RT-PCR em tempo real (Syber Green)

1) Fazer Mix: p/ 1 reação

Master Mix Syber Green (2x): 10 uL (1X)
Primer F (10uM) 0,4 uL (0,2uM)
Primer R (10uM) 0,4 uL (0,2uM)
H20 8,2 uL
cDNA (10ng/uL) 1 uL (10ng)
_____________
20 uL

2) Pegar 19 uL do mix mais 1 uL do cDNA (10ng/uL) na placa de 96 poços

(Optical 96-Wells Plate);
3) Colocar na máquina 7500 Fast Real Time PCR Systems (Sala de PCR):
a. Na área de trabalho clicar no programa 7500 Software v2.0.5;
b. Clicar em Guest e seguir Ok
c. Clicar em Continue without connection;
d. Clicar em Advanced setup;
i. Experiment name: colocar o nome da corrida;
ii. Which instrument: escolher o experimento: 7500 Fast;
iii. Type of experimente: escolher o tipo do experimento:
Quantitation – Standard curve
iv. Which reagents: escolher os reagentes do experimento: TaqMan
v. Wich ramp speed: escolher o tempo da corrida: Standard (2hrs)
vi. Plate setup: desenhar a placa: colocar o nome dos genes (targets)
e das amostras (samples);
vii. Confirmar o protocolo da corrida (40ciclos);
viii. Clicar em “Run”.