Machine Translated by Google

Recebido: 25 de novembro de 2019 | Revisado: 2 de março de 2020 | Aceito: 3 de março de 2020

DOI: 10.1111/jph.12894

ARTIGO ORIGINAL

Podridão da haste de estacas de eucalipto causada por

Neopestalotiopsis spp. no brasil

Gizeli S. Santos1 | Reginaldo G. Máfia2 | Aurélio M. Aguiar2 | Talyta G.

Zarpelon2 | Michelle B. Damacena2 | Aline F. Barros1 | Maria A. Ferreira1

1
Departamento de Fitopatologia,
Universidade Federal de Lavras – UFLA,
Abstrato
Lavras, Brasil No Brasil, o fungo Neopestalotiopsis (= Pestalotiopsis) é conhecido por causar doenças
2
Suzano SA Centro de Tecnologia, Aracruz,
em estacas de eucalipto. No entanto, embora ocorra com relativa frequência em cortes
Brasil
viveiros, as espécies patogênicas ainda não foram identificadas. Assim, o objetivo do
Correspondência
presente trabalho foi realizar uma caracterização morfológica e filogenética para
Maria A. Ferreira, Departamento de
Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras – identificar o agente etiológico. Para isso, os isolados foram submetidos a um
UFLA, CP3037, 37200-000 Lavras, Minas Gerais, Brasil.
análise multilocus usando as duas regiões gênicas ÿ-tubulina (TUB) e o fator de alongamento
E-mail: ferreirama.ufla@gmail.com da tradução (TEF). Com base nas sequências genômicas, duas espécies conhecidas e
uma nova espécie do patógeno foi identificada. Após a confirmação de seu patho
Informações de financiamento
Conselho Nacional de Desenvolvimento genicidade, N. australis foi confirmado como novo relato em eucalipto. Neopestalotiopsis
Científico e Tecnológico; Fundação de
rosae não diferiu do controle, porém, apresentou lesão interna e externa
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
Gerais; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal em caule de eucalipto. Além disso, neste estudo, uma nova espécie denominada N. eucalypti foi
de Nível Superior
descrito, causando doença em híbridos de eucalipto. caracterização morfológica al
baixado para a confirmação dos isolados de N. australis e N. rosae , principalmente com base
em diferenças no tamanho e forma dos conídios. Para N. eucalypti, nenhum morphologi
foi encontrado um marcador cal que a separou das demais espécies dentro do gênero. O
resultados confirmam a existência de pelo menos três espécies de Neopestalotiopsis como
agentes de mancha foliar e podridão do caule em estacas de eucalipto no Brasil.

PALAVRAS-CHAVE

eucalipto, morfologia, Neopestalotiopsis eucalypti, filogenia

1 | INTRODUÇÃO a doença. Devido à combinação dessas condições específicas para

o estabelecimento da doença, o patógeno tem sido considerado
No Brasil, o fungo Neopestalotiopsis (= Pestalotiopsis) causa secundária e oportunista, embora não haja estudos mais específicos sobre
mancha e podridão do caule em plantas de eucalipto. Embora seja relativamente com a etiologia da doença (Alfenas, Zauza,
comum em viveiros que produzem mudas, o patógeno não foi Máfia, & Assis, 2009).

identificado ainda. A doença geralmente ocorre em estacas enfraquecidas, e Espécies de Pestalotiopsis são fitopatogênicas, causando diversas
infecções por patógenos começam a partir de lesões causadas pelo desenvolvimento vegetativo doenças infecciosas, como lesões de cancro, morte de brotos, ferrugem da agulha,
processo de propagação. As condições ambientais necessárias para o ferrugem das pontas, cancro sarnento, manchas foliares, ferrugem cinzenta, ferrugem foliar e

propagação vegetativa do eucalipto também favorecem a ocorrência de podridão dos frutos, bem como danos pós-colheita, às vezes resultando em

Este é um artigo de acesso aberto nos termos da Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial, que permite o uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original
seja devidamente citado e não seja utilizado para fins comerciais. © 2020 Os Autores. Journal of Phytopathology publicado
pela Blackwell Verlag GmbH

Jornal de fitopatologia. 2020;168:311–321. wileyonlinelibrary.com/journal/jph | 311

 bj
6
12
Machine Translated by Google
312 |ÿÿ

perdas econômicas consideráveis. Espécies de Pestalotiopsis são comuns

patógenos que causam uma variedade de doenças, reduzem a produção e

causam perdas econômicas em maçã, mirtilo, coco, castanha, gim

Ger, Videira, Goiaba, Avelã, Lichia, Manga, Orquídea, Pêssego, Chá

e maçã de cera devido a doença. Eles também ocorrem comumente como seiva

rotrophs na serapilheira de muitas espécies de plantas. Pestalotiopsis spe

cidades foram recuperadas do solo, água de córrego poluída, madeira,

papel, tecidos e lã (Maharachchikumbura, Hyde, Groenewald,

Xu, & Crous, 2014; Reddy, Murali, Suryanarayanan, Govindarajulu,

& Thirunavukkarasu, 2016). Estudos recentes mostraram que sev

Espécies orais de Pestalotiopsis causam infecções assintomáticas em plantas

tecidos (Debbab, Aly, & Proksch, 2013), incluindo a casca das árvores

(Murali, Thirunavukkarasu, Govindarajulu e Suryanarayanan, 2013).

Algumas espécies têm sido associadas a infecções humanas e animais

ções, e outros também foram isolados de ambientes extremos

(Maharachchikumbura et al., 2014).

Pestalotiopsis é um gênero anamórfico e monofilético

caracterizada por conídios multicelulares contendo apêndices, e é

amplamente distribuído em regiões tropicais e temperadas.

O gênero Pestalotiopsis possui inúmeras espécies, com pelo menos 253

representada como a forma assexuada. Até o momento, apenas 13 morfos sexuais

foram registrados na literatura e foram previamente

tratados como espécies de Pestalosphaeria (Maharachchikumbura,

Guo, Chukeatirote, Bahkali, & Hyde, 2011; Reddy e outros, 2016).

Recentemente, o gênero Pestalotiopsis foi revisado, e dois

novos gêneros de Pestalotiopsis, ou seja, Neopestalotiopsis e

Pseudopestalotiopsis, foram propostas com base em morfologia

cal e dados de DNA (Maharachchikumbura et al., 2014).

Recentemente, a ocorrência de podridão em plantas enxertadas de eucalipto com

sintomas típicos da doença causada por Pestalotiopsis sp. foi ob

servido. Os sintomas foram observados em plantas jovens aos quatro meses

de idade, que foram utilizadas para enxertia. Infecções pelo patógeno

começaram nos locais onde os ramos laterais foram podados, e eles

progrediu em direção ao caule primário da planta, que muitas vezes

diluindo os conídios em cultura de BDA a 2% (batata, dextrose e ágar)

meio de cultura para obter culturas monospóricas (Crous, Verkley, &

Groenwald, 2009).

2.2 | caracterização molecular

Nove culturas puras (PA1 a PA7, PA9 e PA10) foram cultivadas em BDA

meio a 25°C por 10 dias para obter biomassa fúngica suficiente para

Extração de DNA. O micélio foi raspado das superfícies de ac

foi usado em cada reação de PCR.

O gene da ÿ-tubulina foi amplificado usando os primers BT1 e

BT-2b (TUB) (Glass & Donaldson, 1995; O'Donnell, Kistler, Cigelnik,

& Ploetz, 1998). O gene do fator de alongamento (TEF) foi amplificado

usando os primers EFE1-728F e EF2 1-alfa (TEF) (Carbone & Kohn,

SANTOS e outros.

culturas em crescimento, colocadas em um almofariz e pilão congelados, contêm

nitrogênio líquido e moído em um pó fino. As extrações de DNA foram realizadas

usando o Wizard® Genomic DNA Purification Kit

(Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e quantidade de

DNA foram checadas usando um NanoDrop® (Thermo

Fisher Científico). As amostras de DNA foram diluídas para 50 ng/µl e 1 µl

1999; O'Donnell et al., 1998). Todas as reações de PCR foram preparadas em

um volume final de 25 µl usando 2,5 µl de 10× Reaction Buffer, 2,5 µl

de MgCl2 (25 mM), 0,5 µl de dNTPs (10 mM), 0,5 µl de cada primer (10 µM), 1 µl de
solução de DNA e 0,3 µl de Taq polimerase usando o GoTaq® DNA Polymerase

(Promega), 18,1 µl de água MiliQ,

e foram realizadas em um termociclador (My Cycler™ BIO-RAD), e

as condições foram ajustadas para cada gene conforme descrito anteriormente

(Carbone & Kohn, 1999; Glass & Donaldson, 1995; O'Donnell et al.,

1998). O índice de consistência (CI), índice de retenção (RI) e composto

índice (CR) foram calculados.

A purificação dos produtos de PCR e sequenciamento foi por

formada pela Macrogen Company (Coreia). O eletrofero gerado

gramas foram editados usando o software SeqAssem (Hepperle, 2004).

sultado em deterioração e morte. Considerando as condições em que Sequências de estudos anteriores e sequências que foram publicadas

a doença ocorreu, que eram menos favoráveis do que aqueles normalmente disponíveis no GenBank (Tabela 1) para espécies do gênero Pestalotiopsis

observados durante a propagação clonal do eucalipto, o objetivo deste e Neopestalotiopsis foram usados para o estudo filogenético

trabalho foi estudar a etiologia e a patogenicidade da doença. isis. As sequências geradas neste estudo foram depositadas no

(g
N 2 | MATERIAL E MÉTODOS

2.1 | Isolamento

A doença foi observada em plantas de eucalipto com 4 meses de idade

como porta-enxerto, em julho de 2016, em área de pesquisa em Jacareí, estado de São

Paulo (SP), Brasil. O clima da região é Cfa segundo a

classificação de Köppen, que é caracterizada como um clima úmido

com verão quente, com temperatura média anual de 19,3°C,

altitude de 634 m e precipitação anual de 1.396 mm (Álvares,

Stape, Sentelhas, Moraes, & Sparovek, 2013). Vinte doentes

estacas exibindo acervulos e conídios foram coletadas e usadas

para obter os isolados do patógeno. O fungo foi isolado diretamente

Múltiplos alinhamentos de sequências de nucleotídeos foram construídos

usando o programa clustalw (Thompson et al., 1994) e mega 6.0

software (Tamura, Stecher, Peterson, Filipski e Kumar, 2013). O

as sequências foram editadas manualmente quando necessário. Árvores filogenéticas

foram construídos usando o software paup* versão 4.0 (Swofford, 2002)

usando máxima parcimônia (MP) e mrbayes 3.2.1 (Ronquist et al.,

2012). Uma análise bootstrap (1.000 réplicas) também foi realizada

no conjunto de dados para determinar os níveis de confiança das ramificações.

A inferência bayesiana foi usada para gerar probabilidades posteriores (PP)

para os nós de consenso usando mrbayes (Huelsenbeck & Ronquist,

2001). A Cadeia Monte Carlo Markov (MCMC) (Larget & Simon,

1999) foi executado por 1.000.000 gerações usando o sub

modelo de evolução da instituição determinado pelo jmodeltest. As árvores eram

visualizado e editado no figtree 1.3.1. (http://tree.bio.ac.uk/software).
 b
6
12
Mj
Machine Translated by Google
SANTOS e outros.

Espécies

N. australis

N rosae

N. eucalipto

N. eucalipto

N. australis

N. eucalipto

N. eucalipto

N. eucalipto

N. eucalipto

N. aotearoa

N. brasiliensis

N. asiática

N. australis

N. chrysea

N. chrysea

N. clavispora

N. clavispora

N. clavispora

n. cubana

N. elipsospora

N. elipsospora

N. elipsospora

N. eucalipticola

N. foedans

N. foedans

N. foedans
Número de culturas

PA1

PA2

PA3

PA4

PA5

PA6

PA7

PA9

PA10

CBS36754

COAD 2.166

MFLUCC 12–0286

CBS 114.159

MFLUCC120261

MFLUCC120262

CBS44773

MFLUCC120280

MFLUCC120281

CBS60096

CBS115113

MFLUCC120283

MFLUCC120284

CBS26437

CGMCC39123

CGMCC39178

CGMCC39202

CBS11583
Hospedeiro/substrato

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

eucalipto sp.

Tela

Psidium guajava

árvore não identificada

Telopea sp.

Folhas mortas

planta morta

madeira em decomposição

Magnólia sp.

Magnólia sp.

serapilheira

Ardisia crenata

Materiais vegetais mortos

Materiais vegetais mortos

Eucalyptus globulus

planta de mangue

Neodypsis decaryi

Calliandra haematocephala China

restos de plantas
Localização

Brasil

Brasil

Brasil

Brasil

Brasil

Brasil

Brasil

Brasil

Brasil

Nova Zelândia

Brasil

China

Austrália: Novo
Gales do Sul

China

China

Sri Lanka

China

China

Cuba

Hong Kong

China

tailândia
*

China

China

Cuba
TEF

MK253105

MK253106
MK253107
MK253109
MK253108
MK253110
MK253111
MK253112
KM199526
MG692402

JX399049
KM199537

JX399051

JX399052

KM199539

JX399044

JX399045

KM199521

KM199544

JX399047

JX399046

KM199551

JX399053

JX399055

JX399054

KM199519
ÿÿ |

TABELA 1 Espécies, número de culturas, hospedeiro/substrato, localização e número de acesso do Genbank das sequências de Neopestalotiopsis e
Pestalotiopsis incluídas neste estudo

Número de acesso do Genbank

BANHEIRA

MK286940

MK286941

MK286942

MK286943

MK286945

MK286944

MK286946

MK286947

MK286948

KM199454

MG692400

JX399018

KM199432

JX399020

JX399021

KM199443

JX399013

JX399014

KM199438

KM199450

JX399016

JX399015

KM199431

JX399022

JX399024

JX399023

KM199444
313

N. formicarum

N. formicarum CBS36272 Formicidae Morto (formiga) Gana KM199517 KM199455

N. honoluluana CBS111535 Telopea sp. EUA: Havaí KM199546 KM199461

N. honoluluana CBS114495 Telopea sp. EUA: Havaí KM199548 KM199457

N. javaensis CBS 257.31 cocos nucifera Indonésia: Java KM199543 KM199437

N. magna MFLUCC12652 Pteridium sp. França KF582791 KF582793

N. mesopotâmica CBS29974 eucalipto sp. Peru KM199541 KM199435

N. mesopotâmica CBS33686 pinus brutia Iraque KM199555 KM199441

*
N. mesopotâmica CBS46469 Achras sapota Índia KM199436
*
N macadâmia BRIP63736a NSW KX186623 KX186651
*
N. macadâmia BRIP63737b NSW KX186626 KX186653
N. macadâmia BRIP63740a
* NSW KX186628 KX186656
N. natalensis CBS13841 acácia mollissima África do Sul KM199552 KM199466
*
N. piceana CBS22530 Mangifera indica KM199535 KM199451

N. piceana CBS25432 cocos nucifera Indonésia KM199529 KM199452

N. piceana CBS39448 Picea sp. Reino Unido KM199527 KM199453

(Continuou)
 b
6
12j
Machine Translated by Google

K 314 |ÿÿ

TABELA 1 (Continuação)

Espécies

N. protearum

N rosae

N rosae

N. samarangensis

N. samarangensis

N. saprophytica

N. saprophytica

Neopestaoliopsis sp. clado 4

Neopestalotiopsis sp. Classe 10

Neopestalotiopsis sp. clado 15

Neopestalotiopsis sp. clado 15

Neopestalotiopsis sp. clado 15

Neopestalotiopsis sp. clado 15

Neopestalotiopsis sp. clado 20

Neopestalotiopsis sp. clado 20

Neopestalotiopsis sp. clado 22

Neopestalotiopsis sp. clado 26

Neopestalotiopsis sp. clado 26

Neopestalotiopsis sp. clado 26

N. steyaertii

N. surinamensis
Número de culturas

CBS 114.178

CBS101057

CBS124745

CBS115451

MFLUCC120233

CBS115452

MFLUCC120282

CBS23379

CBS11020

CBS17725

CBS27429

CBS66494

CBS32276

CBS16442

CBS36061

CBS11975

CBS26637

CBS32376

CBS36161

IMI192475

CBS45074
Hospedeiro/substrato

Leucospermum
cuneiforme cv. 'Pássaro Solar'

Rosa sp.

Paeonia suffruticosa

árvore não identificada

Syzygium samarangense

Litsea rotundifolia

Magnólia sp.

Crotalaria juncea
*

Dalbergia sp.

cocos nucifera

cocos nucifera

Camélia sp.

Duna de areia

Cinchona sp.

Achras sapota

Érica sp.

Erica gracilis

Cissus sp.

eucalipto viminalis

Solo sob Elaeis

guineense
Localização

Zimbábue

Nova Zelândia

EUA

Hong Kong

tailândia

Hong Kong

China

*
*
Índia

Indonésia: Java

Holanda

França

França

Guiné

Índia

Alemanha

França

Holanda

Austrália

Suriname
KM199523
KM199524
KM199556

JQ968611
KM199538
JX399048

KM199528

KM199540

KM199533

KM199534

KM199525

KM199536

KM199520

KM199522

KM199531

KM199547

KM199550

KM199549

KF582792

KM199518
SANTOS e outros.

Número de acesso do Genbank

TEF BANHEIRA

KM199463

KM199429

KM199430

KM199447

JQ968610

KM199433

JX399017

KM199464

KM199442

KM199445

KM199448

KM199449

KM199446

KM199434

KM199440

KM199439

KM199459

KM199458

KM199460

KF582794

KM199465

N. surinamensis CBS111494 Protea eximia Zimbábue KM199530 KM199462

N. umbrinospora MFLUCC120285 Planta não identificada China JX399050 JX399019

N. zimbabwana CBS111495 Leucospermum cunciforme Zimbábue KM199545 KM199456

cv. 'Pássaro Solar'

*
P. oryzae CBS17126 Itália KM199494 KM199397

P. oryzae CBS111522 Telopea sp. EUA: Havaí KM199493 KM199394

P. biciliata CBS23638 Paeonia sp. Itália KM199506 KM199401

P. biciliata CBS124463 Platanus × hispanica Eslováquia KM199505 KM199399

P. australis CBS111503 Protea neriifolia × susannae cv. África do Sul KM199557 KM199382
'Gelo Rosa'

P. australis CBS114474 Protea neriifolia × susannae cv. África do Sul KM199477 KM199385
'Gelo Rosa'

P. australasiae CBS114141 Protea sp Austrália KM199501 KM199410

P. australasiae CBS114126 Knightia sp. Nova Zelândia KM199499 KM199409

Abreviações: CBS, Coleção de Cultura do Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal Biodiversity Centre, Utrecht, Holanda; CGMCC, Centro Geral de Coleta de Culturas Microbiológicas
da China, Instituto de Microbiologia, Academia Chinesa de Ciências, Pequim, China; IMI, coleção de cultura do CABI Europe UK Centre, Egham, Reino Unido; MFLUCC, Coleção
de Cultura da Universidade Mae Fah Luang, Chiang Rai, Tailândia.

A combinação dos dois genes foi determinada com uma partição
teste de homogeneidade (PHT) (Farris, Kallersj, Kluge, & Bult, 1994).
As árvores foram construídas usando 75 sequências alinhadas, incluindo
as nove sequências de isolados híbridos de Eucalyptus e Xylaria
grupo externo hipoxilon , de acordo com Maharachchikumbura et al. (2014).
2.3 | caracterização morfológica
As estruturas fúngicas e corpos frutíferos que se originaram do herbário
material e placas contendo os isolados foram selecionados com base na
análise filogenética e utilizada para a caracterização morfológica.
Machine Translated by Google
SANTOS e outros. 315
ÿÿ |

bj
6
12 Descrições morfológicas foram feitas para isolados cultivados em PDA

meio a 25°C com fotoperíodo de 12 horas. caules de eucalipto com

contendo acervulos foram usados para analisar essas estruturas. o predomi

a cor nante da colônia cultivada em PDA foi determinada comparando

com a cartela de cores de Rayner (1970). As preparações microscópicas foram

feito em água destilada, com 30 medidas por estrutura, e

foram observados em um microscópio LX400 com software capture pro

V2.8.8.5. Medidas dos conidiomas, células conidiogênicas,

células conidiais incluindo a célula basal, três células medianas, célula apical e

apêndices apicais e basais foram retirados. As fotos foram captadas em

um microscópio binocular Nikon Eclipse E-200 LED.

2.4 | teste de patogenicidade

Para testar a patogenicidade, cinco isolados (PA1, PA2, PA3, PA4 e PA5)

foram inoculados em dez plantas com idade de 90 dias cada. Para as inoculações,

discos de micélio foram inoculados no caule. Para isso, o iso

lates aqui utilizados foram cultivados em placas de Petri contendo meio BDA

e mantida por 7 dias a 25°C, com fotoperíodo de 12 horas. Depois

incubação, discos de micélio de 5 mm de diâmetro foram colocados no local da

lesão de cada planta, que também media 5 mm de diâmetro. o frag

mento foi coberto com filme plástico para manter a umidade e proteger

Proteger a lesão da dessecação. Os controles receberam apenas um disco

contendo PDA, sem o fungo. Após 18 dias de inoculação,

os comprimentos das lesões externas e internas causadas pelo pato

gen foram medidos. O experimento foi realizado em um ambiente totalmente

delineamento inteiramente casualizado com seis tratamentos (cinco isolados e um

ao controle). Os dados foram submetidos a uma análise de variância, e o

as médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott (1974) (p < 0,05). Depois de

patogenicidade foi confirmada, o patógeno foi novamente isolado de

as plantas inoculadas e as características morfológicas do

fungos foram comparados para cumprir os postulados de Koch.

3 | RESULTADOS

3.1 | Isolamento

Dez isolados foram obtidos dos acervulos e conídios associados

com Eucalyptus spp. estacas. Apenas a fase assexuada foi

TEF). A análise filogenética incluiu 57 sequências adicionais

de Neopestalotiopsis spp. e oito Pestalotiopsis spp., incluindo o

Xylaria hypoxylon como grupo externo, conforme obtido do GenBank. árvores

gerados para as duas regiões gênicas apresentaram topologias semelhantes

baseado em métodos de parcimônia e bayesianos. a partição ho

teste de mogeneidade (p = 0,01) mostrou que os conjuntos de dados (TUB e TEF)

tinham a mesma topologia e podiam ser combinados. o concatenado

As sequências de DNA das duas regiões contêm 1.355 caracteres do

75 isolados resultando em 399 constantes, 618 parcimônia não informativa

e 338 caracteres informativos de parcimônia. Cem árvores com

Foram gerados 1.355 passos, com IC de 0,88, IR de 0,95 e CR de

0,84 para todos os sites informativos e não informativos de parcimônia.

A árvore combinada mostrou que os isolados sequenciados neste

estudo foram agrupados em diferentes clados. Foi possível classificar

os isolados PA1 e PA5 como Neopestalotiopsis australis e o PA2

e PA9 isolados como Neopestalotiopsis rosae (Figura 2). O ramo

foi suportado por altos valores de bootstrap (88% e 74%, respectivamente)

e probabilidade posterior (0,95 e 0,81, respectivamente). Isola PA3,

PA4, PA6, PA7 e PA10 foram agrupados em um novo clado suportado

por alto bootstrap e valores de probabilidade posterior, em 96% e 0,98,

respectivamente (Figura 2).

3.3 | caracterização morfológica

Os isolados PA1 (N. australis) e PA2 (N. rosae) foram selecionados para mais

caracterização filológica com base nos resultados da análise filogenética

análises. Não houve variação na cor entre os isolados

quando cultivadas em meio BDA. Os esporos eram personagens

por conídios com cinco células, três células medianas coloridas (igualmente

pigmentadas), células terminais hialinas e apêndices originários de

ápice da célula apical.

Neopestalotiopsis australis (Figura 3). Conidiomas em PDA, glo

bose ou clavate, agregado ou disperso, semi ou totalmente imerso,

preto, 200–500 ÿm de comprimento; massas conidiais globosas exsudativas, marrom-

escuras a pretas; conidióforos indistintos, muitas vezes reduzidos a conídeos

células iógenas. Células conidiogênicas discretas, hialinas, de paredes ásperas,

único, 2,5–4,0 ÿm de altura e 8,5–14,0 ÿm de comprimento. Conídio fusóide,

elipsóide, reto a ligeiramente curvo, 4 septos. Cônico para ob

Célula basal cônica com corpo truncado, hialino, altamente verruculoso e

base de paredes finas, 2,0–3,5 × 3,0–5,0 ÿm de comprimento; três células medianas,

encontrados, e os sintomas primários foram observados em plantas jovens em marrons, com um septo mais escuro que o restante da célula (segunda célula basal

quatro meses de idade, que foram utilizadas para enxertia. Infecções por patógenos célula: 3,0–4,0 × 3,0–6,0 ÿm de comprimento; terceira célula: 4,0–5,0 × 3,5–6,82 ÿm
começou em locais onde os ramos laterais foram podados e depois pro de comprimento, quarta célula 3,5–5,0 × 5,0–5,5 ÿm de comprimento); célula apical
progrediu em direção ao caule primário da planta. Assim, os sintomas sob 2,0–3,0 × 3,0–5,00 ÿm de comprimento, hialina, cilíndrica a subcilíndrica, de paredes
condições naturais de infecção consistiam em uma podridão do caule com pequenos finas, com 2–3 apêndices tubulares apicais (principalmente 3), surgindo

a pontuações pretas, culminando com a morte da planta (Figura 1a). da crista apical, não ramificado, filiforme, 20 a 27 ÿm de comprimento.

Apêndice basal único, tubular, não ramificado, centrado, 3,0–6,5 ÿm de comprimento.

Colônias em PDA atingindo 55–60 mm de diâmetro após
3.2 | caracterização molecular 10 dias a 25°C, branco, com denso micélio aéreo na superfície
com conidiomas pretos e concêntricos, e reverso de cor semelhante.

As árvores filogenéticas foram geradas usando máxima parcimônia (MP) Neopestalotiopsis rosae (Figura 4). Conidiomas, globosos, sol

e inferência Bayesiana (BI) para as regiões amplificadas (TUB e itário, semi-imerso, preto, exsudando massas de conídios e
 bSpdfnp[cpusvjr
6
12
Machine Translated by Google
316 |ÿÿ

(a) (b)

88/0,95

75/0,94

98/0,99

70/0,99

87/0,98

78/0,99

100/1,00

68/0,91

58/0,95
PA1
PA05
Neopestalotiopsis sp. clado 22 CBS11975
N. australis CBS114159
N. brasiliensis COAD2166 N.
macadamiae KX186623 N.
macadamiae KX186626 N.
macadamiae KX186628 N.
asiatica P817 N.
chrysea MFLUCC120261 N.
chrysea MFLUCC120262 N.
umberspora MFLUCC120285
N. surinamensis CBS111494
N. protearum CBS114178
Neopestalotiopsis sp. clade 4 CBS23379 N.
surinamensis CBS45074 N.
aotearoa CBS36754 N.
ellipsospora CBS115113 N.
samarangensis CBS115451 N.
ellipsospora MFLUCC120283 N.
ellipsospora MFLUCC120284 N.
samarangensis MFLUCC120233 N.
piceana CBS22530 N.
piceana CBS25432 N.
piceana CBS39448
Neopestalotiopsis sp. clado 15 CBS17725
Neopestalotiopsis sp. clado 15 CBS27429
Neopestalotiopsis sp. clado 15 CBS66494
Neopestalotiopsis sp. clade 15 CBS32276 N.
clavispora CBS44773 N.
clavispora MFLUCC120280 N.
clavispora MFLUCC120281 N.
formicarum CBS11583 N.
formicarum CBS36272
Neopestalotiopsis sp. clade 10 CBS11020 N.
eucalypticola CBS26437
N. honoluluana CBS111535 N.
honoluluana CBS114495
Neopestalotiopsis sp. clado 26 CBS26637
Neopestalotiopsis sp. clado 26 CBS36161
Neopestalotiopsis sp. clado 26 CBS32376 N.
zimbabwana CBS111495 N.
magna MFLUCC12652 N.
cubana CBS60096
Neopestalotiopsis sp. clado 20 CBS16442
Neopestalotiopsis sp. clade 20 CBS36061 N.
mesopotamica CBS46469 N.
saprophyta MFLUCC120282 PA2
N. australis
FIGURA 1 Sintomas de
Neopestalotiopsis spp. em estacas de

alinhamento combinado (TUB + TEF)

para as sequências analisadas de
SANTOS e outros.

eucalipto. (a) Plantas com quatro meses de

idade com doença em condições naturais de
infecção. (b) Reprodução dos sintomas da
doença em plantas inoculadas artificialmente.

FIGURA 2 Árvore filogenética bayesiana do

Neopestalotiopsis spp. e Pestalotiopsis spp.

Probabilidades bayesianas posteriores (PP) acima
de 50%. As proporções de bootstrap de
parcimônia máxima são fornecidas nos nós (MP/
PP). A árvore foi enraizada com Xylaria hypoxylon

PA09
74/0,81 N. rosae CBS124745 N. N rosae
rosae CBS101057 PA3
PA4
PA4
PA07
PA10 N. eucalipto
96/0,98 PA6
N. foedans CGMCC39123 N.
foedans CGMCC39178 N.
foedans CGMCC39202
99/0,98 N. javaensis CBS25731 N.
mesopotamica CBS33686 N.
mesopotamica CBS29974 N.
saprophytica CBS115452 N.
natalensis CBS13841 N.
steyaertii IMI192475 P.
68/0,71 oryzae CBS17126 P.
oryzae CBS111522 P.
biciliata CBS23638 P.
biciliata CBS124463 P.
australasiae CBS114126 P.
australasiae CBS114141 P.
98/0,72 australis CBS111503
P. australis CBS114474
Xylaria hipoxylon AF132333
80,0

marrom a preto; conidióforos indistintos, muitas vezes reduzidos a conídeos
células iógenas; discreto, cilíndrico, hialino, conídeo de paredes lisas
células iogênicas, únicas, com ápice truncado com periclinal visível
espessamento, 2–5 × 5–18 ÿm de comprimento; conídio fusóide, elipsóide, reto a
ligeiramente curvo, 4 septos; Células basais cônicas a obcônicas
com base truncada, hialina, áspera e de paredes finas, 3,5–6,0 ÿm de comprimento,
geralmente com um pequeno apêndice basal; três células medianas com
pigmentação castanho claro a escuro com uma parede áspera, e um set
fica mais escuro que o resto da célula (segunda célula da base pálida
marrom, 3,5–3,0 × 4,5–5,6 ÿm de comprimento; terceira célula marrom dourado
3,5–5,0 × 4,5–7,0 ÿm de comprimento; quarta célula marrom, 3,5–4,5 × 4,5 a 7,0
ÿm de comprimento); célula apical de 3,5–3,0 × 4,5–5,5 ÿm de comprimento,
hialina, cilíndrica, fina e de paredes lisas com 3–5 tubulares apicais
apêndices, não surgindo da crista apical, mas cada um inserido em
Machine Translated by Google
SANTOS e outros. 317
ÿÿ |

bj
6
12 (a)

(d)

50–60 mm após 10 dias a 25°C.

3.4 | Taxonomia
(b)

(e)

Com base nos resultados das análises de sequência TUB e TEF juntas

com uma avaliação da literatura e morfologia, uma nova espécie

(PA3, PA4, PA6, PA7 e PA10) foi proposto usando o suporte de ramificação

portado por alto bootstrap (96%) e alto valor de probabilidade posterior

ues. Este resultado confirma a ocorrência desta espécie no Brasil.

(c)

(f)

FIGURA 3 Neopestalotiopsis australis. (a, b) Células conidiogênicas (indicadas pelas setas). (c) Acérvulos. (d–f) Conídios. Barras de escala = 10 µm [A figura colorida pode ser
visualizada em wileyonlinelibrary.com]

um locus diferente na metade superior da célula apical, não ramificado,

filiforme, 20–31 µm de comprimento; apêndice basal único, tubular, un

ramificado, centrado, 4,5–7,5 ÿm de comprimento. Uma colônia do patógeno no meio

de cultura PDA apresentou leve coloração de micélio

fusoide, elipsoide, reto a ligeiramente curvo, 5 células (4 septos); célula basal

com base truncada, hialina, áspera e de paredes finas, 2,0–3,5 × 1,5–

6,0 ÿm de comprimento; três células medianas marrom claro, septo mais escuro que o

resto da célula (segunda célula da base, 3,0–5,0 × 3,5–5,5 ÿm de comprimento;

terceira célula: 3,5–5,5 × 3,0–4,6 ÿm de comprimento, quarta célula: 3,0 –5,0 × 3,0–

5,0 ÿm de comprimento); célula apical 6,0–3,0 × 3,0–5,5 ÿm de comprimento, hialina,

subcilíndrica a obcônica, de paredes finas; com 2–4

apêndices tubulares apicais, surgindo da crista apical, não ramificados,

filiforme, flexuosa, 12–27 ÿm de comprimento; apêndice basal único, tubular, não

ramificado, centrado, 3–7 ÿm de comprimento.

Características da Cultura: Colônias em PDA atingindo 50-70 mm em

diâmetro após 10 dias a 25°C, micélio branco, inodoro, exu

livre de tâmaras, com micélio aéreo denso na superfície com

e conidiomas pretos; Creme suave e pálido reverso. Mycelium hya

hifas lineares, septadas, neutras e lisas.

Habitat: Eucalyptus sp.

3.4.1 | Neopestalotiopsis eucalipto Distribuição: Brasil.

Material examinado: Brasil, julho de 2016, em área de pesquisa no

RG Máfia, GS Santos, & MA Ferreira, sp. nov. Figura 5 Região de Jacareí, no Vale do Ribeira-SP, 23°18'10"S e

Etimologia: Relativo ao país onde foi coletado, Brasil. 45°17'31"W, observada em porta-enxertos com 6 meses de idade em julho de 2016.

Morfologia assexuada: Conidiomata acervular ou picnidial em cultura Notas: A nova espécie proposta, N. eucalypti, difere de outras

em PDA, globosa, solitária ou agregada, semi ou parcialmente imersa espécies em termos de tamanho, número de apêndices e cor da medial

e totalmente imerso, preto, 100–500 ÿm de diâmetro; exsudando massas de conídios células. Neste estudo, tanto os conidiomas quanto os conídios que se desenvolveram

globosos, viscosos e negros; conidióforos indistintos, em PDA apresentou caracteres semelhantes em relação aos demais descritos

muitas vezes reduzido a células conidiogênicas; células conidiogênicas discretas, espécies. De acordo com Maharachchikumbura et al. (2014), o co

hialino, de paredes ásperas, único, 1,5–4,5 × 9,0–20,5 ÿm; conídio nidia obtidos da natureza são geralmente mais uniformes em tamanho e
Machine Translated by Google
SANTOS e outros.
318 |ÿÿ

bj
6
12 (a)

(c)

visualizada em wileyonlinelibrary.com]

de características morfológicas entre N. autralis, N. rosae e

A espécie N. eucalypti é apresentada na Tabela 2.

3.5 | teste de patogenicidade

(b)

(d)

As inoculações dos isolados fúngicos PA3 e PA5 levaram ao desenvolvimento da doença

opment. Os isolados PA3 e PA5 não diferiram quanto à doença

gravidade, expressa em termos de extensão da lesão. Os outros isolados

(PA1, PA2 e PA4) não diferiram do controle, porém,

mostrou lesão interna e externa em caule de eucalipto (Figura 6).

(e)

FIGURA 4 Neopestalotiopsis rosae. (a) Células conidiogênicas (indicadas pelas setas). (b) Acérvulos. (c–e) Conídios. Barras de escala = 10 µm [A figura colorida pode ser

morfologia do que aqueles obtidos a partir de meios artificiais. Uma comparação pela primeira vez como agentes etiológicos de mancha foliar e podridão do caule na ue

estacas de calipto. Além disso, uma nova espécie, N. eucalypti, foi

inscritos no mesmo hospedeiro no Brasil. Neopestalotiopsis rosae foi o primeiro

relatados em lesões em caules de rosas e Paeonia suffruticosa, enquanto

N. australis foi observado pela primeira vez nas folhas e caule de Vitis vinifera

e Achras sapota (Maharachchikumbura et al., 2014).

No Brasil, acreditava-se que essas doenças do eucalipto eram

causada por apenas uma espécie pertencente ao gênero Pestalotiopsis

(Alfenas e outros, 2009). No entanto, de acordo com os resultados deste estudo,

existe um complexo de pelo menos três espécies desse patógeno pertencentes

do gênero Neopestalotiopsis. Maharachchikumbura et al. (2014) por

formou uma reconstrução filogenética da família Amphisphaeriaceae

Os postulados de Koch foram cumpridos através do isolamento do mesmo com base na morfologia e análise filogenética de rDNA (ITS) e

fungo das plantas inoculadas. As lesões presentes na inoculação 28S rRNA (LSU) e dos genes ÿ-tubulina (BT) e fator de alongamento 1-alfa (TEF). O

plantas infectadas eram semelhantes àquelas em condições naturais de infecção. alinhamento da região LSU foi usado para

ção. No entanto, além da lesão no caule da estaca (podridão do caule), uma determinar onde colocar os gêneros dos isolados de Pestalotiopsis dentro

observou-se lesão de coloração acastanhada no pecíolo da planta (Figura 1b). da família Amphisphaeriaceae. Em um estudo de 2012, Maharachchikumbura

e outros analisou dez regiões genômicas e descobriu que a combinação

As regiões TUB e TEF possuem melhor resolução para descrição das espécies.

4 | DISCUSSÃO Em 2014, Maharachchikumbura et al. usou o ITS, TUB e TEF re

regiões em combinação para definir as espécies. Os autores propuseram

Com base nas análises filogenéticas do TUB e TEF combinados dois novos gêneros segregados de Pestalotiopsis, Neopestalotiopsis e

regiões gênicas, bem como as características morfológicas, duas espécies Pseudopestalotiopsis. No presente estudo, a região ITS não presenciou

espécies de Neopestalotiopsis (N. australis e N. rosae) foram relatadas para resolução suficiente para definir a espécie; além disso, não
Machine Translated by Google
SANTOS e outros. 319
ÿÿ |

bj
6
12 (a)

(d)

(g)
(e)

(h)
(b) (c)

(eu)
(f)

FIGURA 5 Neopestalotiopsis eucalypti. (a) Conidiomas em PDA. (b, c) Esporulação em placas de Petri contendo Potato Dextrose Agar (frente e verso,
respectivamente) (d, e) células conidiogênicas (indicadas pelas setas). (f) Acérvulos. (g–i) Conídios. Barras de escala = 10 µm [A figura colorida pode ser visualizada
em wileyonlinelibrary.com]

apresentam a mesma topologia para as árvores TUB e TEF. Portanto, é por Maharachchikumbura et al. (2014) e Sangkyu et al. (2016).
foi retirado do estudo. No entanto, os caracteres morfológicos podem variar de acordo com o hospedeiro
Neste estudo, as sequências que se agruparam com o clado 22 e o ambiente.

apresentou morfologia semelhante à de N. australis. Como descrito
em Maharachchikumbura et al. (2014), embora a espécie
foram separados filogeneticamente e ecologicamente, eles são mor
fologicamente semelhantes. A morfologia de Neopestalotiopsis sp.
(clado 22) descrito neste estudo corrobora os observados
As sequências dos isolados que se agruparam dentro da N. rosae
clado descrito neste estudo apresentou um dos caracteres primários
características que a diferenciam de outras espécies, nomeadamente, o número
de apêndices tubulares apicais (3-5) que não surgem da crista apical
mas de locais diferentes na metade superior da célula apical. Esses
Machine Translated by Google
SANTOS e outros.
320 |ÿÿ

bj
6
12 TABELA 2 Comparação das características morfológicas entre N. autralis, N. rosae e N. eucalypti

Recurso

Diâmetro da colônia em PDA a

25°C, 10 dias

Cor da colônia

Conidiomas no PDA

Conidióforos

Células conidiogênicas

Forma conidial

Septação conidial

Tamanho dos apêndices

Número de apêndices

Cor das células medianas

e outros (2014).
Organismos

N. australis

55–60 mm

Branco

Conidiomas, globosos ou clavados,

agregados ou dispersos, semi ou totalmente
imersos, pretos, 200–500 ÿm de comprimento;
massas conidiais globosas exsudativas, marrom-
escuras a pretas

Conidióforos indistintos, frequentemente

reduzido a células conidiogênicas

Células conidiogênicas discretas,

hialinas, de paredes ásperas, únicas, 2,5–4,0
ÿm de altura e 8,5–14,0 ÿm de comprimento

Conídio fusoide, elipsoide, reto a ligeiramente

curvo

4 septos

20-27 ÿm de comprimento.

2–3 (principalmente 3)

Marrom

os resultados são consistentes com os descritos por Maharachchikumbura

A nova espécie descrita neste estudo foi denominada N. eucalypti.

As análises filogenéticas das sequências TUB e TEF mostraram que
N. eucalypti forma um clado distinto com suporte bootstrap de 96%.
N rosae

50–60 mm

Branco

Conidiomas, globosos, solitários,

massas de conídios semi-imersas, pretas,
exsudativas e marrom-escuras
para preto

Conidióforos indistintos, frequentemente

reduzido a células conidiogênicas

Células conidiogênicas discretas,

cilíndricas, hialinas, de paredes lisas, únicas,
com ápice truncado com espessamento
periclinal visível, 2–5 x 5–18 ÿm de comprimento

Conídio fusoide, elipsoide, reto a ligeiramente

curvo

4 septos

20–31 ÿm de comprimento

3–5

Castanho claro a escuro

N. eucalipto

50–70 mm

Branco

Conidiomas acervulares ou picnidiais, globosos,

solitários ou agregados, semi ou
parcialmente imersos e totalmente
imersos, pretos, 100–500 ÿm de
diâmetro; exsudando conídios globosos,
viscosos e pretos
massas

Conidióforos indistintos, frequentemente

reduzido a células conidiogênicas

Células conidiogênicas discretas,

hialinas, de paredes ásperas, únicas,
1,5–4,5 × 9,0–20,5 ÿm

Conídio fusoide, elipsoide, reto a ligeiramente

curvo

4 septos

12–27 ÿm de comprimento

2–4

Marrom claro

A morfologia versicolor dos conídios, que é característica

tic do gênero Neopestalotiopsis, corrobora os resultados da
análises moleculares. Neste estudo, tanto os conidiomas quanto os conídios
desenvolvido em PDA apresentou características semelhantes em relação ao
outras espécies descritas. No entanto, nenhum marcador morfológico foi
encontrado que poderia diferenciá-lo das outras espécies dentro do
gênero.

As espécies N. australis, N. rosae e N. eucalypti foram patogênicas

gênico ao eucalipto. Os isolados N. eucalypti (PA3) e N. austra
lis (PA5) apresentou agressividade semelhante e superior aos demais
isoladas no teste de patogenicidade. Os outros isolados não diferiram
do controle, no entanto, apresentou lesão interna e externa em
caule de eucalipto, indicando que esses isolados são menos agressivos em
eucalipto. Além da lesão no caule da estaca, o fungo
foi observada no pecíolo da planta, indicando que o fungo pode
migram através dos vasos condutores da planta e causam
sões em pontos distantes de inoculação. Devido a esses resultados, seria
seria interessante realizar uma avaliação mais abrangente do
população de patógenos para determinar se há mais espécies patogênicas
e avaliar a variabilidade na virulência dentro deste complexo
de espécies.
Os sintomas observados em plantas doentes eram típicos de doenças
FIGURA 6 Extensão das lesões causadas por Neopestalotiopsis spp. em
doenças causadas por fungos oportunistas. Lesões iniciadas nos locais
estacas de eucalipto . As barras indicam o erro padrão da média.
onde foram podados os ramos laterais, demonstrando que
Os valores médios com a mesma letra minúscula (comprimento da lesão
externa) e maiúscula (comprimento da lesão interna) não diferem a penetração do patógeno ocorreu indiretamente por meio dessas lesões
significativamente de acordo com o teste de Scott-Knott (1974) (p < 0,05 ) ries. Esse padrão de infecção é semelhante ao observado em eucalipto
Machine Translated by Google
SANTOS e outros. 321
ÿÿ |

bj
6
12 podridão da miniestaquia (Alfenas et al., 2009). No entanto, no presente estudo,

a doença foi observada em estacas mais velhas após a propagação clonal

processo de ção e em condições ambientais menos favoráveis à

o patógeno. Assim, acredita-se que esse patógeno, que foi ini

considerados oportunistas, devem ser mais estudados, juntamente

com a epidemiologia da doença.

Os resultados obtidos e apresentados neste estudo ajudarão na

aumentar nosso conhecimento sobre as doenças causadas por espécies no

Gênero Neopestalotiopsis em plantas lenhosas. Além disso, pode haver

muitas outras espécies crípticas dentro da família Amphisphaeriaceae. Para

eucalipto, a doença tem se mostrado causada por um complexo

de pelo menos três espécies, e N. australis e N. rosae , bem como uma nova

espécies denominadas N. eucalypti foram relatadas pela primeira vez.

RECONHECIMENTOS

Os autores agradecem à Agência Federal de Apoio e Avaliação

de Pós-Graduação (Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior - CAPES), Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq), e o Minas

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Gerais

do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG) pelo financiamento.

ORCID

Maria A. Ferreira

REFERÊNCIAS
https://orcid.org/0000-0001-9401-7142

Alfenas, AC, Zauza, EAV, Máfia, RG, & Assis, TF (2009). Clonagem e doenças do
eucalipto (2ª ed., p. 500). Viçosa, Brasil: UFV.
Alvares, CA, Stape, JL, Sentelhas, PC, de Moraes, GJL, & Sparovek, G. (2013). Mapa
de classificação climática de Köppen para o Brasil. Meteorologische Zeitschrift,
22(6), 711–728. https://doi. org/10.1127/0941-2948/2013/0507

Carbone, I. & Kohn, LM (1999). Um método para projetar conjuntos de primers para
estudos de especiação em ascomicetos filamentosos. Mycologia, 91(3), 553-556.

Crous, PW, Verkley, GJM e Groenewald, JZ (2009). Biodiversidade fúngica (Vol. 1, p.

269). Utrecht, Holanda: Centraalbureau voor
Schimmelculturas.
Debbab, A., Aly, AH, & Proksch, P. (2013). Fungos endofíticos derivados de manguezais
e percepção química e biológica. Diversidade de fungos, 61(1), 1–27. https://doi.org/
10.1007/s13225-013-0243-8 Farris, JS, Kallersj, M., Kluge, AG, &
Bult, C. (1994). Testando a significância da incongruência. Cladística, 10(3), 315–319.
https://doi. org/10.1111/j.1096-0031.1994.tb00181.x Glass, NL, & Donaldson, GC
Larget, B., & Simon, D. (1999). Algoritmos de Markov Chain Monte Carlo para a análise
bayesiana de árvores filogenéticas. Biologia Molecular e Evolução, 16(6), 750–759.

Maharachchikumbura, SSN, Guo, LD, Chukeatirote, E., Bahkali, H.

A., & Hyde, DA (2011). Pestalotiopsis – Morfologia, filogenia, bioquímica e
diversidade. Diversidade fúngica, 50, 167–187. https://doi. org/10.1007/
s13225-011-0125-x Maharachchikumbura,
SSN, Guo, LD, Lei Cai, L., Chukeatirote, E., Wu, PW, Sun, X., … Hyde, KD (2012). Uma
árvore espinhal multilocus para Pestalotiopsis, com uma caracterização polifásica
de 14 novas espécies. Diversidade de fungos, 56, 95–129. https://doi.org/10.1007/
s1322 5-012-0198-1

Maharachchikumbura, S., Hyde, KD, Groenewald, JZ, Xu, J., & Crous, PW (2014).
Pestalotiopsis revisitada. Estudos em Micologia, 79, 121–186. https://doi.org/
10.1016/j.simyco.2014.09.005
Murali, TS, Thirunavukkarasu, N., Govindarajulu, MB e Suryanarayanan, TS (2013).
Comunidades fúngicas de cascas menos sintomáticas de árvores tropicais.
Mycosphere, 4(3), 627-637. https://doi. org/10.5943/mycosphere/4/3/15

O'Donnell, K., Kistler, HC, Cigelnik, E., & Ploetz, RC (1998). Múltiplas origens evolutivas
do fungo causador da doença do Panamá da bananeira: evidências concordantes
de genealogias de genes nucleares e mitocondriais. Proceedings of the National
Academy of Sciences of United States of America, 95(5), 2044–2049. https://doi.org/
10.1073/pnas.95.5.2044 _

Rayner, RW (1970). Uma cartela de cores micológica. Kew, Surrey:

Instituto Micológico da Commonwealth.
Reddy, MS, Murali, TS, Suryanarayanan, TS, Govindarajulu, M.
B., & Thirunavukkarasu, N. (2016). Espécies de Pestalotiopsis ocorrem como
endófitos generalistas em árvores das florestas de Ghats Ocidentais no sul da
Índia. Ecologia fúngica, 24, 70–75. https://doi.org/10.1016/j. funeco.2016.09.002

Ronquist, F., Teslenko, M., Van Der Mark, P., Ayres, DL, Darling, A., Höhna, S., …
Huelsenbeck, JP (2012). MrBayes 3.2: Inferência filogenética bayesiana eficiente e
escolha de modelo em um grande espaço de modelo. Biologia Sistemática, 61(3),
539–542. https://doi. org/10.1093/sysbio/sys029 Sangkyu, P., Seung-Yeol, L., Jae-
Jin, L., Chang-Gi, B., Leonid, T.,
Burm, L.
H., & Hee-Young, J. (2016). Primeiro relato de Neopestalotiopsis australis isolado
de solo na Coréia. Journal of Mycology, 44, 360–364. https:// doi.org/10.4489/
KJM.2016.44.4.360
Scott, A. & Knott, M. (1974). Método de análise de cluster para agrupar meios
na análise de variância. Biometria, 30, 507–512.
Swofford, DL (2002). Paup: Análise filogenética usando parcimônia, versão 4.0b10.
Sunderland, Reino Unido: Sinauer.
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., & Kumar, S. (2013).
Mega6: Análise de genética evolutiva molecular versão 6.0.
Biologia Molecular e Evolução, 30, 2725–2729.
Thompson, JD, Higgins, DG e Gibson, TJ (1994). CLUSTAL W: melhorando a
sensibilidade do alinhamento progressivo de múltiplas sequências por meio de
ponderação de sequência, penalidades de lacunas específicas de posição e escolha
(1995). Desenvolvimento de conjuntos de primers
da matriz de ponderação. Nucleic Acids Res., 22, 4673–4680. https://doi. org/
projetados para uso com PCR para amplificar genes conservados de ascomicetos
10.1093/nar/22.22.4673
filamentosos. Microbiologia Aplicada e Ambiental, 61(4), 1323–2133.

Hepperle, D. (2004). SeqAssem©: Uma ferramenta de análise de seqüência contig Como citar este artigo: Santos GS, Máfia RG, Aguiar AM,
assem bler e ferramenta de visualização de dados de rastreamento para seqüências e outros Podridão da haste de estacas de eucalipto causada por
moleculares. Versão Win32. Distribuído pelo autor via http://www.sequentix.de Neopestalotiopsis spp. no brasil. J Phytopathol. 2020;168:311–
Huelsenbeck, JP, & Ronquist, F. (2001). Mrbayes: Inferência bayesiana de árvores
321. https://doi.org/10.1111/jph.12894
filogenéticas. Bioinformática, 17(8), 754–755. https://doi. org/10.1093/bioinformatics/
17.8.754