Tese Completa Liliane Willi Monteiro PDF

LILIANE MARIA VALENTIM WILLI MONTEIRO
Dirofilaria immitis: INFECÇÃO CANINA EM FISIONOMIAS DISTINTAS E

SUSCEPTIBILIDADE ÀS LACTONAS MACROCÍCLICAS
Niterói, RJ
2016
LILIANE MARIA VALENTIM WILLI MONTEIRO
Dirofilaria immitis: INFECÇÃO CANINA EM FISIONOMIAS DISTINTAS E

SUSCEPTIBILIDADE ÀS LACTONAS MACROCÍCLICAS
Tese apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Medicina
Veterinária da Universidade Federal
Fluminense como requisito parcial
para obtenção do grau de Doutora.
Área de concentração: Clínica e
Reprodução Animal.
ORIENTADORAS:
Dra. FLAVYA MENDES-DE-ALMEIDA (UFF)
Dra. NORMA VOLLMER LABARTHE (UFF)
Dra. TÂNIA ZAVERUCHA DO VALLE (FIOCRUZ)
Niterói, RJ
2016
M775d Monteiro, Liliane Maria Valentim Willi
Dirofilaria immitis: infecção canina em
fisionomias distintas e susceptibilidade às
lactonas macrocíclicas/ Liliane Maria Valentim
Willi Monteiro; orientadora Flavya-Mendes-de
Almeida. – 2016.
170f.
Tese (Doutorado em Clínica e Reprodução Animal)-

Universidade Federal Fluminense, 2016.
Orientador: Flavya Mendes-de-Almeida
1. Dirofilaria immitis. 2. Doenças do Cão. 3.

Resistência a medicamento. 4. Lactona. I.
Título.
CDD 636.708969652
Aos meus amados pais, Ricardo e Maria
José, pelo porto seguro e linda família. Ao
meu marido, verdadeiro companheiro,
grande amor da minha vida, Fernando. A
minha linda e doce filha, cujo amor maior
não há, Julia Maria. A todas as minhas
irmãs e irmão, sobrinhas e sobrinhos....
Que me guiam quando o sol se põe e me
abrigam quando a tempestade me alcança!
AGRADECIMENTOS
As minhas orientadoras Profa Flavya Mendes de Almeida, Norma Vollmer Labarthe

e Tânia Zaverucha do Valle, na certeza de terem me oferecido o melhor ao longo
desta jornada. Em especial, à Profa Flavya, por ter me aceitado como orientada,
pelo apoio, grande suporte e conhecimento gentilmente disponibilizados. À Profa
Norma, por ter me dado a chance de desenvolver algo de grande dimensão, pelo
seu brilhante conhecimento e apoio. À Profa Tânia, por ter me recebido em seu
laboratório com muita atenção e por todo conhecimento adquirido ao longo do
trabalho em sua cativante companhia. À todas, meu eterno e carinhoso obrigada!
Ao meu amigo Jonimar Paiva pela companhia e apoio, principalmente durante a

nossa jornada no trabalho de campo. Que tudo aquilo que vivenciamos e
aprendemos até hoje esteja sempre presente em nossa vida profissional!
À minha amiga Marcia Miranda pelo imenso apoio, com destaque especial no
trabalho de campo. Obrigada Marcinha!
Aos meus amigos e queridos ex-alunos Carolina Haje, Daniel Marques, Daniel
Paiva, Daniel Ribeiro, Marcela Machado, Monique Paiva e Thiago Gomes, pelo belo
time que formamos. A presença de vocês foi essencial durante os nossos meses de
trabalho de campo!
À toda equipe do Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto

Oswaldo Cruz, Fiocruz. Em especial à Dra. Kátia Calabrese por ter concedido o
desenvolvido de parte deste estudo no laboratório. À Celeste Souza, Luiz D’Escoffier
e Luis Otávio por todo apoio e conhecimento fornecidos nos momentos necessários.
À Sandy Pereira pela prontidão e saudável companhia nas atividades da biologia
molecular. À Caroline Magalhães, Carolina Salles, Daiana Hardoim, Fernando
Almeida, Flavia Cardoso, Henrique Previtale e Mariana Rottini por toda ajuda e
companhia. Foi muito bom ter conhecido e convivido com vocês!
À Profa Fabiana Knackfuss pelo apoio e conhecimento fornecidos durante as

análises estatísticas dos resultados. Você é uma amiga querida, uma pessoa muito
especial!
À Celeste Souza e Mariana Cavalheiro pelo auxílio na contagem das lâminas.
À Tainá Laeta pela cuidadosa confecção dos mapas e pronta disponibilidade sempre
que necessário.
À Alexandre Bendas pela disponibilidade no fornecimento de informações ao longo

deste estudo.
À Luzia Felippe por tornar o nosso trabalho de campo mais saudável e agradável.
Às minha amigas-mães Janaína Barcelos, Luciana Zanon e Simone Botelho, por

poder contar com vocês na intensa jornada maternal diária. Este apoio foi essencial!
À Simone da Silveira por todo apoio na jornada diária.

A minha querida Vó de coração pelo abrigo no momento necessário.
Aos proprietários da Pousada Suba para ver, José e Maria Luiza, por disponibilizar
os aposentos para realização do nosso trabalho de campo.
Ao médico veterinário Gustavo Nascimento pelo auxílio nas atividades realizadas em

prol dos cães das localidades do estudo.
Ao laboratório Bayer Saúde Animal, em especial Karen Zoreck, pelo suporte para
realização do trabalho.
Às empresas Linavet Distribuidora de Produtos Veterinários e IDEXX Laboratories

pelo suporte e pronto atendimento no fornecimento dos Kits utilizados no trabalho.
Ao laboratório Ourofino Saúde Animal pelo fornecimento de produtos para os cães

do trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (CAPES) pelo

fornecimento da bolsa de estudo.
Aos tutores dos cães por permitirem a participação dos seus animais neste estudo e
àqueles que nos auxiliaram nas primeiras visitas aos domicílios.
À todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
Dirofilaria immitis é o agente etiológico de uma das parasitoses caninas mais

relevantes do mundo, a dirofilariose canina, ou verme do coração. No Brasil, a
infecção canina foi frequente e distribuída em diversas regiões do país até a década
de 1990. Mais tarde, estudos epidemiológicos demostraram ter baixado ou até
desaparecido, porém a partir do ano de 2003, a infecção voltou a ser observada
pelos médicos veterinários. A prevenção desta parasitose é efetuada por fármacos
do grupo das lactonas macrocíclicas. Entretanto, desde meados da década de 2000,
há relatos de ocorrência de resistência de D. immitis a estas moléculas, que estão
sendo correlacionadas a alterações genéticas no parasito. Assim, o estudo teve
como objetivos atualizar e verificar a influência das condições ambientais e
socioculturais na ocorrência da infecção canina em cinco localidades do estado do
Rio de Janeiro, confirmar a eficácia preventiva da infecção pelo uso das lactonas
macrocíclicas e pesquisar polimorfismos pontuais nos genes glicoproteína-P e da ß-
tubulina em linhagens de D. immitis do estado do Rio de Janeiro. Para atualizar a
frequência da infecção canina e verificar a influência das condições ambientais e
socioculturais na transmissão da infecção canina, animais de cinco localidades ao
longo e uma linha imaginária de 60km, iniciando-se na costa e terminando na serra
do mar do estado do Rio de Janeiro, tiveram amostras de sangue examinadas
quanto à presença de microfilárias e de antígenos de parasitos adultos. Para estudar
a eficiência dos fármacos do grupo das lactonas macrocíclicas na prevenção da
infecção, cães amicrofilarêmicos e sem antigenemia foram submetidos ao
tratamento preventivo com moxidectina (2,5 a 6,25mg/kg) + imidacloprida ou
selamectina (6mg/kg) tópicas e acompanhados por onze meses. E para pesquisar
polimorfismos pontuais nos genes glicoproteína-P e da ß-tubulina em linhagens de
D. immitis do estado do Rio de Janeiro, foram obtidas microfilárias de cães
naturalmente infectados e expostas aos fármacos. As microfilárias foram avaliadas
quanto aos marcadores de resistência conhecidos, polimorfismos pontuais nos
genes glicoproteína-P e da ß-tubulina. A ocorrência da infecção foi maior nas duas
localidades costeiras, quando comparadas às localidades distantes da costa e
próximas à serra. Na baixada litorânea, entre a costa e a região de maior altitude,
não foi encontrado nenhum animal infectado. A moxidectina (2,5 a 6,25mg/kg) +
imidacloprida tópica mostrou-se 100% eficaz na prevenção de novas infecções
enquanto a selamectina (6mg/kg) tópica teve eficácia de 71,4%. Foram detectados
polimorfismos pontuais no gene da ß-tubulina, mas não foram detectados no gene
da glicoproteína-P das microfilárias. Portanto, pode-se dizer que a infecção canina
por D. immitis voltou a ser frequente no estado do Rio de Janeiro, que moxidectina
(2,5 a 6,25mg/kg) + imidacloprida foi eficiente na prevenção e, que há circulação de
D. immitis portadoras de polimorfismos pontuais no gene da ß-tubulina no Estado,
indicando a possibilidade de haver populações do parasito resistentes às lactonas
macrocíclicas.
Palavras-chave: Dirofilaria immitis, lactona macrocíclica, resistência.

ABSTRACT
Dirofilaria immitis is the causative agent of one of the most relevant canine parasitic
infections of the world, dirofilariasis or heartworm disease. Canine infection was
frequent and well distributed in different regions of Brazil until 1990 decade.
Nevertheless, epidemiological surveys conducted years later showed that prevalence
decreased or even that infections disappeared. After 2003, infection rebounded and
veterinarians began to report canine cases. Therefore, canine blood samples were
obtained from animals kept at five localities along an imaginary 60km line, from the
coast to the serra do mar, Rio de Janeiro state in order to study the influence of
environmental and sociocultural conditions upon the parasite transmission. All
samples were examined for microfilariae and for antigen detection. Since heartworm
is a preventable disease and its chemoprophylaxis may be achieved by the use of
macrocyclic lactones, although since 2000 decade there are reports of worm
resistance to these drugs, the efficacy of those drugs was locally studied. To do so,
dogs free from antigens and microfilariae, living at a high prevalence neighborhood of
the State received topical moxidectin (2.5 a 6.25mg/kg) + imidacloprid or selamectin
(6mg/kg) and were followed for eleven months. The reported worm resistance to
macrocyclic lactones has been associated to genetic modifications that are punctual
polymorphisms of glycoprotein-P and of ß-tubulin. Therefore, to test worms from the
state of Rio de Janeiro, microfilariae were obtained from canine blood samples
collected from naturally infected dogs that received macrocyclic lactone treatment.
Those microfilariae’s DNAs were obtained tested for detection of the punctual
polymorphisms of glycoprotein-P and of ß-tubulin. The infections was found to be
more prevalent at the two coastal areas when compared to those distant from the
coast and close to the sierra. No infected dogs was detected at the coastal lowlands.
Topical moxidectin (2.5 a 6.25mg/kg) + imidacloprid was shown to be 100%
efficacious in preventing new infections while topical selamectin´s (6mg/kg) efficacy
was 71,4%. Punctual polymorphisms of ß-tubulin gene were detected although they
were not detected in the gene of glycoprotein-P. Therefore, it can be stated D.
immitis infections became frequent in the state of Rio de Janeiro, that moxidectin (2,5
a 6,25mg/kg) + imidacloprid was efficacious in preventing the infection and that there
are D. immitis which harbor punctual polymorphisms of the ß-tubulin gene circulating
in the State, suggesting the presence of resistant D. immitis populations.
Keywords: Dirofilaria immitis, macrocyclic lactone, resistance

LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Microfilária de Dirofilaria immitis. A-Extremidade cefálica; B. Extremidade

caudal. Técnica de Knott modificada (NEWTON; WRIGHT, 1956), p.23
Figura 02: Ciclo biológico de Dirofilaria immitis em Canis familiaris, p.25
Figura 03: A. Microfilária de Dirofilaria immitis e B. Microfilária de Acanthocheilonema

reconditum em esfregaço sanguíneo de cão (NELSON, C.T.; MCCALL, J.W.;
CARITHERS, D. Currente canine guidelines for the diagnosis, prevention and
management of heartworm (Dirofilaria immitis) infection in dogs. Canine heartworm
guidelines. 2014), p.36
Figura 04: Mapa mostrando as localidades do estudo sobre a influência das

condições ambientais e socioculturais na ocorrência da infecção por Dirofilaria
immitis, agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.50
Figura 05: Imagens do loteamento Caiçara, município de Arraial do Cabo, RJ,

Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012. A- Lagoa de Araruama que margeia o
loteamento; B- Vista das ruas e moradias onde o estudo foi realizado, p.51
Figura 06: Imagens do bairro Praia da Pontinha, no município de Araruama, RJ,

Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012. A- Margem Norte da Lagoa de
Araruama ao pôr do sol; B- Vista das ruas e moradias onde o estudo foi
realizado, p.52
Figura 07: Imagens do loteamento Monteiros, no município de Araruama, RJ,

Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012. A e B- Vista das moradias onde o
estudo foi realizado, p.52
Figura 08: Imagens da localidade Aldeia Velha, no município de Silva Jardim,

RJ, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012. A- Rua de acesso à localidade; B-
Exemplo das ruas e moradias onde o estudo foi realizado, p.53
Figura 09: Imagens da localidade de Toca da Onça, no município de Nova

Friburgo, RJ, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012. A- Vista panorâmica da
localidade mostrando áreas com cobertura vegetal conservada e áreas
antropizadas; B- Exemplo das moradias onde o estudo foi realizado, p.54
Figura 10: Esquema do trabalho realizado para estudo da influência das

condições ambientais e socioculturais na ocorrência da infecção por Dirofilaria
immitis em cães domésticos, p.55
Figura 11: Kit comercial SNAP 4Dx®: A– controle positivo; B- reação positiva de
detecção de antígeno de parasito adulto de Dirofilaria immitis, p.57
Figura 12: Esquema do estudo para confirmação da eficácia preventiva da

infecção por Dirofilaria immitis pelo uso de moléculas do grupo das lactonas
macrocíclicas p.58
Figura 13: Esquema do estudo para pesquisa de polimorfismos pontuais nos genes
da glicoproteína-P e β-tubulina em linhagens de Dirofilaria immitis do estado do Rio
de Janeiro, p.59
Figura 14: Esquema do trabalho realizado para pesquisa de polimorfismos pontuais

nos genes da glicoproteína-P e β-tubulina em linhagens de Dirofilaria immitis do
estado do Rio de Janeiro, p.60
Figura 15: Separação de microfilárias: A– suporte de filtro para membrana de

policarbonato; B– seringa contendo amostra de sangue acoplada ao suporte de filtro;
C- seringa contendo solução de NaHCO3 acoplada ao suporte de filtro; D– remoção
da membrana de policarbonato do suporte de filtro; E– imersão da membrana de
policarbonato em PBS na placa de Petri descartável; F– incubação da membrana de
policarbonato em PBS, p.62
Figura 16: Sequência parcial de referência do gene da glicoproteína-P (GenBank

HM596853) de Dirofilaria immitis com marcação da posição 11 e da posição 618,
p.65
Figura 17: Sequência de referência do gene da ß-Tubulina (GenBank HM596854) de

Dirofilaria immitis com a marcação da posição 561 e da posição 2755 e dos três
pares de primers, p.66
Figura 18: Número de cães registrados e número de amostras de sangue canino

obtidas nas cinco localidades distintas do estudo da influência das condições
ambientais e socioculturais na ocorrência da infecção por Dirofilaria immitis em cães
domésticos, estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.69
Figura 19: Mapa de cobertura do loteamento Caiçara, localidade de estudo para

obtenção das amostras de sangue canino para determinação da frequência da
infecção por Dirofilaria immitis, janeiro de 2012, p.70
Figura 20: Mapa de cobertura da Praia da Pontinha, localidade de estudo para

infecção por Dirofilaria immitis, novembro e dezembro de 2011, p.71
Figura 21: Mapa de cobertura do loteamento Monteiros, localidade de estudo para

infecção por Dirofilaria immitis, outubro de 2011, p.71
Figura 22: Mapa de cobertura de Aldeia Velha, localidade de estudo para obtenção
das amostras de sangue canino para determinação da frequência da infecção por
Dirofilaria immitis, setembro de 2011, p.72
Figura 23: Mapa de cobertura de Toca da Onça, localidade de estudo para obtenção
das amostras de sangue canino para determinação da frequência da infecção por
Dirofilaria immitis, agosto de 2011, p.72
Figura 24: Frequência absoluta de amostras sanguíneas nas quais se detectou a

presença de microfilaremia (mf) ou antigenemia (Ag) de Dirofilaria immitis ou
ambas, em localidades distintas do leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil,
agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.74
Figura 25: Frequência absoluta de cães submetidos ao tratamento com lactonas
macrocíclicas na população de cães amostrada para diagnóstico da infecção por
Dirofilaria immitis nas localidades do leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil,
agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.76
Figura 26: Frequência absoluta de mamíferos silvestres citados pelos

responsáveis dos cães nas localidades do leste do estado do Rio de Janeiro,
Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.77
Figura 27: Amplificação de um fragmento do gene da glicoproteína P (623pb) em

amostras (pool de microfilárias) do estudo - Gel de agarose (1,5%) de amostras
amplificadas pela reação em cadeia pela polimerase. Controle positivo (Ctrl pos.) –
parasito adulto de Dirofilaria immitis. Controle negativo (Ctrl neg.) – água ultrapura.
Peso molecular (PM) – ladder 100, p.80
Figura 28 – Amplificação de fragmento do gene da ß-tubulina (692pb) em amostras

(pool de microfilárias) do estudo - Gel de agarose (1,5%) de amostras amplificadas
pela reação em cadeia pela polimerase. Controle positivo (Ctrl pos.) – parasito
adulto de Dirofilaria immitis. Controle negativo (Ctrl neg.) – água ultrapura. Peso
molecular (PM) – ladder 100, p.80
Figura 29 – Amplificação de fragmento do gene da ß-tubulina (832pb) em amostras

(pool de microfilárias) do estudo - Gel de agarose (1,5%) de amostras amplificadas
pela reação em cadeia pela polimerase. Controle positivo (Ctrl pos.) – parasito
adulto de Dirofilaria immitis. Controle negativo (Ctrl neg.) – água ultrapura. Peso
molecular (PM) – ladder 100, p.80
Figura 30: Cromatogramas da amostra AR59 de pools de microfilárias de Dirofilaria

immitis, sequenciada para o gene parcial da glicoproteína-P com marcação da
posição 11 (A) e 618 (B), e para o gene da β-tubulina com marcação das posições
561 (C) e 2755 (D), p.81
Figura 31: Cromatogramas das amostras dos pools de microfilárias de Dirofilaria

immitis sequenciadas para o gene parcial da glicoproteína-P com marcação da
posição 11, p.82

immitis sequenciadas para o gene parcial da glicoproteína-P com marcação da
posição 618, p.83

immitis sequenciadas para o gene da β-tubulina com marcação da posição 561.
Amostras com duplo pico em destaque, p.84

immitis sequenciadas para o gene da β-tubulina com marcação da posição 2755.
Amostras com duplo pico em destaque, p.85
LISTA DE QUADROS
Quadro 01: Ocorrência de Dirofilaria immitis em cães no Brasil, p.29
Quadro 02: Características morfológicas das microfilárias de Dirofilaria immitis,

Acanthocheilonema reconditum e Dirofilaria repens, p.37
Quadro 03: Esquema de origem das lactonas macrocíclicas: da bactéria do solo

aos produtos terapêuticos (PRICHARD, R. K.; MÉNEZ, C.; LESPINE, A.
Moxidectin and the avermectinas: consanguinity but not identity. International
Journal of Parasitology: Drugs and Drug Resistance, v.2, p.134-153, 2012), p.40
Quadro 04: Lactonas macrocíclicas para uso na quimioprofilaxia da dirofilariose

canina e respectivas apresentações comerciais disponíveis no Brasil, p.42
Quadro 05: Lista de primers usados para amplificação do gene da glicoproteína-P

(Pgp) e do gene da ß-tubulina (Tub) de Dirofilaria immitis, p.63
Quadro 06: Primers usados para amplificação e sequenciamento do gene da

glicoproteína-P (Pgp) e do gene da ß-tubulina (Tub) de Dirofilaria immitis,
respectivamente., p.64
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Densidade populacional de cães das cinco localidades distintas do leste
do estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.68
Tabela 02: Frequências absolutas e relativas dos cães examinados quanto à

detecção exclusiva de microfilaremia (mf) ou de antigenemia (Ag) ou de ambos
(mf/Ag) de Dirofilaria immitis, em localidades distintas do leste do estado do Rio de
Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012, p.74
Tabela 03: Frequências absolutas e relativas de infecção por Dirofilaria immitis em

cães, quanto à idade, ao gênero, à raça e o ambiente de permanência do cão em
localidades distintas do leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a
janeiro de 2012, p.75
Tabela 04 – Frequências absolutas e relativas de cães sem infecção detectável (-)

por pesquisa de microfilárias (mf) ou por pesquisa de mf e de antígenos (mf/ag) de
Dirofilaria immitis, quanto à idade, gênero ou raça, em área de alta frequência de
infecção na costa leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil, dezembro de 2012, p.78
Tabela 05 – Frequências absolutas e relativas de cães submetidos ao tratamento

com moxidectina ou selamectina segundo detecção de microfilárias (mf) ou de
antígenos de parasitos adultos (Ag) de Dirofilaria immitis, até o dia 150 (infectados
antes do início do estudo), no dia 180 (possivelmente infectados antes do início do
estudo) e entre os dias 270 e 300 (infectados durante o tratamento preventivo), p.79
Tabela 06 – Número de amostras de DNA de pools de microfilárias de linhagens de

Dirofilaria immitis do estado do Rio de Janeiro analisadas quanto à presença de
polimorfismos pontuais para pesquisa da ocorrência dos marcadores de resistência
às lactonas macrocíclicas nos genes da glicoproteína-P e β-tubulina, p.81
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO, p.19
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p.21

2.1 AGENTE ETIOLÓGICO, p.21
2.2 CICLO BIOLÓGICO, p.23
2.3 EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO CANINA, p.25
2.3.1 Distribuição geográfica, p.25
2.3.2 Hospedeiros intermediários, p.31
2.3.3 Hospedeiros definitivos, p.33
2.4 MÉTODOS DE DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR Dirofilaria immitis, p.35
2.4.1 Pesquisa de microfilárias, p.35
2.4.2 Pesquisa de antígenos de parasitos adultos, p.37
2.4.3 Detecção de ácido desoxirribonucleico (DNA), p.38
2.5 QUIMIOPROFILAXIA DA DIROFILARIOSE CANINA, p.39
2.5.1 Lactonas macrocíclicas, p.39
2.5.2 Resistência às lactonas macrocíclicas, p.44
3 MATERIAL E MÉTODOS, p.49

3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO, p.49
3.1.1 Etapa I: Estudo da influência das condições ambientais na ocorrência da
infecção por Dirofilaria immitis em cães domésticos, p.49
3.1.1.1 Descrição das localidades do estudo, p.50
3.1.1.2 Obtenção das amostras de sangue canino, p.55
3.1.1.3 Procedimentos realizados com as amostras de sangue canino, p.56
3.1.1.3.1 Pesquisa de microfilárias, p.56
3.1.1.3.2 Pesquisa de antígenos de parasitos adultos, p.56
3.1.2 Etapa II: Confirmação da eficácia preventiva da infecção por Dirofilaria immitis
pelo uso de moléculas do grupo das lactonas macrocíclicas, p.57
3.1.3 Etapa III: Pesquisa de polimorfismos pontuais nos genes da glicoproteína-P e
ß-tubulina em linhagens de Dirofilaria immitis do estado do Rio de Janeiro, p.59
3.1.3.1 Procedimentos realizados com as amostras de sangue canino, p.61
3.1.3.1.1 Contagem de microfilárias, p.61
3.1.3.1.2 Separação de microfilárias, p.61
3.1.3.2 Procedimentos realizados com pools de microfilárias de Dirofilaria immitis,
p.62
3.1.3.2.1 Extração de DNA, p.62
3.1.3.2.2 Amplificação do DNA, p.63
3.1.3.2.3 Sequenciamento, p.65
3.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p.67
4 RESULTADOS, p.68
4.1 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS NA OCORRÊNCIA
DA INFECÇÃO POR Dirofilaria immitis EM CÃES DOMÉSTICOS, p.68
4.2 CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DA INFECÇÃO POR Dirofilaria
immitis PELO USO DE MOLÉCULAS DO GRUPO DAS LACTONAS
MACROCÍCLICAS, p.77
4.3 PESQUISA DE POLIMORFISMOS PONTUAIS NOS GENES DA
GLICOPROTEÍNA-P E ß-TUBULINA EM LINHAGENS DE Dirofilaria immitis DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, p.79
5 DISCUSSÃO, p.86
5.1 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS NA OCORRÊNCIA
DA INFECÇÃO POR Dirofilaria immitis EM CÃES DOMÉSTICOS, p.86
5.2 CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DA INFECÇÃO POR Dirofilaria
immitis PELO USO DE MOLÉCULAS DO GRUPO DAS LACTONAS
GLICOPROTEÍNA-P E ß-TUBULINA EM LINHAGENS DE Dirofilaria immitis DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, p.92
6 CONCLUSÃO, p.95
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p.96
8 APÊNDICES, p.119
8.1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA OBTENÇÃO
DA AMOSTRA DE SANGUE CANINO, p.118
8.2 FICHA DE CAPTURA DOS DADOS DOS CÃES, p.120
8.3 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DA ETAPA DE
CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DAS LACTONAS MACROCÍCLICAS,
p.121
8.4 FICHA DE CAPTURA DOS DADOS DURANTE O TRATAMENTO PREVENTIVO
DA ETAPA DE CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DAS LACTONAS
8.5 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DA ETAPA DA
PESQUISA DE POLIMORFISMOS PONTUAIS NOS GENES DA GLICOPROTEÍNA-
P E ß-TUBULINA, p.123
8.6 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Circulação de Dirofilaria immitis no
estado do Rio de Janeiro: revisita ao foco da região dos lagos” apresentado no 1°
Encontro Nacional de Epidemiologia Veterinária – ENEPI 2012 e publicado na Acta
Scientiae Veterinariae 40 (supl2):S65, 2012, p.124
8.7 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Dirofilaria immitis canina em paisagens
distintas no estado do Rio de Janeiro” apresentado no XVII Congresso Brasileiro de
Parasitologia Veterinária - 2012 e publicado nos anais do congresso (PH 133), p.126
8.8 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Canine Leishmania spp. Ross, 1913 and
Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911 infections as models for
zoonotic and environment studies” apresentado Second International Congress on
Pathogens at the Human Animal Interface – ICOPHAI 2013, p.128
8.9 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Pesquisa de polimorfismo genético em
linhagens de Dirofilaria immitis provenientes do estado do Rio de Janeiro”
apresentado no 50° Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical –
MEDTROP 2014 e publicado nos anais do congresso (P-334), p.131
8.10 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Aspecto da população de cães
incluídos em um estudo de frequência de Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) em
localidades com fisionomias distintas” apresentado no 2° Encontro Nacional de
Epidemiologia Veterinária – ENEPI 2015, p.133
8.11 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Search for genetic polymorphism in
canine Dirofilaria immitis” apresentado no 25th International Conference of the World
Association for the Advancement of Veterinary Parasitology – WAAVP 2015, p.135
8.12 íNTEGRA DO TRABALHO INTITULADO “Chemoprophylaxis of Dirofilaria
immitis (Leidy 1856) infection at a high challenge environment” publicado na revista
Parasites & Vectors (2015) 8:523, p.137
8.13 íNTEGRA DO MANUSCRITO INTITULADO “Serological evidence of canine
exposure to arthropod-borne pathogens at different landscapes” submetido para
revista Veterinary Parasitology: regional studies and reports, p.142
8.14 íNTEGRA DO MANUSCRITO INTITULADO “Genetic polymorphism in Dirofilaria
immitis: what’s happening in another country” submetido para revista Parasite &
Vectors, p.160
9 ANEXOS, p.169
9.1 LICENÇA DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA FUNDAÇÃO
OSWALDO CRUZ, p.169
9.2 LICENÇA DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, p.170
19
1 INTRODUÇÃO
Dirofilaria immitis é a espécie de nematódeo causadora de uma parasitose

relevante que acomete os cães, a dirofilariose canina. Além de cães domésticos e
selvagens, pode infectar naturalmente outras espécies de mamíferos, incluindo
humanos.
Este parasito foi primeiramente descrito em cães em meados do século XIX
nos Estados Unidos da América. Desde então, estudos sobre este agente e sua
infecção vem sendo realizados em diversos países. A infecção é detectada com maior
frequência em regiões de clima tropical ou subtropical, apesar de também ser
observada em regiões de clima temperado. As condições ambientais favoráveis ao
desenvolvimento da infecção devem-se principalmente a presença dos hospedeiros
intermediários, que são os culicídeos.
Os parasitos adultos habitam as artérias pulmonares de cães e produzem
microfilárias por meio de reprodução sexuada. A infecção cursa geralmente de forma
assintomática. A presença da sintomatologia está relacionada com a carga parasitária,
a duração da infecção ou a resposta do hospedeiro, e é caracterizada pela presença
de sinais clínicos como tosse, perda de peso, dispneia e intolerância ao exercício. A
pesquisa de microfilárias pelos métodos de concentração e a de antígenos de
parasitos adultos no sangue dos animais são consideradas os métodos de eleição
para a detecção de D. immitis.
Desde a década de 1980, a prevenção da infecção é realizada com fármacos
pertencentes ao grupo das lactonas macrocíclicas. Atualmente, as lactonas
disponíveis para uso em cães pertencem ao grupo das avermectinas (ivermectina e
selamectina) e das milbemicinas (milbemicina oxima e moxidectina). Porém, mesmo
com a disponibilidade efetiva de preventivos e de eficazes ferramentas de diagnóstico,
a dirofilariose canina ainda é muito difundida e prevalente em todo mundo.
O uso desordenado de fármacos do grupo das lactonas macrocíclicas em
mamíferos domésticos, inclusive cães, parece ter levado a falhas no efeito desejado.
Estudos realizados em alguns países revelara casos de resistência do nematoide D.
immitis a estes produtos. Vários fatores como falha na administração correta do
preventivo, variação biológica entre os hospedeiros no metabolismo do fármaco e da
resposta imune, assim como a susceptibilidade do parasito ao fármaco, vêm sendo
estudados para esclarecer os casos de resistência observados desde 2005.
20
Assim sendo, o presente estudo teve como objetivos verificar a influência das
condições ambientais na ocorrência da infecção por Dirofilaria immitis em cães
domésticos; confirmar a eficácia preventiva da infecção por D. immitis pelo uso de
moléculas do grupo das lactonas macrocíclicas; e pesquisar a presença de
polimorfismos pontuais nos genes da glicoproteína-P e β-tubulina em linhagens de D.
immitis do estado do Rio de Janeiro.
21
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO
Classificação sistemática do agente etiológico segundo Anderson (2006):
Reino Metazoa
Filo Nemathelminthes
Classe Nematoda
Ordem Spirurida
Superfamília Filarioidea (Weiland, 1858) Stiles 1907
Família Onchocercidae (Leiper, 1911)
Subfamília Dirofilariianae Sandground, 1921
Gênero Dirofilaria Raillet & Henry, 1911
Espécie Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911
Os parasitos adultos de Dirofilaria immitis apresentam aspecto filiforme e

coloração esbranquiçada. A extremidade cefálica é ligeiramente fina e arredondada
com abertura bucal circular e sem lábios (ABRAHAM, 1988; LOK, 1988; ANDERSON,
2006; FURTADO et al., 2010). Apresentam cobertura corporal constituída por cutícula,
hipoderme e camada muscular. A cutícula é lisa, multilaminar com 5 a 25 µm de
espessura, com sulcos longitudinais observados na face ventral da região caudal
(LOK, 1988). Possuem linhas laterais constituídas por cristas descontinuas discretas
na porção anterior e posterior do filarídeo, e por duas ou três linhas continuas paralelas
em todo o corpo. O trato digestório é constituído por um único tubo, composto por
esôfago, com uma porção anterior muscular e outra posterior glandular, porém sem
limites bem demarcados entre estas (REY, 2001; FURTADO et al., 2010); e intestino,
formado por células intestinais simples com algumas mitocôndrias rudimentares (LOK,
1988).
Os machos medem de 12 a 20cm de comprimento e 0,7 a 0,9mm de diâmetro,
com extremidade caudal espiralada. As fêmeas são maiores que os machos, medindo
de 25 a 31cm de comprimento e 1,0 a 1,3mm de diâmetro, com extremidade caudal
arredondada (OLSEN, 1974; LEE, 1975; RODRIGUES-SILVA et al., 1999; REY, 2001;
FURTADO et al., 2010).
22
Os vermes adultos podem viver até sete anos e geralmente são observados
nas artérias pulmonares podendo também ser encontrados no ventrículo direito. Em
cães com número de vermes adultos superior a 40, os parasitos tendem a migrar
retrogradamente podendo chegar no átrio direito e na veia cava caudal, interferindo
na função valvular e fluxo sanguíneo (KOTANI; POWERS, 1982; ABRAHAM, 1988;
LOK, 1988; BOWMAN, 2010). Quando a carga parasitária é superior a 15 adultos não
parece ter diferença na proporção entre parasitos machos e fêmeas. Entretanto,
quando a carga parasitária é inferior a 11 adultos, sugere-se uma ocorrência maior de
fêmeas (RISHNIW et al., 2012).
Ao atingirem a maturidade sexual, inicia-se a fase reprodutiva que pode
permanecer por até cinco anos. Parasitos adultos machos e fêmeas localizados nas
artérias pulmonares ou no ventrículo direito se acasalam, e a partir da fecundação,
ocorre o desenvolvimento embrionário até a liberação de microfilárias livres na
corrente sanguínea do hospedeiro definitivo (OLSEN, 1974).
Este parasito alberga a bactéria intracelular do gênero Wolbachia. Este
endossimbionte foi detectado em várias espécies de filarídeos, sendo atribuído
importante papel na biologia destes nematóides. Acredita-se que esta bactéria seja
necessária para o desenvolvimento, reprodução e, até mesmo, sobrevivência do
parasito, influenciando na resposta imunológica e patogênese das filarioses. Nos
parasitos de D. immitis são encontradas em vacúolos citoplasmáticos das cordas
hipodérmicas longitudinais laterais de machos e fêmeas adultos, no trato reprodutivo
das fêmeas, assim como nas larvas presentes nos mosquitos vetores (KRAMER et
al., 2003; KOZEK, 2005).
As microfilárias de D. immitis medem 295 a 325µm (média 308µm) de
comprimento e 5 a 7,5µm (média 7µm) de diâmetro. Possuem corpo e extremidade
cefálica afilada e caudal estendida, com 11,5 e 28,0µm de comprimento,
respectivamente (Figura 1). São observadas estrias ao longo de todo o comprimento
da microfilária, sendo mais visíveis nas extremidades cefálica e caudal. Para atingirem
a fase adulta, elas passam por quatro mudas, sendo duas no hospedeiro intermediário
e duas no hospedeiro definitivo (ANDERSON, 2006; LOK, 1988; MAGNIS et al., 2013).
Permanecem viáveis por até dois anos e são encontradas em quantidades variáveis
na corrente sanguínea de cães, independentemente do número de parasitos adultos
(GRIEVE et al., 1983; LOK, 1988).
23
Figura 01: Microfilária de Dirofilaria immitis. A-

Extremidade cefálica; B- Extremidade caudal.
Técnica de Knott modificada (NEWTON e WRIGHT,
1956).
2.2 CICLO BIOLÓGICO B A
O ciclo biológico necessita da presença de hospedeiros intermediários

(culicídeos), hospedeiros definitivos vertebrados portadores de microfilárias e
hospedeiros definitivos vertebrados susceptíveis (KARTMAN, 1953; LOK, 1988). Mais
de 70 espécies de culicídeos já foram citadas como hospedeiros intermediários deste
parasito sob condições experimentais ou naturais (LUDLAM; JACHOWSKI; OTTO,
1970; LOK, 1988).
Cão doméstico, Canis familiaris, é o hospedeiro definitivo ao qual o parasito é
melhor adaptado, entretanto relata-se que todos os indivíduos do gênero Canis podem
desenvolver a infecção (OLSEN, 1974; ANDERSON, 2006; LABARTHE; ALVES;
SERRÃO; 2002).
O ciclo do parasito é longo, com duração entre seis e nove meses. Durante o
repasto sanguíneo, as fêmeas de culicídeos ingerem as larvas de primeiro estágio
(microfilárias) juntamente com o sangue do canídeo infectado. Os culicídeos podem
ingerir grandes quantidades de microfilárias, uma vez que os cães podem albergar até
5
10 microfilárias/mL de sangue (LOK, 1988). Entretanto, a ingestão de um número
elevado de microfilárias pode provocar a destruição maciça de células nos túbulos de
Malpighi, culminando na morte do culicídeo (CHRISTENSEN, 1978; WALTERS;
LAVOIPIERRE, 1984; LAI et al., 2000).
24
Nas primeiras 24 horas após serem ingeridas pelos culicídeos, as microfilárias

migram para as células primárias dos túbulos de Malpighi, onde permanecem até o
sexto dia pós-infecção, e a partir deste momento, migram para o lúmen dos túbulos
de Malpighi. Na luz dos túbulos, as microfilárias fazem duas mudas (L1-L3) e
alcançam a forma infectante (L3) (KARTMAN, 1953; LOK, 1988; BOWMAN, 2010). As
mudas entre L1 e L3 nos hospedeiros intermediários são dependentes da temperatura
ambiente, ocorrendo entre 10 e 14 dias à temperatura de 28°C e 80% de umidade
relativa. Em temperaturas mais baixas, o período de maturação tende a ser maior,
podendo chegar até 30 dias a 18°C (OLSEN, 1974; LOK, 1988; CUERVO et al., 2013;
NELSON; McCALL; CARITHERS, 2014) (Figura 02).
Durante o repasto sanguíneo as larvas de terceiro estágio (L3) migram para
probóscida do mosquito infectado, sendo depositadas na pele do hospedeiro definitivo
numa gota de hemolinfa. Consecutivamente, as larvas L3 penetram de forma ativa
através do orificio resultante da picada do mosquito (ABRAHAM, 1988; BOWMAN;
ATKINS, 2009) (Figura 02).
Ao infectar o hospedeiro definitivo, as larvas (L3) permanecem no tecido
subcutâneo, e no período de três a quatro dias pós-infecção, fazem outra muda,
passando para larvas de quarto estágio (L4). Neste estágio inicia-se a migração
somática em direção ao tórax do hospedeiro definitivo. Cinquenta a 70 dias após a
infecção ocorre a última muda. As formas imaturas apresentam grande capacidade
de migração, atingindo abdome, tórax, cabeça, pescoço e veias, inclusive a jugular.
Chegam ao ventrículo direito e artérias pulmonares (habitat) em 70 a 110 dias pós-
infecção e continuam crescendo (KOTANI; POWERS, 1982; KNIGHT, 1987;
ABRAHAM, 1988) (Figura 02).
Quando as formas imaturas (3,2–11 cm de comprimento) atingem os pulmões,
elas migram para as pequenas artérias pulmonares devido ao fluxo sanguíneo. À
medida que crescem e aumentam de tamanho, ocupam progressivamente artérias
cada vez maiores até que se tornam totalmente maduras. Os parasitos atingem a
maturidade sexual três meses após a chegada ao habitat. Com a presença de adultos
machos e fêmeas, ocorre o acasalamento, e as fêmeas vivíparas liberam microfilárias
na circulação sanguínea de seis a nove meses pós-infecção (LOK, 1988; CALVERT;
RAWLINGS; McCALL, 2003; ANDERSON, 2006; NELSON; McCALL; CARITHERS,
2014) (Figura 02).
25
Norma Labarthe
*dpi- dias pós infecção.

Figura 02: Ciclo biológico de Dirofilaria immitis em Canis familiaris.
2.3 EPIDEMIOLOGIA DA INFECÇÃO CANINA
A infecção canina por D. immitis apresenta distribuição mundial, e para que

ocorra a transmissão em uma determinada área é fundamental a presença de
canídeos portadores de microfilaremia, de mosquitos vetores e, de animais
susceptíveis (WALTERS; LAVOIPIERRE, 1984).
2.3.1 Distribuição geográfica
A maior ocorrência da infecção é observada em áreas costeiras tropicais ou

subtropicais, entretanto também pode ser encontrada em áreas distantes do litoral
(LABARTHE et al., 1997; CALVERT; RAWLINGS; MCCALL, 2003; GENCHI et al.,
2009; WILLI et al., 2012; LITTLE et al., 2014). Casos de infecção foram diagnosticados
em regiões previamente consideradas livres da infecção (GENCHI et al., 2007;
26
OTRANTO et al., 2009; MORCHÓN et al., 2012). Essa dispersão da infecção para
áreas antes indenes, pode ser justificada pelas alterações climáticas, alterações
ecológicas artificiais, aumento da densidade populacional humana, globalização,
surgimento de novas espécies de mosquitos vetores competentes, assim como
presença de hospedeiros silvestres capazes de manter a infecção. Além disso, fatores
inerentes ao cão e a quimioprofilaxia, como o uso inadequado das lactonas
macrocíclicas no manejo profilático, a falha na absorção do ingrediente ativo, a
variação biológica entre hospedeiros no metabolismo do fármaco e da resposta
imunológica, e a susceptibilidade do parasito ao fármaco associada à hipótese da
resistência às lactonas macrocíclicas, também são atribuídos ao aumento da
ocorrência da infecção por D. immitis em algumas localidades (REIFUR; THOMAZ-
SOCCOL; MONTIANI-FERREIRA, 2001; GENCHI et al., 2009; BROWN et al., 2012;
ALHO et al., 2014; RINALDI et al., 2014; WANG et al., 2014).
No Brasil, o estudo da dirofilariose canina ocorre desde 1878. Estudos
realizados em meados ao final do século XX, principalmente na região Sudeste do
Brasil, verificaram índices variáveis da infecção por D. immitis, observando-se,
contudo, as maiores taxas de infecção nas áreas costeiras (LABARTHE; ALVES;
SERRÃO, 2002). Neste período, o estado do Rio de Janeiro foi o que teve o maior
número de estudos sobre a ocorrência da infecção, apresentando no decorrer dos
anos as seguintes taxas de cães portadores de microfilaremia: cidades do Rio de
Janeiro e Niterói - 10,83 % (XAVIER, 1946); cidade do Rio de Janeiro - 4,9%
(DACORSO et al, 1953); cidade do Rio de Janeiro – 16% (LANGENEGGER et al.,
1962); cidades do Rio de Janeiro (7,76%) e Niterói (23,75%) (LABARTHE; PEREIRA;
SOARES, 1988); estado do Rio de Janeiro - 19,18% no litoral e 12,88% na região
central e montanhosa (LABARTHE et al., 1989); estado do Rio de Janeiro – 16,1%
(LABARTHE et al., 1992); região oceânica da cidade de Niterói - 31,7% (SERRÃO et
al., 2000). Um estudo que realizou pesquisa de microfilárias e antígenos de parasitos
adultos, em cães provenientes das cidades de Niterói, Rio de Janeiro e alguns
municípios da região Serrana e da Costa Leste do Estado, verificou 21,34% de
animais infectados (LABARTHE et al., 1997). No estado de São Paulo, foi relatado
0,7% de cães com microfilaremia (HAGIWARA et al., 1984), e 8,8% na cidade de São
Paulo, em um estudo realizado cerca de 10 anos após (LARSSON, 1990). Já estudo
com detecção de microfilaremia e antigenemia mostrou 14,3% de cães infectados no
27
estado de São Paulo (LABARTHE et al., 1992) e 12,2% no litoral Paulista e 3,9% na
cidade de São Paulo (SOUZA; LARSSON, 2001) (Quadro 01).
Nas outras regiões do País, como no Nordeste Brasileiro, foi verificada
prevalência de 2,3% de cães infectados na cidade de Recife, PE (ALVES et al., 1999);
em São Luís, MA foi observada ocorrência de 15% de cães com microfilaremia (AHID;
LOURENÇO-DE-OLIVEIRA; SARAIVA, 1999) e 1,3% em Maceió, AL (BRITO et al.,
2001). Já na região Norte, foram diagnosticados 10,74% de cães portadores de
microfilaremia no município de Belém, PA (SOUZA et al., 1997). Enquanto que no Sul
do País foi observado 1,1% no Rio Grande do Sul e 12,0% em Santa Catarina
(LABARTHE et al., 1992) e em áreas do litoral paranaense, verificou-se 5,47% de cães
infectados (REIFUR; THOMAZ-SOCCOL; MONTIANI-FERREIRA, 2004) (Quadro 01).
Nos estudos a partir de 2000, de âmbito nacional, uma pesquisa realizada em
2001 observou a seguinte ocorrência da infecção: 2,2% na região Sudeste; 2,5% na
região Nordeste; 2,0% na região Central e 2,0% na região Sul (LABARTHE et al.,
2003). Em 2014, outro estudo percorreu várias localidades da costa Brasileira,
demonstrando um aumento nas taxas de infecção, como: 26,3% na região Sudeste;
29,7% na região Nordeste e 13,2% na região Sul (LABARTHE et al., 2014) (Quadro
01).
No estado do Rio de Janeiro, no início da década de 2000, foi observada
tendência à redução de casos de infecção por D. immitis, como a ocorrência de 3,8%
em 2001 (LABARTHE et al., 2003). Entretanto, nos últimos anos a ocorrência de casos
da infecção canina vem recrudescendo, principalmente, nas áreas de baixada
litorânea do Estado, chegando a 53% (BENDAS et al., 2007; LABARTHE et al., 2011).
Nesta mesma localidade, um estudo realizado cerca de sete anos após, revelou um
índice de 79% de ocorrência de casos da infecção canina (MENDES-DE-ALMEIDA et
al., 2012) (Quadro 01).
No nordeste Brasileiro, na região metropolitana de Recife foi observado
frequência de 7,69% de cães infectados (CARVALHO SILVA, 2006). De forma isolada
no semiárido paraibano, até então caracterizado como uma região que
epidemiologicamente não apresenta fatores que favoreçam a ocorrência da infecção,
foi recentemente relatado caso de infecção em um cão residente no local há sete anos
sem histórico de deslocamentos para outras regiões (DANTAS et al., 2013). Na região
Metropolitana de João Pessoa foi observado prevalência da infecção de 0,33%
(VIDAL, 2014).
28
Já na região Norte, em cães do município de Salvaterra, Ilha do Marajó, PA

foi encontrada prevalência de 53,5% (GARCEZ et al., 2006). Em outras localidades
da Ilha de Marajó foram detectados 16,56% de cães infectados com pesquisa de
microfilárias e antígenos de parasitos adultos (MAIA et al., 2007) e 32,45% com
pesquisa de microfilárias e PCR (FURTADO et al., 2009). Na Ilha de Maiandeua,
município de Maracanã, PA foi observado que 46,86% de cães eram portadores de
microfilaremia (FURTADO et al., 2012). No município de Coari, AM foram
diagnosticados 12,5% de cães com microfilaremia (SILVA et al., 2008) e, no município
de Lábrea, AM foram diagnosticados, pela técnica de PCR, 44,4% de cães infectados
(SOARES et al., 2014). Na cidade de Porto Velho, RO foi verificado que 12,8% dos
cães encontravam-se infectados por D. immitis (OGAWA et al., 2013) (Quadro 01).
No Sul do País, pesquisa realizada no município de São José, SC verificou
que 15% dos cães eram portadores de microfilaremia (ARAÚJO et al., 2003). Em
Guaratuba, PR foi observada que 0,94% dos cães de um canil municipal estavam
infectados (LEITE et al., 2007) (Quadro 01).
29
Quadro 01: Ocorrência de Dirofilaria immitis em cães no Brasil.

Região/estados Ocorrência da Autores
infecção (%)
Sudeste
São Paulo 0,7 a 14,3 Hagiwara et al., 1984; Larsson, 1990; Labarthe et
al., 1992; Souza; Larsson, 2001; Labarthe et al.,
2003; Labarthe et al., 2014
Rio de Janeiro 3,8 a 79,0 Xavier, 1946; Dacorso et al., 1953; Langenegger et
al., 1962; Labarthe; Pereira; Soares,1988; Labarthe
et al., 1989; Labarthe et al., 1992; Labarthe et al.,
1997; Serrão et al., 2000; Labarthe et al., 2003;
Costa et al., 2004; Bendas et al., 2007; Mendes-de-
Almeida et al., 2012; Labarthe et al., 2014
Minas Gerais 0,0 a 9,41 Ferreira et al., 1999; Labarthe et al., 2003
Nordeste
Bahia 0,0 a 20,3 Almeida et al., 2001; Labarthe et al., 2003; Carlos et
al., 2007; Labarthe et al., 2014
Alagoas 0,0 a 1,78 Brito et al., 2001; Labarthe et al., 2003
Pernambuco 0,0 a 49,5 Alves et al., 1999; Labarthe et al., 2003; Carvalho
Silva, 2006; Labarthe et al., 2014
Paraíba 0,33 Vidal, 2014
Ceará 9,1 Labarthe et al., 2003
Maranhão 15% Ahid, Lourenço-de-Oliveira; Saraiva, 1999

Norte
Pará 10,7 a 53,5% Souza et al., 1997; Garcez et al., 2006; Maia et al.,
2007; Furtado et al., 2012
Amazonas 12,5 a 57,6 Silva et al., 2008; Soares et al., 2014
Rondônia 12,8 Ogawa et al., 2013

Centro-Oeste
Mato Grosso 5,8 Fernandes et al., 1999
Sul
Rio Grande do Sul 0,3 a 1,1 Labarthe et al., 1992; Labarthe et al., 2003
Santa Catarina 2,1 a 15,0 Labarthe et al., 1992; Labarthe et al., 2003; Araújo et
al., 2003; Labarthe et al., 2014
Labarthe et al., 2003; Reifur; Thomaz-Soccol;
Paraná 0,9 a 26,3
Montiani-Ferreira, 2004; Leite et al., 2007; Labarthe
et al., 2014
Pesquisa realizada nos países da América Central demonstrou taxas de

prevalência variáveis, sendo observados índices entre 20% e 40% em cidades na
Costa do Golfo do México; 20,4% e 63,2% no Caribe (SIMÓN et al., 2012). Inquéritos
30
em algumas localidades, como na Península Samaná, na República Dominicana,

divulgaram que 1/5 (18,2%) dos cães estavam infectados (DURAN-STRUUCK; JOST;
HERNANDEZ, 2005). Na Costa Rica, recente estudo detectou índice de 15% de cães
infectados (ROJAS et al., 2015).
Em localidades da América do Sul, foi verificado que em Lima, Peru, 4,4% dos
cães encontravam-se infectados em amostras obtidas em 2001 (ADRIANZÉN et al.,
2003) e 5,6% no ano de 2002 (CORIMANYA et al., 2004). Na Venezuela, foi
observado frequência de 15,2% de cães infectados, em município no estado de Sucre
(GUILARTE et al., 2011). Argentina foram observadas frequência da infecção entre 5
e 74% (SIMÓN et al., 2012). Ainda neste País, na região centro-oeste, foram
detectados cães infectados em área cuja infecção ainda não havia sido relatada
(CUERVO et al., 2013).
Nos países da América do Norte, principalmente nos Estados Unidos da
América (EUA), onde a infecção é amplamente estudada, pesquisas demonstraram
soroprevalência entre 0,8 e 1,4%, com maior ocorrência da infecção na região Sul do
território americano (BOWMAN et al., 2009; YANCEI et al., 2014; LITTLE et al., 2014).
Estudo realizado nos cães resgatados da região da Costa do Golfo quatro meses após
o furacão Katrina demonstrou que 48,8% dos cães encontravam-se infectados (LEVY
et al., 2011). No Canadá, foi observado 0,16% de cães infectados com prevalência
realizada por meio de inquéritos anuais no período de 20 anos (KLOTINS et al., 2000).
Em 2008, verificou-se a porcentagem de 0,22% (VILLENEUVE et al., 2011). No
México, 8,3% de cães estavam infectados em estudo realizado em 2001 e 2002
(BOLIO-GONZALEZ et al. 2007). Em localidade costeira no sudeste do México foi
verificada prevalência 59,8%, sendo considerada uma região de alta prevalência
(CARO-GONZALEZ et al., 2011). Já um estudo realizado em uma cidade no nordeste
do México há 530m acima do nível do mar (Monterrey), demonstrou 7% de cães
infectados (SALINAS-MELENDEZ et al., 2012)
Na Europa, até o ano de 2001, a dirofilariose canina era diagnosticada
principalmente nos países da região Sul, como Espanha, Portugal, Itália e França. Na
Grécia, Turquia e alguns países do Oriente foram observados casos isolados, assim
como na Europa Central e do Norte (MORCHÓN et al., 2012). Desde então, o cenário
epidemiológico desta infecção mostra um aumento na ocorrência da infecção,
inclusive em locais cujos casos eram isolados (MORCHÓN et al., 2012; MAIA et al.,
2015). Um estudo realizado na Sérvia, no sudeste europeu, demonstrou ocorrência
31
média de 30,6% de cães infectados entre 2009 e 2013, com índice máximo de 38,8%
em 2012 e mínimo de 24,7% em 2013 (SAVIC et al., 2014). Recente estudo realizado
nas Ilhas Canárias, um arquipélago espanhol, confirmou a permanência desta região
como hiperendêmica, com prevalência de 15,7% (MONTOYA-ALONSO et al., 2016).
Na cidade de Ligúria, no noroeste da Itália, foi observada uma ocorrência de 0,65%
de animais infectados, numa área que até então era considerada livre da infecção
(MAGI et al., 2015). Conceitualmente unânime entre os pesquisadores deste
continente, a dispersão da infecção para áreas até então indenes ou com casos
isolados, é decorrente de vários acontecimentos, como mudanças climáticas,
presença de novos vetores competentes e deslocamento de cães infectados (GENCHI
et al., 2005, 2009, 2011; OTRANTO et al., 2009; PANTCHEV et al., 2011; MORCHÓN
et al., 2012; SIMÓN et al., 2012; GENCHI; BOWMAN; DRAKE, 2014; RINALDI et al.,
2014; SASSNAU et al., 2014; MAIA et al., 2015).
2.3.2 Hospedeiros intermediários
Espécies de culicídeos dos gêneros Aedes, Anopheles, Culex e Mansonia são

os principais representantes dentre os hospedeiros intermediários para a transmissão
de D. immitis (LUDLAM; JACHOWSKI; OTTO, 1970). Apesar da citação de várias
espécies, nem todas possuem capacidade vetorial para transmissão (WALTERS;
LAVOIPIERRE, 1984; LABARTHE et al., 1998a, b; AHID; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA,
1999; SERRÃO; LABARTHE; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 2001; CARVALHO et al.,
2008; CARVALHO et al., 2013).
As espécies de culicídeos capazes de transmitir a infecção são aquelas que
conseguem suportar o desenvolvimento completo do parasito (L1 e L3). Isto ocorre,
pois, alguns fatores podem levar à morte dos vetores ou impedir o desenvolvimento
das larvas dos filarídeos. Durante a migração do parasito no corpo do mosquito e o
desenvolvimento das larvas, podem ocorrer danos que culminarão na morte do
culicídeo. Além disso, a resposta imune do mosquito, principalmente o
encapsulamento e a melanização, pode impedir a progressão dos estágios larvares
dos filarídeos (VEGNI TALLURI; CANCRINI, 1994; BEERNTSEN; JAMES;
CHRISTENSEN, 2000; CHRISTENSEN et al., 2005; BARTHOLOMAY, 2014).
No Brasil, na década de 1990, as espécies Aedes taeniorhynchus (Wiedmann,
1821) e Ochlerotatus scapularis (Rondani, 1848) foram sugeridas como hospedeiros
32
intermediários (LOURENÇO-DE-OLIVEIRA; DEANE, 1995). Posteriormente, outros

estudos apontaram Culex quinquefasciatus (Say, 1823) como mais um possível vetor
no Rio de Janeiro (LABARTHE et al., 1998b; COSTA et al., 2004; LABARTHE;
GUERRERO, 2005; PAIVA, 2009) e em São Luís, MA (AHID; LOURENÇO-DE-
OLIVEIRA, 1999). Um estudo realizado em área litorânea de Maceió, AL, verificou a
presença de exemplares de Cx. quinquefasciatus infectados com D. immitis na região
de maior prevalência da infecção (BRITO et al., 2001). Em Recife, PE, foi verificado
que Cx. quinquefasciatus apresentava capacidade vetorial para transmissão de D.
immitis (CARVALHO et al., 2008), assim como também observado para Aedes
albopictus (Skuse, 1894) (CARVALHO et al., 2013).
Tratando-se das principais espécies de vetores no Rio de Janeiro, a espécie O.
scapularis é comumente observada no ambiente extra domicílio, apesar de também
ser encontrada no domicílio humano, nos períodos em que ocorre aumento
populacional. Tem como criadouros poças de água e alagados, de caráter natural e
temporários no solo. Entretanto, também já foram encontradas formas imaturas em
recipientes artificiais. Os criadouros de Ae. taeniorhynchus são coleções de água no
solo, de caráter transitório e que apresentem salinidade. A população de adultos é
observada mais abundantemente no verão devido a maior probabilidade de chuvas,
que favorece a formação dos criadouros transitórios (CÔNSOLI; LOURENÇO-DE-
OLIVEIRA, 1994). Já quanto a espécie Cx. quinquefasciatus os criadouros potenciais
são depósitos e recipientes temporários, assim como ralos e poços de residências,
favorecendo a proliferação em áreas urbanas (CÔNSOLI; LOURENÇO-DE-
OLIVEIRA, 1994; COSTA et al., 1994).
Em outras localidades do mundo, espécies vetoriais competentes também
foram observadas, como Aedes aegypti e Culex pipiens na Argentina (VEZZANI;
EIRAS; WINIVESKY, 2006). No México, Ae. taeniorhynchus, apresentou a maior taxa
de infecção (MANRIQUE-SAIDE et al., 2010).
Na América do Norte, as espécies Ae. vexans e Ae. sierrensis foram
identificadas como vetores potenciais de transmissão da infecção por D. immitis no
norte da Califórnia (WALTERS; LAVOIPIERRE, 1982). De acordo com a Sociedade
Norte Americana de Dirofilariose (AHS), Ae. albopictus, que foi inicialmente
introduzido na região sul dos Estados Unidos em 1985, encontra-se difundido para a
região norte, já se aproximando do Canadá. Ae. sierrensis é considerado o vetor
primário dos estados do ocidente americano, embora populações isoladas de Ae.
33
albopictus já tenham sido identificadas nestas áreas (NELSON; McCALL;

CARITHERS, 2014). Nas regiões norte-americanas com alta frequência da infecção,
como estado de Missouri, Ae. triseriatus foi citado como vetor (DEBBOUN et al., 2005).
No nordeste do estado de Arkansas, as principais espécies ditas como vetores foram
Ae. vexans and An. quadrimaculatus (MCKAY et al., 2013). Já no Tennesse, as
espécies citadas foram Cx. pippiens e Cx. quinquefasciatus (FRYXELL et al., 2014).
Na Europa, as espécies Cx. theileri, Cx. pippiens e Ae. albopictus foram
identificadas como vetores em vários estudos (CANCRINI et al., 2003; SANTA-ANA;
KHADEN; CAPELA, 2006; GENCHI et al., 2009; MORCHÓN et al., 2012; CAPELLI et
al., 2013; KRONEFELD et al., 2014; FERREIRA et al., 2015). Recentemente foi
verificada na região central da Europa uma espécie exótica do Sudeste Asiático, Ae.
koreicus (SUTER et al. 2015), sendo considerado um vetor competente (MONTARSI
et al., 2015).
2.3.3 Hospedeiros definitivos
Cães domésticos são os hospedeiros definitivos melhor adaptados à infecção

por D. immitis (OLSEN, 1974; McCALL; CALVERT; RAWLINGS, 1994; ANDERSON,
2006; LABARTHE; ALVES; SERRÃO, 2002). Entretanto canídeos silvestres podem
ser acometidos, sendo capazes de desenvolver a infecção (McCALL et al., 2008),
como lobo guará (Chrysocyon brachyurus Illiger, 1815) (DEEM; EMMONS, 2005); lobo
vermelho (Canis lupus rufus Audubon & Bachman, 1851) (PHILLIPS; SCHECK, 1991);
dingo (Canis dingos Meyer, 1793) (STARR; MULLEY, 1988; SMOUT et al., 2016),
coiote (Canis latrans Say, 1823), chacal (Canis aureus Linnaeus, 1758); raposa
vermelha (Vulpes vulpes fulvus Desmarest, 1820 e Vulpes vulpes vulpes Linnaeus,
1758), raposa cinza (Urocyon cinereoargenteus Schreber, 1775) (KAZACOS;
EDBERG, 1979; SIMMONS et al., 1980; CARLSON; NIELSEN, 1983; MULLEY;
STARR, 1984; PAPPAS; LUNZMAN, 1985; GORTAZAR et al., 1994; SACKS, 1998;
TOLNAI et al., 2014).
A ocorrência da infecção é maior em cães com idade superior a dois anos
(SOUZA et al., 1997; ROSA et al., 2002; ARAÚJO et al., 2003; MAIA et al., 2007;
SILVA et al., 2008; VEZZANI et al., 2011; OGAWA et al., 2013; LABARTHE et al.,
2014). Animais com idade inferior a seis meses que apresentam microfilaremia são
aqueles que provavelmente adquiriram pela via transplacentária ou por transfusão de
34
sangue. Nestes casos, não ocorre o desenvolvimento do parasito adulto, visto que o
ciclo só se completa com a participação dos hospedeiros intermediários
(MANTOVANI; JACKSON, 1966; TODD; HOWLAND, 1983).
Aparentemente não há predisposição quanto ao sexo e à raça (BRITO et al.,
2001; ARAÚJO et al., 2003; REIFUR et al., 2004). Entretanto, algumas pesquisas
realizadas para verificar a ocorrência da infecção em diferentes localidades
demonstram maior número de cães machos infectados (SOUZA et al., 1997; MAIA et
al., 2007; SILVA et al., 2008; VEZZANI et al., 2011; OGAWA et al., 2013), enquanto
em outras a maior prevalência foi observada nas fêmeas (LABARTHE et al., 2003;
2014). A raça não é caracterizada como um fator de risco independente, visto que
pode estar associada ao estilo de vida do cão. Os animais que vivem em ambientes
abertos têm maior chance de serem infectados, visto que se encontram expostos aos
mosquitos durante as 24 horas do dia (WALTERS, 1995; ALMEIDA et al.,2001;
VEZZANI et al., 2011; LABARTHE et al., 2014).
Alguns pontos interessantes são destacados quanto aos cães com maior
possibilidade de serem infectados, como: i) os machos têm quatro vezes mais
probabilidade de serem infectados; ii) as infecções ocorrem cinco vezes mais em cães
que vivem em ambientes abertos; iii) a maioria das infecções ocorre em cães com
idade entre três e quinze anos e iv) raças de grande porte são mais frequentemente
infectadas em relação às raças de pequeno porte (BLAGBURN, 2013).
Gatos, mesmo susceptíveis, são considerados uma espécie mais resistente à
infecção com o desenvolvimento de parasitos adultos. Neles, a maioria das infecções
é relativamente leve e consiste em menos de seis vermes adultos, entretanto apenas
dois parasitos podem acarretar em doença grave e até óbito deste hospedeiro
(GENCHI et al., 2008; LITSTER; ATWELL, 2008).
A infecção por D. immitis é considerada uma zoonose desde 1979 pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). Humanos são considerados hospedeiros
acidentais, uma vez que o ciclo do parasito não se completa. As larvas normalmente
não atingem a maturidade sexual, pois geralmente morrem no tecido subcutâneo.
Ocasionalmente, vermes imaturos migram para o coração, e quando ocorre a morte
dos parasitos, são conduzidos para o tecido pulmonar. Há a formação de nódulos
subcutâneos ou pulmonares de acordo com o local no qual as larvas morrem (SIMÓN
et al., 2012; FOISSAC et al., 2013; MALIK et al., 2016). No Brasil, estudos relatam que
a apresentação mais comum é um nódulo pulmonar solitário, entretanto também já foi
35
diagnosticada a presença de D. immitis em outros locais como no globo ocular

(CAVALLAZZI et al., 2002; RODRIGUES-SILVA et al., 2004; BUBLITZ et al., 2012).
Eventualmente outras espécies de mamíferos, podem infectar-se, tais como:
tigre (Panthera tigris Linnaeus, 1758), onça pintada (Panthera onca Linnaeus, 1758),
leopardo (Panthera pardus Linnaeus, 1758) (OTTO, 1974, PAUL-MURPHY et al.,
1994; MAZZARIOL et al., 2010); leão marinho (Zalophus californianus Lesson, 1828)
(FORRESTER et al., 1973); foca (Phoca vitulina Linnaeus, 1758) (MEDWAY;
WIELAND, 1975); lontra (Lontra longicaudis Olfers, 1818) (MATSUDA et al., 2003);
urso (Ursus arctos) (JOHNSON, 1975); panda vermelho (Ailurus fulgens Cuvier, 1825)
(HARWELL; CRAIG, 1981); furão (Mustela putorius furo Linnaeus, 1758) (MILLER,
MERTON, 1982), macaco rhesus (Macaca mulatta Zimmermann, 1780) (BASKIN;
EBERHARD, 1982); coelho (Oryctolagus cuniculus Linnaeus, 1758) (NARAMA et al.,
1982); lebre (Lepus brachyurus angustidens Linnaeus, 1758) (OYAMADA et al., 1995);
cavalo (Equus caballus Linnaeus, 1758) (THURMAN; JOHSON; LICHTENFELS,
1984); guaxinim (Nyctereutes procyonoides viverrinus Temminck, 1838) (SNYDER et
al., 1989; NAKAGAKI et al., 2007); quati (Nasua nasua Linnaeus, 1766) (MORAES et
al., 2015) e gato-do-mato-grande (Leopardus geoffroyi d’Orbigny & Gervais, 1844)
(UHART et al., 2012).
2.4 MÉTODOS DE DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR Dirofilaria immitis
Para o diagnóstico da infecção por D. immitis, a Sociedade Norte Americana

de Dirofilariose (American Heartworm Society - AHS) recomenda a pesquisa de
microfilárias por concentração (técnica de Knott modificada por Newton & Wright, 1956
ou filtração) e a pesquisa de antígenos de parasitos adultos por métodos
imunoenzimáticos ou imunocromatográficos (NELSON; McCALL; CARITHERS,
2014).
2.4.1 Pesquisa de microfilárias
As técnicas para detecção de microfilárias incluem o método direto da gota

espessa (KNIGHT, 1977) e os métodos de concentração, que são as técnicas de
filtração em membrana de policarbonato (CHULARERK; DESOWITZ, 1970) e de Knott
modificada (NEWTON; WRIGHT, 1956).
36
O método direto da gota espessa é o teste mais simples e rápido, usado

inclusive para avaliar o movimento das microfilárias entre as células do sangue.
Embora fácil e acessível, é considerado pouco eficaz, pois não permite a diferenciação
entre espécies de microfilárias, e para que ocorra a detecção, é necessária a presença
de 30 ou mais microfilárias por mL de sangue examinado. Já nos métodos de
concentração, basta a presença de uma microfilária por mL de sangue para que haja
a detecção (BOWMAN; MANNELLA, 2011).
Dentre os métodos de concentração, a técnica de filtração é considerada
rápida e sensível, porém de custo elevado e não permite a confirmação da espécie de
microfilária encontrada (GENCHI; VENCO; GENGHI, 2007). A detecção de
microfilárias pela técnica de Knott modificada (NEWTON; WRIGHT, 1956) é a de
eleição para análise da morfologia das larvas e a mensuração de suas dimensões,
permitindo ainda a diferenciação entre D. immitis e outras espécies de filarídeos, como
Acanthocheilonema (Dipetalonema) reconditum (Figura 03) e Dirofilaria repens
(STEIN; LAWTON, 1973; CIOCAN; DARABUS; IGNA, 2010; MAGNIS et al., 2013)
(Quadro 02).
Figura 03: A- Microfilária de Dirofilaria immitis e B- Microfilária de

Acanthocheilonema reconditum em esfregaço sanguíneo de cão (NELSON, C.T.;
MCCALL, J.W.; CARITHERS, D. Current canine guidelines for the diagnosis,
prevention and management of heartworm (Dirofilaria immitis) infection in dogs.
Canine heartworm guidelines. 2014).
37
Quadro 02: Características morfológicas das microfilárias de Dirofilaria immitis, Acanthocheilonema

reconditum e Dirofilaria repens*
Características D. immitis A. reconditum D. repens
Tamanho Comprimento 301,77 + 6,29 µm 264,83 + 5,47 µm 369,44 + 10,76 µm

Largura 6,30 + 0,26 µm 4,63 + 0,52 µm 8,87 + 0,58 µm
Lento e ondulante
Movimento do tipo Rápido e errático Errático
serpentiforme
Extremidade cefálica Ovalada Achatada Achatada
Extremidade caudal Reta Em forma de gancho Curta e filiforme
*Adaptado de: MAGNIS, J.; LORENTZ, S.; GUARDONE, L.; GRIMM, F.; MAGI, M.; NAUCKE, T.; DEPLAZES, P. Morphometric
Analyses of canine microfilariae isolated by the Knott´s test enables Dirofilaria immitis and D. repens species-specific and
Acanthocheilonema (Syn. Dipetalonema) genus-specific diagnosis. Parasites and Vectors, v.6, p.48, 2013.
Algumas infecções podem cursar sem microfilaremia, sendo denominadas de

infecções ocultas. Podem ocorrer em cães infectados por parasitos de apenas um
sexo, presença de resposta imune contra as microfilárias, uso de fármacos
microfilaricidas ou infecções pré-patentes (WONG et al., 1973; RAWLINGS et al.,
1982; GRIEVE et al., 1986). Geralmente ocorrem entre 20 e 30% dos cães infectados,
onde nestes casos, o diagnóstico só é possível pela pesquisa de antígenos de
parasitos adultos (THILSTED et al., 1987; BENDAS et al., 2007; NELSON; McCALL;
CARITHERS, 2014).
2.4.2 Pesquisa de antígenos de parasitos adultos
A maioria dos testes imunoenzimáticos e imunocromatográficos disponíveis

no mercado internacional apresenta boa sensibilidade (84%) e especificidade (97%)
(McCALL et al., 2001b; ATKINS, 2003; CHANDRASHEKAR et al., 2010; ROHRBACH;
PATTON, 2013).
Para verificar a ocorrência da infecção em populações de cães, a pesquisa de
antígenos é o método de diagnóstico mais sensível. No entanto, recomenda-se que a
pesquisa de microfilárias seja realizada em conjunto com o método de detecção de
antígenos em casos de suspeita de infecção e quando o uso da quimioprofilaxia é
desconhecido (NELSON; McCALL; CARITHERS, 2014).
Antigenemia e microfilaremia geralmente são detectadas, respectivamente,
cinco e seis meses após a infecção. Desta forma, tal pesquisa não é justificada em
38
cães com idade inferior a sete meses de idade. A detecção de antígenos é observada
a partir da presença de pelo menos um parasito fêmea adulta. Resultados falsos
negativos podem ocorrer principalmente em casos de presença de fêmeas imaturas
ou somente de vermes adultos machos. Geralmente a antigenemia precede ao
aparecimento de microfilárias por algumas semanas (VEZZANI; FONTANARROSA;
EIRAS, 2008; ROHRBACH; PATTON, 2013; NELSON; McCALL; CARITHERS, 2014),
entretanto nas pesquisas realizadas no estado do Rio de Janeiro, as microfilárias
precedera à detecção de antígenos de parasitos adultos (informação verbal)1.
A antigenemia pode ser suprimida até cerca de nove meses após a infecção
em cães submetidos à quimioprofilaxia com fármacos do grupo das lactonas
macrocíclicas (informação verbal)2. Cães infectados e submetidos ao tratamento
adulticida com lactonas macrocíclicas e doxiciclina podem apresentar resultados
falsos negativos nos testes imunoenzimáticos, pois a hiperglobulinemia induzida pela
morte dos parasitos favorece a formação de imunocomplexos que impedem a
detecção dos antígenos de parasitos adultos (DRAKE et al., 2015). Para descartar
este resultado falso-negativo, indica-se o tratamento térmico da amostra, a fim de
promover a destruição dos imunocomplexos, permitindo a detecção dos antígenos
(LITTLE et al., 2014; VELASQUEZ et al., 2014).
2.4.3 Detecção de ácido desoxirribonucleico (DNA)
O diagnóstico da infecção também pode ser efetuado por técnicas

moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR). Este método foi proposto
como método espécie-específico de diagnóstico da dirofilariose canina (NICOLAS;
SCOLES, 1997). Esta técnica é principalmente indicada quando não é possível
detectar a infecção com uma das metodologias consagradas ou para definir a espécie
de filarídeo encontrada (RISHNIW et al., 2006; VEZZANI; FONTANARROSA; EIRAS,
2008; SCHNYDER; DEPLAZES, 2012; MAGGI et al., 2014).
Atualmente existem várias técnicas aprimoradas capazes de aperfeiçoar o
diagnóstico e auxiliar nos estudos epidemiológicos nos hospedeiros definitivos e nos
vetores (WONGKAMCHAI et al., 2013; KRONEFELD et al., 2014; SIBERMAYR et al.,
1
Comunicação pessoal feita por Norma Labarthe em 10.07.2015, Rio de Janeiro, Brasil.
2
Comunicação pessoal feita por John McCall em 10.04.2014, Memphis, EUA.
39
2014; ROJAS et al., 2015). Esta técnica pode gerar resultados falso-negativos em
casos de infecção oculta e falha na extração de DNA (CROWDER et al., 2012;
BORTHAKUR et al., 2015).
2.5 QUIMIOPROFILAXIA DA DIROFILARIOSE CANINA
A dietilcarbamazina foi um dos fármacos utilizados para prevenção da

dirofilariose canina antes da década de 1980 (JACKSON, 1969; OTTO, 1969;
FOWLER et al., 1970), quando então, a primeira lactona macrocíclica (LM) foi lançada.
Assim, os fármacos pertencentes ao grupo das LMs passaram a ser a opção mais
utilizada, devido à eficácia e segurança (HAMPSHIRE, 2005; CAMPBELL, 2012).
2.5.1 Lactonas macrocíclicas
As lactonas macrocíclicas (LMs), também denominadas de macrolídeos

endectocidas, são divididas em dois grupos: avermectinas (ivermectina e selamectina)
e milbemicinas (milbemicina oxima e moxidectina). As substâncias destes dois grupos
são produtos de fermentações de diferentes bactérias, porém com estruturas químicas
semelhantes, caracterizando-as como LMs (Quadro 03). Apresentam uma estrutura
cíclica principal formada por 16 elementos com um grupamento éster e subestruturas
como uma subunidade espiroacetal e um anel benzofurânico. A diferença estrutural
principal está na posição C13 do anel macrocíclico, com a presença de um
dissacarídeo (bis-oleandrose) no grupo das avermectinas, diferenciando-as assim das
milbemicinas (PRICHARD; MÉNEZ; LESPINE, 2012).
40
Quadro 03: Esquema de origem das lactonas macrocíclicas: da bactéria do solo aos produtos
terapêuticos (PRICHARD, R. K.; MÉNEZ, C.; LESPINE, A. Moxidectin and the avermectinas:
consanguinity but not identify. International Journal of Parasitology: Drugs and Drug Resistance,
v.2, p.134-153, 2012).
AVERMECTINAS MILBEMICINAS
Streptomyces Mutação genética Streptomyces Streptomyces

avermitilis cyaneogriseus hydroscopicus
ABAMECTINA DORAMECTINA NEMADECTINA
MILBEMICINA
IVERMECTINA SELAMECTINA MOXIDECTINA OXIMA
O mecanismo de ação destes fármacos consiste em bloquear os

neurotransmissores, interferindo nas sinapses neuromusculares. Eles atuam
principalmente sobre os canais de cloro-glutamato, que são comuns em nematoides,
insetos e carrapatos. As avermectinas/milbemicinas ligam-se aos canais de cloro-
glutamato, abrindo-os de forma irreversível, causando uma hiperpolarização das
células nervosas ou musculares, levando a uma paralisia flácida. Em nematóides que
ingerem nutrientes pela abertura bucal, os músculos da faringe parecem ser mais
sensíveis às LMs, e ao bloquear os movimentos, o parasito não consegue se alimentar
(WEBSTER, 2004; SPINOSA, 2006; OMURA, 2008; GEARY; MORENO, 2012). Além
disso, foi verificado que o uso continuo desses fármacos impedem o desenvolvimento
dos estágios pré-larvares no útero das fêmeas adultas de D. immitis (LOK; HARPAZ;
KNIGHT, 1988). Também foi observada a inibição da secreção de proteínas
imunomoduladoras no sistema excretor das microfilárias, tornando o parasito
vulnerável à resposta do sistema imune do hospedeiro (GEARY; MORENO, 2012).
Nos vertebrados, estimula liberação de ácido gama-aminobutírico (GABA) nos
neurônios no sistema nervoso central, porém devido à presença da barreira
hematoencefálica, este grupo de fármacos é seguro para mamíferos nas doses
capazes de atuar nos parasitos nematoides (WEBSTER, 2004).
A ivermectina foi a primeira LM a ser utilizada na medicina veterinária
(CAMPBELL, 1982), e a sua história começou em 1974, quando um microorganismo,
Streptomyces avermitilis foi isolado no Japão, sugerindo ter potente bioatividade
(BURG et al., 1979; HOTSON, 1982). O uso na terapia preventiva da infecção por D.
immitis na dose de 6 µg/kg mensais foi aprovado em 1987 pelo FDA (U.S. Food and
41
Drug Administration) (NADA 140-971) (CAMPBELL, 1989). Após a ivermectina, as

outras LMs usadas na quimioprofilaxia preventiva foram, ordenadas de acordo com o
ano de aprovação para uso: milbemicina oxima (1995 / NADA 141-084), selamectina
(1999 / NADA 141-152) e moxidectina (2001 / NADA 141-189) (BOWMAN;
MANNELLA, 2011). No Brasil, a primeira apresentação de ivermectina específica para
uso em cães surgiu em 1992 (LABARTHE et al., 1996; LABARTHE; ALVES; SERRÃO,
2002) (Quadro 04).
Pelo fato das avermectinas e milbemicinas serem eficazes em baixas doses,
apresentarem elevada atividade lipofílica, estabilidade e segurança, encontram-se
comercialmente disponíveis em várias apresentações, como para uso oral, tópico ou
injetável (NOVOTNY et al., 2000; McCALL et al., 2005; SNYDER et al., 2011;
BOWMAN; MANNELLA, 2011; PRICHARD; MÉNEZ; LESPINE, 2012). Dentre as LMs,
a moxidectina tem maior lipofilicidade, e por isso suas concentrações permanecem
por um tempo maior que a das outras moléculas de macrolídeos endectocidas
(SANGSTER, 1999; WEBSTER, 2004; AL-AZZAM et al., 2007; BLAGBURN et al.,
2011) (Quadro 04). Um estudo realizado para comparar a farmacocinética entre
ivermectina e moxidectina demonstrou que a meia-vida de eliminação da moxidectina
(25,9 dias) foi oito vezes maior que da ivermectina (3,3 dias) (AL-AZZAM et al., 2007).
A moxidectina apresenta um substituto olefinico na cadeia lateral na posição 25 e
metoxima na posição 23, que são as duas características específicas a esta droga,
não sendo observadas nas outras LMs (PRICHARD; MÉNEZ; LESPINE, 2012).
42
Quadro 04: Lactonas macrocíclicas para uso na quimioprofilaxia da dirofilariose canina e respectivas
apresentações comerciais disponíveis no Brasil.
Fármaco Dose Uso Apresentação Fármacos associados na
comercial no Brasil composição
Ivermectina 6-12 µg/kg Oral Cardomec Plus® 1 Pirantel
Oral Endogard® 2 Febantel

+Pirantel+Praziquantel
Milbemicima 500 -1000 µg/kg Oral Program plus® 3 Lufenuron

oxima
Oral Milbemax C® 3 Praziquantel
Oral Trifexis® 3 Spinosad
Selamectina 6000-12000 µg/kg Tópico Revolution® 4 -
Moxidectina 2500-6200 µg/kg Tópico Advocate® 5 Imidacloprida
500 µg/kg Injetável ProHeart® 4 SR-12 -
1.Laboratório Merial Brasil; 2.Laboratório Virbac Saúde Animal; 3.Laboratório Novartis Brasil Saúde
Animal / Laboratório Elanco Brasil; 4.Laboratório Zoetis; 5.Laboratório Bayer Pet.
Os fármacos usados na quimioprofilaxia são submetidos a dois tipos de

estudos estabelecidos pela Food and Drug Administration (FDA) para testar a eficácia
mensal: i) estudo de titulação para determinar a dose mínima eficaz contra o parasito
e ii) estudo de dose de confirmação para verificar se a dose mínima estabelecida é
eficaz contra dois diferentes parasitos isolados. Para serem aprovados, os fármacos
empregados na quimioprofilaxia da dirofilariose tem que apresentar eficácia de 100%
quando utilizados de acordo com as orientações do fabricante, não havendo o
desenvolvimento de nenhum parasito adulto nos cães que são tratados com estes
produtos. Tal exigência foi resultante da perfeita eficácia originalmente conferida à
ivermectina (HAMPSHIRE, 2005; BOWMAN, 2012).
As LMs afetam as microfilárias, larvas de terceiro (L3) ou quarto estágios (L4),
e em alguns casos de uso contínuo podem afetar também os parasitos adultos
(NELSON; McCALL; CARITHERS, 2014). O alvo principal consiste na eliminação das
larvas L3 e L4 devido à elevada vulnerabilidade destes estágios, quando comparado
43
às outras etapas do ciclo do parasito (BOWMAN; MANNELLA, 2011). Ao longo dos

anos, estudos com ivermectina (BLAIR; CAMPBELL, 1980; McCALL et al., 2001a),
milbemicina oxima (SNYDER et al., 2011), selamectina (BISHOP et al., 2000; BOY et
al., 2000; NOVOTNY et al., 2000) e moxidectina (GENCHI et al., 2001; ARTHER et
al., 2005; TRAVERSA et al., 2013; BOWMAN et al., 2016) foram realizados para
confirmar a eficácia das LM na profilaxia da dirofilariose canina.
Quando administradas em cães com microfilaremia, foi constatado que as
LMs tendem a eliminar as microfilárias circulantes no período médio de três meses.
Entretanto, cerca de 10 a 20% de cães infectados tratados mensalmente com dose
preventiva podem manter-se com microfilaremia persistente após este período
(McCALL et al., 2001a).
A ivermectina quando administrada por via oral mensalmente por um ano a
cães após quatro meses de infecção por D. immitis, teve efeito nos parasitos adultos
jovens (McCALL et al., 1996). O efeito adulticida deste fármaco foi de 56,3% quando
administrado por 16 meses consecutivos (McCALL et al., 1998) e de 94,9%, quando
administrado durante 29 meses consecutivos (McCALL et al., 2001a).
Ivermectina e milbemicina oxima foram utilizadas para verificar a eficácia em
parasitos imaturos de três ou quatro meses e adultos de oito meses pós infecção.
Quando administradas a cães infectados por via oral durante 13 meses consecutivos,
ambas foram igualmente eficazes contra os parasitos de três meses (97,7% e 96,8%
respectivamente). No entanto, contra os de quatro meses, a ivermectina se manteve
eficaz (95,1%) e a milbemicina oxima apresentou-se parcialmente eficaz (41,4%). Já
com os parasitos adultos, a ivermectina administrada pelo período de 16 meses
consecutivos, teve eficácia de 56%, enquanto a milbemicina oxima foi ineficaz
(McCALL et al., 2001).
A administração mensal de selamectina em cães com microfilaremia elevada
(>10.000 mf/mL) ocasionou uma redução de 90% no número de microfilárias após a
terceira dose, alcançando a eficácia de 100% na sexta dose. Já nos parasitos adultos,
houve uma redução de 36,4% quando administrada durante 18 meses consecutivos
(DZIMIANSKI et al., 2001).
A moxidectina, em sua formulação injetável de liberação lenta, foi
administrada para avaliação de sua eficácia retroativa em parasitos imaturos de 4
meses. Uma única aplicação demonstrou eficácia de 85,9%, com aumento para 97,2%
quando aplicada uma segunda dose seis meses após a primeira. Entretanto, a eficácia
44
foi bem inferior (<25%) com parasitos de seis meses (McCALL et al., 2001). Em sua
formulação tópica, com uma ou duas aplicações, foi verificada eficácia na supressão
da microfilaremia em cães infectados por D. immitis (McCALL et al., 2014;
REGALBONO et al., 2015; BOWMAN et al., 2015).
Para prevenção da infecção por D. immitis, os diferentes fármacos do grupo
das LMs nas formulações oral e tópica devem ser administrados mensalmente,
evitando o desenvolvimento das larvas (L3 e L4) à fase adulta. Na formulação injetável
de longa ação, são administradas a cada seis ou doze meses. A quimioprofilaxia deve
ser iniciada em filhotes de cães a partir de oito semanas de idade com as formulações
oral ou tópica. Ao iniciar nesta faixa etária, é indicado realizar pesquisa para detecção
de antígenos seis meses após a administração da primeira dose. A formulação
injetável só pode ser empregada na profilaxia da infecção em cães a partir dos seis
meses de idade. O início da terapia preventiva a partir dos sete meses de idade deve
ser precedido dos testes de diagnóstico da infecção. Cães sob terapia preventiva
devem ser avaliados anualmente para detecção de antígenos de parasitos adultos,
com o intuito de confirmar a eficácia da profilaxia (SNYDER et al., 2011; NELSON;
McCALL; CARITHERS, 2014).
2.5.2 Resistência às lactonas macrocíclicas
A resistência aos fármacos é resultante da seleção de uma subpopulação dos

patógenos que pode tolerar efeitos dos produtos farmacêuticos que são normalmente
letais ou prejudiciais a eles. Como a seleção tem base genética, as alterações que
vão afetar o funcionamento ou a expressão de produtos de genes podem ser
detectadas nas sequências de DNA (LESPINE et al., 2012). Estas alterações podem
ser provenientes de mutação espontânea, mutação induzida por exposição química
ou irradiação, levando ao aumento da frequência de um fenótipo em determinada
população. No caso da dirofilariose canina, os casos de resistência podem ser
provenientes de uma mutação espontânea ou pela seleção de um fenótipo raro
(BOWMAN, 2012).
Relata-se que a resistência se desenvolve lentamente no início, e depois
aumenta para níveis máximos de forma relativamente rápida. Ela é determinada
inicialmente pelo aparecimento de genes de resistência e à sua subsequente
acumulação a um nível que leve à falha do tratamento. É provável que os genes de
45
resistência estejam presentes em diversas populações de parasitos ou que processos,

como mutação, sejam responsáveis pela resistência (SANGSTER, 1999).
A resistência anti-helmíntica é considerada um problema global e crescente
em medicina veterinária, em face da pressão de seleção de anti-helmínticos, incluindo
as lactonas macrocíclicas. O histórico de resistência para este grupo de fármacos se
iniciou na década de 1980 em pequenos ruminantes e equinos com parasitas
intestinais (BLACKHALL et al., 1998; KAPLAN, 2004; PRICHARD, 2005). Também
foram relatados casos de falhas no tratamento de filarioses humana com ivermectina
(AWADZI et al., 2004).
Os primeiros comunicados de diminuição de eficácia quanto ao uso das LMs
na quimioprofilaxia da infecção por D. immitis começaram a ser informados ao FDA
em 1998. Nesta época, a maior parte dos relatórios continham informações limitadas,
onde na maioria dos casos, foi sugerido que os responsáveis pelos cães não haviam
cumprido corretamente as recomendações dos fabricantes. Em 2001 e em 2002, o
número de comunicados quanto à ineficácia praticamente dobrou, quando
considerado o número de doses vendidas dos produtos. Desta forma, em 2003 foi
publicado um novo regulamento quanto à apresentação de experiências adversas,
que gerou um número bem maior de relatórios referentes a esta situação. No último
trimestre de 2003 e primeiro trimestre de 2004 houve declínio dos relatos. Apesar da
diminuição de novos casos reportados nessa época, os dados indicaram de fato que
algo estava ocorrendo, não sendo apenas uma simples sugestão. A ocorrência destes
relatos associado às alterações climáticas na Costa do Golfo do México entre 2001 e
2002, que favoreceu o deslocamento e o aumentou a quantidade de vetores,
desencadeou uma incessante busca para verificar se uma situação de resistência em
relação aos produtos usados para impedir a infecção de D. immitis estava se
manifestando. Os relatórios eram principalmente provenientes de áreas endêmicas da
infecção nos EUA, sendo mais de um terço procedente do sul do Texas, da Flórida,
da Carolina do Norte e de regiões próximas ao delta do rio Mississipi (HAMPSHIRE,
2005).
A ocorrência de falhas na quimioprofilaxia com LMs pode ser atribuída ao uso
inadequado do protocolo previsto ou em função de alterações individuais que
modifiquem a farmacocinética. Outra possibilidade de ocorrência seria a presença de
parasitos geneticamente diferentes capazes de sobreviver à exposição do fármaco
46
usado até então em doses recomendadas e eficazes (GEARY; BOURGUINAT;

PRICHARD, 2011).
Com o propósito de comparar quatro produtos disponíveis no mercado
utilizados na quimioprofilaxia da dirofilariose, dois estudos foram realizados utilizando-
se duas cepas de D. immitis isoladas em laboratório (MP3 e JYD-34). A cepa MP3 foi
obtida em junho de 2006 de um cão do nordeste da Geórgia, EUA, naturalmente
infectado e sem histórico de utilização de LMs. Em estudos anteriores, foi verificado
que esta cepa apresentava menor susceptibilidade ao tratamento com ivermectina,
sendo então proposta uma comparação entre ivermectina, milbemicina oxima,
selamectina e moxidectina. A eficácia observada com a utilização de uma única dose
de tratamento experimentalmente em cães infectados com L3 da cepa MP3 foi de
95,6% nos cães tratados com ivermectina, 95,4% com milbemicina oxima, 95,5% com
selamectina e 100% com moxidectina (BLAGBURN et al., 2011). Já o estudo realizado
com a cepa JYD-34 demonstrou os seguintes índices de eficácia: 29% nos cães
tratados com ivermectina, 52,2 % com milbemicina oxima, 28,8% com selamectina e
100% com moxidectina (BLAGBURN et al., 2016).
A heterogeneidade genética de uma população de nematóides implica na
probabilidade do desenvolvimento de resistência aos fármacos, pois uma população
homogênea é menos susceptível a seleção por fármacos ou outras pressões devido
a baixa frequência de polimorfismo (HAMPSHIRE, 2005). Tal fato foi atribuído ao
observado em um estudo de populações de D. immitis, cuja variabilidade genética
encontrada não foi associada exclusivamente pela distribuição geográfica. Desta
forma, levou-se em consideração a hipótese da existência de populações de D.
immitis resistentes às LMs, dependendo da pressão de seleção (BOURGUINAT et al,
2011c).
Estudos de susceptibilidade de D. immitis às LMs estão sendo desenvolvidos
para auxiliar nas pesquisas sobre a resistência. Os transportadores ABC (MDR1) são
importantes focos na resistência às LMs (SANGSTER, 1994; BLACKHALL et al.,
1998; XU et al., 1998, KAPLAN, 2004). Estudos moleculares indicaram que estes
fármacos interagem fortemente com os transportadores ABC de efluxo, como a
glicoproteína-P (Pgp), que é uma proteína de membrana codificada pelo gene MDR1.
Nos mamíferos, este mecanismo está envolvido no efluxo de uma grande variedade
de xenobióticos e desempenham um papel importante na toxicidade e farmacocinética
de LM no hospedeiro (SANGSTER, 1994; BOURGUINAT et al., 2008; LESPINE et al.,
47
2012). Essas interações diferem claramente entre moxidectina e avermectinas, visto

que a interação de moxidectina com a Pgp é muito mais fraca em comparação com
ivermectina (LESPINE et al., 2012). Além disso, a superexpressão destes
transportadores ABC parece ser parte do mecanismo de resistência da ivermectina
em nematoides. Entretanto, a moxidectina tem efeitos diferentes e reduzidos sobre
essa superexpressão (ARDELLI; PRICHARD, 2008), que pode estar associado às
diferenças nos substituintes da estrutura e propriedades físico-químicas desta
substância (PRICHARD; MÉNEZ; LESPINE, 2012). Além do gene da glicoproteína-P,
o gene da ß-tubulina também tem sido sugerido como marcador de resistência (ENG,
PRICHARD, 2005; BOURGUINAT et al., 2011c; OSEI-ATWENEBOANA et al., 2012).
A presença de polimorfismos pontuais (SNPs) nos genes da Pgp e da ß-
tubulina (Tub) tem sido verificada em populações com menor susceptibilidade às LMs,
e assim sugeridos como marcadores de resistência (ENG; PRICHARD, 2005;
BOURGUINAT et al., 2011b). Nesses genes, os SNPs estão sendo observados nas
posições 11 e 618 no gene da pgp, e nas posições 561 e 2755 no gene da tub. Na
pesquisa realizada em parasitos de cães com respostas sub ideais às LMs, observou-
se uma correlação significativa com a presença do genótipo GG-GG no gene da pgp.
Nas amostras consideradas resistentes, a frequência deste genótipo foi de 51,3%,
comparado à frequência de zero a 18,5% observada nas amostras sensíveis
(BOURGUINAT et al., 2011a; BOURGUINAT et al., 2011b).
Com a proposta dos marcadores, foi confirmada a existência de cepas
resistentes (LSU10 e LSU13) isoladas de cães provenientes de áreas suspeitas de
ocorrência de falha de eficácia no estado de Louisiana, EUA. Nos parasitos obtidos
dos cães que foram inoculados com as cepas e desenvolveram a infecção após
tratamento com ivermectina por seis meses consecutivos, foi verificado o genótipo
GG-GG em índices de 40% (LSU10) e 51,7% (LSU13) (PULASKI et al., 2014).
Dentre os estudos para contribuir com a detecção de populações resistentes,
pesquisadores estão desenvolvendo e aperfeiçoando o ensaio de inibição da
migração larval (LMIA) para uso em L3 de D. Immitis, sugerindo ser essa uma boa
técnica para investigar a susceptibilidade de populações de D. immitis às LMs, devido
aos mecanismos de ação nos estágios larvares do parasito (EVANS et al., 2013;
MACLEAN et al., 2015).
A sequência genômica de D. immitis foi analisada com a proposta de
diferenciar geneticamente as populações sensíveis, com falha na eficácia e
48
resistentes às LMs. Este estudo foi realizado com amostras isoladas de estudos
anteriores e constatou que populações de parasitos resistentes e com falha na eficácia
são geneticamente diferentes das populações sensíveis, e que estas diferenças
parecem resultar de um processo de seleção (BOURGUINAT et al., 2015).
Desde os primeiros relatos de diminuição de eficácia na quimioprofilaxia da
infecção por D. immitis, associado ao já observado em outras espécies de helmintos,
diversas hipóteses e consequentes estudos vêm sendo realizados com a proposta de
esclarecer a ocorrência de casos de resistência, principalmente em relação aos casos
descritos na região do Delta do Mississipi dos EUA. Entretanto, até o presente
momento, pode-se dizer que já foram evidenciadas populações de D. immitis
resistentes às LMs, porém ainda há pouca informação sobre a prevalência destas
populações. Pode-se considerar que, a presença da população em refugia, nos cães
não submetidos ao tratamento com as LMs e nos canídeos silvestres, seja um fator
que interfere na dispersão da população de parasitos resistentes (PRICHARD, 2005;
WOLSTENHOLME et al., 2015).
49
3 MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi autorizado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da

Fundação Oswaldo Cruz em 01 de agosto de 2011 sob o número LW-33/11 (Anexo
9.1) e pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense
em agosto de 2012 sob o número 233 (Anexo 9.2).
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O estudo foi desenvolvido em três etapas: I) estudo da influência das

condições ambientais e socioculturais na ocorrência da infecção por Dirofilaria immitis
em cães domésticos; II) confirmação da eficácia preventiva da infecção por Dirofilaria
immitis pelo uso de moléculas do grupo das lactonas macrocíclicas; e III) pesquisa de
polimorfismos pontuais nos genes da glicoproteína-P e β-tubulina em linhagens de
Dirofilaria immitis do estado do Rio de Janeiro.
3.1.1 Etapa I: Estudo da influência das condições ambientais na ocorrência da

infecção por Dirofilaria immitis em cães domésticos.
Para escolher ambientes com fisionomias distintas no estado do Rio de

Janeiro, da Costa Atlântica até a Serra do Mar, iniciou-se pela definição do loteamento
Caiçara, Arraial do Cabo, onde havia um foco ativo da infecção (PAIVA, 2009). Desta
localidade costeira, buscando um gradiente de altitude e distanciamento da costa, com
auxílio do programa Google Earth® (Google Inc.), foram identificadas localidades com
aglomerações humanas em direção à Serra. As localidades previamente identificadas
foram visitadas entre julho e agosto de 2011. Nestas visitas, conversávamos com
moradores das respectivas localidades sobre o estudo a ser realizado e, sempre que
possível um dos moradores nos acompanhava durante o trabalho. Assim, após os
acertos iniciais, definiu-se como localidades de estudo: i) Loteamento Caiçara
(22º55’23”S; 42º13’29”O), município de Arraial do Cabo; ii) Praia da Pontinha
(22º53’08”S; 42º18’54”O), município de Araruama; iii) Loteamento Monteiros
(22º44’02”S; 42º15’15”O), município de Araruama; iv) Aldeia Velha (22º27’34”S;
42º18’23”O), município de Silva Jardim; e v) Toca da Onça (22º24’32”S; 42º19’1”O),
município de Nova Friburgo (Figura
50
Figura 04: Mapa mostrando as localidades do estudo sobre a influência das condições ambientais
e socioculturais na ocorrência da infecção por Dirofilaria immitis em cães domésticos, agosto de
2011 a janeiro de 2012.
3.1.1.1 Descrição das localidades do estudo
Na região costeira, inicialmente o estudo foi realizado no loteamento Caiçara,

a margem da RJ-102, estando ao nível do mar, em área banhada ao sul pelo Oceano
Atlântico e ao Norte pela Lagoa de Araruama (Figura 05A). Esta localidade era
constituída principalmente por casas e poucos estabelecimentos comerciais. As casas
de alvenaria apresentavam, em sua maioria, um aspecto de construção inacabada,
com quintal de terra e pouca arborização. O local era desprovido de ruas
pavimentadas, fornecimento de água ou serviço de tratamento de esgoto, embora
contasse com fornecimento de energia elétrica (Figura 05B). A água era proveniente
de poços artesianos. A localidade pertence ao município de Arraial do Cabo, na Área
de Proteção Ambiental (APA) de Massambaba, a restinga de Massambaba. A restinga
é uma faixa de terra com extensão de 50km entre a lagoa e o oceano, que se estende
desde o Município de Saquarema até Arraial do Cabo. Toda essa região de baixada
litorânea é constituída por dunas e cordões arenosos, que nas áreas mais secas,
51
próximas ao mar, a vegetação é rasteira e arbustiva. O município de Arraial do Cabo,

com área de 160.286km2, apresentou uma população estimada em 2015 de 29.097
habitantes (IBGE, 2014). O clima é tropical litorâneo, com temperatura máxima
absoluta de 34°C e mínima de 10°C. Dados observados ao longo de 30 anos mostram,
respectivamente, médias de 21°C e 28°C de temperaturas mínima e máxima3. O vento
é intenso, sendo o Nordeste de maior frequência, observado principalmente entre os
meses de setembro e abril. Esta região recebe a menor quantidade de chuvas do
Estado, ocorrendo precipitações máximas entre outubro e abril, e as mínimas de julho
a agosto (ARAÚJO et al., 2009; www.arraial.rj.gov.br).
A B
Figura 05: Imagens do loteamento Caiçara, município de Arraial do Cabo, RJ, Brasil, agosto de
2011 a janeiro de 2012. A- Lagoa de Araruama que margeia o loteamento; B- Vista das ruas e
moradias onde o estudo foi realizado.
A Praia da Pontinha é um bairro do município de Araruama, localizado ao nível

do mar. Esta região era vastamente urbanizada, constituída quase em sua totalidade
por casas de alvenaria com construções bem-acabadas e arborizadas, com a maioria
das ruas pavimentadas, contando com fornecimento de energia elétrica, de água
tratada e com serviço de tratamento de esgoto (Figura 06A e B).
O loteamento Monteiros, a margem da RJ-138, no distrito de São Vicente de
Paula, município de Araruama, está a aproximadamente 50m de altitude, numa
distância de 10km da represa de Juturnaíba. No momento do estudo, esta localidade
era uma região em expansão urbana desordenada, ainda caracterizada pela produção
rural. Era constítuído por ruas não pavimentadas, casas de alvenaria com aspecto
3
www.climatempo.com.br/climatologia/770/arraialdocabo-rj.
52
inacabado e pouca arborização, com fornecimento de energia elétrica e de água

tratada, embora sem serviço de tratamento de esgoto (Figura 07A e B).
Tanto a Praia da Pontinha quanto o loteamento Monteiros fazem parte do
município da Região dos Lagos, com área de 638.023km2 e população estimada em
2015 de 122.865 (IBGE, 2014). O território é marcado por planícies e alguns lagos,
como a Lagoa de Araruama e a represa de Juturnaíba (situada entre os municípios
de Araruama e Silva Jardim). O clima da região é tropical, sendo as mínimas diárias
de 9°C a 19°C no inverno, e máximas superiores a 35°C, no verão. Dados observados
ao longo de 30 anos mostram médias 19°C e 31°C de temperaturas mínima e
máxima4, respectivamente. O período de maior ocorrência de chuvas é de dezembro
a fevereiro, e de julho a agosto o período menos chuvoso (www.araruama.rj.gov.br).
A B
Figura 06: Imagens do bairro Praia da Pontinha, no município de Araruama, RJ, Brasil, agosto
de 2011 a janeiro de 2012. A- Margem norte da Lagoa de Araruama ao pôr do sol; B- Vista
das ruas e moradias onde o estudo foi realizado.
A B
Figura 07: Imagens do loteamento Monteiros, no município de Araruama, RJ, Brasil, agosto
de 2011 a janeiro de 2012. A- Vista de uma moradia onde o estudo foi realizado e B- Vista de
uma rua e moradias onde o estudo foi realizado.
4
www.climatempo.com.br/climatologia/285/araruama-rj.
53
Aldeia Velha, localizada no pé da Serra do Mar, está a 140m de altitude, na

divisa política entre os municípios de Silva Jardim e Casimiro de Abreu, situada a 8km
da principal estrada da região (BR-101), por uma estrada ainda não pavimentada.
Apresentava algumas ruas pavimentadas, casas de alvenaria em sua maioria com
aspecto bem-acabado e arborizadas, e alguns estabelecimentos comerciais.
Contavam com fornecimento de energia elétrica e de água tratada, embora sem
serviço de tratamento de esgoto (Figura 08A e B). Pode ser definido como um
pequeno povoado de aproximadamente 800 habitantes, cercado por áreas de Mata
Atlântica conservada pelas propriedades rurais da região, embora com
empobrecimento da cobertura vegetal primitiva devido à ação antrópica,
principalmente nas planícies de inundação (LIMA et al., 2006). A área está localizada
dentro da APA São João/ Mico Leão Dourado, que inclui a Reserva Biológica Poço
das Antas e segue em direção a Serra do mar. Esta localidade integra o município de
Silva Jardim, que ocupa uma área de 937,547km², com uma população estimada em
2015 de 21.307 habitantes (IBGE, 2014). Neste município, o clima é o tropical úmido,
com temperatura média de 24°C. Médias de 15°C de temperatura mínima e de 27°C
de temperatura máxima foram obtidas a partir de uma série de dados observados ao
longo de 30 anos5. O verão é caracterizado como um período quente, úmido e
chuvoso (principalmente entre os meses de dezembro e março); e o inverno é frio e
seco (www.silvajardim.rj.gov.br).
A B
Figura 08: Imagens da localidade Aldeia Velha, no município de Silva Jardim, RJ, Brasil,
agosto de 2011 a janeiro de 2012. A- Rua de acesso à localidade; B- Exemplo das ruas e
moradias onde foi realizado o estudo.
5
www.climatempo.com.br/climatologia/3276/silvajardim-rj.
54
O ponto de maior altitude e mais distante da costa do Oceano Atlântico foi

Toca da Onça. Este lugarejo, localizado no distrito de Lumiar, município de Nova
Friburgo, apresentava ruas sem calçamento, algumas casas de alvenaria com aspecto
bem-acabado e com vegetação, e geralmente distantes umas das outras, quando
comparadas com as outras localidades do estudo (Figura 09A e B). Contavam com
fornecimento precário de energia elétrica, a água era proveniente de nascentes locais
e não havia serviço de tratamento de esgoto. Pode ser definido como um povoado
rural situado em área de Mata Atlântica próximo à RJ-142, a 10km de Lumiar.
Localizado no centro-norte do estado a uma altitude média de 846m, Nova Friburgo
ocupa uma área de 933,414km² e com uma população estimada em 2015 de 184.786
habitantes (IBGE, 2014). O clima da região é o tropical de altitude, com temperatura
média de 19°C. Médias de 10°C de temperatura mínima e de 28°C de máxima foram
calculadas com dados obtidos ao longo de 30 anos6. É considerada a cidade mais fria
do Estado (www.novafriburgo.rj.gov.br).
A B
Figura 09: Imagens da localidade de Toca da Onça, no município de Nova Friburgo, RJ, Brasil,
agosto de 2011 a janeiro de 2012. A- Vista panorâmica da localidade mostrando áreas com
cobertura vegetal conservada e áreas antropizadas; B- Exemplo das moradias onde foi realizado
o estudo.
O estudo da influência das condições ambientais na ocorrência da infecção

canina por D. immitis foi realizado entre agosto de 2011 e janeiro de 2012. Para se
ter conhecimento das cinco áreas de estudo, foram elaborados mapas de cobertura
da terra das mesmas. Para saber o tipo de ambiente observado nas áreas, foi
estabelecido um raio de abrangência de 6km a partir da delimitação da área de
estudo.
6
www.climatempo.com.br/climatologia/314/novafriburgo-rj.
55
Por meio de busca ativa nas moradias das localidades selecionadas, com
equipe composta por cinco médicos veterinários e três ou quatro estudantes de
medicina veterinária, buscou-se incluir todos os cães residentes há pelo menos um
ano na localidade, independentemente de sexo ou raça. A inclusão dos animais foi
realizada somente quando seus responsáveis: i) autorizavam a inclusão dos animais
pela assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Apêndice
8.1) e ii) informavam dados sobre os cães e sobre o ambiente onde viviam (Apêndice
8.2). Amostras de sangue foram coletadas de todos os cães incluídos para pesquisa
de microfilárias e pesquisa de antígenos de parasitos adultos de D. immitis. Os locais
onde os cães eram mantidos tiveram as coordenadas registradas com auxílio de
navegador GPS7 (Global position system) (Figura 10).
Localidades do estudo
Cães residentes há mais de um ano
Assinatura do termo de Consentimento Livre e Esclarecido

pelos responsáveis
Coordenada Amostra de sangue Captura

geográfica (GPS) de dados
Pesquisa de Pesquisa de
microfilária antígeno
Figura 10: Esquema do trabalho realizado para estudo da influência das condições ambientais e
socioculturais na ocorrência da infecção por Dirofilaria immitis em cães domésticos.
3.1.1.2 Obtenção das amostras de sangue canino
Amostras de sangue canino foram obtidas nas três etapas do estudo. Para tal,
os cães foram contidos manualmente, sempre que possível com auxílio dos seus
7
Garmin 60 CSx Garmin International Inc., Kansas, EUA.
56
respectivos responsáveis, por punção das veias jugular ou cefálica com agulhas
hipodérmicas 22GX1 ou agulhas multifly 23G (safety-multifly®)8 descartáveis
acoplados a seringas descartáveis (5mL). As amostras sanguíneas foram
imediatamente transferidas para tubos contendo anticoagulante (heparina sódica). As
amostras foram acondicionadas a 4°C, por no máximo quatro horas, até o
processamento. O processamento das amostras e a análise dos resultados foram
realizados na Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense (UFF),
Niterói, RJ, e no Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto Oswaldo
Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, RJ.
3.1.1.3 Procedimentos realizados com as amostras de sangue canino
3.1.1.3.1 Pesquisa de microfilárias
Para detecção de microfilárias, alíquotas de sangue total foram submetidas

ao exame pela técnica de Knott modificada por Newton e Wright (1956). Para a
realização da técnica, 1mL de sangue total foi diluído em 9mL de formalina 2% e
centrifugado (2260 x g / 5min). Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o
precipitado transferido para lâminas de vidro, cobertas com lamínulas 24x32mm, e
observadas ao microscópio óptico (aumento 100 ou 400x) para detecção e
identificação morfológica das microfilárias.
3.1.1.3.2 Pesquisa de antígenos de parasitos adultos
A pesquisa de antígenos de parasitos adultos foi realizada com alíquotas de

plasma obtidas por centrifugação (2260 x g / 5min) das amostras de sangue total. As
amostras de plasma foram armazenadas a -20°C até a realização do teste. Para isto,
as amostras de plasma foram descongeladas e submetidas ao exame por método
imunoenzimático com kits comerciais9, seguindo-se as recomendações do fabricante
(Figura 14).
8
Lab. Sarstedt, São Paulo, Brasil.
9
SNAP 4Dx®, Lab. Idexx, Maine, EUA.
57
Figura 11: Kit comercial SNAP 4Dx®: A – controle

positivo; B – reação positiva de detecção de antígenos
de parasitos adultos de Dirofilaria immitis.
3.1.2 Etapa II: Confirmação da eficácia preventiva da infecção por Dirofilaria immitis
pelo uso de moléculas do grupo das lactonas macrocíclicas*
A confirmação da eficácia preventiva de moléculas do grupo das lactonas

macrocíclicas (LMs) foi realizada com a inclusão de cães livres de infecção por D.
immitis, residentes em área de alto desafio pela infecção, independente de sexo, idade
ou raça. Os cães foram inseridos no estudo com realização de busca ativa nas
residências do loteamento Caiçara (Arraial do Cabo) e da Praia da Pontinha
(Araruama). Após assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido (Apêndice
8.1) pelos responsáveis pelos cães, amostras de sangue foram coletadas (item
3.1.1.2) para pesquisa de microfilárias (mfs) (item 3.1.1.3.1) e quando se
apresentavam amicrofilarêmicas, realizava-se a pesquisa de antígenos de parasitos
adultos (item 3.1.1.3.2) de D. immitis. Todas as amostras de sangue foram obtidas e
processadas até dois dias antes (dia -2) do início da administração de LMs (Figura
11).
Entre as quatro moléculas de LMs disponíveis no mercado para
quimioprofilaxia da dirofilariose canina, duas foram escolhidas (selamectina e
moxidectina) por serem as mais recentes, pertencerem a grupos distintos de LM
(avermectinas e milbemicinas) e terem a mesma apresentação comercial (bisnaga
com conteúdo de uso tópico para aplicação na região da cernelha), contribuindo
assim, para diminuição das variáveis do estudo.
58
Todos os cães amicrofilarêmicos e sem antigenemia, cujos responsáveis

autorizaram a inclusão no estudo proposto com assinatura do Termo de
Consentimento Livre Esclarecido (Apêndice 8.3), foram aleatoriamente distribuídos
em dois grupos, e receberam: moxidectina tópica (2,5 a 6,25mg/kg) + imidacloprida10
ou selamectina tópica (6mg/kg)11 a cada 30 dias (±5dias), durante oito meses
consecutivos, seguindo-se as recomendações dos fabricantes. Para compreender os
dados ao longo dos meses do estudo, utilizou-se uma ficha de acompanhamento
mensal para cada animal incluído (Apêndice 8.4). Durante os meses de administração
das lactonas macrocíclicas, os cães foram pesados e posteriormente submetidos à
aplicação de LM tópica por um dos integrantes da equipe (Figura 11).
Nos dias 30, 90, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 (± 5 dias) após a primeira
aplicação de LM tópica, foram obtidas amostras de sangue de todos os cães. Todas
as amostras de sangue foram submetidas à pesquisa de mfs e todas as amostras de
sangue obtidas nos dias 90, 150, 180 e 300 (± 5 dias), também foram submetidas à
pesquisa de antígenos de parasitos adultos (Figura 11).
Dia do
estudo
-2 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Tratamento -         - - -
    
Amostra -  - -   
    
 Aplicação de moxidectina tópica (2,5 a 6,5 mg/kg) + imidacloprida ou selamectina tópica (6 mg/kg).
 Amostra de sangue canino para pesquisa de microfilárias (Técnica de Knott modificada por Newton e
Wright, 1956).
 Amostra de sangue canino para pesquisa de microfilárias (Técnica de Knott modificada por Newton e
Wright, 1956) e de antígenos de parasitos adultos por método imunoenzimático (SNAP 4Dx®- Lab.
Idexx).
Figura 12: Esquema do estudo para confirmação da eficácia preventiva da infecção por
Dirofilaria immitis pelo uso de moléculas do grupo das lactonas macrocíclicas.
*(Apêndice 8.12)
10
Advocate®, Lab. Bayer, São Paulo, Brasil.
11
Revolution®, Lab. Zoetis, São Paulo, Brasil.
59
3.1.3 Etapa III: Pesquisa de polimorfismos pontuais nos genes da glicoproteína-P e β-

tubulina em linhagens de Dirofilaria immitis do estado do Rio de Janeiro
Os responsáveis pelos cães microfilarêmicos e com antigenemia das

localidades costeiras do leste do estado do Rio de Janeiro incluídos na etapa I foram
convidados a participar desta nova etapa do estudo. Após assinatura do Termo de
Consentimento Livre Esclarecido (Apêndice 8.1) por eles, foram obtidas amostras de
sangue dos cães (item 3.1.1.2) para pesquisa (item 3.1.1.3.1) e contagem de
microfilárias (mfs), e para pesquisa de antígenos de parasitos adultos (item 3.1.1.3.2)
de D. immitis.
Os cães que tiveram a infecção confirmada pela presença de mfs e de
antígenos de parasitos adultos nas amostras sanguíneas, e cuja microfilaremia foi
superior a 300mf/mL foram incluídos no estudo. Após assinatura do Termo de
Consentimento Livre Esclarecido (Apêndice 8.5) pelos seus respectivos responsáveis,
os cães incluídos receberam quatro doses de ivermectina oral (6 a 12μg/kg) + febantel
+ pirantel + praziquantel12 ou selamectina tópica (6mg/kg)9 a cada 30 dias (±5dias),
seguindo-se as recomendações dos fabricantes. Trinta dias após a quarta dose
profilática de avermectina foram obtidas amostras de sangue para pesquisa de mfs e
separação de mfs de D. immitis (Figura 12).
Dia do estudo -2 0 30 60 90 120
Tratamento -     -
Amostra   - - - 
Administração de ivermectina oral (6 a 12μg/kg) + febantel + pirantel + praziquantel ou selamectina tópica (6

 mg/kg).
Amostra de sangue canino para pesquisa de microfilárias (Técnica de Knott modificada por Newton e Wright,
 1956) e de antígenos de parasitos adultos por método imunoenzimático (SNAP 4Dx®- Lab. Idexx).
 Contagem de microfilárias.
Amostra de sangue canino para pesquisa de microfilárias (Técnica de Knott modificada por Newton e Wright,
 1956)
 Separação de microfilárias.
Figura 13: Esquema do estudo para pesquisa de polimorfismos pontuais nos genes da glicoproteína-
P e β-tubulina em linhagens de Dirofilaria immitis do estado do Rio de Janeiro.
12
Endogard®, Lab. Virbac, São Paulo, Brasil.
60
Dos pools de microfilárias (de cada cão) separadas de amostras que se

mantiveram microfilarêmicas um mês após a quarta dose profilática mensal de
avermectina, extraiu-se DNA para amplificação do fragmento do gene da
glicoproteína-P (Pgp) e do gene da ß-tubulina (Tub) de D. immitis pela técnica da
reação em cadeia pela polimerase (PCR). Após amplificação e confirmação por
eletroforese em gel de agarose a 1,5%, os fragmentos foram sequenciados e os
resultados analisados13 quanto presença de polimorfismos pontuais (SNPs) nos
genes Pgp e Tub. A pesquisa de SNPs foi realizada nas posições 11 e 618 no gene
da Pgp, e nas posições 561 e 2755 no gene da Tub, que foram indicados como
marcadores de resistência de D. immitis às lactonas macrocíclicas (BOURGUINAT et
al., 2011c) (Figura 13).
Cães infectados por

Dirofilaria immitis
(Microfilaremia > 300mf/mL
e antigenemia)
Administração de
avermectina
Presença de microfilárias
Dia 0
Separação de microfilárias
Dia 30
Extração DNA de
Pool de microfilárias
Dia 60
Dia 90 Amplificação DNA pela

PCR para os genes da
Amostra de
glicoproteína-P e
sangue
Dia 120 ß-tubulina
para
pesquisa de
microfilárias
Sequenciamento dos
genes alvos
Pesquisa de
polimorfismos pontuais
(SNPs)
Figura 14: Esquema do trabalho realizado para pesquisa de polimorfismos pontuais nos genes
da glicoproteína-P e β-tubulina em linhagens de Dirofilaria immitis do estado do Rio de Janeiro
61
3.1.3.1 Procedimentos realizados com as amostras de sangue canino
3.1.3.1.1 Contagem de microfilárias
A contagem de microfilárias foi realizada com duas lâminas de cada amostra

de sangue. Em cada lâmina foram instilados 20μL de sangue e 5μL de água, que
foram homogeneizados com bastão de plástico e distribuídos de maneira uniforme por
um retângulo de 25x35mm. Após secagem a temperatura ambiente por 12h, foram
fixadas pelo calor (120°C por 30min) em estufa seca. Depois de secas foram coradas
pelo método de Giemsa (SCHLOTTHAUER et al., 1986) e examinadas ao microscópio
óptico (aumento de 100x) para contagem das microfilárias. As microfilárias foram
contadas em toda área do retângulo de 25x35mm, sempre pelos mesmos dois
operadores, de forma cega e independente. O resultado de cada operador foi obtido
pela média aritmética das contagens das duas lâminas de cada animal. E o resultado
da contagem de microfilárias de cada amostra foi obtido pela média aritmética das
contagens de cada operador. O resultado final de cada amostra foi multiplicado por
50, para ajustar a concentração de microfilárias para 1mL.
3.1.3.1.2 Separação de microfilárias
Para separação de microfilárias dos demais elementos do sangue, misturou-

se 1mL de sangue total a 1mL de solução de NaHCO3, e então passou-se a mistura
em suporte de membrana de policarbonato de 3µm14. Após a passagem da mistura,
as membranas foram retiradas do suporte e imediatamente imersas em PBS (pH 7,2)
em placas de Petri de poliestireno 40 (área 9,2cm2), e incubadas durante 4h a
temperatura ambiente (Figura 15A a F). Após as quatro horas de incubação, todo o
volume da suspensão de cada amostra contendo microfilárias foi transferido para
microtubos de 2mL e centrifugado (2260 x g / 5min). Os sobrenadantes foram
descartados e a cada sedimento foi adicionado 1mL de isopropanol15, e assim
mantidos a 4°C até a extração de DNA.
13
BioEdit Sequence Alignment Editor versão 7.1.11 (HALL, T. A., 1999) e SeqScape® 2.1
14
Sterlitech Corporation, Washington, E.U.A.
15
Lab. Sigma-Aldrich, Missouri, E.U.A.
62
A B C
D E F
Figura 15: Separação de microfilárias: A – suporte de filtro para membrana de policarbonato; B

– seringa contendo amostra de sangue acoplada ao suporte de filtro; C - seringa contendo
solução de NaHCO3 acoplada ao suporte de filtro; D – remoção da membrana de policarbonato
do suporte de filtro; E – imersão da membrana de policarbonato em PBS na placa de Petri
descartável; F – incubação da membrana de policarbonato em PBS.
* Imagens B a F gentilmente cedidas pelo médico veterinário Alexandre Bendas.
3.1.3.2 Procedimentos realizados com pools de microfilárias de Dirofilaria immitis
3.1.3.2.1 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada a partir de alíquotas de 50µL da solução de

pool de microfilárias. O pool de microfilárias de cada amostra foi submetido à digestão
por 2µl proteinase K (2mg/mL) em 100µL de solução de lise (Tris 50mM, NaCl 10mM,
EDTA 5mM, SDS 0,5 %) a 37ºC por 1h. Após a digestão, o DNA foi extraído pela
técnica de fenol/clorofórmio (SAMBROOK, RUSSEL, 2001). Para isto, inicialmente
acrescentou-se fenol16 (volume/volume) à amostra. Após misturar por inversão,
centrifugou-se (18440 x g / 15min), transferiu-se a fase aquosa superior (DNA) para
um microtubo e acrescentou-se 100µL de solução de clorofórmio/álcool isoamílico
1:24. O conteúdo foi misturado por inversão, para posterior centrifugação (21952 x g
16
Lab. Sigma-Aldrich, Missouri, E.U.A.
63
/ 15min). Após a centrifugação, a fase superior foi transferida para outro microtubo e
acrescida de 200µL etanol absoluto. Após misturar por inversão, centrifugou-se
(18440 x g / 15min), descartou-se o sobrenadante e o sedimento de DNA permaneceu
secando à temperatura ambiente por 30 a 60min. Uma vez não observado conteúdo
líquido no microtubo, ressuspendeu-se o DNA em 35µL de água ultrapura.
3.1.3.2.2 Amplificação do DNA
A amplificação do gene da glicoproteína-P (Pgp) e do gene da ß-tubulina (Tub)

de D. immitis foi realizada pela técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR)
utilizando-se primers específicos (Quadro 05).
Quadro 05: Lista de primers usados para amplificação do gene da glicoproteína-P (Pgp) e do gene da
ß-tubulina (Tub) de Dirofilaria immitis
Gene Nome do primer Sequência do primer de 5’ para 3”
Glicoproteína-P PGP_F GGACAATTATCCGGTGGTCA*
PGP_R TCGCAAATTTCCTCCCACTT*
PGP_R2 CTCTTGATGTGTTCCCTGCT**
ß-tubulina TUB1_F TCAAGCTGGTCAGTGTGGC*
TUB1_R CGTTATAGTAGACATTGATTCG*
TUB7_F ATGTGATCCACGTCATGGCC*
TUB7_R CATGTTGTATTTATTCCTCTTGC*
TUB7a_F2 TGCTGAGCTCACTCAACAGG**
TUB7a_R2 GAATGTTGCGCTCATCTTCA**
*BOURGUINAT, C.; KELLER, K.; PRICHARD, R.K.; GEARY, T. Genetic polymorphism in Dirofilaria immitis. Veterinary
Parasitology, v. 176, p.368-373, 2011. **Primers desenhados usando o software primer 3.
Ao volume de 10μL de cada amostra de DNA extraído foi adicionado 1μL de

dNTP (100mM), 1μL de cada primer (10mM), 5μL da solução tampão 10x; 1,5μL de
MgCl2 (50mM); e 0,4μL de Taq DNA Polymerase Recombinant (5U/μL)17,
completando-se ao volume final de 50μL com água ultrapura (Quadro 06).
17
Invitrogen, Lab. Life Technologies Corporation, São Paulo, Brasil.
64
Quadro 06: Primers usados para amplificação e sequenciamento do gene da glicoproteína-P (Pgp) e
do gene da ß-tubulina (Tub) de Dirofilaria immitis, respectivamente.
Gene Posição no gene Primer usado para Primer usado para

amplificação sequenciamento
Glicoproteína-P 11 PGP_F/PGP_R2 PGP_R2
618 PGP_F/PGP_R PGP_F
ß-tubulina 561 TUB1_F/TUB1_R TUB1_R
TUB7_F/TUB7_R TUB7_F
2755
TUB7a_F2/TUB7a_R2 TUB7a_F2
Para amplificação do gene da Pgp, a PCR foi realizada utilizando temperatura

de desnaturação inicial de 94ºC por 3min, seguida de 35 ciclos de desnaturação à
94ºC por 45s, anelamento a 56ºC por 45s, extensão a 68ºC durante 2min, seguida de
uma extensão final a 68ºC por 5min em termociclador18. A amplificação do gene da
Tub foi realizada em temperatura de desnaturação inicial de 94ºC por 3min, seguida
de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 45s, anelamento a 58ºC por 45s, extensão
a 72ºC durante 2min, seguida de uma extensão final a 72ºC por 5min em
termociclador.
Para confirmação da amplificação do gene alvo, os produtos da PCR foram
submetidos à eletroforese horizontal, em gel de agarose a 1,5%, em tampão de corrida
TBE19 (pH 8,3) com marcador de peso molecular de 100 pares de bases (Ladder
100)20 em cuba eletroforética a 100V/30min. Posteriormente, o gel foi corado com
GelRedTM21 e os produtos visualizados e fotografados em transiluminador
ultravioleta22. Todas as reações foram realizadas com controle positivo (DNA extraído
de exemplares adultos de D. immitis oriundos de necropsia de cães domiciliados no
estado do Rio de Janeiro naturalmente infectados) e negativo (água ultrapura).
18
NYX Technick ATC 401 Thermal Cycler Amplitronyx, Califórnia, E.U.A.
19
TBE 10X, Lab. Promega, Wiscosin, E.U.A.
20
Invitrogen, Lab. Life Technologies Corporation, São Paulo, Brasil.
21
Lab. Uniscience, Manitoba, Canadá.
22
Spectroline® ultraviolet transilluminator Kodak.
65
3.1.3.2.3 Sequenciamento
Os fragmentos amplificados de cada amostra para os genes da Pgp e Tub

foram enviados para purificação e sequenciamento na empresa Macrogen
Incorporation23 ou submetidos à purificação com kit de purificação24 e sequenciados
na plataforma de sequenciamento do Instituto Oswaldo Cruz (PDTIS/FIOCRUZ). Os
resultados dos sequenciamentos dos fragmentos dos genes foram analisados pelo
programa BioEdit25 e SeqScape26. Inicialmente o sequenciamento dos genes da Pgp
e da Tub de cada amostra eram comparados com as respectivas sequências de
referência obtidas no GenBank. Posteriormente, nos cromatogramas dos
sequenciamentos dos genes da Pgp e da Tub de cada amostra, foi realizada a
pesquisa dos polimorfismos pontuais (SNPs) nas posições 11 e 618 do gene parcial
da Pgp e nas posições 561 e 2755 do gene da Tub (BOURGUINAT et al., 2011c), por
três operadores de forma independente, com comparação subsequente dos
resultados e considerado o visualizado por pelo menos dois operadores (Figuras 16 e
17).
5’CGAAATCCAAAGATATTATTGCTTGATGAAGCGACCAGTGCATTAGATGCGGAAAGTGAAAGAG
TTAGCTTTTTTAATTTTAAATTTTTAATCTCTTGGAACTATTGAATGATTTTTAATTCACTATTCTTTT
AGTCACGAAAAATTAGTTGGTTTCAAAAAATTCTATAATTTTAAAAAGTCTTTCGCAGAGATTATTT
CATGTACAATTTAATATCTTCATGAAAAATTAGGATTAATATTTGTTAGGATAATCAGCTAAACTGA
ATATAATCTAGCAAATTTTTTCAATCATTAGAAATAAGGAACATGAGGTAAAAAAATATGTGAATAT
TGCGAATACTTTTGAATTGCCTTTTTTCTTAGTAATTCTCATTATCATAGTTTCATTTCAGACAGTTC
AACAAGCTTTGGACGTTGCAAGTAGCGGTCGAACATGTATTACAGTTGCACATAGACTATCATCC
ATTCAGTTTGCAGATCAGATATTTTTTGTAGAAAATGGAAAAGTAGTTGAGCAGGGAACACATCAA
GAGCTCATTGAATTGGACGGGAAGTACGCTGATTTAACTCGCAAACAAGATTTGAGGTCATAAAT
GGTCAGAAATGAAGATAATGTGGTA3’
Figura 16: Sequência parcial de referência do gene da glicoproteína-P (GenBank HM596853) de

Dirofilaria immitis com a marcação da posição 11 (A) e da posição 618 (G)
23
Macrogen Inc.,1007 World Meridian Venture Center, #60-24, Gasan-dong, Geumchun-gu, Seoul, 153-781, Korea.
24
QIAquick® PCR Purifcation Kit, Lab. QIAGEN.
25
BioEdit Sequence Alignment Editor versão 7.1.11 (HALL, T. A., 1999).
26
ABI Prism®, SeqScape® Software versão 2.1, Applied Biosystems.
66
5’GGAGAGAATGAGAGAAATAGTTCACGTTCAAGCTGGTCAGTGTGGCAATCAAATTGGTGCCAA
GGTATCGATTTATCTATTAATTCTTTTTGTCTCTTGAGCAAATGACTCATCTTTTCGTAATATTCCCG
AGCGATAATCAATAAATGATTGATTTGTTCATACATGTATAGACTATCAATGGATGCTGTCACTTTG
TTCTTTTTAGAATTTTCGAAAAAAAATTCTTGAAAAAATCAAAAAAAAATAGGATGTTATTCATTAAA
ATATTTCATTTAATTAAAAATCAATCCCAAGAATCTTATTCCAATTTTTTTCAATGCTTTTATTCGTTT
GCTATATTTCTTCGATTGTATCTTCCTTCTTTCCATTATTTATTCGTGTCCGGATGTAATTGTAATAT
ATATCTCAAAGTCATTTGTCATTTAGCACTTTAATGAGATTCTCAATAAGATCCTTCATATCGAACT
ATGGGGTTGCCTTCTTTTATGTGATAAATAATTGCCCCTTAGTTGTCTGGAATTGAAACAAGATGT
TTTAAGTGCAAACGTACATTATTTAAAGGCTTTTTTTTAAAGATTGCTGTTTGAAAATTTTAAGCGC
AATTTTGATTTTTCAGTTCTGGGAAGTAATATCGGATGAGCATGGCATTCAGCCTGATGGTACGTA
TAAAGGTGATTCAGATTTGCAAATTGAACGAATCAATGTCTACTATAACGAAGCAAATGGTTGGTT
TATTGGGATTTTTTCTCTTTTTTTTGTTTCCTCTGCTTGCTCAAATCATTTTCCGTCTTCGCACGCTC
ACATCACATTATACATAATTCGATATGTACATGCCTATTCCTATTACACCATAGTCTCATATACAAC
CAGTTATCGTCTGGCACCGAGCATTAGTATCGCCAATGAGGTTCATCAGAATGTCCTCAAAATAAT
ATGTTCGAAAGTTAAATGAACATTGTCTGCGTCTCTTTTCAAGGTCTATAGTGATGGATAAAATTTA
GGACATATAATGGGATAGATGGCATGAACTAGTTAGATTAGATGAATTAGTCGCATGGTCTTACTT
TCTAATCTCTTCTTTGCATAATGGAATTTGATATTGAACTAAAATTCTCTGGCTATGGTCTTTTCTG
ACAGATTAGTACTTGTATTTATTGACAAATTTTAATAGGTGTCAATTTGTTTAGAATACTACAGTGC
ATCTTCGCGTTCATTTTTGTATCATTTCTATTCGCAGTTTAATAAATAAATAATATTTTTCTCTAACA
ACAGTATTGTGATGAGGAATTTTTTTTATATGTTTAGGTGGCAAATATGTACCACGAGCGATCCTT
GTCGATCTGGAACCTGGTACTATGGATTCTATTCGAGGAGGTGGATTTGGTCAACTGTTCCGACC
GGATAATTTCGTATTTGGACAGAGTGGAGCTGGCAACAACTGGGCTAAGGGACATTACACAGAAG
GTGCCGAATTAGTTGATAACGTTTTGGACGTAATACGAAAAGAAGCTGAAGGATGCGACTGTCTT
CAGGTGCAATTTGTGGATTGTTACGATTCCTTAGCTATTTTGAATGTGAATGTGGTTTTGAACAGC
CTCATTTTTTTTGAAAAAAATATTAATGAATTTTTTCAGGGATTCCAACTGACTCATTCACTTGGAG
GTGGTACAGGTTCTGGTATGGGAACATTGCTTATCTCGAAGATCCGTGAGGAATATCCAGATCGG
ATTATGAGCTCTTTTTCGGTTGTGCCATCACCTAAAGTATGTATATTTGTGTCTTAACTAGTTTGAT
TTAATTTTCTTGGTTCATACCTTTTCGTTATTTAGAAGCCATCATTTTATTTGCTTCAAATTCATGAA
TGAAGTGAACACTATCTGACGAGATGATTTTAATCTGTCCCTATTTCCTTTTGAAATGCAAGGTTG
GTTTTTCAGGTATCAGATGTTGTGTTGGAACCTTACAATGCAACGTTATCAGTGCATCAATTAGTT
GAAAACACTGATGAAACTTTCTGCATTGATAATGAAGCTTTATATGATATCTGCTTCCGAACATTGA
AATTGACGAATCCAACTTACGGCGATCTCAATCACTTGGGTCCGTTGATTGAGTCCGTCTCTTCAT
TTATTCTTCATATCTTTGCTAAACTTCAAATTGCGGTTTCTTCAATCATGTTTTATTTAGTATCTGTA
ACAATGTCTGGAGTAACAACATGTTTACGTTTCCCTGGACAATTAAATGCCGATCTTCGTAAGCTT
GCTGTTAATATGGTACCATTCCCACGTTTGCATTTCTTCATGCCTGGATTTGCTCCTCTCTCTGCA
CGTGGTGCTGCTGCTTATCGGGCACTCAATGTTGCTGAGCTCACTCAACAGGTTTTGTTTTTCTTT
ATCATTAGAATTGAGAACATGAGCGCCACAATCCCTATTTTTCTATTTAATATATCGTTATAACAGT
ACTTTTAGATTTTTTCAGAAGCGTATTTTTTCAGATGTTTGATGCCAAAAATATGATGGCAGCATGT
GATCCACGTCATGGCCGTTATCTGACCGTAGCTGCTATGTTCCGAGGCAGAATGTCGATGCGAG
TGAGTTAATTTTGGTATTCTTCTTGTTAAAACTGAGAATGGAAATGTGGAAAACTTTTATCTATCTG
ATCCTGGTTTTTCTTTGTCTTAATTTAAATTATAGAAGTAGAATTTTGTCTACGTATTTCTTCAACTG
CAATTTTTTTGCAATTAAAGGGTTTTTTTTTTCTGGTGCAAGGATTTCTTTTGTTTAAAGCTCGATTT
ATTAGTTGAAAGTTTCTGCTAAATTAATTTTTAGGAAGTAGACGAGCAAATGATGCAAGTGCAGAA
TAAGAATTCATCGTATTTCGTTGAATGGATTCCGAATAACGTAAAAACAGCTGTTTGCGATATTCC
ACCACGTGGCTTGAAGATGAGCGCAACATTCATCGGCAATACAACAGCCATACAAGAACTTTTTA
AACGCATTTCTGAACAGTTTACTGGTAAAGGATTTTATTATCTGCTCACTTGATTGGCCAAAATTTA
GGTTTTTGACGACTTTGGGAGAAGGCATAGTGGATGTGGAACATCCATGAACTTCCACTCTAAAA
GAGAGCAGTTTGATTCGATTTTGTTTTATTTCAGCTATGTTCCGACGTAAAGCATTCTTGCATTGGT
ATACTGGAGAAGGTATGGATGAAATGGAATTCACGGAAGCAGAGAGTAACATGAATGACTTGGTG
TCTGAATATCAGCAATATCAGGATGCAACGTCTGATGAAGACGGTGATCTTCAGGAAGGTGAATC
GGAATATATTGAGCAAGAGGAATAAATACAACATGATTAATTTTATGAAAAAAAAAAGAAAAAACAG
AAATGTTTCAGTTTTTTAATTCTCGTCTTCTTCATGTTTTGTGTTGTTACAATT3’
Figura 17: Sequência de referência do gene da ß-Tubulina (GenBank HM596854) de Dirofilaria immitis
com a marcação da posição 561 (A) e da posição 2755 (T) e dos três pares de primers (TUB1), (TUB7)
e (TUB7a).
67
3.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após coletar os dados de cada animal com relação à idade, gênero, raça e
estilo de vida em cada localidade, os mesmos foram armazenados em um banco de
dados utilizando-se o programa EPI INFO 2000® (CDC- Centers for Disease Control
and Prevention).
A fim de se verificar o efeito significativo de D. Immitis com relação à idade,
gênero, raça e estilo de vida dos cães foi realizado o teste do qui-quadrado, sendo
empregada a correção de Yates quando necessário (n<40) ou o teste exato de Fisher
(n<20) dentro e entre localidades, sendo considerado 5% de probabilidade. O mesmo
foi realizado para avaliar a eficácia preventiva de duas moléculas do grupo das
lactonas macrocíclicas, sendo considerado 10% de probabilidade. Todas as análises
foram realizadas a partir do programa BIOESTAT 5.0 (Ayres et al. 2007).
68
4 RESULTADOS
4.1 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS E

SOCIOCULTURAIS NA OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR DIROFILARIA IMMITIS EM
CÃES DOMÉSTICOS
O total de cães registrados nas cinco localidades foi 461, dos quais foi possível
obter 333 (72,2%) amostras de sangue. A densidade populacional de cães foi obtida
pela relação entre o número de cães registrados e o tamanho da área de estudo de
cada localidade. O tamanho da área de estudo de cada localidade foi definido pela
área de um polígono formado pelas residências mais externas dos cães registrados.
Com o resultado do cálculo foi observado que, as localidades da Praia da Pontinha e
do loteamento Monteiros apresentaram as maiores densidades, enquanto que a
menor densidade foi verificada em Toca da Onça (Tabela 01).
Tabela 01: Densidade populacional de cães das cinco localidades distintas do leste do estado do Rio
de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012.
Localidades Tamanho da área Número de cães Densidade populacional

de estudo (ha) registrados (Número de cães/ha)
Loteamento Caiçara 68,2 ha 101 1,5 cães/ha
Praia da Pontinha 38,9 ha 170 4,4 cães/ha
Loteamento Monteiros 15,3 ha 76 5 cães/ha
Aldeia Velha 46,5 ha 67 1,4 cães/ha
Toca da Onça 360,8 ha 47 0,1 cão/ha

69
Apesar de o esforço amostral ter sido semelhante em todas as localidades, a

eficiência amostral foi diferente ao se compará-la nas localidades (  2 =61,2397;
G.L.=4; p<0,0001). A eficiência amostral da Praia da Pontinha (89/170 – 52,3%),
quando comparada à Toca da Onça (45/47 - 95,7%) (  2 =29,352; G.L.=1; p<0,0001),
Aldeia Velha (61/67 - 91,0%) (  2 =30,967; G.L.=1; p<0,0001), loteamento Monteiros
(60/76 – 78,9%) (  2 =15,553; G.L.=1; p=0,0001) e loteamento Caiçara (78/101 -
77,2%) (  2 =16,577; G.L.=1; p<0,0001), mostrou-se inferior. Já as duas localidades
com eficiência acima de 90% (Toca da Onça e Aldeia Velha) mostraram-se
semelhantes entre si (  2 =0,935; G.L.=1; p=0,55210) e diferentes das demais à
exceção de Aldeia Velha quando comparada ao loteamento Monteiros (  2 =4,003;
G.L.=1; p=0,07700). A eficiência amostral de loteamento Monteiros (78,9%) e
loteamento Caiçara (77,2%) foi semelhante (  2 =0,075; G.L.=1; p=0,9283) (Figura
18).
180
160
140
120
Número de cães
100
80 Cães registrados
Amostras de sangue
60
40
20
0
Loteamento Praia da Loteamento Aldeia Velha Toca da Onça
Caiçara Pontinha Monteiros
Localidades
Figura 18: Número de cães registrados e número de amostras de sangue canino obtidas nas cinco
localidades distintas do estudo da influência das condições ambientais e socioculturais na
ocorrência da infecção por Dirofilaria immitis em cães domésticos, estado do Rio de Janeiro, Brasil,
agosto de 2011 a janeiro de 2012.
Apesar das localidades terem sido selecionadas a partir de aglomerados

humanos, as características ambientais tanto dos aglomerados como das periferias
70
eram distintas. Os mapas de cobertura de cada área do estudo permitiram observar

as regiões costeiras com cobertura bastante heterogênea e área antrópica mais
concentrada no loteamento Caiçara, enquanto na localidade da Praia da Pontinha
foi observada área antropizada na maior parte da sua extensão (Figuras 19 e 20).
A região de planície (loteamento Monteiros) é quase que em sua totalidade coberta
por gramínea e vegetação herbácea (Figura 21). Já as regiões serranas (Aldeia
Velha e Toca da Onça) apresentaram fisionomias bem parecidas, caracterizadas
pela vasta cobertura arbórea e pouca área antrópica (Figuras 22 e 23).
Figura 19: Mapa de cobertura do loteamento Caiçara, localidade de estudo para obtenção
das amostras de sangue canino para determinação da frequência da infecção por Dirofilaria
immitis, janeiro de 2012.
71
Figura 20: Mapa de cobertura da Praia da Pontinha, localidade de estudo para obtenção
immitis, novembro e dezembro de 2011.
Figura 21: Mapa de cobertura do loteamento Monteiros, localidade de estudo para obtenção
immitis, outubro de 2011.
72
Figura 22: Mapa de cobertura de Aldeia Velha, localidade de estudo para obtenção das
amostras de sangue canino para determinação da frequência da infecção por Dirofilaria
immitis, setembro de 2011.
Figura 23: Mapa de cobertura de Toca da Onça, localidade de estudo para obtenção das
amostras de sangue canino para determinação da frequência da infecção por Dirofilaria
immitis, agosto de 2011.
73
Em toda a área estudada composta pelas cinco localidades, a frequência da

infecção por D. immitis foi de 36,9% (123/333). Nos cães infectados, a maior
frequência foi de cães portadores de microfilaremia e antigenemia (82/333 - 24,6%) (
 2 =81,8; G.L.=2; p<0,0001). A infecção oculta por D. immitis foi verificada em 10,5%
(35/333) e apenas 1,8% (6/333) dos cães infectados apresentaram somente

microfilaremia (Tabela 02) (Figura 24).
Nas regiões costeiras (loteamento Caiçara e Praia da Pontinha) as
frequências de infecção por D. immitis foram maiores que nas demais. A localidade
costeira com áreas conservadas (loteamento Caiçara) foi onde a frequência da
infecção canina por D. immitis foi maior (63/78 – 80,8%), quando comparada com a
outra localidade costeira (Praia da Pontinha) (52/89 – 58,4%) (  2 =9,677; G.L.=1;
p=0,0032) (Tabela 02) (Figura 24).
Na localidade da planície (loteamento Monteiros), entre o oceano e a serra,
altamente impactada por ação antrópica desordenada e localizada junto a grandes
áreas de substituição de cobertura original do solo por pastagens, não foi encontrado
nenhum animal infectado. Já nas localidades de Aldeia Velha (4/61 – 6,5%) e Toca da
Onça (4/45 – 8,9%), apesar de haver extensas áreas conservadas, foi possível
observar a infecção canina com frequências semelhantes entre elas (  2 =0,202;
GL=1; p=0,9385), embora mais baixas do que das localidades costeiras (Tabela 02)
(Figura 24).
A maior porcentagem de infecções ocultas em relação ao total de animais
examinados foi observada no loteamento Caiçara (17/78 – 21,8%) e na Praia da
Pontinha (13/89 – 14,6%). Entretanto, não houve diferença entre Toca da Onça (4/45
– 8,9%) e estas duas localidades (  2 =3,7631; G.L.=2; p=0,1524) (Tabela 02) (Figura
24).
Já quando se considerou o número de infecções ocultas em relação ao total
de resultados positivos; loteamento Caiçara (17/63 – 27,0%), Praia da Pontinha (13/52
– 25,0%) e Aldeia Velha (1/4 – 25,0%) apresentam resultados semelhantes.
Entretanto, foi em Toca da Onça que se detectou a maior frequência de infecções
ocultas (4/4 – 100%), embora não tenha sido possível demonstrar diferença com
Aldeia Velha (1/4 – 25%) (  2 =4,800; G.L.=1; p=0,1441).
74
Tabela 02: Frequências absolutas e relativas dos cães examinados quanto à detecção exclusiva de
microfilaremia (mf) ou de antigenemia (Ag) ou de ambos (mf/Ag) de Dirofilaria immitis, em localidades
distintas do leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012.
mf Ag mf/Ag Total
Localidades
+/total % +/total % +/total % +/total %
Loteamento Caiçara 1/78 1,3 17/78 21,8a 45/78 57,7a 63/78 80,8a
Praia da Pontinha 4/89 4,5 13/89 14,6a 35/89 39,3b 52/89 58,4b
Loteamento Monteiros 0/60 (-) 0/60 (-) 0/60 (-) 0/60 (-)
Aldeia Velha 1/61 1,6 1/61 1,6b 2/61 3,3c 4/61 6,5c
Toca da Onça 0/45 0,0 4/45 8,9a,b 0/45 0,0c 4/45 8,9c
Total 6/333 1,8 35/333 10,5 82/333 24,6 123/333 36,9

Valores nas colunas com letras sobrescritas distintas são diferentes ao nível de 1% ou 5%. Valores na
linha com símbolos distintos são diferentes ao nível de 1%.
Loteamento Caiçara
Praia da Pontinha
Localidades
Loteamento Monteiros
Aldeia Velha
Toca da Onça
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Número de amostras
Amostras negativas Amostras mf positivas Amostras Ag positivas Amostras mf e Ag positivas
Figura 24: Frequência absoluta de amostras sanguíneas nas quais se detectou a presença de
microfilaremia (mf) ou antigenemia (Ag) de Dirofilaria immitis ou ambas, em localidades distintas do
leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012.
Não foi observada diferença quanto à presença da infecção nos cães em

relação à idade (  2 =3,1503; G.L.=2; p=0,2070) ou raça (  2 =0,105; G.L=1;
p=0,8339) nas diferentes localidades. Entretanto, na Praia da Pontinha, os machos
foram os mais acometidos (  2 =7,254; G.L.=1; p=0,0133) (Tabela 03). Quanto ao
ambiente, os cães que permaneciam a maior parte ou totalidade do tempo ao ar
75
livre foram os mais acometidos, embora com diferença observada somente na Praia
da Pontinha (  2 =4,860; G.L.=1; p=0,0494). Em Aldeia Velha e Toca da Onça todos
os cães infectados permaneciam ao ar livre (Tabela 03).
Tabela 03: Frequências absolutas e relativas de infecção por Dirofilaria immitis em cães, quanto à
idade, ao gênero, à raça e o ambiente de permanência do cão em localidades distintas do leste do
estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012.
Loteamento Praia da Loteamento Aldeia Toca da
Categoria
Caiçara Pontinha Monteiros Velha Onça
+ / Total (%) + / Total (%) + / Total (%) + / Total (%) + / Total (%)
Idade (anos)
1 ┤2 26/36 (72,2) 2/8 (25,0) 0/30 1/22 (4,5) 1/16 (6,3)

2 ┤5 23/26 (88,5) 17/26 (65,4) 0/20 1/22 (4,5) 2/16 (12,5)
>5 14/16 (87,5) 33/55 (60,0) 0/10 2/17 (11,8) 1/13 (7,7)
Combinado 63/78 (80,8) 52/89 (58,4) 0/60 4/61 (6,5) 4/45 (8,9)
Gênero
Macho 27/33 (81,8) 29/39 (74,4)a 0/29 3/36 (8,3) 3/27 (11,1)
Fêmea 36/45 (80,0) 23/50 (46,0)b 0/31 1/25 (4,0) 1/18 (5,6)
Combinado 63/78 (80,8) 52/89 (58,4) 0/60 4/61 (6,5) 4/45 (8,9)
Raça
S.R.D*. 44/53 (83,0) 24/36 (66,7) 0/45 3/40 (7,5) 2/21 (9,5)
Mestiça** 19/25 (76,0) 28/53 (52,8) 0/15 1/21 (4,8) 2/24 (8,7)
Combinado 63/78 (80,8) 52/89 (58,4) 0/60 4/61 (6,5) 4/45 (8,9)
Estilo de
vida
Guarda
50/59 (84,7) 42/64 (65,6)a 0/50 4/45 (8,8) 4/45 (8,8)
(Externo)
Companhia
13/19 (68,4) 10/25 (40,0)b 0/10 0/16 0/0
(Interno)
Combinado 63/78 (80,8) 52/89 (58,4) 0/60 4/61 (6,5) 4/45 (8,9)
+ Cães portadores de microfilárias (técnica de Knott modificada por Newton e Wright, 1956) ou
antígenos (SNAP 4Dx®, Idexx).
*S.R.D. Sem raça definida.
**Mestiça (Akita, Beagle, Bichon Frisé, Bull Terrier, Boxer, Collie, Dálmata, Daschund, Dogue Alemão,
Fila Brasileiro, Fox Paulistinha, Golden Retriever, Labrador Retriever, Maltês, Pastor, Pinscher, Pit Bull,
Pointer, Poodle, Schnauzer e Yorkshire Terrier).
Valores nas colunas com letras sobrescritas distintas são diferentes ao nível de 1% ou 5%.
De acordo com as informações fornecidas pelos responsáveis, em todas as

localidades, parte da população de cães amostrada já fizeram o uso de lactonas
macrocíclicas (LMs), entretanto na maioria das vezes para tratamento de outras
76
parasitoses, e não com o propósito de ser empregada na quimioprofilaxia da infecção

por D. immitis em intervalos mensais. Porém, na Praia da Pontinha, dentre os cães
tratados com LMs, em 50% (14/28) eram efetuados em intervalos mensais (Figura
25).
100
80
60
40
20
0
Loteamento Praia da Pontinha Loteamento Aldeia Velha Toca da Onça
Caiçara Monteiros
Total de cães amostrados
Cães tratados com lactonas macrocíclicas
Cães tratados com lactonas macrocíclicas em intervalos mensais
Figura 25: Frequência absoluta de cães submetidos ao tratamento com lactonas macrocíclicas na
população de cães amostrada para diagnóstico da infecção por Dirofilaria immitis nas localidades do
leste do estado do Rio de Janeiro, Brasil, agosto de 2011 a janeiro de 2012.
Nenhum responsável pelos cães incluídos nas localidades costeiras

(loteamento Caiçara e Praia da Pontinha) citou a ocorrência de mamíferos silvestres
na vizinhança. Já na localidade da planície (loteamento Monteiros) foi citada a
presença apenas de marsupiais (gambá) e nas localidades serranas (Aldeia Velha e
Toca da Onça) várias espécies foram citadas, como canídeos (cachorro do mato);
felídeos (gato do mato, jaguatirica, onça); dasipotídeos (tatu); lagomorfos (tapiti);
marsupiais (cuíca, gambá); mustelídeos (irara); primatas (saguis); procionídeos
(quati); quirópteros (morcegos) ou roedores (esquilo, hamster, ouriço, paca, preá).
Tanto a maior diversidade de observações, quanto o número de responsáveis que
citaram a presença dos animais silvestres foi em Toca da Onça (Figura 26).
77
20
Frequência das citações 18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Mamíferos silvestres
Loteamento Monteiros Aldeia Velha Toca da Onça
Figura 26: Frequência absoluta de mamíferos silvestres citados pelos responsáveis dos cães nas
localidades do loteamento Monteiros, Aldeia Velha e Toca da Onça, Brasil, agosto de 2011 a
janeiro de 2012.
4.2 CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DA INFECÇÃO POR DIROFILARIA

IMMITIS PELO USO DE MOLÉCULAS DO GRUPO DAS LACTONAS
MACROCÍCLICAS
Para identificar animais amicrofilarêmicos e sem antigenemia, 80 cães foram

examinados (loteamento Caiçara: 67/80 – 83,8%; Praia da Pontinha: 13/80 – 16,2%).
A menor frequência da infecção foi observada em cães com idade inferior a um ano
(32/80 – 40,0%) (  2 =9,6031; G.L.=3; p=0,0223). Entretanto, não houve diferença
entre machos (38/80 – 47,5%) e fêmeas (42/80 – 52,5%) (  2 =0,263; G.L.=1;
p=0,8027) ou entre diferentes composições raciais, S.R.D. (52/80 - 65,0%) e mestiços
(28/80 – 35,0%) (  2 =0,553; G.L.=1; p=0,6396) (Tabela 04).
78
Tabela 04 – Frequências absolutas e relativas de cães sem infecção detectável (-) por pesquisa de
microfilárias* (mf) ou por pesquisa de mf e de antígenos** (mf/ag) de Dirofilaria immitis, quanto à idade,
gênero ou raça, em área de alta frequência de infecção na costa leste do estado do Rio de Janeiro,
Brasil, dezembro de 2012.
mf mf/ag
Categoria
- / total examinados % - / total amicrofilarêmicos %
Idade (anos)
<1 30/32 93,8a 28/30 93,3ª
1 ┤2 12/19 63,2b 8/12 66,7 a,b

2 ┤5 13/21 61,9b 8/13 61,5b
>5 6/8 75,0a,b 5/6 83,3 a,b
Combinado 61/80 76,3 49/61 80,3
Gênero
Macho 28/38 73,7 26/28 92,5
Fêmea 33/42 78,6 23/33 70,0
Combinado 61/80 76,3 49/61 80,3
Raça
S.R.D.*** 41/52 78,8 32/41 78,0
Mestiça**** 20/28 71,4 17/20 85,0
Combinado 61/80 76,3 49/61 80,3

*técnica de Knott modificada por Newton e Wright, 1956 ou **SNAP 4Dx, IDEXX;
***S.R.D. Sem raça definida;
****Mestiça (Boxer, Pinscher, Pit Bull e Yorkshire Terrier);
Valores nas colunas com letras sobrescritas distintas são diferentes ao nível de 5%.
Dentre os 49 cães amicrofilarêmicos e sem antigenemia, 46 puderam ser

incluídos no estudo, sendo 23 cães alocados no grupo que recebeu moxidectina tópica
(2,5 a 6,25mg/kg) + imidacloprid8 e 23 no grupo que recebeu selamectina tópica
(6mg/kg)9. Destes animais incluídos no dia 0, 29 concluíram o estudo (14 no grupo
que recebeu moxidectina + imidacloprid8 e 15 no grupo que recebeu selamectina
tópica2). Dentre os 17 excluídos ao longo do estudo, sete foram por razões diversas,
independentes do estudo, e dez cães foram excluídos por terem se tornado
microfilarêmicos ou com antigenemia nos primeiros seis meses (até o dia 180) após a
primeira dose de lactona macrocíclica e, portanto, considerados previamente
infectados (Tabela 05).
Após a exclusão dos cães previamente infectados, todos que receberam
moxidectina8 se mantiveram amicrofilarêmicos e sem antigenemia (14/14 – 100%),
79
durante os 11 meses de estudo, enquanto que, 73,3% (11/15) dos cães que
receberam selamectina9 mantiveram-se livre da infecção (amicrofilarêmicos e sem
antigenemia) (Tabela 05). Dentre os quatro cães que alteraram o status durante o
período da quimioprofilaxia, um apresentou antigenemia e três apresentaram
microfilaremia e antigenemia.
Tabela 05 – Frequências absolutas e relativas de cães submetidos ao tratamento com moxidectina ou

selamectina segundo detecção de microfilárias (mf)* ou de antígenos de parasitos adultos (Ag)** de
Dirofilaria immitis, até o dia 150 (infectados antes do início do estudo), no dia 180 (possivelmente
infectados antes do início do estudo) e entre os dias 270 e 300 (infectados durante o tratamento
preventivo).
Dias após o início do tratamento
Lactona
macrocíclica
0 a 150 180 270 a 300
+ / Total (%) + / Total (%) + / Total (%)
Moxidectina 3/23 (13,0) 0/18 (-) 0/14 (-)a
Selamectina 6/23 (26,1) 1/20 (5,0) 4/15 (26,7)b
*técnica de Knott modificada por Newton e Wright, 1956 ou **SNAP 4Dx, IDEXX.
Houve redução no número de animais em tratamento devido à exclusão pela mudança de status da
infecção por Dirofilaria immitis ou por causas diversas.
Valores nas colunas com letras sobrescritas distintas são diferentes (p=0,057).

GLICOPROTEÍNA-P E β-TUBULINA EM LINHAGENS DE DIROFILARIA IMMITIS DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Durante a revisita às localidades costeiras para identificação de cães

infectados com >300mf/mL foram examinados 65 cães e todos continuavam
microfilarêmicos e com antigenemia. Destes, os responsáveis por 43 autorizaram a
participação no estudo. Dos 43, 32 (74,4%) apresentaram microfilaremia acima de
300mf/mL. O DNA foi extraído e amplificado de 30 pools de mfs para o gene parcial
da glicoproteína-P (Pgp) (Figura 27) e para o gene da β-tubulina (Tub) (Figuras 28 e
29). Sempre que possível, o sequenciamento foi realizado para os quatro locus em
cada uma das amostras (Figura 30). Duas amostras foram excluídas do estudo devido
a impossibilidade de extrair ou amplificar o DNA dos pools de mfs.
80
Figura 27 – Amplificação de um fragmento do

gene da glicoproteína P (623pb) em
amostras (pool de microfilárias) do estudo -
Gel de agarose (1,5%) de amostras
amplificadas pela reação em cadeia pela
polimerase. Controle positivo (Ctrl pos.) –
parasito adulto de Dirofilaria immitis.
Controle negativo (Ctrl neg.) – água
ultrapura. Peso molecular (PM) – ladder 100.
Figura 28 – Amplificação de fragmento

do gene da ß-tubulina (692pb) em
amostras (pool de microfilárias) do
estudo - Gel de agarose (1,5%) de
amostras amplificadas pela reação em
cadeia pela polimerase. Controle
positivo (Ctrl pos.) – parasito adulto de
Dirofilaria immitis. Controle negativo
(Ctrl neg.) – água ultrapura. Peso
molecular (PM) – ladder 100.
Figura 29 – Amplificação de fragmento

do gene da ß-tubulina (832pb) em
amostras (pool de microfilárias) do
estudo - Gel de agarose (1,5%) de
amostras amplificadas pela reação em
cadeia pela polimerase. Controle
positivo (Ctrl pos.) – parasito adulto de
Dirofilaria immitis. Controle negativo
(Ctrl neg.) – água ultrapura. Peso
molecular (PM) – ladder 100.
Das 30 amostras de DNA de pools de mfs amplificadas e sequenciadas para

o seguimento parcial do gene da Pgp, a observação da posição 11 foi possível em 28
cromatogramas (Figura 31), e da posição 618 em 26 cromatogramas (Figuras 32).
81
Nestes cromatogramas não foi observada presença de polimorfismos pontuais

(SNPs). Devido à baixa qualidade dos picos nas posições 11 e 618, respectivamente,
dois e quatro cromatogramas não foram analisados (Tabela 06).
Já para o gene da Tub, a posição 561 do sequenciamento foi analisada em
25 cromatogramas e a posição 2755, foi analisada em 27 cromatogramas. A análise
dos cromatogramas destas posições sugeriu a presença de SNPs em 18 amostras na
posição 561 (18/25 – 72,0%) (Figura 33) e em 13 amostras na posição 2755 (13/27 –
48,0%) (Figura 34). Também devido à baixa qualidade dos picos, cinco e três
cromatogramas não foram analisados, respectivamente, nas posições 561 e 2755
(Tabela 06).
Tabela 06 – Número de amostras de DNA de pools de microfilárias de linhagens de Dirofilaria immitis

do estado do Rio de Janeiro analisadas quanto à presença de polimorfismos pontuais para pesquisa
da ocorrência dos marcadores de resistência às lactonas macrocíclicas nos genes da glicoproteína-P
e β-tubulina.
Número de amostras de DNA
Posição no
Gene Presença de
gene Amplificadas e Análise do
polimorfismos
sequenciadas cromatograma
pontuais
Glicoproteína-P
11 30 28 -
618 30 26 -
β-tubulina
561 30 25 18
2755 30 27 13
A B C D
Figura 30: Cromatogramas obtidos pelo sequenciamento da amostra AR59 de pools de

microfilárias de Dirofilaria immitis, sequenciada para o gene parcial da glicoproteína-P com
marcação da posição 11 (A) e 618 (B), e para o gene da β-tubulina com marcação das
posições 561 (C) e 2755 (D).
82
Adulto AR58 AR59 AR60
AR62 AR65 AR66 AR67
AR91 AR98 AR101 AR155
AR159 CAJ01 CAJ06 CAJ08
CAJ17 CAJ22 CAJ24 CAJ39
CAJ45 CAJ67 CAJ76 CAL29
CAL39 CAL45 CAL50 CAL51
CAL84
Figura 31: Cromatogramas obtidos pelos sequenciamentos das amostras dos pools de microfilárias
de Dirofilaria immitis sequenciadas para o gene parcial da glicoproteína-P com marcação da posição
11.
83
AR62 AR65 AR66 AR67
AR91 AR98 AR101 AR155
AR159 CAJ01 CAJ06 CAJ08
CAL29 CAL45 CAL50
de Dirofilaria immitis sequenciadas para o gene parcial da glicoproteína-P com marcação da posição
618.
84
AR62 AR65 AR66 AR67
AR101 AR155 AR159 CAJ01
CAJ76 CAL29 CAL39 CAL45
CAL51 CAL84
de Dirofilaria immitis sequenciadas para o gene da β-tubulina com marcação da posição 561.
Amostras com duplo pico em destaque ( ).
85
ADULTO AR58 AR59 AR60
AR62 AR65 AR66 AR67
AR98 AR101 AR155 AR159
CAJ68 CAJ76 CAL29 CAL39
CAL45 CAL50 CAL51 CAL84
de Dirofilaria immitis sequenciadas para o gene da β-tubulina com marcação da posição 2755.
Amostras com duplo pico em destaque ( ).
86
5 DISCUSSÃO
5.1 ESTUDO DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES AMBIENTAIS E

SOCIOCULTURAIS NA OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR DIROFILARIA IMMITIS EM
CÃES DOMÉSTICOS
A interferência das condições socioculturais e econômicas da população

humana sobre a eficiência na conquista da confiança dos responsáveis pelos animais
e consequente obtenção de amostras foi notável. A localidade na qual a menor
proporção foi obtida (Praia da Pontinha – 52,3%) foi exatamente aquela onde havia
as melhores condições, que era fortemente urbanizada e também onde havia dois
estabelecimentos médico-veterinários próximos. A proximidade com os
estabelecimentos médico-veterinários pode ter contribuído para a menor aceitação da
população local em submeter seus animais aos cuidados de profissionais
desconhecidos, ou simplesmente por considerarem seus cães já supervisionados de
forma adequada. Tanto assim que as duas localidades mais isoladas (Aldeia Velha –
91,0% e Toca da Onça – 95,7%) foram aquelas nas quais a população foi mais
colaborativa. Curiosamente, parece que o relativo isolamento favoreceu a aceitação
da equipe e consequentemente a colaboração com o trabalho. Além disso, a sensação
de segurança experimentada pela equipe de trabalho e certamente vivida pela
população residente nessas localidades mais afastadas dos grandes centros urbanos,
pode ter colaborado para o sucesso do esforço amostral. É fato que ambas eram as
mais distantes de estabelecimentos médico-veterinários e de atividades culturais, o
que pode ter facilitado a aproximação da população local com o grupo de trabalho.
Já os loteamentos Monteiros (78,9%) e Caiçara (77,2%), embora
apresentassem as condições socioculturais e econômicas menos favorecidas,
contavam com raros estabelecimentos médico-veterinários a distâncias intermediárias
e suas populações eram expostas a atividades culturais de um distrito dormitório
(loteamento Monteiros) ou de balneários de veraneio de populações menos
favorecidas (loteamento Caiçara). Assim, é possível que a baixa eficiência amostral
nessas localidades tenha sido reflexo de receio quanto à segurança local e das longas
jornadas de trabalho acrescidas do tempo necessário ao deslocamento diário.
A mais alta taxa de infecção por Dirofilaria imitis foi observada no loteamento
Caiçara (80,8%), provavelmente por que lá se observou a presença de todas as
87
condições ideais para que a transmissão ocorresse: i) presença de animais

suscetíveis; ii) presença de animais portadores de microfilaremia e; iii) presença de
populações de vetores capazes (WALTERS; LAVOIPIERRE, 1984). No caso, os
animais susceptíveis foram representados por densa população de cães (1,5 cães/ha)
que não recebiam prevenção adequada. Os animais portadores de microfilárias foram
representados pelos cães infectados naturalmente. A população de vetores na
localidade parece ser favorecida pela presença de áreas naturais conservadas, por
temperaturas ambientes altas (34°C), que aumentam o número de gerações de
mosquitos por ano (CALADO; SILVA, 2002), pela fartura de criadouros naturais com
água salobra e turfa, favorecendo a população de Aedes taeniorhynchus (Wiedmann,
1821) e de criadouros naturais efêmeros que favorecem a população de Ochlerotatus
scapularis (Rondani, 1848) (FORATTINI et al., 1987; 1989; CÔNSOLI; LOURENÇO-
DE-OLIVEIRA, 1994; PAIVA, 2009), uma vez que, estas duas espécies de vetores
hemi-sinantrópicos, são reconhecidamente eficientes em baixadas litorâneas do
estado do Rio de Janeiro (LOURENÇO-DE-OLIVEIRA; DEANE, 1995; LABARTHE et
al., 1998b).
Além disso, a manutenção de temperaturas ambientes acima de 21°C durante
a maior parte do ano acelera o ciclo extrínseco dos vermes, favorecendo que cada
espécime infectado se torne infectante mais rapidamente e, portanto, tenham
possibilidade de transmitir maior número de larvas infectantes durante seu tempo de
vida alada (KNIGHT; LOK, 1998; GENCHI et al., 2009; SSASNAU et al., 2014).
Ao se considerar a população canina da localidade, as taxas de infecção
foram semelhantes quanto à faixa etária, ao gênero, à composição racial ou ao estilo
de vida. Entretanto, as condições socioculturais e econômicas e a distância de
recursos médico-veterinários pareceram interferir nos cuidados dedicados aos
animais uma vez que havia mais cães com idade entre um e dois anos (36/78 - 46,1%)
do que cães com idade superior a cinco anos (16/78 - 20,5%). Além disso, 75,6%
(59/78) dos cães permaneciam a maior parte do tempo ao ar livre, o que os deixava
expostos aos mosquitos.
Já na Praia da Pontinha (58,4%), que embora também seja litorânea e com
alta densidade canina (4,4 cães/ha), não contava com abundância de todas as
condicionantes ideais inerentes à transmissão. Lá as condições de urbanização
provavelmente reduziram os criadouros naturais de mosquitos vetores. Além disso, os
recursos médico-veterinários locais associados às condições socioculturais favoráveis
88
certamente concentraram cães que recebiam prevenção adequada, reduzindo a

população canina susceptível. Parece que os cuidados dispensados aos animais eram
diferenciados, tanto assim que a tabela de vida da população canina de lá era
invertida. A maior população era de cães adultos com idade superior a cinco anos
(55/89 - 61,8%), seguidos por cães adultos jovens (idade entre dois e cinco anos)
(26/89 - 29,2%) e apenas 9% (8/89) dos cães tinham idade entre um e dois anos.
Entretanto, a maioria (64/89 – 71,9%) era mantida ao ar livre na maior parte do tempo,
e consequentemente expostos aos mosquitos. Mesmo assim, a característica de
baixada litorânea do estado do Rio de Janeiro, apresentando temperaturas altas
durante o ano (35°C) mesmo com menor disponibilidade de criadouros e de cães
susceptíveis ou microfilarêmicos, reuniu condições suficientes à manutenção da
transmissão, embora representando menor desafio quando comparada com a outra
localidade costeira.
A ausência de cães infectados no loteamento Monteiros sugere que a
urbanização local desordenada associada a cobertura do solo predominantemente por
gramíneas de pastagens, tenha reduzido ou até eliminado a população de mosquitos
vetores. Interessante observar que a localidade dista da costa oceânica por
aproximadamente 22km, da Lagoa de Araruama por 14km e da represa de Juturnaíba,
coleção de água com 43Km2 de superfície (WASSERMAN; BARROS; VOLCKER,
2008), por apenas 10km, sugerindo haver ambientes favoráveis à proliferação de
vetores nas proximidades, o que poderia ter favorecido a instalação de populações de
vetores no local. Essa ausência de infecção canina sugere também que a forte
antropização local tenha afastado os animais silvestres que poderiam ser refugia do
parasito. Além disso, como a localidade não é um destino turístico, o fluxo de cães
vindos de outras localidades que poderiam ser microfilarêmicos é desprezível. Assim,
a localidade, apesar de não contar com condições socioculturais favoráveis, ser
desprovida de recursos médico-veterinários próximos e de ter temperatura ambiente
alta (35°C), não reunia todas as condições necessárias para favorecer a transmissão,
embora os cães permanecessem a maior parte do tempo ao ar livre, expostos aos
possíveis vetores. Lá havia mais cães com idade entre um e dois anos (30/60 - 50%)
que cães com idade entre dois e cinco (20/60 – 33,3%) e acima de cinco anos (10/60
- 16,7%), sugerindo que o recrutamento seja alto em função de morte ou fuga dos
animais devido à pouca atenção que provavelmente recebem de seus responsáveis.
89
A presença de cães infectados nas duas localidades de temperaturas

ambientes médias mais amenas (24°C e 19°C respectivamente) e mais afastadas de
coleções de água salgada (costa atlântica e lagoa de Araruama) ou fresca (represa
de Juturnaíba), Aldeia Velha e Toca da Onça, com taxas de infecção semelhantes
entre si (6,5% e 8,9% respectivamente) mostra que mesmo em locais desfavoráveis
à concentração de culicídeos e onde os helmintos poderão ter ciclos extrínsecos
longos, os vetores são capazes de transmiti-los. Nestas duas localidades é provável
que a principal fonte de infecção para os mosquitos fossem cães microfilarêmicos
vindos de outras localidades com seus responsáveis em função de turismo. Além
disso, em Toca da Onça, a presença de animais silvestres habitantes das extensas
áreas conservadas pode ter aumentado a oferta de microfilárias aos mosquitos
(McCALL et al., 2008; BOWMAN; ATKINS, 2009). Tanto assim que o avistamento de
grupos de mamíferos silvestres locais que podem servir de refugia, como canídeos,
mustelídeos e procionídeos (SNYDER et al., 1989; TORRES et al., 2004; DEEM;
EMMONS, 2005; MORAES et al., 2015), só foi citado pelos moradores de Toca da
Onça. Já em Aldeia Velha, mesmo adjacente a grandes áreas de proteção natural
permanente (APA São João/ Mico Leão Dourado e RPPN Fazenda Bom Retiro), o
avistamento de animais com potencial de infecção com microfilaremia não foi citado,
provavelmente por que há maior aglomeração de residências do que em Toca da
Onça, tanto assim que a área total de residências era de 46,5ha enquanto em Toca
da Onça era de 360,8ha. Assim, pode-se sugerir que as áreas conservadas de Mata
Atlântica ofereceram recursos suficientes aos vetores para transmitirem D. immitis,
mesmo que em baixa frequência, como já evidenciado (LABARTHE et al., 2014).
A análise da tabela de vida dos cães das duas localidades não demonstrou
diferença entre as faixas etárias, sugerindo que haja pouca interferência nas
condições de vida dos animais. Assim como nas demais localidades, a maioria dos
animais vivia a maior parte do tempo ao ar livre, expostos aos mosquitos.
Apesar de infecções ocultas ocorrerem de 20 a 30% da população canina
infectada (BENDAS et al., 2007; NELSON; McCALL; CARITHERS, 2014), a taxa
verificada foi menor (10,5%), sugerindo que a utilização de medicamentos com efeitos
microfilaricidas não seja uma prática frequente em todas as localidades. A
porcentagem de infecções ocultas em todas as localidades acompanhou a frequência
da infecção local, sugerindo ser, na maioria das vezes, fenômeno natural e esperado.
Interessante notar que em Toca da Onça todas as infecções foram amicrofilarêmicas
90
(4/45), sugerindo provável uso de lactonas macrocíclicas ou até de antibióticos para

controle de infecções transmitidas por carrapatos nos cães desta localidade. Este fato
reforça a hipótese de que o isolamento da população com consequente
distanciamento de recursos médico-veterinários e com atividade agropecuária intensa
facilite o acesso e consequente uso inadequado desses produtos.
Ao comparar as cinco localidades entre si, sugere-se que a proximidade com
coleções de água com alto teor de salinidade, com temperaturas altas, ambiente
natural conservado e com alta densidade populacional de cães favorecem a
transmissão. Além disso, condições socioculturais e econômicas favorecidas
associadas à disponibilidade de recursos médico-veterinários, apesar de não ter se
configurado em conduta preventiva da infecção por D. immitis, parecem ter
determinado maior sobrevida aos animais. Assim, a infecção não pode ser
considerada exclusividade da costa oceânica, uma vez que a transmissão ocorreu em
localidade afastada da costa, a quase 1000m de altitude, com temperaturas amenas
que tendem a reduzir o número de gerações de mosquitos vetores por ano e a
aumentar o ciclo extrínseco dos helmintos.
5.2 CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DA INFECÇÃO POR DIROFILARIA

IMMITIS PELO USO DE MOLÉCULAS DO GRUPO DAS LACTONAS
MACROCÍCLICAS
Para que o estudo da eficácia da utilização das moléculas do grupo das

lactonas macrocíclicas (LMs) fosse realizado em localidade que indicasse a eficácia
em condições reais de alto desafio, a busca por cães não infectados demandou o
exame de muitos animais. Como as localidades de loteamento Caiçara e de Praia da
Pontinha reuniam condições ideais de transmissão, o esforço foi concentrado lá.
Assim, após o exame de 80 cães, apenas 49 (61,2%) mostraram-se amicrofilarêmicos
e sem antígenos de parasitas adultos detectáveis. Os resultados mostraram que o
desafio local é alto, tanto assim que a maioria desses animais tinha idade inferior a
um ano (28/49 – 57,1%) e que composição racial e gênero não interferiram.
91
O desafio local mostrou-se alto mesmo após o início do uso da medicação

preventiva, uma vez que a infecção pode ser detectada até o dia 180 em 10 cães,
denotando infecção prévia ao início da prevenção. A eficácia das moléculas foi
comprovada pelos resultados obtidos entre 270 e 300 dias de estudo, quando o
produto à base de moxidectina tópica (2,5 a 6,25mg/kg) + imidacloprid8 mostrou-se
100% (14/14) eficaz e o produto à base de selamectina tópica (6mg/kg)9 mostrou-se
73,3% (11/15) eficaz.
As principais razões para falhas na quimioprofilaxia com LMs são
subdosagens e falhas no atendimento às recomendações dos laboratórios
(BOWMAN; ATKINS, 2009; ATKINS et al., 2014). Entretanto, estas foram controladas
uma vez que todas as aplicações dos produtos foram executadas pela equipe de
trabalho, atendendo às recomendações dos laboratórios produtores. Portanto, as
principais razões indiretas para o insucesso da prevenção foram excluídas.
O uso de moxidectina tópica (2,5 a 6,25mg/kg) + imidacloprid8 mostrou-se
mais eficaz do que o uso de selamectina tópica (6mg/kg)9 na prevenção da infecção
por D. immitis, como já demonstrado anteriormente frente a cepas consideradas
resistentes (BLAGBURN et al., 2011; BOWMAN, 2012; BLAGBURN et al., 2016).
Assim, a eficácia da moxidectina foi confirmada em condições naturais em locais de
alto desafio, de forma semelhante ao que já fora observado em estudos laboratoriais
(ARTHER et al., 2005). É possível que a maior lipofilicidade da moxidectina quando
comparada à da selamectina (SANGSTER, 1999; WEBSTER, 2004; AL-AZZAM et al.,
2007; BLAGBURN et al., 2011) possa ter interferido de forma positiva na eficácia, uma
vez que as larvas mais susceptíveis ao efeito das LMs são aquelas que se encontram
no tecido subcutâneo (BOWMAN; MANNELLA, 2011), rico em tecido adiposo.
Além disso, deve-se considerar que como as LMs podem retardar o
desenvolvimento de D. immitis por nove meses quando administradas corretamente
(informação verbal)27 e, portanto, é possível inferir que a infecção dos cães que
receberam selamectina tenha ocorrido antes da primeira dose e que o uso de
selamectina foi ineficaz em eliminar a infecção mesmo que tenha retardado o
desenvolvimento dos vermes.
27
Comunicação pessoal feita por John McCall em 10.04.2014, Memphis, EUA.
92
Deve-se também supor a presença de parasitos menos susceptíveis às LMs

na região do estudo, visto que, desde os primeiros relatos de diminuição de eficácia
das LMs na quimioprofilaxia da infecção por D. immitis (HAMPSHIRE, 2005), estudos
sobre a susceptibilidade deste parasito a esses fármacos, vêm sendo realizados
(GEARY; BOURGUINAT; PRICHARD, 2011).
O acompanhamento da eficácia das moléculas de LMs usadas na
quimioprofilaxia deve ser mantido para que mesmo nas regiões de alto desafio, a
infecção possa ser eficazmente evitada tanto em cães quanto em humanos.

GLICOPROTEÍNA-P E β-TUBULINA EM LINHAGENS DE DIROFILARIA IMMITIS DO
ESTADO DO RIO DE JANEIRO
A resistência anti-helmíntica é considerada um problema mundial progressivo

na medicina veterinária, devido à pressão de seleção dos fármacos, como já
observado com as lactonas macrocíclicas (LMs) desde a década de 1980, em
nematódeos de pequenos ruminantes (KAPLAN, 2004). Em populações de Dirofilaria
immitis, o primeiro comunicado de diminuição de eficácia das LMs na quimioprofilaxia
da infecção foi feito em 2005 (HAMPSHIRE, 2005). Desde então, diversos relatos de
perda de eficácia foram publicados (BLAGBURN et al., 2011; BOURGUINAT et al.,
2011b), porém, ainda não foi possível saber quanto à propagação das populações
resistentes no mundo.
Por outro lado, diferente dos pequenos ruminantes, na população canina a
utilização de LMS é feita de modo individual, dependendo do responsável de cada
animal. Grande parte da população, especialmente em áreas onde as condições
humanas são mais precárias, não utiliza ou o faz de modo inadequado. Assim, estes
cães não submetidos à quimioprofilaxia da infecção, junto com os animais errantes e
silvestres mantêm uma população de parasitos em refugia, interferindo na pressão de
seleção para a resistência às LMs (PRICHARD, 2005; WOLSTENHOLME et al.,
2015).
93
Este estudo foi realizado com microfilárias isoladas de cães submetidos ao

tratamento mensal com quatro doses profiláticas de avermectinas. Como é sabido, a
frequência e o tempo de utilização dos fármacos promove uma pressão de seleção
podendo resultar em uma população de parasitos resistente (KAPLAN, 2004;
WOLSTENHOLME; KAPLAN, 2012). A ivermectina por ter sido a primeira LM
empregada na quimioprofilaxia da dirofilariose canina (CAMPBELL, 1989), é a que
exerce pressão há mais tempo e por isso é a mais passível de ter gerado resistência.
A caracterização de uma população de parasitos resistentes é algo complexo,
devido à dificuldade em diferenciar aqueles que são geneticamente resistentes
daqueles que fortuitamente resistiram ao tratamento (WOLSTENHOLME; KAPLAN,
2012; BOURGUINAT et al., 2015). Grande também é a dificuldade em caracterizar a
causa da resistência. Sendo assim, a identificação de marcadores genéticos de
resistência permitiria acompanhar a disseminação das cepas resistentes pelo mundo
e discriminar cepas resistentes de sensíveis antes de iniciar um tratamento. Estudos
com Haemonchus contortus e Onchocerca volvulus já preconizaram os genes da
glicoproteina-P (Pgp) e da ß-tubulina (Tub) como marcadores de populações
resistentes à ivermectina (XU et al., 1998; ENG; PRICHARD, 2005), como a
ocorrência de SNPs no gene da Tub de O. Volvulus (ENG et al., 2006). Assim, como
estudado nestes outros helmintos, a ocorrência de mutação espontânea ou seleção
de um genótipo raro parece justificar os relatos de resistência na dirofilariose canina
(BOWMAN, 2012).
O presente estudo baseou-se nos trabalhos obtidos com linhagens de D.
immitis laboratoriais e de campo dos EUA (principalmente da região do Delta do
Mississipi) e do Japão, que preconizou os SNPs nas posições 11 e 618 do gene da
Pgp e nas posições 561 e 2755 do gene da Tub, como marcadores importantes para
suspeita de populações de D. immitis com menor susceptibilidade às LMs
(BOUGUINART et al., 2011c). Foram utilizados pools de microfilárias para a triagem
das amostras que apresentavam polimorfismos nestas regiões. Esta estratégia foi
utilizada pois não seria viável realizar o sequenciamento individual de microfilárias de
tantas amostras. Na análise dos cromatogramas foi possível detectar a ocorrência de
polimorfismo em ambas as posições do gene da Tub, sugerindo variabilidade genética
na população estudada. Informações sobre a variabilidade genética de uma
população de helmintos é relevante, devido a possibilidade de desenvolver resistência
aos fármacos (HAMPSHIRE, 2005).
94
O genótipo GG-GG nas posições 11 e 618 do gene da Pgp que apareceu em

alta frequência em microfilárias com respostas subideais às LMs provenientes de cães
dos estados de Arkansas e Lousiania (EUA) (BOURGUINAT et al., 2011b) não pode
ser observado nas amostras deste estudo, levantando a questão de que seu uso como
marcadores genéticos de resistência pode ser restrito a uma região geográfica
específica. Este fato pode sugerir que a distância geográfica entre as linhagens de
parasitos do estudo e os utilizados para determinar os marcadores de resistência é
um fator a ser considerado, visto que os SNPs encontrados nas linhagens dos EUA,
não foram observados aqui.
O fato dos cães permanecerem microfilarêmicos após quatro doses
profiláticas mensais de avermectinas, associado à presença de SNPs no gene da Tub,
pode sugerir a existência de linhagens brasileiras de D. immitis com susceptibilidade
reduzida ou até mesmo resistentes, cujos marcadores ainda não foram identificados.
Isso pode ser considerado, independente da presença do genótipo GG-GG nas
posições 11 e 618 do gene da Pgp, visto que este também não foi identificado em
cepas (MP3) com menor susceptibilidade às LMs (GEARY, BOURGUINAT,
PRICHARD, 2011). É importante salientar que o genótipo GG-GG foi encontrado em
desequilíbrio de reação em microfilárias ditas resistentes e assim sugerido como um
marcador genético, mas não como a mutação causal da resistência (BOURGUINART
et al., 2015). O fato de não ter encontrado os mesmos marcadores genéticos sugere
que a seleção de indivíduos menos sensíveis às LMs tenha ocorrido de forma
independente nas duas regiões. Neste sentido, faz-se necessário a pesquisa de
outros polimorfismos que possam ser usados como marcadores genéticos para
rastrear linhagens de D. immitis resistentes em diferentes regiões, sendo improvável
a identificação de um marcador de resistência universal.
95
6 CONCLUSÃO
O estudo sobre a infecção canina por Dirofilaria immitis e susceptibilidade às

lactonas macrocíclicas permitiu concluir que:
1. As localidades com natureza conservada e de baixada litorânea com

características de restinga foi aquela com maior concentração de cães
infectados por D. immitis.
2. O distanciamento da costa Atlântica somado ao aumento na altitude em relação
ao nível do mar não impediu a presença de cães infectados por D. immitis.
3. A melhor estratégia preventiva foi com o uso de moxidectina tópica
(moxidectina + imidacloprida) mensal, com o qual 100% dos cães mantiveram-
se amicrofilarêmicos e sem antígenos de parasitos adultos de D. immitis.
4. Não foram encontrados polimorfismos pontuais nas posições 11 e 618 do gene
da glicoproteína-P em linhagens de D. immitis resistentes a quatro doses
mensais de avermectinas.
5. Polimorfismos pontuais foram detectados nas posições 561 e 2755 do gene da
ß-tubulina em linhagens de D. immitis resistentes a quatro doses mensais de
avermectinas.
96
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março de 2016.
119
8. APÊNDICES
8.1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA OBTENÇÃO DA

AMOSTRA DE SANGUE CANINO
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DOS RESPONSÁVEIS PELOS

ANIMAIS
AUTORIZAÇÃO
Eu,____________________________________________________________,
responsável pelo(s) animal(is) abaixo discriminado(s), autorizo a sua participação na
pesquisa “Dirofilaria immitis (Leidy, 1856): infecção canina, resistência às
lactonas macrocíclicas e modelo de ocorrência em paisagens distintas”. Sei que
terão amostra(s) de sangue coletadas e estou ciente dos riscos e procedimentos
necessários.
Endereço:___________________________________________________________
___________________________________________________________
Telefone:_________________
Rio de Janeiro, _____, de __________________ de _______. Hora: _______
Espécie Nome Sexo Idade Raça Pelagem

cor marcação
Sei que posso retirar meu animal do estudo a qualquer momento, independentemente
de qualquer situação.
______________________________________________________
Assinatura Responsável pelo(s) animal(is)
_______________________________________________________
Assinatura do Responsável pelo estudo

120
8.2 FICHA DE CAPTURA DOS DADOS DOS CÃES
Data _____/____/____
LOCALIDADE: .............................. FICHA N
1 – VETERINÁRIO
NOME: FLAVYA MENDES DE ALMEIDA/ JONIMAR PEREIRA PAIVA / LILIANE WILLI MONTEIRO/
MARCIA MIRANDA/ NORMA LABARTHE
2 – PROPRIETÁRIO DO ANIMAL
NOME TELEFONE
ENDEREÇO (RUA, N, BAIRRO, CIDADE, ESTADO) CEP
Latitude Longitude Altitude
3 – ANIMAL
NOME BAIRRO TEMPO DE RESIDÊNCIA
PRESENÇA DE ANIMAIS SELVAGENS DISTÂNCIA DO VETERINÁRIO (KM)
( )SIM ( )NÃO QUAIS? ( )< 1 ( )1-5 ( )5-10 ( )10-20 ( )>20
COR PREDOMINANTE
1-[ ] BRANCA 2-[ ] PRETA 3-[ ] DOURADA 4-[ ] MARROM 5-[ ] CINZA
PELAGEM TIPO DE PELAGEM

1–[ ] CURTO 2–[ ] MÉDIO 3–[ ] LONGO 1–[ ] COM SUBPÊLO 2–[ ] SEM SUBPÊLO
SEXO IDADE RAÇA TOSA TIPO DE TOSA FREQUÊNCIA DA

TOSA
MACHO / FÊMEA SIM / NÃO
FINALIDADE DO CÃO
1-[ ] GUARDA 2–[ ] COMPANHIA 3–[ ] OUTROS
PREVENTIVO FREQÜÊNCIA / QUAL? / ÚLTIMA ADMINISTRAÇÃO MICROFILÁRIA

SIM / NÃO POSITIVO / NEGATIVO
QUEIXA CLÍNICA? ( )SIM ( )NÃO QUAL?
SNAP
( )DIROFILARIA ( )EHRLICHIA ( )ANAPLASMA ( )LYME
Eu, através deste, certifico que o proprietário ou responsável pelo animal acima mencionado
autorizou a coleta de amostra sanguínea por punção da venosa para pesquisa de Dirofilaria
immitis e outras doenças transmitidas por artrópodes.
_____________________________________
Assinatura do Veterinário
121
8.3 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DA ETAPA DE

CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DAS LACTONAS MACROCÍCLICAS
CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO

Descrição do estudo - Dirofilariose canina: uso de lactonas macrocíclicas no tratamento
preventivo
Responsável: Liliane Maria Valentim Willi Monteiro (CRMV-RJ: XXXX)-(Contato ___________)
Nome(s) do(s) animal(s): (1)___________________ REG do animal: ____________
(2)___________________ REG do animal: ____________
(3)___________________ REG do animal: ____________
1. Eu, através deste, certifico que sou o responsável pelo(s) animal(s) acima
mencionado(s);
2. Sei que o(s) animal(s) será(ão) submetido(s) ao tratamento preventivo com um dos
produtos comerciais descritos abaixo, uma vez por mês, durante 8 meses
consecutivos.
Base farmacológica/nome comercial:
Moxidectina tópica (2,5 a 6,25mg/kg)/Advocate
Selamectina tópica (6 mg/kg)/Revolution
3. Para acompanhamento do tratamento serão coletadas amostras de sangue com
intervalos de 25 a 30 dias, durante cinco meses consecutivos;
4. Eu li e entendi os itens 2 e 3;
5. O responsável pelo estudo explicou-me sobre a natureza do estudo e a medicação a
ser usada e respondeu todas as minhas questões relativas ao estudo;
6. Eu forneci ao responsável pelo estudo, de sã consciência, todas as informações
referentes a medicações que foram dadas ao meu(s) animal(s) nos últimos 30 dias. Eu
não devo dar ao meu(s) animal(s) nenhuma medicação durante o curso do estudo,
exceto aquelas indicadas pelo médico veterinário;
7. Eu concordo em cooperar assegurando que o estudo seja realizado de acordo com as
instruções dadas, que não administrarei nenhum medicamento sem conhecimento do
responsável pelo estudo, a menos que seja uma emergência médica, embora eu
entenda que estou completamente livre para retirar meu(s) animai(s) do estudo a
qualquer tempo e isto não implica em futuros cuidados ao(s) meu(s) animal(s). Eu
entendo que minha assinatura neste formulário não representa uma renúncia aos
meus direitos;
8. Eu concordo em informar imediatamente ao responsável pelo estudo se meu(s)
animal(s) mostrar(em) quaisquer sinais de doença ou anormalidade ou se ocorrer
qualquer evento não usual;
9. Eu permito voluntariamente a participação do(s) meu(s) animal(s) neste estudo;
10. Eu entendo que a droga foi testada em diversos animais e pertence a uma classe de
drogas atualmente comercializada e em uso em pacientes veterinários.
11. Os animais tratados devem ser observados intermitentemente após administração. Eu
entendo que a participação neste estudo pode resultar em riscos para meu(s)
animal(s). Eu contarei ao responsável pelo estudo se quaisquer sinais anormais forem
vistos.
Responsável pelo animal (nome): _____________________________Data___/___/___
Assinatura: ________________________________________________
Responsável pelo estudo: Liliane M. V. Willi Monteiro - CRMV-RJ: XXXX – Data___/___/___
Assinatura: ________________________________________________
122
8.4 FICHA DE CAPTURA DOS DADOS DURANTE O TRATAMENTO PREVENTIVO

DA ETAPA DE CONFIRMAÇÃO DA EFICÁCIA PREVENTIVA DAS LACTONAS
MACROCÍCLICAS
FICHA DE ACOMPANHAMENTO DOS CÃES
Data:
NOME: REG:
PESO:
MEDICAMENTO UTILIZADO:
( ) ADVOCATE®
( ) REVOLUTION®
Partida:
APRES: ................................ QUANT: ................................ Nº...............................
APRES: ................................ QUANT: ................................ Nº............................... .
EXAME REALIZADO RESULTADO

( ) Knott
( ) Snap
RESPONSÁVEL:..................................................................................................................
ASSISTENTE:.....................................................................................................................
123
8.5 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DA ETAPA DA

PESQUISA DE POLIMORFISMOS PONTUAIS NOS GENES DA GLICOPROTEÍNA-
p E ß-TUBULINA
CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO

Descrição do estudo - Dirofilariose canina: uso de lactonas macrocíclicas no tratamento
microfilaricida.
Responsável: Liliane Maria Valentim Willi Monteiro (CRMV-RJ: 4680)-(Contato 21-92135795)
Nome(s) do(s) animal(s): (1)___________________ REG do animal: ____________
(2)___________________ REG do animal: ____________
(3)___________________ REG do animal: ____________
1. Eu, através deste, certifico que sou o responsável pelo(s) animal(s) acima
mencionado(s);
2. Sei que o(s) animal(s) será(ão) submetido(s) ao tratamento microfilaricida com o
produto comercial descrito abaixo, uma vez por mês, durante quatro meses
consecutivos.
Basefarmacológica/nomecomercial: ......................................................................
Para acompanhamento do tratamento serão coletadas amostras de sangue com
intervalos de 25 a 30 dias, durante cinco meses consecutivos;
3. Eu li e entendi os itens 2 e 3;
4. O responsável pelo estudo explicou-me sobre a natureza do estudo e a medicação
a ser usada e respondeu todas as minhas questões relativas ao estudo;
5. Eu forneci ao responsável pelo estudo, de sã consciência, todas as informações
referentes a medicações que foram dadas ao meu(s) animal(s) nos últimos 30 dias.
Eu não devo dar ao meu(s) animal(s) nenhuma medicação durante o curso do
estudo, exceto aquelas indicadas pelo médico veterinário;
6. Eu concordo em cooperar assegurando que o estudo seja realizado de acordo
com as instruções dadas, que não administrarei nenhum medicamento sem
conhecimento do responsável pelo estudo, a menos que seja uma emergência
médica, embora eu entenda que estou completamente livre para retirar meu(s)
animai(s) do estudo a qualquer tempo e isto não implica em futuros cuidados ao(s)
meu(s) animal(s). Eu entendo que minha assinatura neste formulário não
representa uma renúncia aos meus direitos;
7. Eu concordo em informar imediatamente ao responsável pelo estudo se meu(s)
animal(s) mostrar(em) quaisquer sinais de doença ou anormalidade ou se ocorrer
qualquer evento não usual;
8. Eu permito voluntariamente a participação do(s) meu(s) animal(s) neste estudo;
9. Eu entendo que a droga foi testada em diversos animais e pertence a uma
classe de drogas atualmente comercializada e em uso em pacientes veterinários.
10. Os animais tratados devem ser observados intermitentemente após
administração. Eu entendo que a participação neste estudo pode resultar em
riscos para meu(s) animal(s). Eu contarei ao responsável pelo estudo se quaisquer
sinais anormais forem vistos.
Responsável pelo animal (nome): _____________________________Data___/___/___
Assinatura: ________________________________________________
Responsável pelo estudo: Liliane M. V. Willi Monteiro -CRMV-RJ: 4680 – Data___/___/___
Assinatura: ________________________________________________
124
8.6 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Circulação de Dirofilaria immitis no

estado do Rio de Janeiro: revisita ao foco da região dos lagos” apresentado no 1°
Encontro Nacional de Epidemiologia Veterinária – ENEPI 2012 e publicado na Acta
Scientiae Veterinariae 40 (supl2):S65, 2012.
125
126
8.7 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Dirofilaria immitis canina em paisagens

distintas no estado do Rio de Janeiro” apresentado no XVII Congresso Brasileiro de
Parasitologia Veterinária - 2012 e publicado nos anais do congresso (PH 133).
127
128
8.8.íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Canine Leishmania spp. Ross, 1913 and

Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911 infections as models for
zoonotic and environment studies” apresentado Second International Congress on
Pathogens at the Human Animal Interface – ICOPHAI 2013.
129
“Canine Leishmania spp. Ross, 1913 and Dirofilaria immitis

(Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911 infections as models for
zoonotic and environment studies”
Norma Labarthe 1, Liliane Willi Monteiro 2, Laeta Tainá 3, Celeste Freitas de Souza 4,
Flavya Mendes-de-Almeida 5, et al.
1 Programa Institucional Biodiversidade & Saúde/ Fundação Oswaldo Cruz
2 Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal Fluminense
3 Programa de Pós-Gradução em Engenharia Cartográfica do Instituto Militar de Engenharia/ Ministério do Exército
4 Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz/ Fiocruz
5 Departamento de Patologia e Clínica Veterinária – Faculdade de Veterinária – UFF.
Dirofilaria immitis (heartworm) and Leishmania spp, are worldwide present insect transmitted
parasites, shared by various mammal species, including humans. Worldwide, 12,000,000
humans are infected by Leishmania spp. The occurrence of heartworm infected dogs is higher
at coastal tropical or subtropical areas and Leishmania infected dogs are more common at dry
tropical, anthropically modified areas. Heartworm or Leishmania infection rates in a given area
seems to be multifactorial where, mosquitoes or sandflies populations respectively (density and
diversity), besides the presence of sources of parasites and susceptible hosts are of paramount
importance to keep transmission active. Nevertheless, there are areas where those factors are
present and transmission is rare, suggesting that environmental conditions may play an
important role. Canine blood samples were collected at three points along a 60km line at the
eastern state of Rio de Janeiro, Brazil, from a sandbank section to the mountainous area. The
points were selected aiming to identify physiognomic features (distance from the coast, land
use, height, human population density and environmental conservation status) that could
interfere with the circulation of the parasites. As many as possible older than one year dogs
were sampled as long as their owners formally consented. All the homes were registered
(Garmin® GPSMAP62) and georeferenced (ArcGIS 10). Determination of D. immitis infection
was performed by detection of microfilariae or antigen (SNAP 4Dx®, IDEXX Laboratories);
detection of leishmaniasis was by immunoenzymatic assays (EIE canine leishmaniasis –
BioManguinhos/Fiocruz) associated with indirect immunofluorescence (canine leishmaniasis
IFI – BioManguinhos/Fiocruz) for the cutaneous form or with immunocromatographic assay
(TR DPP® canine visceral leishmaniasis - BioManguinhos/Fiocruz) for the visceral form. The
overall heartworm infection prevalence was 37% (123/333) and at the different landscapes: at
sea level – 68.9%, at ~50m - 0 and from 130 to 800m – 7.5%. CutaneousLeishmania spp. form
overall seroprevalence was 25% (49/195) and at the different landscapes: at sea level – 16.4%,
at ~50m – 19.2% and at the higher area – 6.4%. For the visceral form, overall seroprevalence
was 1% (2/195) and at the different landscapes: at sea level – 0.85%, at approximately 50m –
2.1% and at the higher area no seroreactive dogs were found. Results show that close to the
sandbank at the edge of a lagoon, where human population density is intermediate and
conserved areas are scarce, both parasites circulate; at the medium height area, densely
occupied and devastated by human use, heartworm is absent and the highest rate
of Leishmania seroprevalence was observed, with the visceral form present. At the highest area,
where nature is better conserved and human density is lowest, both parasites were detected in
low rates and visceral leishmaniasis evidence was absent. These results suggest that these
vector-borne parasites are rare where the environment is conserved. Furthermore, they are
abundant at altered edge areas; that heartworm prevails at coastal environment and that it is rare
or absent at a highly altered one and that Leishmania spp. pattern seems to be the reverse.
130
131
8.9 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Pesquisa de polimorfismo genético em

linhagens de Dirofilaria immitis provenientes do estado do Rio de Janeiro”
apresentado no 50° Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical –
MEDTROP 2014 e publicado nos anais do congresso (P-334).
132
133
8.10 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Aspecto da população de cães

incluídos em um estudo de frequência de Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) em
localidades com fisionomias distintas” apresentado no 2° Encontro Nacional de
Epidemiologia Veterinária – ENEPI 2015
134
Eventos LEB, II Encontro Nacional de Epidemiologia Veterinária
ASPECTOS DA POPULAÇÃO DE CÃES INCLUÍDOS EM UM ESTUDO DE

FREQUÊNCIA DE DIROFILARIA IMMITIS (Leidy, 1856) EM LOCALIDADES COM
FISIONOMIAS DISTINTAS
Liliane Maria Valentim Willi, Jonimar Pereira Paiva, Marcia Gonçalves Nobre de
Miranda, Flavya Mendes-de-Almeida, Norma Vollmer Labarthe
Resumo
Dirofilaria immitis é um nematóide que além de canídeos, infecta outras espécies de
animais domésticos, silvestres ou humanos. Mosquitos são seus vetores, o que tende
a aumentar a frequência das infecções em regiões quentes e úmidas. Sabe-se que na
região leste do estado do Rio de Janeiro a frequência da infecção varia com a
paisagem da localidade onde os animais são mantidos; em localidades costeiras, que
misturam áreas urbanizadas e conservadas, a frequência foi 68,9 %, na planície entre
a costa e a serra, em região altamente degradada pela ação antrópica não há registro,
e nas serranas, conservadas, a frequência foi 7,5%. Para estudar a composição das
populações das diferentes localidades onde a frequência da infecção foi relatada, as
fichas dos cães foram revisitadas e os dados compilados. Foram incluídas 333 fichas,
sendo 167 (50,2%) de cães das localidades costeiras, 60 (18%) da planície e 106
(31,8%) das serranas. Nas localidades costeiras a população era, majoritariamente,
composta por animais de idade avançada (>5anos) (42,5% - 71/167), por fêmeas
(56,9% - 95/167), por cães sem raça definida (SRD) (53,3% - 89/167) e mantidos
principalmente no exterior das casas (EC) (73,6% - 123/167). Na planície, a população
era, majoritariamente, composta por animais jovens, (1 a 2 anos) (50% - 30/60), por
fêmeas (51,7% - 31/60), por SRD (75% - 45/60) e mantidos principalmente no EC
(83,3% - 50/60). Nas localidades serranas a composição etária predominante foi entre
um e cinco anos de idade (73,8% - 76/106), sendo 59,4% machos (63/106), 57,5%
SRD (61/106) e 84,9% (90/106) mantidos principalmente no EC. Quando se compara
as classes dos animais segundo a infecção por D. immitis, observa-se que nas
localidades costeiras a maior frequência foi observada nos adultos jovens (2 a 5 anos),
(40/52 – 76,9%), machos (56/72 – 77,8%), SRD (68/89 – 76,4%) e mantidos
principalmente no EC (92/123 – 74,8%). Nas serranas a maior frequência foi
observada naqueles de idade avançada (3/30 – 10%), machos (6/63 – 9,5%), SRD
(5/61 – 8,2%), e mantidos principalmente no EC (8/90 – 8,9%). Considerando que em
todas as localidades a maioria dos cães era SRD e exposta aos mosquitos por
permanecerem no EC, é interessante observar que onde a infecção foi frequente,
mesmo com maioria de cães apresentando idade avançada, a infecção foi detectada
majoritariamente nos adultos jovens, enquanto onde a infecção foi infrequente a
situação inverteu-se, sugerindo que a taxa da infecção pelas classes variará com o
desafio local.
Palavras-chave: Aspectos populacionais; Dirofilaria immitis; cães
135
8.11 íNTEGRA DO RESUMO INTITULADO “Search for genetic polymorphism in

canine Dirofilaria immitis” apresentado no 25th International Conference of the World
Association for the Advancement of Veterinary Parasitology – WAAVP 2015
136
137
8.12 íNTEGRA DO TRABALHO INTITULADO “Chemoprophylaxis of Dirofilaria immitis

(Leidy 1856) infection at a high challenge environment” publicado na revista Parasites
& Vectors (2015) 8:523.
Labarthe et al. Parasites & Vectors (2015) 8:523
DOI 10.1186/s13071-015-1141-6
RESEARCH Open Access
Chemoprophylaxis of Dirofilaria immitis

(Leidy 1856) infection at a high challenge
environment
Norma Vollmer Labarthe1,2 , Liliane Maria Valentim Willi3*, Jonimar Pereira Paiva4,
Marcia Gonçalves Nobre de Miranda5, Karen Zoreck6 and Flavya Mendes de Almeida1
Abstract
Background: The frequency of canine heartworm infection in the state of Rio de Janeiro, Brazil was high before
chemoprophylactic treatment was available, with one of the highest rates of infection (52.5 %) found among dogs
living on the eastern shore of the state. Following the launch of a chemoprophylactic product, the rate of infection
gradually decreased, and new infections were rarely reported. After 2005, outbreaks reported at the eastern shore
as well as for new infections in other areas of high infection frequency were considered to possibly be related to
reduced efficacy of macrocyclic lactones. Therefore, this study aimed to evaluate the efficacy of topical heartworm
preventatives from different drug families at the high challenge area of the state of Rio de Janeiro.
Methods: A total of 46 dogs, including animals negative for Dirofilaria immitis microfilariae and antigen (Snap 4 Dx,
IDEXX Laboratories, USA) at the initial screening were randomly allocated to two monthly treatment groups. Dogs
in one group received topical moxidectin + imidacloprid and dogs in the other group received topical selamectin
for eight consecutive months. Blood samples were obtained for microfilariae and antigen detection until the
eleventh month after the first treatment. Dogs becoming microfilaremic or antigenemic on or before day 180 were
considered to be infected prior to the first dose and were excluded from the study.
Results: A total of 29 dogs completed the study, including 14 treated with moxidectin + imidacloprid and 15
treated with selamectin. No dogs treated with moxidectin + imidacloprid (0/14) became infected during the
treatment period, whereas four dogs of the selamectin group (4/15) became infected.
Conclusion: Topical moxidectin + imidacloprid is 100 % effective in preventing D. immitis infections in dogs living
in a high challenge natural environment.
Keywords: Canine heartworm, Macrocyclic lactones, Preventive medication
Background Before the year of 1992, when the first chemoprophy-

Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) Raillet & Henry, 1911 lactic treatment was launched in Brazil, reported canine
is a mosquito-borne parasite species present worldwide heartworm infection frequency at the state of Rio de
and is frequently found infecting Brazilian dogs [1]. As Janeiro ranged from 14 % to 17 % [4, 5]. During those
in other areas of the world, its transmission depends on years (1988–1990), at the eastern shore of the state, the
the presence of microfilaremic dogs, competent mos- frequency was as high as 52.5 % [5]. During the follow-
quito vectors, and susceptible dogs [2, 3]. ing years (2000–2001), after the first chemoprophylactic
product was launched, a downward trend in heartworm
infection occurred in Brazil [6, 7], and new infections
* Correspondence: liliwillimonteiro@hotmail.com
were rarely reported.
3
Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, In 2005, following the availability of chemopro-
Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Rua phylactic heartworm treatments, the first heartworm
Vital Brazil 64, Santa Rosa, CEP 24230-340 Niterói, RJ, Brazil
Full list of author information is available at the end of the article
outbreak in the state was identified in the area of the
© 2015 Labarthe et al. Open Access This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0
International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use, distribution, and
reproduction in any medium, provided you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to
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(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article, unless otherwise stated.
Labarthe et al. Parasites & Vectors (2015) 8:523 Page 2 of 4
eastern shore, with 53 % of the dogs found to be in- (±5 days), and blood samples were obtained on days −2,
fected [8]. Following the first outbreak, many other 30, 90, 150, 180, 210, 240, 270, and 300 (±5 days) for
infections were reported, and lack of efficacy of microfilariae detection. On days −2, 90, 150, 180, and 300,
macrocyclic lactones in preventing infections was sus- plasma samples were tested for detection of antigens by
pected in high infection frequency areas of the state the same ELISA test used for the initial screening. Plasma
[9]. An update of the 2005 outbreak area six years from all microfilaremic samples obtained on days 30, 210,
later showed that infection frequency was even higher 240, or 270 was also tested for antigens (Fig. 1).
(80 %) [10, 11], which, along with local veterinarians Dogs becoming microfilaremic or antigenemic on day
reports that dogs on chemoprophylaxis were becom- 180 or before were considered to be infected prior to the
ing infected (personal communication), suggests the first chemoprophylactic dose. Those dogs and any other
presence of less susceptible populations of D. immitis inadvertently treated with macrocyclic lactones by the
at the site. Therefore, the aim of this study was to owners were excluded from the study.
evaluate the efficacy of topical heartworm preventa- Detection of infected dogs during the study were eval-
tives from different drug families at the high chal- uated for significance of differences between the treat-
lenge area of the state of Rio de Janeiro. ment groups by chi square or Fisher’s exact tests.
Methods Results
In order to identify as many as possible D. immitis The initial screening of 80 dogs detected 31 positive
microfilariae and antigen negative dogs living at the for microfilariae and/or D. immitis antigen (38.8 %).
high challenge area, all dog owners were invited to Among the 46 dogs included, 14 of the moxidectin +
participate of the study. According to the approval of imidacloprid group and 15 of the selamectin group
the ethical committee of the Universidade Federal completed the study. On day 180, one of the selamec-
Fluminense (233) and after obtaining owner consent, tin dogs became microfilaremic and became antigen
blood samples were obtained from 80 chemoprophy- positive later. Therefore, this dog was considered to
laxis naïve dogs (32 under 12 months old; 19 from 1 have been previously infected before the study was
to 2 years old and 29 over 2 years) for detection of initiated. The number of dogs in the selamectin group
microfilariae using Knott´s modified test (Newton & that became infected during the treatment period (4/15)
Wright, 1956) and ELISA test (Snap 4 Dx IDEXX was higher than the moxidectin + imidacloprid treated
Laboratories, USA). group (0/14) (χ2 = 2.38; p = 0.057) (Table 1). Among the
After screening, 46 out of the 49 dogs with negative four selamectin-treated dogs that became infected during
test results on both tests (26/46, 56.5 % less than 1 year the study, three tested positive for microfilariae and anti-
of age) were included in the study and randomly sorted gen and one was antigen-positive but was amicrofilaremic.
in two groups; dogs in one group received topical moxi- Therefore the efficacy of the selamectin treatment was
dectin + imidacloprid at 2.5 to 6.25 mg moxidectin/kg/ 73.3 % and the efficacy of the moxidectin + imidacloprid
month (23 dogs); dogs in the second group received treatment was 100 %.
topical selamectin at 6 to 12 mg/kg/month (23 dogs).
Every monthly treatment was administered by the Discussion
veterinarians participating in the study after weighing Because dogs had to be free of detectable microfilariae
the dogs and adjusting the dose if necessary. Dogs were and antigens to be included in the study and the chal-
treated on days 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 and 210 lenge at the study site was known as very high, young
Fig. 1 Timeline of canine treatments and blood sampling.

Table 1 Number and percentage of dogs receiving monthly treatment with topical moxidectin + imidacloprid or selamectin
treatment positive for microfilariae or antigen of Dirofilaria immitis at different study intervals from day 30 (after first treatment) up to
day 300 after the first treatment
Day 30 to 150a Day 180b Day 270 to 300
Monthly treatment No. pos./total No. pos./total No. pos./total
Moxidectin + imidacloprid 3/23 (13.0 %) 0/18 (0 %) 0/14a (0 %)
Selamectin 6/23 (26.1 %) 1/20 (5.0 %) 4/15b (26.7 %)
a
Considered to be infected before the first treatment
b
Possibly infected before the first treatment
Different superscript letters in columns are significantly different (x2 = 2.38; p = 0.057)
dogs were privileged. Even so, the percent of positive test living in extreme challenge situations, such as those
results was high (38.75 %), confirming previous results found in the coastal lowland of the eastern state of Rio
[11] and demonstrating how intense the challenge was. de Janeiro, Brazil [8, 9, 11, 18], the Mississippi delta in
Therefore, the severe life threatening cardiopulmonary the United States [12], and others.
condition the infection determines, the risk treatment
imposes to the dogs and the zoonotic potential of the in- Conclusions
fection highlights the definite need for chemoprophy- Topical moxidectin + imidacloprid was 100 % effect-
laxis in order to control transmission. Minimizing the ive for D. immitis prevention in dogs living in a high
number of infected dogs acting as reservoirs of the para- challenge natural environment therefore at those
site is pivotal to reduce the chance of infective blood environments should be the chemoprophylaxis of
meals for mosquitoes and to reduce the occurrence of choice. These results suggest that experimental stud-
D. immitis in vectors, dogs and humans. Besides the dir- ies should be conducted to elucidate the stunting
ect impact upon D. immitis transmission, the use of top- effect of different macrocyclic lactones consistent
ical moxidectin/imidacloprid or topical selamectin treatment.
provides reliable control against other major endo and
ectoparasites. Competing interests
Norma Labarthe is a consultant for Bayer Animal Health, Idexx Laboratories,
The main reasons for macrocyclic lactones treatment and Zoetis in Brazil.
failures which may impair analysis of lack of efficacy or Flavya-Mendes-de-Almeida is a consultant for Bayer Animal Health and Idexx
resistance are known to be underdosing and owners’ Laboratories.
Jonimar Paiva is a consultant for Zoetis in Brazil.
noncompliance [12–15], which were carefully con- Karen Zoreck is a current employee of Bayer Animal Health in Brazil.
trolled in the present study. Therefore, the results ob- Liliane Willi and Marcia Nobre de Miranda have no competing interests.
tained ruled out major indirect reasons for lack of
Authors' contributions
efficacy at a high natural challenge area were the occur- NVL conceived of the study and participated in coordination of
rence of resistant populations or lack of efficacy can´t the study, the acquisition of data, interpretation of results, and
be disregarded. helped to draft the manuscript. FMA participated in the study
coordination, acquisition of data, laboratory analysis and helped to
Topical moxidectin + imidacloprid was more effica- draft the manuscript. LMVW participated in the acquisition of data,
cious (100 %) than topical selamectin (73.3 %) in pre- interpretation of results, and helped to draft the manuscript. JPP
venting D. immitis infection, as it had been shown participated in the acquisition of data and performed the statistical
analysis. MGNM participated in the acquisition of data and laboratory
before when the resistant strains MP3 or JYD-34 were analysis. KZ participated in the study design. All authors read and
used as models for evaluation of efficacy [13, 16, 17]. approved the final manuscript.
Furthermore, it should be considered that since macro-
Acknowledgements
cyclic lactones may stunt D. immitis development for The authors acknowledge Carolina Haje, Daniel Marques, Daniel Paiva,
nine months when administered accordingly to recom- Thiago Gomes, Marcela Machado, Monique Paiva for assistance in the
mendations (John Wilson McCall - personal communi- acquisition of data. The authors thank Kathleen Newcomb, Nathalie, VA, USA
for editorial assistance in the preparation of this manuscript.
cation), it is possible to assume that infection of the
selamectin dogs occurred prior to the first treatment Funding
dose and that selamectin treatment was ineffective in Funding for this study and the publication of the results was provided by
eliminating the infection although stunted worm Bayer Animal Health.
development. Author details
Therefore, it is possible to infer that topical moxidec- 1
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Faculdade de
tin + imidacloprid, when consistently administered to Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Rua Vital Brazil 64, Santa Rosa,
CEP 24230-340 Niterói, RJ, Brazil. 2Programa Institucional Biodiversidade e
dogs on a monthly schedule, is highly effective in pre- Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4036, Manguinhos, CEP 21040-361
venting heartworm patent infections in treated dogs Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 3Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em
Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade 17. Blagburn BL, Carmichael J, Kaminsky R, Schenker R, Kaplan R, Moorhead A,
Federal Fluminense, Rua Vital Brazil 64, Santa Rosa, CEP 24230-340 Niterói, RJ, et al. Resistance and heartworm preventives: historical perspectives and
Brazil. 4Departamento de Medicina e Cirurgia Veterinária, Instituto de overview of research (abstract). American Heartworm Society; 2013:21
Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, BR-465, Km 7, CEP 18. Bendas, AJR, Paiva JP, Branco AS, Belmonte DR, Mendes-de-Almeida, F,
23890-000 Seropédica, RJ, Brazil. 5Médica Veterinária Vet Ypiranga, Rua Guerrero J, et al. Back to Rio! The return of heartworm infections in dogs
Ypiranga 107, Laranjeiras, CEP 22231-120 Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 6Bayer S.A., (abstract). 13th Triennial State of the Heartworm Symposium, Memphis. 2010.
Bayer Technology Services, Av. das Américas, 500, Downtown Bloco 11, Loja
108, 26640-100 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
Received: 13 May 2015 Accepted: 3 October 2015
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• Research which is freely available for redistribution
Submit your manuscript at

www.biomedcentral.com/submit
142
8.13 íNTEGRA DO MANUSCRITO INTITULADO “Serological evidence of canine

exposure to arthropod-borne pathogens at different landscapes” submetido para
revista Veterinary Parasitology: regional studies and reports.
143
Serological evidence of canine exposure to arthropod-borne pathogens at different
landscapes
Liliane Maria Valentim Willi a,*, Flavya Mendes-de-Almeidaa, Celeste da Silva Freitas de
Souzab, Tainá Laetac, Jonimar Pereira Paivad, Marcia Gonçalves Nobre de Mirandae, Fabiana
Batalha Knackfussf, Norma Labarthe a,g
a
Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Veterinária, Rua Vital Brazil Filho 64,
24230340, Niterói, RJ, Brazil.
b
Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocuz, Av. Brasil
4365, 21040360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
c
Programa de Pós-Graduação em Geografia, Departamento de Geografia, Instituto de
Geociências, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941972, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
d
Departamento de Medicina e Cirurgia Veterinária, Instituto de Veterinária, Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, 23890000, Seropédica, RJ, Brazil.
e
Médica Veterinária, Vet Ypiranga, 22231120 , Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
f
Escola de Ciências da Saúde, Universidade do Grande Rio, 25071202, Duque de Caxias, RJ,
Brazil.
g
Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, 21040360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
*Contact for correspondence:

Liliane Maria Valentim Willi
Rua Vital Brazil Filho, 64
Niterói, RJ, 24230340, Brazil
E-mail: liliwillimonteiro@hotmail.com
Tel: 55-21-26299527
144
Abstract
Arthropod-borne infections are dependent on environmental conditions, and several
combinations of natural and human-related variables play an important role in vector
populations as well as the life cycle of agents carried by the arthropods. The top five canine
arthropod-transmitted agents, Dirofilaria immitis, Leishmania spp., Ehrlichia canis,
Anaplasma phagocytophilum, and Borrelia burgdorferi infect unprotected animals without
propensity. The purpose of the study was to determine the prevalence of these parasite species
in three different landscape settings (sandbank, plains and mountains) along a 60-km line.
During a 6 months period blood samples were collected from dogs (>12 months old) living in
the different settings. Prevalence of D. immitis was determine by modified Knott test and,
ELISA. Prevalence of E. canis, A. phagocytophilum, and B. burgdorferi was determined by
ELISA, and Leishmania spp. by ELISA, indirect immunofluorescence, and
immunocromatographic assays. D. immitis was most prevalent in the sandbank (68.9%) as
well as Leishmania spp. (34.5%), and tick-transmitted agents in the plains (61.7%). B.
burgdorferi was not detected. Depending on the resources for arthropods present in regions,
dogs are likely to be exposed to different arthropod-borne parasites and should receive
preventives tailored to the risk of infection in the region in which the dog resides.
Keywords: Anaplasma; Ehrlichia; Heartworm; Leishmania; canine parasites
1. Introduction
145
Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Borrelia burgdorferi and
Leishmania spp., are important arthropod-transmitted pathogens of medical and veterinary
concern (Labarthe et al., 2003; Dantas-Torres, 2008; Bowman et al., 2009; Villeneuve et al.,
2011; Cardoso et al., 2012). It is known that D. immitis is one of the most important
nematodes in veterinary medicine due to the high numbers of infected domestic and wild
animals (Labarthe, Alves, Serrão, 2002; AHS, 2014). This parasite is vectored by several
culicid species that may present hemi-synanthropic (e.g., Ochlerotatus scapularis and Aedes
taeniorhynchus) or synanthropic (e.g. Culex quinquefasciatus) behavior (Labarthe et al.,
1998).
Accordingly, tick-borne pathogens such as E. canis, A. phagocytophilum, and B. burgdorferi
are the cause of important diseases for humans and domestic or wild animals (Little et al.,
2014; Sykes, 2014). Rhipicephalus sanguineus, known as the brown dog tick, is their
principal vector species in Brazil (Labruna and Pereira, 2001).
Similarly, Leishmania spp. has been included in the list of the top five parasites that affect an
incalculable number of domestic, synanthropic, or wild animals, and is considered one of the
most prevalent neglected human infections. It is believed that about from 200.000 to 400.000
new cases of human visceral leishmaniasis occur annually, with >90% of these cases
occurring in six developing countries, including Brazil (WHO, 2015). On the other hand,
from 0.7 to 1.3 million of new cases cutaneous leishmaniasis is reported annually, with
approximately 95% of cases occurring in the Americas, the Mediterranean basin, the Middle
East, and Central Asia. In fact, in Brazil, both cutaneous (caused by Leishmania braziliensis)
and visceral form are endemic (Aguilar, 1987), and outbreaks are usually related to disorderly
land occupation (Kawa and Sabroza, 2002; Aguiar et al., 2014).
The occurrence of infected dogs with D. immitis or tick-borne parasites is high in tropical and
subtropical areas, and in general, vectors are prevalent throughout the year in those areas
146
(Labarthe et al., 1997; Labarthe, Alves, Serrão, 2002; Genchi et al., 2009; Willi et al., 2012;
Little et al., 2014). Interestingly, in Brazil D. immitis infections are known to be frequent in
coastal areas where nature is better conserved, providing better conditions for development of
culicid vectors (Labarthe et al., 2014). Conversely, Leishmania spp. infected dogs are more
commonly found in dry tropical areas anthropically modified. Similarly, to the other vector-
borne pathogens, the distribution of Leishmania spp. depends on vector populations, and
therefore the expansion of phlebotomies sand flies habitats is directly related to the
distribution of leishmaniasis (Killick-Kendrick, 1999; Maia-Elkhoury et al., 2008).
Undoubtedly, the environment plays an important role in the occurrence of vector-borne
pathogens, since it is strictly related to the development of their vectors. Therefore, the
present study assessed the prevalence of D. immitis, E. canis, A. phagocytophilum, B.
burgdorferi and Leishmania spp. in dogs living in different landscape settings in a Brazilian
tropical area.
2. Materials and methods
2.1. Ethical aspect and study area
This study was approved by the Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA of the
Fundação Oswaldo Cruz (protocol number: LW-33/11). This study was conducted from
August 2011 to January 2012 in three different landscape areas of the state of Rio de Janeiro
(22° 54’ S 43° 10’ W), Brazil. .
The landscapes were located along a 60-km line from a sandbank section to the mountain
region in the eastern area of the state of Rio de Janeiro.
In the sandbank area (sea level) (Site 1), one locale was between the lagoon and the seashore
and the other at the opposite margin of the lagoon. In the plains (50 m above sea level) (Site
2), the area studied was between the sandbank and the mountain regions. Finally, in the
147
mountain landscape, two locales were included one at 140 m and the other at 840 m above sea
level (Site 3) (Figure 1). The main features considered for all three landscapes were distance
from the coast, land use, altitude, human population density, and environmental conservation
status. The landscape margins and surface features were determined by visual analysis using
Google Earth.
The American global navigation satellite system (GNSS) was used, denominated GPS (global
position system). Thus, from the GARMIN GPSMAP 62 receiver, the locations where dogs
were sampled were acquired and subsequently processed in ArcGIS 10 software.
In the sandbank area, human population density was intermediate and conserved areas were
scarce. The locale between the lagoon and the seashore consists basically of homes that are
devoid of public water supply, sewage treatment, and paved streets, although public power
had recently been installed. The houses had an unfinished aspect, with filthy yards and no
trees. At the opposite margin of the sandbank region, houses were brick and well-finished.
Roads were partially paved, and public power, water supplies, and public sewage treatment
were the norm.
In the plains, the human occupation was dense, leading to intense destruction of natural
resources in the region. The population in the area was expanding as people were abandoning
urban settings and moving to these more rural areas. Streets were generally unpaved and
houses were unfinished; however, public power and water supplies were available, but there
was no public sewage treatment.
In the mountain landscape, the balance of nature was conserved, and human density was the
lowest of the three regions. The 140-m point was set in a small village surrounded by Atlantic
forest and some rural properties, where only the principal streets were paved, public power
and water supplies were present, but sewage treatment was not. The 840-m point was a rural
148
village with unpaved streets, water supply from local sources, and poor public power supply,
situated in Atlantic forest.
2.2. Animals and blood sampling
Dogs (n = 333) with at least 1 year of age were used in this study. To be included in the
research, animals had to have lived within the study area for at least 6 months.
Whole blood samples were collected from each dog through the puncture of the cephalic vein
and stored in sterile plastic tubes containing anticoagulant (EDTA). Afterwards, each sample
was divided in an aliquot of whole blood and from the other was obtained the plasma.
All owners filled out an Informed Consent Form, demonstrating the interest in to have their
dog included in the study.
2.3. Laboratorial procedures
Whole blood samples were used to detect the presence of microfilariae by using a modified
Knott test (Newton and Wright, 1956). In addition, plasma samples were tested for the
presence of D. immitis, E. canis, A. phagocytophilum, and B. burgdorferi antigen using a
commercial ELISA test (SNAP 4Dx®, IDEXX Laboratories, Maine, USA) following the
manufacturer’s instructions.
On the other hand, the detection of Leishmania spp. infection was performed by the ELISA
(EIE Leishmaniose Canina – BioManguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil) and
immunofluorescence antibody test (IFAT) (Leishmaniose Canina - BioManguinhos/Fiocruz,
Rio de Janeiro, Brazil). In addition, an immunocromatographic assay (TR DPP® canine
visceral leishmaniasis - BioManguinhos/ Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil) was performed.
2.4. Data analysis

149
Data were entered into EPI INFO 2000 data forms generated for this study, and data entry was
verified for accuracy by two researchers. Nonparametric analysis was performed by chi
square or Fisher’s exact tests.
3. Results
After owners´ consent dogs were tested for D. immitis infection and tick-borne parasite
seroprevalence; however, only 56.7% (189/333) could be tested for seroprevalence to
Leishmania spp.
The overall prevalence of the pathogens herein studied was 37% (123/333) for D. immitis
infection; 46.8% (156/333) for tick-borne parasite seroprevalence and 27% (51/189) for
Leishmania spp. seroprevalence. It is important to note that B. burgdorferi was not detected in
the dogs tested (Table1).
In the sandbank area, the most prevalent parasite was D. immitis (68.9% - 115/167) when
compared with tick-borne parasites (43.7% - 73/167; x2 = 21.465; df=1; P < 0.0001) or
Leishmania spp. (34.5% - 39/113; x2 = 32.128; df=1; P < 0.0001). There was no difference in
the seroprevalence between tick-borne pathogens and Leishmania spp. ( x2 = 2.376; df=1; P =
0.1564) (Table1).
In the plains, tick-borne pathogens had a significantly higher prevalence (61.7% - 37/60)
compared with D. immitis infection (0/60; x2 = 53.494; df=1; P < 0.0001) or Leishmania spp.
(22.2% - 10/45; x2 = 16.181; df=1; P = 0.0001). In this landscape a significant difference
between D. immitis infection and Leishmania spp. seroprevalence was observed ( x2 = 14.737;
df=1; P = 0.0005) (Table1).
In the mountain area, the seroprevalence of tick-borne pathogens was highest (43.4% -
46/106) compared with the prevalence of D. immitis infection (7.5% - 8/106; x2 = 35.880;
df=1; P < 0.0001) or Leishmania spp. (6.4% - 2/331; x2 = 14.383; df=1; P = 0.0003).
150
However, it is important to highlight that difference between D. immitis infection and
seroprevalence of Leishmania spp. was not detected ( x2 = 14.383; df=1; P = 0.8523) (Table1).
Out of 123 dogs positive for D. immitis infection, 93.5% (115/123) were diagnosed at the
sandbank. Likewise, of all 51 dogs diagnosed with Leishmania spp., 76.5% (39/51) were from
the sandbank region (Table1). Of the 115 dogs positive for D. immitis in the sandbank area,
39 also were co-infected with E. canis and 15 with E. canis and A. phagocytophilum. Finally,
in the mountain region, four of the eight dogs infected with D. immitis were co-infected with
E. canis and A. phagocytophilum.
4. Discussion
Considering that landscape characteristics are of paramount importance for arthropod
populations and that different arthropod communities can be highly affected by slight
environmental changes, it is interesting to note that according to the detection of mosquito-
borne infections and antibodies of tick-borne pathogens, ticks and mosquitoes seemed to
share the same habitats. These results suggest that within a landscape there are different
habitats, which provide environmental conditions to development of vector. Mosquitoes are
water-borne and need warm temperatures and humidity, while Lutzomyia spp. needs organic
matter substratum in places with shade and cool temperatures. Conversely, results of the
present study indicate that tick vectors were most frequently found in the dry, warm and
heavily populated suburban areas with substandard housing and squalor. Our findings suggest
that the vector species in the plains was R. sanguineus (Labarthe et al., 1998; Killick-
Kendrick, 1999; Labruna and Pereira, 2001).
Dirofilaria immitis infection was higher in the coastal environment, as it has been previously
observed in other Brazilian regions (Labarthe et al., 2014). The coastal environment provides
richness of salinity that favors populations of the competent vector Aedes taeniorhynchus
151
(Labarthe et al., 1998). However, results from the plains may be somewhat unexpected since
the prevalence of D. immitis infections declined as the study moved on to evaluate dogs away
from the coast. The squalor and the degradation of natural resources of the plains could be the
main reason for decline in the establishment of hemi-synanthropic mosquito populations,
resulting in the absence of infection in the landscape. However, the well-conserved Atlantic
forest resources of the mountains provided sufficient mosquito vectors to transmit D. immitis
to the dogs, although at low rates, as has been observed previously (Labarthe et al., 2014).
The source of infection to the mosquitoes and from the mosquitoes to the canine population of
the mountains is unknown. However, microfilaremic dogs travelling with their owners or
sylvatic microfilaremic Mustelidae or Canidae cannot be disregarded as a source of infective
microfilariae (Bowman et al., 2009; Brown et al., 2012).
Anaplasma phagocytophilum is rarely reported in dogs in Brazil. This infection is vectored by
Ixodes spp. ticks, which are also rarely found on dogs in Brazil. Anti-A. phagocytophilum
antibodies were frequently detected in association with anti-E. canis antibodies in this study,
suggesting that both parasites are transmitted by the same tick species. However, it is also
possible that cross-reaction among Ehrlichia spp. and Anaplasma spp. occurred. This cross-
reactivity is commonly recognized, leading to nonspecific IFA titers (Shaw et al., 2001). The
only landscape where dogs harbored anti-A. phagocytophilum antibodies and no anti-E. canis
antibodies was in the mountains, where Amblyomma cajennense, the wood tick, occurs
frequently and has been suggested as vector for the bacteria. Therefore, it is possible that dogs
that were allowed to roam free by the owners invade the natural environment and become
infected (Labruna and Pereira, 2001; Onofrio et al., 2009; Santos et al., 2011).
The highest seroprevalence of E. canis was observed in the plains where substandard houses
probably provide niches for its principal vector, R. sanguineus. Although the rubbish found in
the plains areas certainly contributed to enhance Anaplasmataceae transmission, the well-
152
conserved environment of the mountains or the sandbank also provided sufficient resources
for R. sanguineus populations (Aguiar et al., 2007), and the seroprevalence of E. canis was
relatively high in both of those regions.
Detection of anti-Leishmania antibodies in canine blood samples was not surprising, and the
integumentary form is endemic in Rio de Janeiro, especially where substandard land
occupation has occurred (Kawa and Sabroza, 2002; Aguiar et al., 2014). The detection of low
antibody levels to Leishmania in the canine blood samples (ELISA and IFA tests) were
mainly from the two less-conserved studied areas (sandbank and plains), suggesting that L.
braziliensis is a frequent parasite at those sites, and further confirming previous reports of
how land occupation influences Leishmania spp. prevalence and distribution. Furthermore,
the presence of two dogs infected with L. infantum (positive by ELISA, IFA and TR DPP®
tests) in the crude occupied lowland areas provided evidence of the presence of the vector
Lutzomyia longipalpis (Brazil et al., 1989; 2012). The confirmed autochthonous infection
nearby (Paula et al., 2009) provides additional evidence of the ongoing risk for infection with
this life-threatening zoonotic parasite.
The present study provides evidence that the lack of basic sanitation of homes and the
neglected conditions in the nearby natural environment play an important role in the provision
of resources for arthropod-borne canine infections. Furthermore, dogs in the eastern state of
Rio de Janeiro were shown to be at risk of becoming infected by preventable life-threatening
parasites with zoonotic potential. These data also provide evidence that enable veterinarians to
advise their clients to use appropriate and effective preventive parasite control treatments for
their pets, especially when they travel to high-risk areas and to routinely screen their patients
for parasites. Further studies must be conducted to better understand the relationship among
the environment, vectors, parasites and hosts.
Acknowledgements
153
The authors acknowledge Marcia Chame for the contribution to study design and Carolina
Haje, Daniel Marques, Daniel Paiva, Daniel Ribeiro, Marcela Machado, Monique Paiva and
Thiago Gomes for assistance in the acquisition of data. The authors thank Kathleen
Newcomb, Nathalie, VA, USA for editorial assistance in the preparation of this manuscript.
The authors are grateful to the owners and the dogs of the study. The authors also
acknowledge Bayer S.A. and Linavet for providing part of the kits.
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Figure 1 Map showing where the different landscapes were studied of the eastern state of Rio
de Janeiro, Brazil
159
Table 1 Detection of heartworm*, tick-borne** and Leishmania*** spp seroprevalence in
dogs from different landscapes in Brazil
No. Positive/Total (%)

Parasite Sandbank Plains Mountain Overall
Mosquito-borne
115/167
Dirofilaria immitis 0/60b† 8/106 (7.5)b† 123/333 (37.0)
(68.9)a†
Tick-borne
Ehrlichia canis 51/167(30.5) 25/60(41.7) 30/106(28.3) 106/333(31.8)
E. canis + Anaplasma
22/167 (41.7) 12/60 (20.0) 14/106 (13.2) 48/333 (14.4)
phagocytophilum
A. phagocytophilum 0/167 0/60 2/106 (1.9) 2/333 (0.6)

73/167 46/106 156/333 (46.8)
Combined 37/60 (61.7)b††
(43.7)a†† (43.4)a††
Sandfly-borne
Leishmania
38/113 (33.6) 9/45 (20.0) 2/31 (6.4) 49/189 (25.9)
braziliensis
Leishmania infantum 1/113 (0.9) 1/45 (2.2) 0/31 2/189 (1.1)

39/113 10/45
Combined 2/31 (6.4)b† 51/189 (27.0)
(34.5)a†† (22.2)a,b†††
*Tested by modified Knott test and ELISA commercial test (SNAP 4Dx®, IDEXX Laboratories,
Maine, USA); **Tested by ELISA commercial test (SNAP 4Dx®; ***Tested by ELISA (EIE
Leishmaniose Canina – BioManguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil), indirect
immunofluorescence – IFA (Leishmaniose Canina-BioManguinhos/Fiocruz) and
immunocromatographic assay (TR DPP® canine visceral leishmaniasis - BioManguinhos/ Fiocruz).
Different letters within rows indicate significant difference (P<0.05). Different symbols within
columns indicate significant difference (P<0.05).

160
8.14 íNTEGRA DO MANUSCRITO INTITULADO “Genetic polymorphism in Dirofilaria

immitis: what’s happening in another country” submetido para revista Parasites &
Vectors.
“Genetic polymorphism in Dirofilaria immitis: what’s happening in another
country?”
Liliane Maria Valentim Willi, MV, MSca,c

Email: liliwillimonteiro@hotmail.com
Norma Vollmer Labarthe, MV, DSca,b

Email: labarthe@fiocruz.br
Luiz Ney d’Escoffier, Biologistc

Email: lescof@ioc.fiocruz.br
Jonimar Pereira Paiva, MV, DScd

Email: jonimarpaiva@uol.com.br
Marcia Gonçalves Nobre de Miranda, MV, MSce

Email: mgnmiranda@yahoo.com.br
Flavya Mendes-de-Almeida, MV, DSca

Email: fma@centroin.com.br
Tânia Zaverucha do Valle, Biologist, PhDc,*

Email: taniazv@ioc.fiocruz.br
a
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução Animal,
Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Rua Vital Brazil Filho 64,
24230-340, Niterói, RJ, Brazil.
b
Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, 21040-360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
c
Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Av.
Brasil 4365, 21040-360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
d
Departamento de Medicina e Cirurgia Veterinária, Instituto de Veterinária,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, BR-465, Km 7, 23890-000, Seropédica,
RJ, Brazil.
e
Médica Veterinária, Vet Ypiranga, Rua Ypiranga 107, Laranjeiras, 22231-120 , Rio de
Janeiro, RJ, Brazil.
*Contact for correspondence:

Tânia Zaverucha do Valle
Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Av.
Brasil 4365, 21040-360, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. taniazv@ioc.fiocruz.br
+55 21 2652-1857
1
Abstract
Background: The filarial nematode, Dirofilaria immitis, the causative agent of canine
heartworm infection, is worldwide the most important filarid to affect domestic dogs.
Prevention of this infection is done by macrocyclic lactones (ML), but some reports on
the lack of efficacy have been published in the last 10 years. Although the actual cause
of resistance is unknown, single nucleotide polymorphisms (SNPs) on a P-glycoprotein
(Pgp) ABC transporter and β-tubulin (Tub) gene have been pointed out as candidates for
genetic markers of resistance. Therefore, we conducted a survey to verify the presence
of these suggested genetic markers in D. immitis microfilariae from naturally infected
dogs under ML treatment living in an endemic area in the state of Rio de Janeiro.
Results: Genomic DNA was extracted from pools of microfilariae from 30 dogs
submitted to 4 months of therapy with avermectins. A fragment of Pgp and two
fragments of Tub gene from microfilariae were amplified and sequenced. The analysis
of the chromatograms of Pgp loci demonstrated no sign of polymorphism, while 72%
and 48% of the samples were polymorphic to the first and second SNPs on Tub loci,
respectively.
Conclusion: This work demonstrates that the Pgp position 11 and 618 were not
polymorphic and, therefore, not suitable as a genetic marker of resistance in the state of
Rio de Janeiro. On the other hand, Tub positions 561 and 2755 were found to be
polymorphic. This work raises the question whether resistance to ML has developed
independently in different regions of the world and points out the difficulty of finding a
universal genetic marker for resistance.
Keywords: Dirofilaria immitis, macrocyclic lactones, resistance, genetic markers
2
Background
Resistance to macrocyclic lactones (ML) is a major problem in small ruminants,
horses and cattle, leading to a discussion on the way these drugs should be used in
livestock farms [1]. In dogs, the first report on ML loss of efficacy in Dirofilaria
immitis prevention has been published in 2005 [2]. Resistance in canine worms should
be more difficult to develop than ruminants helminths because stray and feral dogs, as
well as wild canids, carry a population of parasites that are not exposed to drug
selection and therefore represent a wide refugia. These refugia bring drug-susceptibility
alleles that dilute out the resistant ones in the population, reducing the selection pressure
for drug resistance [3]. Nevertheless, a study using microfilariae obtained from dogs
from US and Japan has shown the genetically variability of D. immitis, suggesting that
the development of resistance could be possible under a high selective pressure [4].
Today it is evident that ML-resistant heartworms are circulating, at least in the
Mississippi delta region of the USA [5]. As the mechanisms for that resistance are hard
to find, researches are looking for genetic markers that could indicate the presence of
resistant worms prior to treatment and follow the spread of D. immitis populations that
are ML sub-optimal responders [6] [7]. Studies conducted in microfilaria obtained from
three dogs originally from Louisiana and Arkansas, USA, that were under unsuccessful
ML heartworm preventive treatment demonstrated an excess of homozygosity, which
might be a sign of selection. In addition, these microfilariae presented high frequency of
a GG-GG genotype on two single nucleotide polymorphisms (SNPs) at positions 11 and
618 of a P-glycoprotein (Pgp) ABC transporter gene. These findings suggest that the
Pgp genotype might be useful as a genetic marker to assay for low responding D.
immitis in the field [8]. β-tubulin (Tub) has also been pointed out as a candidate gene for
3
carrying genetic markers for resistance since it presents two SNPs that are in linkage
disequilibrium in resistant microfilaria [4].
In the present research, we treated dogs living in the state of Rio de Janeiro,
Brazil, and collectted microfilariae that survived to 4 monthly prophylactic doses of
ML. We aimed to identify the presence of the genotype for two SNPs in the Pgp and
two other in Tub genes in worms from the studied area.
Methods
The study was conducted in two coastal areas of the state of Rio de Janeiro in the
municipalities of Arraial do Cabo and Araruama, where the dogs are exposed to a high
challenge, 80.8% and 58.4% respectively (Unpublished data). Microfilaremic and
antigenemic dogs were included in the study after positive SNAP 4DX and modified
Knott´s [9] tests once their microfilaremia was over 300 microfilaria/mL of blood [10].
Dog’s history of ML treatment was not taken into consideration. This study was
approved by Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) Institutional Animal Care and Use
Committee (CEUA - LW-33/11). All dogs received four consecutive monthly
prophylatic doses of avermectins (ivermectin – 0.06-0.12mg/kg or selamectin –
6mg/kg) following prophylactic manufacturer’s guidelines. All doses were administered
by our team. A month after the last dose, microfilariae were isolated by filtration
through polycarbonate membranes [7] from 1 mL of freshly drawn blood from all dogs
that remained microfilaremic. Microfilariae were fixed in isopropanol and kept under
refrigeration. DNA from pools of 50-100 microfilariae from each dog was extracted and
submitted to PCR amplification. The Pgp gene fragment (GenBank HM596853) and the
first Tub fragment (position 28 to 719) were amplified using primers described
4
elsewhere [4], while the second Tub fragment (position 2364 to 2961) was amplified
using the primers 5’ TGCTGAGCTCACTCAACAGG 3’ and 5’
GAATGTTGCGCTCATCTTCA 3’. After confirmation by electrophoresis on a 1.5%
agarose gel, the amplified fragments were sequenced using a 3730XL DNA analyzer
system at the Sequencing Platform at FIOCRUZ (Plataforma de Sequenciamento de
DNA, PDTIS/FIOCRUZ). After sequencing, each individual chromatogram was
analyzed in SeqScape 2.1 (Applied Biosystems) and sequences were aligned in BioEdit
Sequence Alignment Editor 7.1.11 [11]. Sequences with bad reading on the positions of
interest were discarded.
Results and discussion
Overall, samples of 30 dogs were sequenced. Positions 11 and 618 of the Pgp
fragment could be analyzed in 28 and 26 samples respectively, while position 561 and
2755 of the Tub gene could be analyzed in 25 and 27 samples respectively.
The analysis of Tub chromatograms showed the presence of heterozygosity on
72% of samples at position 561 (18/25) and 48% of samples at position 2755 (13/27),
demonstrating that these positions are polymorphic in D. immitis circulating among
dogs in Rio de Janeiro. Individual microfilariae of some of these samples are under
analysis in order to estimate if these positions are in Hardy-Weinberg equilibrium.
On the other hand, none of the Pgp chromatograms showed any sign of
polymorphism as a single ‘A’ peak on position 11 and a single ‘G’ peak on position 618
were detected. No GG-GG genotype identified [8] as a possible genetic marker of
resistance nor any polymorphism on these positions could be found. Therefore, it seems
that the described Pgp SNPs don’t occur in worms of the studied area, raising the issue
5
that their use as genetic markers of worm resistance might be restricted to a specific
geographic region and cannot be accepted globaly.
Indeed, the comparison of the adult worms from US and Japan dogs, found
important differences among the polymorphic loci [4]. This fact alone points out the
difficulty in finding a worldwide genetic marker. Likewise, in other helminths, such as
Fasciola hepatica, it has been demonstrated that the SNP T687G of the Pgp gene is a
good genetic marker for resistance in some regions but not in others [12].
It is important to stress out that, although the microfilariae in this study have
survived 4 doses of avermectins, it cannot be guaranteed that they bare a resistant
genotype. The manufacturer’s guidelines of the ML used in the present study do not
claim to be microfilaricidal, although they have previously been used as so [13]. It is
possible that these are just “lucky” individuals that are genetically indistinguishable
from wild-type worms. On the other hand, the GG-GG phenotype is not expected to be
the actual cause of the resistant phenotype, but rather a surrogate marker for resistance
[8] and therefore it may be absent in some resistant individuals. Indeed, the sequencing
of the Pgp locus in the D. immitis MP3 strain, which is considered to have at least a
proportion of resistant individuals, did not reveal the GG-GG genotype neither [8].
Nevertheless, the absence of polymorphism in these Pgp loci by itself invalidates the
use of these SNPs as genetic markers in D. immitis of the studied area.
Conclusions
This work shows that the Pgp position 11 and 618 are not polymorphic in
microfilariae from dogs in the state of Rio de Janeiro, which invalidates their use as
genetic markers of worm resistance to macrocyclic lactones. On the other hand, Tub
positions 561 and 2755 were found to be polymorphic. Since finding a universal marker
6
seems to be unfeasible once worm resistance to ML develops independently in different
areas of the world, further studies to describe resistance are needed in different high risk
areas.
Conflict of interest
Liliane Willi Monteiro, Luiz D’Escoffier, Marcia Nobre de Miranda and Tânia
Zaverucha do Valle have no competing interests. Flavya-Mendes-de-Almeida is a
consultant for Bayer Animal Health and Idexx Laboratories. Jonimar Paiva is a
consultant for Zoetis and Bayer Animal Health in Brazil. Norma Labarthe is a
consultant for Bayer Animal Health, Idexx Laboratories, and Zoetis in Brazil.
Authors' contributions
LMVW participated in the study design, in the acquisition of data, laboratory analysis,
interpretation of results and helped to draft the manuscript. NVL conceived of the study
and participated in coordination of the study, the acquisition of data, interpretation of
results and helped to draft the manuscript. LND participated in the interpretation of
results and helped to draft the manuscript. JPP participated in the acquisition of data and
performed the statistical analysis. MGNM participated in the acquisition of data and
laboratory analysis. FMA participated in the study coordination, acquisition of data,
laboratory analysis and helped to draft the manuscript. TZV participated in the study
design and coordination, laboratory analysis and helped to draft the manuscript. All
authors read and approved the final manuscript.
Acknowledgements
7
The authors acknowledge Carolina Haje, Daniel Marques, Daniel Paiva, Daniel Ribeiro,
Marcela Machado, Monique Paiva and Thiago Gomes for assistance in the acquisition
of data. The authors are grateful to the owners and to the dogs of the study.
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8
169
9. ANEXOS
9.1 LICENÇA DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA FUNDAÇÃO

OSWALDO CRUZ
170
9.2 LICENÇA DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS DA UNIVERSIDADE

FEDERAL FLUMINENSE

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LILIANE MARIA VALENTIM WILLI MONTEIRO

Dirofilaria immitis: INFECÇÃO CANINA EM FISIONOMIAS DISTINTAS E

Dirofilaria immitis: INFECÇÃO CANINA EM FISIONOMIAS DISTINTAS E

Tese apresentada ao Programa de

Tese (Doutorado em Clínica e Reprodução Animal)-

1. Dirofilaria immitis. 2. Doenças do Cão. 3.

As minhas orientadoras Profa Flavya Mendes de Almeida, Norma Vollmer Labarthe

Ao meu amigo Jonimar Paiva pela companhia e apoio, principalmente durante a

À toda equipe do Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto

À Profa Fabiana Knackfuss pelo apoio e conhecimento fornecidos durante as

À Celeste Souza e Mariana Cavalheiro pelo auxílio na contagem das lâminas.

À Alexandre Bendas pela disponibilidade no fornecimento de informações ao longo

Às minha amigas-mães Janaína Barcelos, Luciana Zanon e Simone Botelho, por

À Simone da Silveira por todo apoio na jornada diária.

Ao médico veterinário Gustavo Nascimento pelo auxílio nas atividades realizadas em

Às empresas Linavet Distribuidora de Produtos Veterinários e IDEXX Laboratories

Ao laboratório Ourofino Saúde Animal pelo fornecimento de produtos para os cães

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (CAPES) pelo

Dirofilaria immitis é o agente etiológico de uma das parasitoses caninas mais

Palavras-chave: Dirofilaria immitis, lactona macrocíclica, resistência.

Keywords: Dirofilaria immitis, macrocyclic lactone, resistance

Figura 01: Microfilária de Dirofilaria immitis. A-Extremidade cefálica; B. Extremidade

Figura 02: Ciclo biológico de Dirofilaria immitis em Canis familiaris, p.25

Figura 03: A. Microfilária de Dirofilaria immitis e B. Microfilária de Acanthocheilonema

Figura 04: Mapa mostrando as localidades do estudo sobre a influência das

Figura 05: Imagens do loteamento Caiçara, município de Arraial do Cabo, RJ,

Figura 06: Imagens do bairro Praia da Pontinha, no município de Araruama, RJ,

Figura 07: Imagens do loteamento Monteiros, no município de Araruama, RJ,

Figura 08: Imagens da localidade Aldeia Velha, no município de Silva Jardim,

Figura 09: Imagens da localidade de Toca da Onça, no município de Nova

Figura 10: Esquema do trabalho realizado para estudo da influência das

Figura 12: Esquema do estudo para confirmação da eficácia preventiva da

Figura 14: Esquema do trabalho realizado para pesquisa de polimorfismos pontuais

Figura 15: Separação de microfilárias: A– suporte de filtro para membrana de

Figura 16: Sequência parcial de referência do gene da glicoproteína-P (GenBank

Figura 17: Sequência de referência do gene da ß-Tubulina (GenBank HM596854) de

Figura 18: Número de cães registrados e número de amostras de sangue canino

Figura 19: Mapa de cobertura do loteamento Caiçara, localidade de estudo para

Figura 20: Mapa de cobertura da Praia da Pontinha, localidade de estudo para

Figura 21: Mapa de cobertura do loteamento Monteiros, localidade de estudo para

Figura 24: Frequência absoluta de amostras sanguíneas nas quais se detectou a

Figura 26: Frequência absoluta de mamíferos silvestres citados pelos

Figura 27: Amplificação de um fragmento do gene da glicoproteína P (623pb) em

Figura 28 – Amplificação de fragmento do gene da ß-tubulina (692pb) em amostras

Figura 29 – Amplificação de fragmento do gene da ß-tubulina (832pb) em amostras

Figura 30: Cromatogramas da amostra AR59 de pools de microfilárias de Dirofilaria

Figura 31: Cromatogramas das amostras dos pools de microfilárias de Dirofilaria

Figura 32: Cromatogramas das amostras dos pools de microfilárias de Dirofilaria

Figura 33: Cromatogramas das amostras dos pools de microfilárias de Dirofilaria

Figura 34: Cromatogramas das amostras dos pools de microfilárias de Dirofilaria

Quadro 01: Ocorrência de Dirofilaria immitis em cães no Brasil, p.29

Quadro 02: Características morfológicas das microfilárias de Dirofilaria immitis,

Quadro 03: Esquema de origem das lactonas macrocíclicas: da bactéria do solo

Quadro 04: Lactonas macrocíclicas para uso na quimioprofilaxia da dirofilariose

Quadro 05: Lista de primers usados para amplificação do gene da glicoproteína-P

Quadro 06: Primers usados para amplificação e sequenciamento do gene da

Tabela 02: Frequências absolutas e relativas dos cães examinados quanto à

Tabela 03: Frequências absolutas e relativas de infecção por Dirofilaria immitis em

Tabela 04 – Frequências absolutas e relativas de cães sem infecção detectável (-)

Tabela 05 – Frequências absolutas e relativas de cães submetidos ao tratamento

Tabela 06 – Número de amostras de DNA de pools de microfilárias de linhagens de

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p.21

3 MATERIAL E MÉTODOS, p.49