Plataforma de

Instituto Nacional de Saúde Isolamento Viral

No de Cópias: 1
Procedimento Operacional Padrão POP - DPT - IV- 009

Página 1 de 10 Extração do RNA Viral Usando o Revisão: 0.2

Kit QIAmp Viral RNA Mini Kit

Índice
1. Objectivo....................................................................................................................2
2. Definições e Siglas.....................................................................................................2
3. Campo de Aplicação / Abragência.............................................................................2
4. Responsabilidade........................................................................................................3
5. Amostra......................................................................................................................3
6. Reagentes...................................................................................................................4
7. Segurança e Saúde........................................................................................................5
8. Calibração.....................................................................................................................5
9. Controlo de Qualidade..................................................................................................6
10. Procedimento Técnico...............................................................................................6
11. Critérios de adequação dos resultados........................................................................8
12. Valores de referência...................................................................................................8
13. Interpretação................................................................................................................8
14. Notificação especial.....................................................................................................8
15. Significado do Diagnóstico.........................................................................................8
16. Interferentes.................................................................................................................9
17. Matriz de Responsabilidades.......................................................................................9
19. Referências Bibliográficas...........................................................................................9
20. Anexos.......................................................................................................................10

QUADRO DE ASSINATURAS
Elaboração Revisão/Verificação Aprovação
Nome: Almiro Tivane Nome: Neuza Nguenha Nome: Ana Paula Mandlaze
Cargo: Técnico Superior N1 Cargo: Técnica Superior N1 Cargo: Chefe do Departamento de
Plataformas Tecnológicas
Data: 06.06.14 Data: 07.11.18 Data:
Visto: Almiro Tivane Visto: Visto:
Data da implementação: / /

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1. Objectivo
Descrever o procedimento correcto para extrair o RNA viral de modo a assegurar que o
mesmo seja feito de forma adequada e segura.

2. Definições e Siglas
 LIV-Laboratório de Isolamento viral
 CNe-Controlo Negativo da Extração
 CBS-Cabine de Biosseguraça
 RNA-Ácido Ribonucléico
 AW1: Tampão de Lavagem 1
 AW2: Tampão de Lavagem 2
 Tampão AVL: Tampão de Lise Viral
 Tampão AVE: Tampão de eluição (pode ser substituido por água ultra pura)
 PCR: Reacção em Cadeia da Polimerase
 N/A: Não aplicável
 CDC: Centro para controlo e prevenção de doenças (do inglês “Centre for
Disease Control and Prevention”)
 HSC: Controlo da amostra humana (do Inglés “Human Specimen Control”)
 POP-Procedimento Operacional Padrão
 uL-Microlitros
 ºC-Graus Celsius

3. Campo de Aplicação / Abragência

Aplica-se ao procedimento de extração do RNA viral em amostras de secreções
respiratórias, plasma, soro, urina, suspensão de cultura de células, ou fluidos corporais
livres de células.

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4. Responsabilidade
Este documento é da responsabilidade do chefe do laboratório e da gestora da qualidade.
Estes devem assegurar a divulgação e a aplicação deste documento por parte dos
técnicos do sector.

5. Amostra

5.1 Preparação do Paciente

N/A.

5.2 Tipo de amostras

Amostras de secreções respiratórias, plasma, soro, urina, suspensão de cultura de
células, ou fluidos corporais livres de célula.

5.3 Volume mínimo de amostra

140μL

5.4 Frascos adequados/Recipientes adequados

Tubos de fundo cônico 1.7ml, estéreis livres de RNA-DNAses e crioviais de base plana
2mL, estéreis livres de RNA-DNAses

5.5 Estabilidade e armazenamento

Vide POP - DPT- IV- 001 e POP - DPT- IV- 002 para a preparação e conservação das
amostras do trato respiratório.

5.6 Preparação da amostra

Descongele as amostras, homogeinize e sedmente com o auxílio do vortex e centrifuga

respectivamente antes da realização da técnica.

5.7 Amostras Inadequadas

Vide POP - DPT- IV- 003

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6. Reagentes
6.1 Tipos de Reagentes
- QIAamp RNA Mini Kit
- Etanol absoluto( 96-100%)
- Água DEPC (água ultra pura).

6.2 Estabilidade e armazenamento

Todos os reagentes do kit Qiagen são estáveis a temperatura ambiente, com excepção do
RNA carreador que deve ser conservado entre 2 a 8ºC após a sua reconstituição.

6.3 Grau de toxidade do Reagente

Vide MSDS de cada reagente coinstituente.

6.4 Acção em caso de Acidente

Vide POP-CIBio-001

6.5 Preparação dos Reagentes

a) Adicionar 310µl de Tampão AVE para o tubo contendo o RNA carreador
liofilizado para obter uma solução de 1µg/µl. Após a preparação o RNA carreador
deve ser amazenado a uma temperatura de -30 a -15ºC. Caso o AVL+carreador de
RNA tenham sido preparados antes e se houver formação de cristais, descristalize
antravés do pré-aquecimento a 37-80°C no banho maria.
b) Calcule o volume da solução RNA carreador mais tampão AVE de acordo com o
número de amostras a serem processadas (ver a tabela 1)

Tabela 1: Volume do tampão AVL e do RNA carreador + AVE necessários para processar X
número de amostras.
RNA carreador Nº de RNA carreador
Nº de amostras Tampão AVL Tampão AVL
+ AVE amostras + AVE
1 0.56 5.6 8 4.48 44.8
2 1.12 11.2 9 5.04 50.4
3 1.68 16.8 10 5.60 56.0
4 2.24 22.4 11 6.16 61.6
5 2.80 28.0 12 6.72 67.2

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6 3.36 33.6 13 7.28 72.8

7 3.92 39.2 14 7.84 78.4

c) Tampão de Lavagem 1 (AW1) :

 Para o kit de 50 extrações de RNA, acrescente 25 mL de etanol (96-100%) ao
concentrado AW1 (19 mL). Dando um volume final de 44 mL de AW1.
 Para o kit de 250 extrações de RNA, acrescente 125 mL de etanol (96-100%) ao
concentrado AW1 (95mL). Dando um volume final de 220 mL de AW1.
d) Tampão de Lavagem 2 (AW2)
 Para o kit de 50 extrações de RNA, acrescente 30 mL de etanol a 96-100% ao
concentrado AW2 (13 mL). Dando um volume final de 43 ml de AW2.
 Para o kit de 250 extrações de RNA, acrescente 160 mL de etanol (96-100%) ao
concentrado de AW2 (66ml). Dando um volume final de 226 mL de AW2.
(NOTA: Tampão de Lavagem 1 e 2 é estável durante um ano quando armazenado á
temperatura ambiente desde que se verifique o prazo de validade).
e) Coloque o Tampão de eluição AVE a temperatura ambiente antes de começar a
extracção.
f) Faça uma alicota de etanol a 96-100% em um tubo falcon na quantidade necessária
para processar as amostras (n amostras x 560 µl de etanol).
g) Adicione o carreador de RNA ao Tampão AVL de acordo com a quantidade de
amostras processadas (Tabela 1).

7. Segurança e Saúde
O procedimento deve ser efectuado dentro da cabine de segurança biológica, usando
sempre o equipamento de protecção individual e deve-se também respeitar as regras de
biossegurança, conforme indicado no manual de Biossegurança.

8. Calibração
N/A.

8.1 Tipo de calibrador

N/A.

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8.2 Periodicidade
N/A.

8.3 Limites aceitáveis

N/A.

8.4 Acção em caso de não conformidade

N/A.

9. Controlo de Qualidade

9.1 Preparação dos Materiais

Vide ponto 10 deste POP.

9.2 Tipo de controlo Interno/Externo

Interno.

9.3 Frequência de utilização

Todas as vezes que se efectua a extração.

9.4 Limites aceitáveis

N/A

9.5 Acção em caso de não conformidade

Em casos de não conformidade deve-se repetir todo procedimento.

10. Procedimento Técnico

10.1. Passo a passo

1. Desinfecte a cabine de fluxo segundo o POP-DPT-IV-028 e ligue a luz UV por
15 minutos.
2. Preencha o formulário de extração (FM-DPT-IV-007) com os códigos das
amostras e os lotes dos reagentes que serão usados. Em cada grupo de amostras

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a extrair, deve ser incluso um controlo negativo da extracção, constituído apenas

por água ultra pura.
3. Identifique os tubos com o código da amostra, data, iniciais e o tipo de ácido
nucleico a ser extraido em duplicado.
4. Adicione para cada tubo 560 µl de tampão AVL+ careador e 140µl da amostra
correspondente, agite durante 10 segundos usando um agitador por vortex.
5. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
6. Adicione 560 µl de etanol (96-100%), vortexar por 5 segundos e faça uma
centrifugação pulsada (pulse) durante 10 segundos.
7. Transfira 630μL da solucão do passo 6 para a coluna QIAmp com tubo colector,
previamente identificada.
8. Centrifugue durante 1 min a 6000xg (8000rpm);
9. Transfira a coluna para outro tubo colector e descarte o anterior, repita os
passos 8 e 9 com o restante volume da solução do ponto 6.
10. Transfira a coluna para outro tubo colector, descarte o anterior.
11. Adicione 500 µl do AW1e centrifugue durante 1 min a 6000xg (8000rpm).
12. Transfira a coluna para outro tubo colector, descarte o anterior.
13. Adicione 500 µl do AW2 e centrifugue durante 3.5 min a 16100xg (13200rpm).
14. Transfira a coluna para outro tubo colector, descarte o anterior.
15. Centrifugue durante 1 min a 16100xg (13200rpm) para secar completamente a
coluna.
16. Transfira a coluna para um tubo 1.7ml préviamente identificado com a data,
código da amostra e as iniciais do nome da pessoa que fez a extracção e o tipo
de ácido núcleico extraído.
17. Pipete 80 µl do AVE (a temperatura ambiente) no centro da membrana, sem
tocar a membrana e incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Ter sempre o
cuidado de certificar que o AVE não ficou apenas nas paredes da coluna.
18. Centrifugue durante 1 min a 6000xg (8000rpm).
19. Conferir se todo o volume do AVE passou da membrana para o tubo de 1,7ml.
20. Descarte a coluna, feche e armazene o tubo contendo o RNA extraído num
criobox identificado com o número e o ano mais recente (ex: Caixa 1/16) a -
70ºC.

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10.2 Equipamento utilizado e alternativas

Micro centrifuga, banho maria, vortex, pipetas, cabine de biossegurança, congelador -
80oC e geleira 2-8oC. Em casos de avaría de um destes equipamentos, deve-se solicitar o
uso dos equipamentos de um outro laboratório do INS.

10.3 Cálculos
N/A.

10.4 Linearidade
N/A.

10.5 Sensibilidade
N/A.

11. Critérios de adequação dos resultados

11.1 Validação
Vide o POP-DPT-IV-008.

12. Valores de referência

N/A

13. Interpretação
Vide o POP-DPT-IV-008.

14. Notificação especial

N/A.

15. Significado do Diagnóstico

N/A.

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16. Interferentes
Poeiras, nucleases e ligantes não específicos.

17. Matriz de Responsabilidades

Ponto Focal de Responsável do
Actividade Técnico
Qualidade Laboratório
Realizar a extração do RNA
viral x x

Assegurar a realização das

actividades de extração do x x
RNA viral
Verificar e validar os
procedimentos de extração x x
de RNA

18. Histórico de Emendas

Data Revisão actual Modificações
Correções ortográficas
Alteração de conteúdo no item 5.5
10.08.16 Alteração de conteúdo no item 5.6
0.1
Alteração de conteúdo no item 10.1
Alteração de conteúdo no item 10.1 ponto 8
Alteração de conteúdo no item 10.1 ponto 21
Alteração de conteúdo no item 6.5
07.11.18
0.2 Alteração de conteúdo no item 10.1

19. Referências Bibliográficas

- SAMBROOK and RUSSEL, Molecular Cloning, A laboratory Manual, V2, 3ª
ed., CSHL PRESS;
- QIAGEN (2003), QIAamp RNA Mini Kit and QIAamp Blood Mini Kit
Handbook;
- Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza,
WHO, 2011.

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20. Anexos
Tempo
Responsável de
Indexaç Local de
Identificação Pasta pelo Arquiv
ão Arquivo
Arquivo o
(anos)

FM-DPT-IV-007 PIV-
1,2 LIV GQ 5 anos
003

FM-DPT-IV-005 PIV-
1,2 LIV GQ 5 anos
003
INDEXAÇÃO
1 – Por nº crescente
2 – Por data crescente
3 – Por nº documento crescente
NA – Não Aplicável

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