos so pratos a base de cereais
e hortalias.
. PROCEDIMENTOS
Inoculao
- Inocular sobre a superfcie seca do gar MYP (Polimixina gema de ovo) ,0,1 mL de cada
diluio selecionada.Com auxilio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por
toda a superfcie do meio at completa absoro.Nos casos em que for necessria a obteno
-1
de resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluio 10 em 3 placas (0,4 mL,
0,3 mL e 0,3 mL). No caso de amostras lquidas, poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da
amostra.
- Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 por 30 a 48 horas.
- Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias

20

UEFS
rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar MYP.
- Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar nutriente inclinado.
- Incubar a 35C por 24 horas.
- De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo Gram para verificar a presena de
bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os
esporos so centrais ou sub-terminais.
- Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as
seguintes provas:
Identificao Bioqumica
- Motilidade e reduo de nitrato
Inocular, com agulha, tubos contendo gar motilidade-nitrato. Incubar a 35 C por 18 a 24 horas.
Aps incubao, verificar o tipo de crescimento presente.
Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha de inoculao, enquanto que as mveis
crescem de forma difusa.O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se mvel.
Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e
2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para
reduo de nitrato.O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito.
- -hemlise em gar sangue de carneiro.
Inocular por estria em placa com gar sangue de carneiro.
- Incubar a 35 C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise caracterstica do Bacillus
cereus.
Bacillus cereus produtor de -hemlise.
- Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente, depositando
o inculo no ponto central da placa.
- Incubar a 35 por 48 a 72 horas.
- Aps incubao verificar o tipo de crescimento: Crescimento rizide se caracteriza pelo
aparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios, tpicas de
Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide, porm algumas cepas
podem apresentar colnias rugosas em forma de galxia.
- RESULTADOS
Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas,
nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado.

ROTEIRO 14
CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E
DE Clostridium perfringens
A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 1 mL em placas estreis e adicionar cerca
de 15 mL de gar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48C.
Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfcie plana.
Aps, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio.
Deixar solidificar em superfcie plana.
Incubao: Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), em
jarra de anaerobiose a 35C por 18 a 24 horas.
Seleo e Isolamento: As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de
tamanho varivel de 1 a 3 mm no gar TSC.
Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias tpicas.
Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado.
Esse resultado, multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium sulfito
redutores presentes por grama da amostra em anlise.
RESULTADOS
Calcular o nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negras
contadas no gar TSC pelo fator de diluio usado

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UEFS
ROTEIRO 15

NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus

PROCEDIMENTOS
Provas presuntivas
-1
Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo: A partir da diluio inicial (10 ), efetuar as
demais diluies desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies).
Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo
GSTB . Incubar os tubos a 35 C por 18 horas a 24 horas.
Leitura: A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio
parahaemolyticus.
Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram turvao.
Isolamento em gar tiosulfato citrato sais biliares (TCBS)
Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB que apresentar turvao, sem agit-lo e com auxlio
de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril, retirar uma alada do
crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de gar tiosulfato citrato sacarose
sais biliares (TCBS). Incubar as placas em posio invertida a 35C por 24 horas.
Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada,
com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus.
Quando no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem.
Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus
De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transfer-las simultaneamente para tubos
contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.Incubar a 35C por 18 a 24
horas.
Colorao de Gram: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder colorao
de Gram . O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram
negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.
Crescimento com 8% de sal e sem sal: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal
3%, transferir, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada
para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%.
Incubar os tubos a 35C por 18 a 24 horas.
Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia de
crescimento. O Vibrio parahaemolyticus no cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8%
de sal.
Prova da oxidase: A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos de
madeira, de plstico descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova de
oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre
tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponveis.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas.
O aparecimento de cor azul (quando usado o reativo N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina)
ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado o oxalato de para-amino-dimetilanilina)
indicativo de reao positiva.
OBS: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase, pois
traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falso-positiva.
O Vibrio parahaemolyticus oxidase positiva
Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal
3%, inocular, com auxlio de ala de nquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol
sacarose sal 3%.
Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estreis.
Incubar a 35C por 18 a 24 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho para
amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido.
O Vibrio parahaemolyticus no altera a colorao do meio pois no capaz de fermentar a
sacarose.
gar Kligler ferro sal 3%
A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina

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ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e estriando
a superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar a 36
1C por 24 horas.
O Vibrio parahaemolyticus apresenta base cida (amarela), sem gs, sem produo de H2S e
bisel alcalino (vermelho).
.Provas adicionais para identificao de Vibrio parahaemolyticus
As colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticus nas provas
preliminares, devero ser submetidas s provas adicionais, conforme descrito em 5.5.1 a 5.5.9.
Teste do crescimento a 42C: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com
auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo
peptonado sal 3%. Incubar a 42 1C por 24 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos meios.
O vbrio parahaemolyticus cresce temperatura de 42C.
gar gelatina sal 3%: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de
ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gar
gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado
no centro de cada setor). Incubar as placas a 35C por 18 a 24 horas.
Colocar as placas em refrigerao por alguns minutos antes e realizar a leitura, o que facilita a
vizualizao do halo.
O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase.
O Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva.
Teste da motilidade: A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio
de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular um
tubo contendo gar motilidade sal 3%.Incubar a 36 1C por 24 horas.
Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva.
O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva.
Prova de Hugh-Leifson glicose (OF): A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3% ,
inocular, com auxlio de agulha de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tubos
contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%.
Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida,estril.Incubar a 35C/24h
Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a
presena de bolhas de gs nos meios.
A cor amarela nos dois tubos significa fermentao da glicose.
A presena de cor amarela somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da
glicose.
O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubos
devem apresentar colorao amarela.
Descarboxilao da lisina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio
de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldo
vermelho de fenol lisina sal 3%.
Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir de
controle.
Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril.
Incubar a 35C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol
lisina sal 3% no inoculado, que servir de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da
glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido
produo de aminas primrias e dixido de carbono.
O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina.
Hidrlise da arginina: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de
ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo arginina
sal 3%.
Inocular tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir de
controle.
Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril.
Incubar a 35C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% no
inoculado, que servir de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias.
Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da
glicose, e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de

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UEFS
aminas primrias e dixido de carbono.
O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
O Vibrio parahaemolyticus no hidrolisa a arginina.
Prova da fermentao do manitol e arabinose: A partir do cultivo mantido em caldo
peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular
um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho
de fenol arabinose sal 3%.
Cobrir o meio com 2 a 3 mL de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 35C por 24 h
Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho para
amarelo, devido fermentao dos acares e conseqente produo de cido.
99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta o manitol.
50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a arabinose.
Teste do halofilismo: A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de
ala de nquel-cromo, platina ou descartvel estril, inocular tubos contendo caldo peptonado
sal 6% e 10%.Incubar a 35C por 24 horas.
Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios.
O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento discreto,
a 10% de sal.
RESULTADOS
Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus
as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao:
Motilidade - positiva
Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo
Descarboxilao da lisina - positivo
Hidrlise da arginina - negativo
Crescimento a 42C - positivo
Fermentao do manitol - positivo
Fermentao da arabinose - positivo
gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo
Halofilismo (6% sal) - positivo
Halofilismo (8% sal) - positivo
Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto
A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero Mais
Provvel.Expressar o valor obtido em NMP/g.

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