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Ministério da Educação

Universidade Tecnológica Federal do Paraná


Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação
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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO FINAL DE ATIVIDADES (AGOSTO/ 2009 A AGOSTO/ 2010)

Monitoramento das Associações de Simbiose e Antibiose


Microbiana em Iogurtes Comercializados na Região Oeste do
Paraná

Daiane Corti

Coordenador: Prof (ª). Dr(ª). Eliane Colla


Co-orientador: Prof (ª). MSc. Celeide Pereira

Modalidade: PIBIC/FUNDAÇÃO ARAUCÁRIA

CAMPUS MEDIANEIRA, AGOSTO de 2010.


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1. TÍTULO Monitoramento das Associações de Simbiose e Antibiose


Microbiana em Iogurtes Comercializados na Região Oeste do Paraná

2. RESUMO: O consumo de produtos lácteos fermentados ocorre desde a mais


remota antiguidade, principalmente pelos povos orientais. Estes produtos eram
considerados eficazes no tratamento de vários males do homem, sendo utilizado no
tratamento de numerosos distúrbios orgânicos, notadamente nas desordens do
estômago, fígado e intestinos. O iogurte exerce efeitos benéficos à saúde,
especialmente devido a sua maior digestibilidade quando comparado ao leite e
maior concentração de vitaminas (B6 e B12) e minerais (cálcio, fósforo, potássio).
Dentre os efeitos benéficos à saúde atribuídos aos leites fermentados estão a
estimulação da produção de ácido lático sobre as glândulas digestivas e intestinais,
fornecimento de flora microbiana adequada, além de ser um produto rico em
peptonas derivadas da caseína. O objetivo principal do trabalho foi monitorar o
período de ocorrência das associações de simbiose e antibiose entre os cocos
(Streptococcus termophilus) e os bacilos (Lactobacillus delbrüeckii subsp.
bulgaricus) em iogurtes comercializados na região Oeste do Paraná. Avaliaram-se
quatro marcas de iogurtes, de dois lotes, as quais foram denominadas de marcas A,
B, C e D, nos tempos de 15, 30 e 45 dias de vida útil. Os iogurtes foram submetidos
à análise microbiológica visando determinar a contagem de lactobacilos, segundo a
metodologia COLLINS e LYNE, (1989). Os resultados obtidos demonstraram que na
contagem de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus no primeiro lote, três marcas
não apresentaram uma contagem mínima de células viáveis do microrganismo no
tempo 45 dias de armazenamento, não atendendo a legislação brasileira em vigor.
Apenas uma das amostras analisadas apresentou contagem de células viáveis do
microrganismo de acordo com a legislação brasileira. No segundo lote avaliado, uma
amostra não apresentou contagem de células viáveis do microrganismo no período
de 15 dias, apresentando posterior crescimento em 30 dias de vida de prateleira.
Nenhuma das quatro amostras apresentou contagem mínima de células viáveis
durante 45 dias de armazenamento, não atendendo a legislação brasileira em vigor.

Palavras-chave: iogurte, simbiose, antibiose.


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3. INTRODUÇÃO

De acordo com a Instrução Normativa nº 46, de 23 de outubro de 2007


(BRASIL, 2007), entende-se por Iogurte o produto incluído na definição de leites
fermentados cuja fermentação se realiza com cultivos protosimbióticos de
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, aos quais se podem acompanhar, de forma complementar, outras
bactérias ácido-lácticas que, por sua atividade, contribuem para as características do
produto final. Segundo OLIVEIRA (1993), o iogurte exerce efeitos benéficos à saúde,
especialmente devido a sua maior digestibilidade quando comparado ao leite e
maior concentração de vitaminas (B6 e B12) e minerais (cálcio, fósforo, potássio).
Pertencente ao gênero Lactobacillus, família Lactobacillaceae, estes
microrganismos são bacilos geralmente largos e finos, que formam cadeias na
maioria de suas espécies. São microaerófilos, catalase positivo, Gram negativos, e
fermentam os açúcares produzindo ácido láctico com principal produto. Se são
homofermentativos, fermentam o açúcar formando principalmente, ácido láctico e
insignificantes quantidades de ácido acético, dióxido de carbono e outros produtos;
se são heterofermentativos, produzem ácido láctico, e uma importante quantidade
de compostos voláteis, entre eles se encontram o álcool (JAY, 1994). O
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophillus, estão entre os lactobacilos
homofermentativos. O Streptococcus thermophillus, pertencente ao gênero
Streptococcus, família Lactobacillaceae, são cocos que formam cadeias curtas ou
largas, e são homofermentativos (FRAZIER e WESTHOFF, 1993).
Os S. thermophilus são esféricos ou ovóides, imóveis, geralmente
arranjados aos pares ou cadeias, anaeróbicos facultativos, termodúrico e resistente
à pasteurização clássica (60°C/ 30min). É amplamente utilizado como fermento
láctico na produção de iogurtes, leites fermentados e queijos. Desenvolvem-se a
temperatura entre 19 a 52ºC, sendo a temperatura ótima de crescimento 37ºC
(SILVA et al., 2007).
O pH e a temperatura ótima para o desenvolvimento do Streptococcus
estão em torno de 6,8 e 38°C, enquanto que para os Lactobacillus, estão
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compreendidos em 6,0 e 43°C. O primeiro chega até 90° Dornic de acidez, enquanto
o segundo vai até 140° Dornic (BEHMER, 1999).
As bactérias láticas Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus crescem simbioticamente. O resultado do
crescimento conjunto é que se acelera o metabolismo e consegue-se a mesma
consentraçao de ácido lático e de outros metabólicos em menos tempo do que se
crescerem separadas. Contudo, os produtos que se formam , contribuem para o
sabor e o aroma do produto final (ORDÓÑEZ, 2005).
Durante a fermentação do iogurte, o S. thermophillus é o primeiro a
desenvolver-se e, preparando assim condições propícias ao desenvolvimento do
Lactobacillus (produção de ácido fórmico e pirúvico, começo da acidificação,
abaixamento do potencial oxiredutor). Além de prosseguir a fermentação láctica, o
Lactobacillus hidrolisa certas proteínas que fornecerão ao Streptococcus os
peptídeos e os aminoácidos essenciais à continuação do seu desenvolvimento. O
Lactobacillus é o principal produtor de compostos responsáveis pelo sabor e o
aroma característico do iogurte (acetaldeído, diacetil, etc.) (FERREIRA, 2005).
Entretanto, a cultura iniciadora do iogurte deve conter uma percentagem
igual das duas bactérias, do contrário não se obterá a consistência e a característica
desejável do odor no produto industrializado (BEHMER, 1999).
É de extrema importância que exista um balanço adequado entre as
contagens de Streptococcus termophillus e Lactobacillus bulgaricus. A
predominância de qualquer uma das espécies pode acarretar em defeitos para o
produto final. Os principais fatores que podem afetar o balanço adequado entre os
dois microrganismos são o tempo e a temperatura de incubação e a porcentagem de
inóculo. Por exemplo, um tempo menor de incubação pode resultar em um produto
com maior proporção de cocos e com um sabor fraco. Por outro lado, um tempo
maior de incubação ou resfriamento inadequado podem favorecer a predominância
de bacilos, resultando em produto com sabor amargo (WALSTRA et al, 1999).
Assim, a estabilidade dos microrganismos durante a vida de prateleira e sua
presença em números viáveis (mínimo 107 UFC/g) no iogurte é essencial para os
efeitos benéficos ao organismo, sendo que quanto mais novo o iogurte, mais
balanceada é a proporção entre os microrganismos e mais saboroso é o produto.
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A Contagem de bactérias láticas totais Streptococcus termophillus e


Lactobacillus bulgaricus deverão cumprir os requisitos considerados de no mínimo
107 ufc/mL no iogurte durante seu período de validade ( BRASIL,2007).
Segundo KOPPER (2009), a necessidade de manter um número elevado
de microrganismos viáveis no produto final é decorrente da dose diária mínima
recomendada, usualmente considerada de 108 a 109 células viáveis, obtidas pelo
consumo de 100 g de produto com 106–107 células viáveis por mL. Estes produtos
devem ser consumidos regularmente para manter o efeito dos microrganismos na
composição da microbiota intestinal.
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4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1. LEITE

Leite é o produto obtido da secreção láctea de uma ou mais vacas sadias


e bem alimentadas, eliminando-se o produto quinze dias antes e cinco dias após o
parto. O leite é um líquido branco e opaco, mais viscoso e denso que a água, de
sabor pouco acentuado (TEIXEIRA, 1987).
O leite é um alimento de grande valor nutritivo pois é fonte de proteína,
gordura, energia e outros constituintes essenciais, os quais fornecem ao homem
macro e micro nutrientes ao seu desenvolvimento e manutenção da saúde, fato este
que o torna um dos principais alimentos do homem (TINÔCO, 2002).
O leite é também considerado, uma das fontes mais adequadas de cálcio.
É muito importante para o corpo humano principalmente durante a fase de
crescimento, quando a absorção média do cálcio varia de 21 % a 27 %.
Recentemente, estudos para reduzir o risco de osteoporose em idosos
demonstraram que o consumo de cálcio deve ser maior, já que entre as causas
dessa doença existem evidências crescentes de que o consumo inadequado de
cálcio ao longo da vida é o mais importante. Isto justifica a necessidade de se
consumir leite em todas as faixas etárias (TRONCO, 1997).

4.2. PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS

Entende-se por Leites Fermentados os produtos adicionados ou não de


outras substâncias alimentícias, obtidos por coagulação e diminuição do pH do leite,
ou leite reconstituído, adicionado ou não de outros produtos lácteos, por
fermentação láctica mediante ação de cultivos de microrganismos específicos. Estes
microrganismos específicos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final
durante seu prazo de validade (LERAYER et al, 2002).
O consumo de produtos lácteos fermentados vem desde a mais remota
antiguidade, sendo consumido principalmente pelos povos orientais (VEISSEYRE,
1998). Estes produtos eram considerados eficazes no tratamento de vários males do
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homem, sendo utilizado no tratamento de numerosos distúrbios orgânicos,


notadamente nas desordens do estômago, fígado e intestinos. Além disso, era
utilizado para estimular o apetite, regulariza a temperatura do sangue e melhorar a
cor da pele (MOREIRA et al, 1999).
Dentre os efeitos benéficos à saúde atribuídos aos leites fermentados
estão a estimulação da produção de ácido lático sobre as glândulas digestivas e
intestinais, fornecimento de flora microbiana adequada, produto rico em ácido lático
e peptonas derivadas da caseína (SOROA, 1980).
Existem muitas variedades de leites fermentados, sendo que muitas deles
são elaborados utilizando tecnologias similares (VARNAM & SUTHERLAND, 1995).
Esses produtos são elaborados com bactérias lácticas que promovam a coagulação
do leite. A diferença entre as variedades baseia-se na composição do leite,
temperatura de incubação, flora lática presente e outros microrganismos além dos
láticos (SÁ & BARBOSA, 1990).
Segundo VARNAM & SUTHERLAND (1995), os leites fermentados
podem ser classificados de várias formas, porém geralmente são classificados
conforme a função do tipo de microrganismos utilizados para sua elaboração, sendo
que as culturas iniciadoras utilizadas com maior freqüência pertencem ao grupo das
bactérias ácido láticas. SOROA (1980), classifica os leites fermentados em leites
fermentados ácidos, como o iogurte, gioddu, leben, mazum, kaimak; e leites
fermentados ácido-alcoólicos como o quefir e o kumys.
As características mais apreciáveis e mais importantes dos produtos
lácteos fermentados são sabor e textura. Essas propriedades estão relacionadas
com o pré-aquecimento da matéria prima e com o crescimento das cepas
microbianas em condições determinadas e perfeitamente controladas, sendo que a
maior parte das culturas são compostas por várias cepas de microrganismos que
freqüentemente atuam em simbiose (AMIOT, 1991).
O termo fermentado descreve o processo de inoculação do leite com
microrganismos que transformam a lactose em ácido lático (EARLY, 2000), sendo
que este é o componente responsável pelo sabor e aroma de todos os leites
fermentados (VARNAM & SUTHERLAND, 1995). Na rota metabólica de terminadas
bactérias há também a produção de dióxido de carbono, ácido acético, diacetil,
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acetaldeído e muitos outros compostos que determinam o sabor, a textura e o aroma


característicos de cada um dos produtos lácteos fermentados (EARLY, 2000).
No caso de iogurtes e produtos similares, o acetaldeído é o componente
dominante, sendo que a sua produção é acentuada quando são adicionados sólidos
ao leite. O diacetil está presente em quantidades sensorialmente importantes
quando são utilizadas culturas que contém Lactobacillus lactis subsp lactis biovar
diacetylactis ou espécies de Leuconostoc. Nos leites fermentados alcoólicos como o
quefir e Koumis, o etanol produzido pelas leveduras predomina nas características
sensoriais (VARNAM & SUTHERLAND, 1995).
A textura do produto se deve a fatores como o enriquecimento do extrato
seco do leite integral, a intensidade e duração do tratamento térmico, a adição de
espessantes, a velocidade e o grau de acidificação e as condições de refrigeração,
entre outros. Já o aroma depende da qualidade da matéria prima e também da
natureza da flora microbiana e das condições de incubação (AMIOT, 1991).

4.2.1. Iogurte

O iogurte é originário da Ásia, onde os turcos viviam como nômades e das


regiões orientais do Balcãs, especialmente da Bulgária (SOROA, 1980; SÁ &
BARBOSA, 1990).
A versão clássica sobre o iogurte é de que, no passado, nômades
carregavam pelo deserto leite acondicionado em vasilhames feito de estômago de
bezerro. Estes recipientes, em contato com o corpo dos camelos faziam com que o
leite se transformasse em uma massa semi-sólida pela ação da microbióta presente
no leite, que encontrava condições ideais de incubação. As baixas temperaturas
durante a noite paralisavam o processo de fermentação. Pela manhã, sem outro
recurso se não o de consumirem o produto, os nômades passaram a gostar dele
(AZEVEDO et al, 2004).
O iogurte é um alimento de alto valor nutritivo e seu tradicional e contínuo
consumo no mundo se deve fundamentalmente a sua imagem de um produto
saudável (EARLY, 2000). Além de nutritivo, trata-se de um alimento com as
seguintes propriedades terapêuticas: redução de reações alérgicas à proteína,
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estímulo de secreções intestinais, facilitador da absorção de fósforo e cálcio, ajuda


na síntese de vitamina K e vitaminas do complexo B, redução do nível de colesterol
(no caso de usar leite desnatado) (LIMA, 2003).
Segundo OLIVEIRA (1993), o iogurte consumido diariamente exerce,
principalmente para determinadas pessoas, efeitos benéficos no auxílio da digestão
no funcionamento geral do aparelho digestivo, reduz a incidência da intolerância à
lactose, de doenças gastrointestinais e a ação contra microrganismos indesejáveis
ou patogênicos.
Por ser previamente digerido pelos lactobacilos, o iogurte não provoca
acidez no estômago, nem reações alérgicas adversas. A digestão protéica é duas
vezes mais rápida que o leite cru. Isso se deve em parte a hidrólise parcial das
proteínas do iogurte e em parte a estrutura física do coágulo que é muito diferente
da que se forma quando o leite chega ao estômago e permite facilmente a interação
entre as enzimas estomacais e seus substratos (VARNAM & SUTHERLAND, 1995).
BROWN e MAEDA (2003) relatam que o iogurte produzido nas últimas
décadas, pela fermentação do leite por bactérias produtoras de ácido láctico
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbruechii subsp.
bulgaricus, tornou-se um produto mais racional, em virtude da contribuição das
disciplinas de microbiologia e enzimologia, física, engenharia química e bioquímica.
Esse produto controlado tem sido considerado, iogurte de segunda geração, onde, o
pH, a acidez, a concentração de microrganismos viáveis e as propriedades
sensoriais são monitoradas e refletem a qualidade do produto final.
Em geral a produção de iogurte compreende as seguintes etapas:
homogeneização, tratamento térmico, resfriamento, inoculação, incubação,
refrigeração, quebra do gel, envase e armazenamento (FERREIRA, 2001; TAMINE
et al, 1991).

4.2.2. Classificação e Composição Química

Entende-se por iogurte o produto adicionado ou não de outras


substâncias alimentícias obtidos por coagulação e diminuição do pH do leite, ou leite
reconstituído, adicionado ou não de outros produtos lácteos, por fermentação láctica
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mediante ação de cultivos de Streptococcus salivarius subsp thermophilus e


Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus que poderão ser acompanhadas, como
complementação, por outras bactérias ácido láticas que contribuem para a
determinação das características do produto final (LERAYER et al, 1998; RAMOS et
al, 2002).
Existem diversos tipos de iogurtes, entre eles o tradicional e o batido,
sendo que o tradicional possui consistência mais firme (MIRANDA et al, 1999;
ROCHA et al, 2003). O iogurte tradicional é incubado já na embalagem de venda
para que não haja a quebra da coalhada. Em contra partida, o iogurte batido após a
fermentação sofrerá a quebra da massa para proceder o envase tendo como
conseqüência um produto menos firme (FIGUEIREDO & PORTO, 2002).
De acordo com a legislação brasileira, os leites fermentados, incluindo os
diferentes tipos de iogurte, classificam-se quanto ao teor de gordura em com creme
(aquele cuja base Láctea contenha 6,0g/100g), integral (com 3,0g/100g) e
desnatado (com 2,9g/100g).
A gordura é responsável pela cremosidade e maciez dos alimentos,
contribuindo também para a aparência, palatabilidade e lubrificação, além de
aumentar a sensação de saciedade durante as refeições (CASTRO et al, 2002).
O iogurte também constitui-se de uma fonte rica de proteínas, fósforo,
vitaminas e carboidratos (TEIXEIRA et al, 2000). O valor nutritivo do iogurte depende
da sua composição, ou seja, da matéria-prima utilizada, dos ingredientes
adicionados e o processo de fabricação (EARLY, 2000). A composição do produto é
basicamente a mesma do leite utilizado (OLIVEIRA, 1993).
Segundo as normas da Organização Mundial da Saúde (FAO/WHO), no
iogurte batido, a porcentagem de sólidos não gordurosos deve estar na faixa de 8,5
% a 10 %, O produto tradicional que é mais firme, deve ter 12 % de sólidos não
gordurosos. Os sólidos totais têm efeito marcante na firmeza do gel do iogurte. Em
geral, quanto maior a porcentagem de sólidos, mais firme é o produto.
Um aumento dos sólidos totais, além de resultar num aumento da
titulação (devido ao maior teor de proteínas, citratos e fosfatos), reduz o tempo de
coagulação. A composição do SNG são principalmente a lactose, as proteínas e os
sais minerais (TAMINE & ROBINSON, 1991).
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A consistência é melhorada quando o percentual do extrato seco total do


leite é elevado de 12 para 20 %. Porém, as diferenças de consistência são muito
pequenas para os teores entre 16 % e 20 % de sólidos. Logo não há interesse em
utilizar concentrações acima de 16 % (PENNA, OLIVEIRA E BARUFFALDI, 1994).
No entanto, se o teor de extrato seco total do leite for superior a 25 %
haverá uma redução na água disponível para o crescimento da cultura láctica tendo
como conseqüência uma inibição da sua atividade. Devido ao efeito tamponante das
proteínas, fosfatos, citratos, lactatos e outros componentes do leite, o extrato seco
desengordurado do leite é acompanhado de um aumento na acidez de valoração
global do leite, o qual pode produzir uma diminuição no tempo de coagulação
(TAMINE & ROBINSON, 1991).
Quanto à qualidade, o iogurte pode ser avaliado através de análises
como: acidez titulável, pH, determinação da composição, vida-de-prateleira e, ainda,
as avaliações sensoriais como sabor, aparência, consistência e textura (PENNA,
OLIVEIRA e BARUFFALDI, 1994). De acordo com a legislação para leites
fermentados (BRASIL, 2000), através da Resolução n° 5, de 13 de novembro de
2000, o iogurte deve apresentar de 0,6 a 1,5g de ácido lático/100g. Segundo EARLY
(2000), para a obtenção de um produto final de qualidade é necessário controlar
rigorosamente fatores como características física e química da matéria-prima, os
ingredientes adicionais, o tratamento térmico utilizado, a emulsificação ou
homogeneização e a preparação da cultura e do substrato que está sendo usado
para fermentação, ajuste da escala de produção pelo controle da quantidade de
starters, menor ou maior concentração, de modo a controlar o tempo gasto na
elaboração de um produto, maior uniformidade do produto em diferentes lotes de
produção, produção de compostos responsáveis pelo aroma, atividade proteolítica e
lipolítica e produção de substâncias, tais como álcool, agentes texturizantes como
exopolissacarídeos e CO2 (FERREIRA, 2001).
As bactérias lácticas utilizadas em produtos lácteos fermentados são de
natureza mesofílica que crescem na faixa de 10 a 45 ºC, com um crescimento médio
(ótimo) a 35ºC (FERREIRA, 2001).
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Durante o crescimento associativo das bactérias do iogurte, observa-se a


produção rápida de acidez e aparecimento das bactérias do iogurte. Dentre os
principais componentes

4.3. PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO

Os métodos de fabricação variam consideravelmente em todos os países


segundo a matéria-prima utilizada, o volume de produção, a formulação do produto e
o tipo de iogurte que se deseja obter. Mas existem alguns princípios básicos comuns
que determinam a natureza e qualidade do produto final, como: aumento da
quantidade de sólidos totais, tratamento térmico a altas temperaturas (≥ 80°C), tipo
de incubação, adição de frutas, aromatizantes e corantes (EARLY, 2000).
O processamento do iogurte fundamenta-se na acidificação do leite,
resultado da associação de microrganismos formada pelo Streptococcus salivarius
subsp termophilus e o Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (MIRANDA et al,
1999; ROCHA et al, 2003), na proporção de 1:1 (OLIVEIRA, 1993; SÁ & BARBOSA,
1990). Estes fermentam a lactose, liberando ácido lático e coagulando o leite
(MIRANDA et al, 1999).
Para a produção de iogurte é necessária a utilização de leite de excelente
qualidade, sendo que este produto possui um processo fermentativo altamente
seletivo sujeito a sofrer facilmente desvios de qualidade se a matéria prima não for
de boa qualidade. O leite deve ser fresco, com acidez de 16 °D, isento de resíduos
de antibióticos, colostro ou leite mamítico, assim como a ausência de conservantes
(SÁ & BARBOSA, 1990).
A utilização de edulcorantes tem por finalidade amenizar a acidez
desenvolvida durante a fermentação e quando são adicionadas frutas muito ácidas
na produção de iogurte sendo que os mais utilizados são a sacarose e a glicose,
podendo também adicionar maltose, galactose e frutose (EARLY, 2000). Geralmente
os edulcorantes, corantes e aromatizantes são adicionados depois da pasteurização
para evitar a degradação térmica das mesmas (VARNAM & SUTHERLAND, 1995).
As frutas adicionadas nos iogurtes contém em torno de 50% de açúcar, o que é
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suficiente para o produto, sendo que pequenas quantidades de edulcorantes podeM


ser adicionadas em iogurte natural (ALFA – LAVAL, 1990).
Os agentes estabilizantes e espessantes mais utilizados são os amidos
naturais, arginatos, Agar, carragena, gomas comestíveis, pectina e celulose. Suas
funções são de manter a viscosidade, modificar a estrutura e a textura, facilitar a
suspensão das partículas das frutas e evitar separação do soro (EARLY, 2000). Se o
iogurte for produzido de forma correta não é necessário a utilização de estabilizante
sendo que a formação de um gel fino e consistente com alta viscosidade ocorre
naturalmente (ALFA – LAVAL, 1990).
Para evitar a separação da gordura durante a fermentação e
armazenamento é necessário realizar a homogeneização do leite que reduz o
tamanho dos glóbulos de gordura facilitando assim a estabilização da emulsão
(EARLY, 2000).
O leite utilizado para produção do iogurte é submetido a tratamento
térmico sendo usualmente utilizado o tratamento a 80 – 85 °C por 30 minutos, sendo
que o mesmo influencia no aumento da viscosidade do iogurte e obtenção de uma
boa textura, além da eliminação de microrganismos patogênicos e deterioradores
que podem dificultar o crescimento das culturas iniciadoras (VARNAM &
SUTHERLAND, 1995). FERREIRA (1987), cita que este binômio de tempo-
temperatura altera as estruturas físico-químicas das proteínas, no pH e nas
propriedades nutritivas do substrato.
Após o tratamento térmico o produto deve ser resfriado a uma
temperatura adequada, em torno de 42 °C, para a adição da cultura. Depois de
adicionada a cultura lática o iogurte é fermentado conforme a necessidade do
produto final, ou seja, na embalagem de venda para iogurtes firmes ou em tanques
de fermentação para iogurtes batidos (EARLY, 2000).
A fermentação pode ser realizada pelo método de incubação curto onde o
iogurte é fermentado a 40 – 45 °C com duração mínima de 2:30 horas, ou pelo
método de incubação longo onde o produto é posto a uma temperatura de 30 °C
durante até 18 horas ou até alcançar a acidez desejada (TAMINE & ROBINSON,
1991).
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As bactérias láticas agem em simbiose, sendo que no inicio da


fermentação, o pH do leite favorece o crescimento Streptococcus salivarius subsp
termophilus que aumentam a acidificação do meio através da transformação da
lactose em ácido lático. Com o aumento da acidez ocorre o favorecimento para o
crescimento do Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus que são microrganismos
proteolíticos produtores de aminoácidos como a glicina, valina e histidina a partir da
casseína (SCHABARUM et al, 2003).
O processo de fermentação modifica as substâncias nutritivas presentes,
porém, a composição final do iogurte esta ligada à composição do leite e dos
ingredientes adicionados (VARNAM & SUTHERLAND, 1995).
A cultura lática metaboliza a lactose presente no leite para suprir suas
necessidades energéticas, dando lugar à formação de ácido lático e outros
compostos importantes (TAMINE & ROBINSON, 1991).
Após a fermentação o iogurte é resfriado com o objetivo de reduzir a
atividade metabólica da cultura para controlar a acidez do produto (FERREIRA,
1987).

4.4. EFEITO DE SIMBIOSE E ANTIBIOSE

Os microrganismos Streptococcus termophillus e Lactobacillus delbrueckii


subsp. bulgaricus exibem uma relação denominada protocooperação ou simbiose
durante o processo fermentativo de produção do iogurte, já que não existe
dependência um do outro para a sua sobrevivência. Essas bactérias produzem mais
ácido lático na forma de cultura mista, ou seja, em simbiose, do que quando
utilizadas como culturas isoladas (THAMER & PENNA, 2005). No início da
fermentação, o pH do leite favorece o desenvolvimento do Streptococcus
thermophilus. Com o aumento da acidificação, ou seja, do teor de ácido láctico a
partir da lactose, crescem os Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus. Estes são
proteolíticos, obtêm aminoácidos a partir da caseína (glicina, histidina, valina) e
ativam o crescimento dos estreptococos que, por sua vez, estimulam o crescimento
dos lactobacilos, com a produção de ácido fórmico e gás carbônico (VARNAM, 1995;
VEISSEYRE,1988). Até esse momento a relação é de simbiose, a partir daí começa
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a antibiose, quando uma grande quantidade de ácido láctico é acumulada no meio e


o pH excessivamente reduzido começa a inibir o desenvolvimento do Streptococcus
thermophilus. O Lactobacillus delbrueckii, por ser mais resistente à acidez, aumenta
em número e sobrepuja o desenvolvimento de Streptococcus thermophilus. Em
condições de pH de 4,3, o crescimento das duas bactérias passa a ser inibido
(FERREIRA, 2005). No final da vida de prateleira do iogurte, que é de
aproximadamente 45 dias, a antibiose (maior crescimento de lactobacilos) pode
gerar sabor desagradável (muito ácido) e dessoramento do produto pela coagulação
protéica, diminuindo sua aceitabilidade (WALSTRA et al., 1999).

4.5. MERCADO

Entre os leites fermentados, o iogurte é o mais conhecido e o mais


consumido a nível mundial (EARLY, 2000; SÁ & BARBOSA, 1990). No Brasil, entre
1994 e 1998 o consumo de iogurte cresceu 162% (TEIXEIRA et al, 2000). De acordo
com SANTOS (2002), desde 1994 há um grande aumento no consumo de iogurte no
país, sendo que desta forma, este produto que era consumido por um público de
poder aquisitivo mais elevado tornou-se acessível a maiores parcelas da população.
Além disso, este produto representa para o pequeno e o médio laticinista a chance
de diferenciação da linha de produtos commodities para produtos de alto valor
agregado e melhor margem de rentabilidade.
Em 1997, o iogurte representou 9,96% dos produtos lácteos
comercializados no mercado formal brasileiro (VILELA, BRESSAN & CUNHA, 2001).
Já em 2001 o país atingiu a marca de 292,42 milhões de litros registrando um
crescimento médio de 5% ao ano (SANTOS, 2002). Segundo dados da Associação
Brasileira de Indústrias de Iogurte (ABRINI), de 2001 para 2002 houve um
crescimento de 20% no mercado de iogurtes (GURGEL, 2003).
No entanto, o brasileiro consome 4,1 Kg/habitante/ano, uma média
bastante baixa se comparado ao europeu que se encontra na casa dos 30 Kg per
capita ano como é o caso de países como a França e Espanha que consomem 35 e
13,34 Kg per capita respectivamente (GURGEL, 2003).
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5. JUSTIFICATIVA DO PROJETO

O objetivo deste trabalho foi analisar a presença de microrganismos


adicionados na fabricação do iogurte e seu efeito de simbiose e antibiose. Os
microrganismos presentes em um iogurte bem balanceado promovem diversos
benefícios á saúde humana, além de proporcionar maior viabilidade sobre as
características químicas, físico-químicas e de textura no mesmo.
O iogurte é largamente consumido pela população e possui elevado valor
nutricional/funcional e devido à disponibilidade de matéria-prima de boa qualidade
torna-se uma alternativa alimentar. Por este motivo outro ponto a ser estudado
nesse projeto é a estabilidade destes microrganismos sob condições de vida de
prateleira, sendo que quanto mais novo o iogurte, mais balanceado estão os
microrganismos e mais saboroso é o produto.
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6. OBJETIVOS

Avaliar as relações de simbiose e antibiose entre os microrganismos


adicionados na fabricação de iogurtes comercializados na região Oeste do Paraná.
Caracterizar a qualidade microbiológica, para estabelecer uma relação com os
efeitos de simbiose e antibiose durante a vida de prateleira dos iogurtes testados.

6.1 OBJETIVO GERAL

Monitorar o período de ocorrência das associações de simbiose e


antibiose entre os cocos (Streptococcus termophilus) e os bacilos (Lactobacillus
delbrüeckii subsp. bulgaricus) em iogurtes comercializados na região Oeste do
Paraná.

6.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Coletar amostras de quatro marcas de iogurtes comercializadas na região Oeste


do Paraná em pontos de venda distintos (supermercados);
 Realizar a contagem de lactobacilos e de estreptococos presentes nas amostras
durante a vida de prateleira do produto, para averiguação da simbiose e antibiose
entre os microrganismos.
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7. MATERIAL E MÉTODOS

7.1. AMOSTRAGEM

Foram avaliadas quatro marcas de iogurtes comercializados na região


Oeste do Paraná, coletadas em dois lotes distintos, as quais foram denominadas de
marcas A, B, C e D. Coletaram-se as amostras de cada marca diretamente das
gôndolas dos supermercados, sendo transportados em caixas isotérmicas até o
laboratório de Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná
(UTFPR) – Campus Medianeira, onde permaneceram armazenados em geladeira a
10ºC e foram analisados quinzenalmente até o final da vida de prateleira do produto.
Avaliaram-se as amostras nos tempos de 15, 30 e 45 dias de vida de
prateleira. Observou-se no momento da aquisição, a data de fabricação, para que
fosse possível a avaliação no tempo de 15 dias de armazenamento.

7.2. MATERIAL

• Utensílios e vidrarias em geral;


• Balança analítica;
• Estufa 37ºC;
• Balança digital;
• Bico de Bunsen;
• Placas de petri;
• Capela de fluxo laminar;
• Banho-maria;
• Beckers, Erlenmeyers, pipetas graduadas e volumétricas, espátulas, placas
de petrí;
• Frasco Erlenmeyer de 250 mL com tampa esmerilhada;
• Meio de cultura MRS (Agar para Lactobacillus);
• Jarra de Anaerobiose;
• Sachet de anaerobiose;
• Microscópio óptico.
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7.3. METODOLOGIA

7.3.1. Análises microbiológicas

7.3.1.1. Contagem de Bactérias Láticas

As contagens de bactérias lácticas dos iogurtes foram realizadas no 15º,


30° e 45º dia de estocagem. A abertura dos fracos de iogurtes foi realizada no
interior de câmara de fluxo laminar para prevenir qualquer contaminação ambiente
na amostra. Uma alíquota de 25 mL de amostra foi transferida para um frasco com
tampa contendo 225 mL de solução de água peptonada estéril 0,1 %. A partir desta
diluição foram feitas diluições subseqüentes, necessárias à análise do produto. Foi
empregado o meio de cultura MRS modificado com a adição de ácido acético para a
contagem de Lactobacilos. A técnica utilizada para a inoculação foi por
profundidade. Após a inoculação, as placas de Petri foram incubadas invertidas em
jarras contendo gerador de anaerobiose Anaerobac (PROBAC) a 37ºC por 72 horas
(COLLINS e LYNE, 1989).
O projeto propõe a contagem de Streptococcus em Agar M17 por
inoculação em profundidade, juntamente com a contagem de Lactobacillus.
Entretanto, neste relatório serão apresentados somente os resultados da contagem
de Lactobacillus, em virtude da indisponibilidade do meio M17, o qual ainda está
sendo adquirido por importação.
Após o tempo de incubação requerido para cada meio de cultura, a
contagem foi realizada em placas de Petri que apresentaram entre 25 e 250
colônias.
Foram realizados esfregaços em lâminas, corados pelo método de Gram.
As lâminas foram observadas em microscópio ótico, a fim de verificar a presença de
bacilos Gram-positivos.
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8. RESULTADOS

8.1. CONTAGEM DE BACTÉRIAS TRADICIONAIS Lactobacillus delbruecki ssp.


bulgaricus

Os resultados das contagens de bactérias lácticas tradicionais


Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus para os dois lotes de amostras de iogurtes
avaliados nos tempos de 15, 30 e 45 dias de armazenamento à 4ºC, estão
apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 - Contagem média do número de células viáveis de Lactobacillus


delbruecki ssp. bulgaricus (UFC/mL) de quatro marcas de iogurtes comercializadas
na região Oeste do Paraná durante o tempo de estocagem.

Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus (UFC/mL)

LOTE 15 DIAS 30 DIAS 45 DIAS


10 7
Amostra A 1 2,4 × 10 6,0 × 10 <10
8
Amostra A 2 < 10 7,8 × 10 < 10
10 7
Amostra B 1 1,9 × 10 2,0 × 10 < 10
7 8
Amostra B 2 5,5 × 10 3,8 × 10 < 10
8 7 7
Amostra C 1 2,0 × 10 4,0 × 10 3,0 × 10
8 7
Amostra C 2 2,2 × 10 3,0 × 10 < 10
Amostra D 1 < 10 < 10 < 10
7 7
Amostra D 2 1,0 × 10 2,0 × 10 < 10

No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)


indica que a contagem de Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus deve cumprir os
requisitos considerados de no mínimo 107 UFC/mL no iogurte durante seu período
de validade [1]. De acordo com a Tabela 1 observa-se que houve um decréscimo
nas contagens de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus durante o período de
armazenamento para as amostras A, B e C, do primeiro lote, sendo que a amostra D
não apresentou contagem em nenhum dos tempos de estocagem.
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Para amostra C a contagem do número de células viáveis variou de


2,0×108 UFC/mL em 15 dias a 3,0×107 UFC/mL em 45 dias de armazenamento. Os
valores encontrados para esta amostra estão de acordo com a Instrução Normativa
nº 46 [1] que estabelece uma contagem mínima de 7 log UFC/mL no produto final.
As amostras A e B apresentaram crescimento de Lactobacillus delbrueckii
ssp. bulgaricus que variou de 10 log UFC/mL em 15 dias para 7 log UFC/mL em 30
dias, porém não houve uma contagem mínima de 7 log UFC/mL de células viáveis
de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus em 45 dias de armazenamento. Para a
amostra D não houve crescimento em nenhum dos tempos de estocagem, portanto,
estas amostras não estão de acordo com a legislação em vigor.
Ainda na Tabela 1 verifica-se que a contagem do microrganismo L.
bulgaricus do segundo lote apresentou variações entre as amostras, sendo que nas
amostras A, B e D o número de unidades formadoras de colônias de L. bulgaricus foi
menor em 15 dias, observando-se um acréscimo em 30 dias de vida de prateleira.
A amostra A não apresentou contagem em 15 dias, e apresentou
contagem de 7,8 × 108 UFC/mL em 30 dias. A amostra B apresentou crescimento de
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus que variou de 107 UFC/mL em 15 dias para
108 UFC/mL em 30 dias, e a amostra D apresentou um pequeno acréscimo em 30
dias, variando de 1 × 107 em 15 dias para 2 × 107 UFC/mL em 30 dias.
A amostra C apresentou crescimento de Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus que variou de 2,2 × 108 UFC/mL em 15 dias para 3,0 × 107 UFC/mL em
30 dias.
Não houve uma contagem mínima de 107 UFC/mL de células viáveis do
microrganismo Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus em 45 dias de
armazenamento em nenhuma das amostras avaliadas.
As variações encontradas nas marcas se devem a vários fatores, como
controle inadequado da cultura, pontos falhos na fabricação ou deficiência na
manipulação e condições de estocagem incorretas durante a fabricação e
comercialização (MOREIRA, 1999).
As características do iogurte estão relacionadas à sua acidez, que se
altera durante o armazenamento, dependendo da acidez inicial e da temperatura de
estocagem (SALJI & ISMAIL, 1983). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária
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e Abastecimento (MAPA) indica um valor entre 0,6 e 1,5 g de ácido lático/100 g


como aceitável para o iogurte ser liberado para o comércio (BRASIL, 2006) e
contagem de Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus deve cumprir os requisitos
considerados de no mínimo 107 UFC/mL no iogurte durante seu período de validade
(BRASIL, 2007).
De acordo com Tamime & Robinson (1999) o valor de pH implica na
atividade metabólica das bactérias, podendo favorecer um determinado grupo, em
detrimento do outro. No caso do iogurte, bactérias do gênero Lactobacillus crescem
e toleram valores de pH mais baixos do que as pertencentes ao gênero
Streptococcus. Segundo SILVA (2007), uma excessiva pós-acidificação (acidificação
indesejada ao produto) ocorre, principalmente, devido ao crescimento incontrolável
de L. bulgaricus nas temperaturas de refrigeração e a baixos valores de pH.
Em um processo que empregasse proporções de 1:1 de S. thermophilus e
L. bulgaricus seria esperado uma concentração maior de L. bulgaricus, uma vez que
o coco é inibido pela própria acidez produzida (em pH abaixo de 5,0) e o bacilo
continua a se multiplicar, embora mais lentamente. No entanto, os resultados
indicam que os fermentos utilizados são desempenhados para manter um produto
mais estável durante sua vida de prateleira. Dessa forma, na composição desses
fermentos, concentrações elevadas de S. thermophilus são utilizadas e o produto
mantém-se em um nível seguro de pH, sem, contudo, tornar-se muito ácido, no
prazo final de (MARTINS et al, 2009). Essa situação pode ser evidenciada em todas
as marcas, apresentando baixas contagens de Lactobacillus delbrueckii ssp.
Bulgaricus com o aumento do tempo de armazenamento.
A menor proporção de bacilos compromete o flavor característico do
iogurte, visto que os mesmos são responsáveis pela produção de acetaldeído. No
entanto, atualmente, a ausência desse componente tem sido mascarada pela
diversidade de aromas disponíveis para a indústria de leites fermentados (MARTINS
et al, 2009).

Neste relatório não serão apresentados os resultados da contagem de


estreptococos, em virtude da indisponibilidade do meio M17, o qual está sendo
adquirido por importação.
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8.2 CONFIRMAÇÃO DOS MICRORGANISMOS Lactobacillus Delbrueckii Ssp.


Bulgaricus e Streptococcus Thermophilus

A confirmação do L. bulgaricus foi feita através de Coloração de Gram


descrita por Silva (1997). As cepas encontradas nas colorações efetuadas para as
amostras A, B, C e D, nos dois lotes, confirmaram a existência de bacilos Gram-
positivos, caracterizando a presença de L. bulgaricus. Na indisponibilidade do meio
M17 para a contagem de S.thermophilus, fez-se somente a confirmação do
microrganismo L. bulgaricus.
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9. CONCLUSÕES

Conclui-se que na contagem de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,


dentre as quatro marcas de iogurte analisadas, três não apresentaram uma
contagem mínima de 7 LOG UFC/mL de células viáveis do microrganismo
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus durante 45 dias de armazenamento, não
atendendo a legislação brasileira em vigor. Apenas uma das amostras analisadas
apresentou contagem de células viáveis do microrganismo de acordo com a
legislação brasileira em vigor, considerando-se o primeiro lote de amostras
avaliadas.

Para o segundo lote de amostras avaliado, uma amostra não apresentou


contagem de células viáveis do microrganismo Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus no período de 15 dias, apresentando posterior crescimento em 30 dias de
fabricação. /Nenhuma das quatro amostras apresentou contagem mínima de células
viáveis do microrganismo Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus durante 45 dias
de armazenamento, não atendendo a legislação brasileira em vigor.

Esta avaliação torna-se importante, pois o sabor e textura do iogurte são


afetados em função do tempo de vida de prateleira. Quanto mais jovem é o produto,
nos tempos iniciais de armazenamento, pode-se dizer que o mesmo é mais
saboroso, o que deriva de um equilíbrio entre os dois microrganismos
(Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) utilizados
como culturas starter no processo fermentativo.
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10. CONSIDERAÇÕES

O proposto para o presente trabalho é de analisar microbiologicamenrte e


físico - quimicamente, quatro amostras em dois lotes distintos, obedecendo-se um
período mínimo de 02 meses entre o primeiro e segundo lote.
O presente projeto propõe a contagem de Streptococcus em Agar M17
por inoculação em profundidade, juntamente com a contagem de Lactobacillus.
Entretanto, neste relatório foram apresentados somente os resultados da contagem
de Lactobacillus, em virtude da indisponibilidade do meio M17, o qual está sendo
adquirido por importação.
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FOLHA DE ASSINATURA

MONITORAMENTO DAS ASSOCIAÇÕES DE SIMBIOSE E ANTIBIOSE


MICROBIANA EM IOGURTES COMERCIALIZADOS NA REGIÃO OESTE DO
PARANÁ

Relatório final de atividades referente ao período de agosto de 2009 a agosto


de 2010 apresentado ao PIBIC – Modalidade Bolsista, como requisito parcial a ser
cumprido pela bolsista abaixo especificada.

Prof (ª). Dr(ª). Eliane Colla


Coordenador– Campus Medianeira

Prof (ª). MSc. Celeide Pereira


Co-orientador – Campus Medianeira

Daiane Corti
Boslista PIBIC – Fundação Araucária

Medianeira, 27 de Agosto de 2010.

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