VALIDAO DE MTODO ANALTICO: DETERMINAO DE CLCIO EM
GUAS MTODO TITULOMTRICO DO EDTA COMPLEXOMETRIA
Diego Manica1, Erlise Loraine Dullius2
CORSAN, Porto Alegre, Brasil, diego.manica@corsan.com.br
CORSAN, Porto Alegre, Brasil, erlise.dullius@corsan.com.br
RESUMO: A NBR ISO/IEC 17025[1] exige que qualquer
alterao em mtodos normalizados seja validada. Logo,
validar um mtodo normalizado garante confiabilidade
analtica. Este trabalho apresenta os testes realizados a fim
de validar as alteraes realizadas no mtodo titulomtrico
para o ensaio de Clcio em guas.
Palavras Chave: Validao de Mtodo Analtico,
Determinao de Clcio em guas
1. INTRODUO:
A preocupao com a qualidade dos ensaios/resultados
apresentados pelos laboratrios analticos eminente,
devido s exigncias de mercado e/ou para garantir
confiabilidade nos resultados. Este contexto promove
aumento de instituies que almejam serem reconhecidas
atravs da implantao de normas internacionais de
qualidade, como a NBR ISO/IEC 17025. A Figura 1 mostra
a evoluo de laboratrios gachos reconhecidos junto a
Rede Metrolgica do Rio Grande do Sul.
Figura 1: Evoluo do Nmero de Laboratrios Reconhecidos junto a
Rede Metrolgica do Rio Grande do Sul (RMRS)[2].
Um dos procedimentos que promove a garantia da
qualidade dos servios prestados por laboratrios analticos
a validao de mtodos, ou seja, a confirmao por
exames e fornecimento de evidncia objetiva de que os
requisitos especficos para um determinado uso pretendido
so atendidos (NBR ISO/IEC 17025, 2005[1]).
Recentemente o rgo acreditador brasileiro (Instituto
Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade
Industrial INMETRO) sugere aos laboratrios acreditados
na norma NBR ISO/IEC17025 a necessidade de validar
mtodos analticos reconhecidos internacionalmente, por
exemplo: mtodos publicados pela US Environmental
Protection Agency (EPA) e bibliografias como o Standard
Methods, visto que se evidencia pequenas alteraes de
metodologia ou para confirmar o comportamento de um
processo. Assim, com o objetivo de confirmar que os
mtodos so apropriados para o uso pretendido, o
laboratrio deve validar (...) mtodos normalizados usados
fora dos seus escopos para os quais foram concebidas,
ampliaes e modificaes de mtodos normalizados (NBR
ISO/IEC 17025, 2005[1]).
Seguindo a sugesto do INMETRO, o Departamento
de Ensaios e Apoio Laboratorial (DEAL) da Companhia
Riograndense de Saneamento (CORSAN) iniciou a
validao dos mtodos analticos do seu escopo de
acreditao. A primeira metodologia validada pelo
laboratrio foi o procedimento interno denominado FQ 009
Determinao de Clcio Mtodo Titulomtrico do
EDTA Complexometria baseado no mtodo nmero 3500
Ca B do livro Standard Methods: for the examination of
water and wastewater, 21th ed., publicado em 2005[3].
2. OBJETIVO:
Este trabalho tem por objetivo, por meio do rigor
metrolgico, a validao da metodologia para a
Determinao de Clcio em guas (Standard Methods 3500
Ca B), com a seguinte alterao no mtodo original:
Uso de soluo padro de EDTA 0,0050 mol L-1.
3. MTODOS:
Segundo Albano e Raya-Rodriguez[4], e confirmado
por INMETRO (2010)[5] os passos necessrios para a
Validao de Mtodos Laboratoriais incluem o estudo dos
seguintes parmetros, requeridos como evidncia objetiva
deste processo:
Seletividade;
Linearidade;
Sensibilidade (Limites de Deteco e
Quantificao);
Preciso (Repetitividade e Reprodutibilidade);
Exatido (Percentual de Recuperao, Z-score
Intralaboratorial e Z-score Interlaboratorial);
 Estabilidade (Cartas de Controle para: Valores
Individuais, Amplitude Mvel, Mdias e Desvio
Padro;
Robustez;
Incerteza de Medio.
Cada avaliao prev diversos testes, atravs de
titulaes de padres e/ou amostras reais fortificadas com
padres com valores conhecidos.
3.1 Seletividade: A seletividade de um mtodo
analtico a capacidade do mesmo ser indiferente presena
de interferentes na amostra que possam vir a mascarar a
determinao do analito em estudo.
Uma das maneiras de avaliar a seletividade atravs de
adio-padro. Este mtodo utilizado quando no
possvel obter a matriz isenta da substncia de interesse.
Neste caso feita uma curva analtica com adio da
substncia de interesse na matriz e comparada com uma
curva analtica sem a presena da matriz.
A seletividade foi avaliada segundo Albano e Raya-
Rodriguez[4] para as trs matrizes de trabalho do laboratrio
(gua bruta, gua tratada e gua subterrnea poo) no
intervalo de 1 a 80 mg Ca2+ L-1. O ensaio foi conduzido para
toda a faixa1 sendo analisadas 05 (cinco) alquotas de 50 mL
do padro, para cada concentrao da faixa a ser utilizada.
3.2 Linearidade: A linearidade do procedimento
analtico a capacidade de produzir resultados que sejam
diretamente proporcionais a concentrao do analisado na
amostra, em uma faixa de concentrao. A faixa linear
definida como a faixa de concentraes na qual a
sensibilidade pode ser considerada constante e ,
normalmente, expressa nas mesmas unidades do resultado
obtido pelo mtodo analtico.
A linearidade foi avaliada segundo Albano e Raya-
Rodriguez[4] no intervalo de 1 a 100 mg Ca2+ L-1.
3.3 Sensibilidade: A Sensibilidade de um mtodo pode
ser avaliada atravs das seguintes ferramentas: Clculo do
Limite de Deteco do Mtodo (LDM) e Clculo do Limite
de Quantificao do Mtodo (LQM).
O Limite de Deteco do Mtodo (LDM) a
concentrao do constituinte que, quando submetida a uma
determinada metodologia, produz uma resposta que com
99% de probabilidade dista do branco, ou seja, representa a
mais baixa concentrao do analito em ensaio que pode ser
detectada com uma dada confiabilidade. Enquanto, o Limite
de Quantificao do Mtodo (LQM) a concentrao de
constituinte que produz uma resposta com o mnimo de
preciso e exatido para a reproduo de uma metodologia.
1
A faixa de concentrao apresentada foi escolhida, pois a que melhor
representa a realidade de amostras analisadas em nosso laboratrio.
Os clculos do LDM e LQM foram realizados
conforme metodologia interna do laboratrio atravs do
ensaio de uma soluo padro de 0,10 mg Ca2+ L-1. Os
resultados devem ser tabulados e se realiza os clculos da
mdia ) e do desvio padro (s). Os dados de mdia e
desvio padro so utilizados nas frmulas (1) e (2).
(1)
(2)
3.4 Preciso: A preciso expressa o grau de disperso
entre as medies independentes a partir de uma mesma
amostra, amostras semelhantes ou padres sobre condies
definidas. A preciso contempla dois nveis: a
Repetitividade e a Reprodutibilidade.
A Repetitividade o grau de concordncia entre os
resultados de medies sucessivas de um mesmo
mensurando efetuada sob as mesmas condies de medio,
ou seja, mesmo procedimento, mesmo observador (tcnico),
mesmo instrumento (equipamento), mesmo local e
repeties em curto perodo de tempo. Enquanto que a
Reprodutibilidade o grau de concordncia entre os
resultados de medies de um mesmo mensurando efetuada
sob condies variadas, que podem incluir condies
alteradas de analista, equipamento, local, tempo (dia da
anlise), marca dos padres.
A repetitividade e a reprodutibilidade foram avaliadas,
segundo Albano e Raya-Rodriguez[4], (Repetitividade
Deciso 657; Reprodutibilidade Intralaboratorial Diretiva
657) atravs de fortificaes de 1,0; 2,0 e 3,0 mg Ca2+ L-1
nas trs matrizes de trabalho do laboratrio. As variaes
das caractersticas ocorridas no teste de reprodutibilidade
foram: variao de analista e variao de equipamento
(titulador automtico).
3.5 Exatido: o grau de concordncia entre o
resultado de uma medio e um valor verdadeiro do
mensurando.
A exatido pode ser avaliada pelos seguintes testes:
Percentual de Recuperao, Z-score Interlaboratorial e Z-
score Intralaboratorial.
O Percentual de recuperao foi avaliado atravs do
preparo de solues padro de clcio, material de referncia
(MR), em um total de 03 (trs) solues, com concentraes
crescentes do MR, no intervalo de 1 a 100 mg Ca2+ L-1. Foi
analisado um total de 03 (trs) alquotas de 50 mL do
padro, para cada concentrao.
Avaliao do Z-score Interlaboratorial: Caso ocorra
alguma oportunidade de participao em um Programa de
Proficincia de Ensaio durante a execuo dos testes de
validao a avaliao de desempenho do Z-score poder ser
includa.
A Avaliao do Z-score Intralaboratorial foi realizada
segundo Albano e Raya-Rodriguez[4], considerando que
no existe valor de referncia conhecido. Trs analistas 4.2 Linearidade: Na linearidade deve-se avaliar se o
analisaram 06 (seis) alquotas de 50 mL de uma soluo R2 (Coeficiente de Determinao) maior que 0,99 e se
intermediria com aproximadamente 10 mg Ca2+ L-1. grfico de Perfil dos Resduos possui uma ordem aleatria
na distribuio dos resduos de regresso. As Figuras 2 e 3,
respectivamente, apresentam a curva de calibrao e o
3.6 Estabilidade: o quanto um determinado analito grfico dos resduos de regresso:
varia ao longo de um determinado perodo de tempo.
possvel tambm avaliar a estabilidade de equipamentos de
medio.
A estabilidade poder ser avaliada atravs dos
seguintes tipos de Carta de Controle: Carta de Controle para
Valores Individuais, Carta de Controle para Amplitude
Mvel, Carta Controle para Mdias, Carta de Controle para
Desvio Padro.
Os quatro modelos de Carta de Controle foram
construdas segundo Albano e Raya-Rodriguez[4] para
solues padro de clcio com concentraes de 5,0 e 50,0
mg Ca2+ L-1.

3.7 Robustez: Robustez a susceptibilidade de um

mtodo analtico em responder a pequenas alteraes das Figura 2: Grfico da Linearidade (Curva de Calibrao), que
demonstra um R2 = 0,9999.
condies experimentais as quais podem ser: condies de
armazenamento, ambientais, preparo de amostra ou outra
pequena alterao.
A robustez ser avaliada segundo Albano e Raya-
Rodriguez[4] na qual se sugere duas alteraes em dois
nveis. Neste caso, ocorreu a variao da marca e/ou lote do
padro e a variao do instrumento para a medida da
amostra (pipeta volumtrica e proveta, ambas calibradas e
de 50 mL).

3.8 Incerteza de Medio: O clculo para estimativa

da incerteza de medio foi realizado segundo procedimento
interno do laboratrio seguindo critrios dispostos no
Standard Methods[3], INMETRO (2003)[6] e no Guia
Eurachem[7].
Figura 3: Grfico do Perfil dos Resduos de Regresso.

4. RESULTADOS E DISCUSSO: Assim, estes resultados demonstram que o mtodo

4.1 Seletividade: Na seletividade deve-se avaliar se o
Fcal < Ftab e se as curvas de calibrao possuem R2
(Coeficiente de Determinao) maior que 0,99. Na Tabela 1
so apresentados os resultados para os diferentes tipos de
matrizes em estudo, sabendo que o Ftab para 05 (cinco) vias
na construo da curva de calibrao igual a 6,388[4]:
linear para a faixa de trabalho estudada.
4.3 Sensibilidade: Com a utilizao da soluo padro
de 0,10 mg Ca2+ L-1 obteve-se os seguintes valores para
LDM e LQM:

Tabela 1: Resultados obtidos para o teste de Seletividade. LDM = 0,14 mg Ca2+ L-1 e
Matriz F calculado R2 LQM = 0,21 mg Ca2+ L-1.
gua Deionizada - 0,9999
gua Bruta 1,1740 0,9999
gua Tratada 1,4614 0,9980
gua Subterrnea Poo 1,2019 0,9999 4.4 Preciso: Na preciso se avaliou os testes de
repetitividade e de reprodutibilidade.
Assim, estes resultados demonstram que o mtodo O critrio de aceitao para a repetitividade CV <
seletivo. CVH, onde CV o Coeficiente de Variao e CVH o
Coeficiente de Variao de Horwitz. A Tabela 2 apresenta
os resultados obtidos para CV e CVH nas trs matrizes Assim, estes resultados demonstram que a
estudadas: reprodutibilidade do mtodo satisfatria. E, tambm, que o
mtodo preciso.
Tabela 2: Resultados obtidos para o teste de Repetitividade.
Faixa de
CV CVH
Matriz Concentrao
(%) (%)
4.5 Exatido: Na exatido se avaliou os testes de
(mg Ca2+ L-1) Percentual de Recuperao, Z-score Interlaboratorial e Z-
6,862 0,69 4,23
score Intralaboratorial.
gua Bruta 7,993 0,58 4,14
8,807 0,65 4,08 O critrio de aceitao para o teste de percentual de
23,184 0,11 3,52
recuperao (%R) foi: 90 %R 107. A Figura 4 apresenta
gua Tratada 23,984 0,39 3,51
24,709 0,13 3,49 os resultados obtidos:
gua 26,009 0,06 3,46
Subterrnea 26,804 0,10 3,45
Poo 28,004 0,27 3,43

Assim, estes resultados demonstram que a

repetitividade do mtodo satisfatria.
O critrio de aceitao do estudo de reprodutibilidade
a obteno de um CV < que 10 %. A Tabela 3 apresenta os
resultados para CV nas trs matrizes estudadas:

Tabela 3: Resultados obtidos para o teste de Reprodutibilidade.

V.V.C. utilizado
CV
Matriz na Fortificao Conjunto
2+ -1 (%)
(mg Ca L )
1,00 1,76 Figura 4: Resultado do teste de Percentual de Recuperao.
2,00 An 1 / Eq A 2,32
3,00 1,39 Para o teste de Z-score Interlaboratorial se avaliou as
1,00 1,00 participaes nas duas rodadas do Programa de Ensaios de
2,00 An 1 / Eq B 1,34
Proficincia em Anlises Ambientais promovido pela
3,00 1,37
gua Bruta RMRS ao longo do ano de 2010, onde o parmetro clcio
1,00 1,20
2,00 An 2 / Eq A 1,53 foi avaliado em Efluentes[8]. A Tabela 4 apresenta os
3,00 0,70 resultados de Z-score obtidos pelo nosso laboratrio e
1,00 1,09 tambm os critrios de avaliao utilizados pelo provedor.
2,00 An 2 / Eq B 1,27
3,00 0,58
1,00 0,49 Tabela 4: Resultados obtidos para o teste de Z-score Interlaboratorial.
2,00 An 1 / Eq A 0,20 Rodada Z-Score
3,00 0,35 Primeira 0,647
1,00 0,53 Terceira - 0,146
2,00 An 1 / Eq B 0,38 Critrio: z |2,00| Resultado Satisfatrio
3,00 0,16 |2,00| < z |3,00| Resultado Questionvel
gua Tratada
1,00 0,60 |3,00| < z Resultado Insatisfatrio
2,00 An 2 / Eq A 0,44
3,00 0,50
Para o teste de Z-score Intralaboratorial o critrio de
1,00 0,86
2,00 An 2 / Eq B 0,55 aceitao foi o mesmo utilizado pelo provedor de programas
3,00 0,54 de proficincia RMRS, apresentado no teste de Z-score
1,00 0,15 Interlaboratorial. A Figura 5 apresenta os resultados obtidos
2,00 An 1 / Eq A 0,12 para o teste de Z-score Intralaboratorial.
3,00 0,12
1,00 0,18
2,00 An 1 / Eq B 0,08
gua
3,00 0,17
Subterrnea
1,00 0,34
Poo
2,00 An 2 / Eq A 0,35
3,00 0,41
1,00 0,67
2,00 An 2 / Eq B 0,63
3,00 0,20
Onde: V.V.C. = Valor Verdadeiro Convencional; An. = Analista; Eq.
= Equipamento.
 Figura 5: Resultados obtidos para o teste de Z-score Intralaboratorial.

Como os resultados para os testes de percentual de Figura 7: Carta de Controle para Amplitude Mdia Padro 50,0 mg Ca2+
recuperao, z-score Intralaboratorial e Interlaboratorial L-1.
foram satisfatrios pode-se afirmar que o mtodo exato.

4.6 Estabilidade: A estabilidade foi avaliada atravs da

visualizao das Cartas de Controle do Mtodo aplicadas
nas concentraes 5,0 e 50,0 mg Ca2+ L-1 em um perodo
aproximado de 4 meses, com um total de 20 medies,
divididas entre quatro analistas treinados no ensaio.
O critrio de aceitao para os testes de estabilidade
foram que nenhuma caracterstica abaixo citada possa
ocorrer:

Pontos fora dos Limites Superiores de Figura 8: Carta de Controle para Mdias Padro 50,0 mg Ca2+ L-1.
Controle (LSC);
Pontos fora dos Limites Inferiores de Controle
(LIC);
7 (sete) pontos ascendentes;
7 (sete) pontos descendentes;
7 (sete) pontos acima ou abaixo da linha
central (linha mdia).

As Figuras 6 a 9 apresentam, respectivamente, as

Cartas de Controle para Valores Individuais, para Amplitude
Mvel, para Mdias e para Desvio Padro do padro de 50,0
mg Ca2+ L-1.
Figura 9: Carta de Controle para Desvio Padro Padro 50,0 mg Ca2+ L-1.

Como os quatro modelos de carta de controle

apresentados atendem os critrios estabelecidos, pode-se
afirmar que o mtodo estvel.

4.7 Robustez: Para se avaliar a Robustez do mtodo se

fez necessrio comparar o resultado do Desvio da Robustez
(Sr) com o Desvio da Reprodutibilidade , obtido
anteriormente. Assim, o critrio de aceitao para o teste de
robustez Sr < . A Tabela 5 apresenta estes resultados
comparativos.

Figura 6: Carta de Controle para Valores Individuais Padro 50,0 mg

Ca2+ L-1.

Tabela 5: Resultados obtidos para o teste de Robustez.
Tipo de Desvio Resultado
Sr 0,1933
gua Bruta 0,1120
gua Tratada 0,4043
gua Subterrnea Poo 0,1951
Considerando o Desvio da Reprodutibilidade em gua
Tratada e gua de Poo como os piores casos, pode-se
afirmar que o mtodo Robusto.
4.8 Incerteza de Medio: Aps levantamento das
fontes de incerteza para o ensaio titulomtrico de clcio em
guas, pode-se estimar os valores da incerteza expandida do
ensaio, para um nvel de confiana de 95%. A Tabela 6
apresenta os valores de incerteza de medio para diversas
concentraes de clcio em amostras reais.
Tabela 6: Valores obtidos para a Estimativa da Incerteza de Medio do
ensaio Titulomtrico de Clcio em guas.
Concentrao Incerteza de
(mg Ca2+ L-1) Medio
1,00 0,39
5,00 0,78
10,00 1,03
20,00 1,70
50,00 3,96
80,00 6,43
100,00 7,97
5. CONCLUSES:
O mtodo encontra-se validado, apresentando preciso
e exatido satisfatrias. Os resultados obtidos para os
parmetros considerados para a validao foram:
Seletividade: o mtodo se mostrou seletivo
para as trs matrizes em estudo;
Linearidade: o mtodo mostra-se linear para
toda a faixa estudada, com R = 0,9999;
Sensibilidade: o mtodo apresentou limites de
deteco e quantificao iguais a 0,14 e 0,21
mg Ca2+ L-1, respectivamente;
Preciso: o mtodo apresentou repetitividade e
reprodutibilidade satisfatrias;
Exatido: o mtodo apresentou percentual de
recuperao de 98,35 %R 100,67; Z-score
Interlaboratorial e Intralaboratorial |2,00|;
Estabilidade: os quatro modelos de carta de
controle do mtodo no apresentaram
tendncias nem pontos fora dos limites de
controle;
Robustez: o mtodo apresentou um desvio de
robustez (Sr) de 0,1933, o qual inferior aos
desvios de reprodutibilidade para gua
de poo e tratada;
Incerteza de Medio: o mtodo apresenta
contribuies prximas a 10% do valor
verdadeiro quando est prxima dos limites de
quantificao e tem seu impacto reduzido
quando comparada a altas concentraes do
analito.
Assim, pode-se concluir que a alterao na
metodologia normalizada do livro Standard Methods no
gerou resultados invlidos na determinao de clcio em
guas pelo mtodo titulomtrico do EDTA.
6. REFERNCIAS:
[1] ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS
TCNICAS (ABNT). NBR ISO/IEC 17025:
Requisitos Gerais para Competncia de
Laboratrios de Ensaios e Calibrao. Rio de
Janeiro: ABNT, INMETRO, 2005
[2] REDE DE METROLOGIA E ENSAIOS DO RIO
GRANDE DO SUL (RMRS). Arquivo particular.
[3] A. D. Eaton, et al. (ed.). Mtodo 3500 Ca B. In.: ___.
Standard Methods: for the examination of water and
wastewater, 21 th ed. Washington, DC: American
Public Health Association, 2005.
[4] F. M. Albano, M. T. Raya-Rodriguez, Validao e
Garantia da Qualidade de Ensaios Laboratoriais
Guia Prtico. Porto Alegre, Rede Metrolgica RS,
2009.
[5] INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA,
NORMALIZAO E QUALIDADE INDUSTRIAL
(INMETRO). DOQ-CGCRE-008: Orientao sobre
Validade de Mtodos Analticos. Reviso 03
FEV/2010. Disponvel em: <
http://www.inmetro.gov.br/Sidoq/Arquivos/CGCRE/D
OQ/DOQ-CGCRE-8_03.pdf>. Acesso em 13 abr.
2011.
[6] ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS
TCNICAS (ABNT). Guia para a Expresso da
Incerteza de Metido (GUM). 3. ed. Rio de Janeiro:
ABNT, INMETRO, 2003.
[7] COOPERATION ON INTERNATIONAL
TRACEABILITY IN ANALYTCAL CHEMISTRY;
EURACHEM. Quantifying Uncertainty in
Analytical Measurement. 2 ed., 2000.
[8] REDE DE METROLOGIA E ENSAIOS DO RIO
GRANDE DO SUL (RMRS) Relatrio de 2010
Programa de Ensaios de Proficincia em Anlises
Ambientais. Porto Alegre, 2010.