Acadêmica: Cássia Cruz Luiz

Universidade Federal de Santa Catarina – Campus Araranguá

Programa de Pós-Graduação em Energia e Sustentabilidade – PPGES
Disciplina: Conversão Biológica de Biomassa em Biocombustíveis e Bioenergia
Análise Crítica 5
 Produção contínua de biohidrogênio a partir do hidrolisado de biomassa de
choupo por uma mistura bacteriana definida imobilizada em materiais
lignocelulósicos sob condições não estéreis
Departament of Chemical Engineering, Konkuk University, Seoul, 05029, Republic of Korea

1. RESUMO
Os biorresíduos lignocelulósicos são ricos em açúcares e podem ser utilizados na
produção de combustíveis ecológicos, como o hidrogênio. A biomassa de choupo está
disponível em grandes quantidades como um resíduo biológico rico em açúcar. Há poucos
estudos que avaliam a produção de hidrogênio em culturas bacterianas mistas bem
definidas em condições de cultura contínua não estéreis. Essas culturas mistas definidas
são compostas por bactérias altamente produtoras de hidrogênio. O que se torna inédito
neste estudo é a produção contínua de hidrogênio a partir de biomassa de choupo em
mistura bacteriana definida e imobilizada sob condições não estéreis. Sob condições
otimizadas de cultura contínua no coco, um rendimento de 2,83 mol/mol constante de
hexose foi obtido ao longo de um período de 40 dias, que foi quatro vezes maior em
comparação com o obtido com Bacillus thuringiensis. Essa abordagem pode permitir
atender a crescente demanda por combustíveis mais limpos em escala constante.

2. OBJETIVO
O objetivo desse estudo é desenvolver culturas eficientes para produção de
hidrogênio (H2) a partir de biomassa de choupo em modo contínuo por meio de DMC
(Defined Mixed Cultures) imobilizado. A imobilização de DMC em biorresíduos
lignocelulósicos de coco foi mais benéfica para produção de H2 sob condições de cultura
contínua em comparação com células de flutuação livre e culturas imobilizadas com
Bacillus thuringiensis. Esse estudo demonstrou que um hidrolisado de biomassa de
choupo pode ser usado diretamente como alimentação para obter alto rendimento de H2
e melhorar a estabilidade do processo. É o primeiro estudo a relatar alto rendimento de
biomassa de choupo em modo contínuo usando imobilizado DMC em condições não
estéreis. Espera-se que tais resultados contribuam para atender a demanda de produção
de H2 mais limpa, reduzindo a carga de poluição e gerenciando resíduos biológicos.
 3. IMPORTÂNCIA
A dependência por combustíveis fósseis como fonte de energia vem sendo
insustentável ao longo dos últimos anos devido a oferta limitada e graves impactos
negativos sobre o meio ambiente de tais recursos. Com isso, o foco nos combustíveis
fósseis vem sendo substituído para fontes de energia renováveis, como microrganismos
capazes de fermentar resíduos biológicos para produzir energia. Esse método de produção
de energia vem recebendo atenção ultimamente. Um benefício adicional da fermentação
microbiana é a remoção de resíduos biológicos que são gerados em grandes quantidades,
aliviando as dificuldades enfrentadas pelos departamentos de meio ambiente e saúde na
gestão de resíduos.
Diversas pesquisas tem sido realizadas para desenvolver alternativas de fontes
renováveis. Dentre as várias fontes de combustível que podem ser produzidos por meio
de atividades microbianas, a produção de hidrogênio biológico prova ser superior devido
à sua alta eficiência e natureza ecológica. Ao contrário da maioria dos combustíveis, a
combustão de H2 não leva a liberação de nenhum poluente, portanto foi reconhecida
como uma abordagem sustentável altamente promissora para geração de energia.
 4. DESCRIÇÃO DO EXPERIMENTO
As cepas bacterianas utilizadas no estudo foram B. cereus, B. pumilus, B.
thuringiensis, Bacillus spp, K aerogenes e Proteus mirabilis. Foram cultivas em caldo de
nutrientes a 37°C com agitação a 200 rpm durante 24h. As células foram colhidas por
centrifugação a 4000 rpm por 30 min a 4°C e lavada duas vezes.
Para o pré-tratamento, foi utilizado 100g de biomassa suspensos em 600ml de
solução de H2SO4 em uma proporção de sólido para liquido de 1:6. A biomassa foi
separada foi filtração, lavada com água para remover excesso de produtos químicos e os
subprodutos de biomassa foram dissolvidos a seco em um forno. Então, foi realizado
hidrólise do material e a mistura foi incubada a 45°C durante 48h agitando a 150 rpm. O
hidrolisado continha aproximadamente 20g/L de açúcares redutores totais (1,0g de
biomassa equivalente a 0,4g de açúcares).
As cepas bacterianas foram usadas em culturas puras para produção de H2. O
conteúdo da célula em repouso era determinado por hidrólise alcalina seguida de
estimativa de proteína pelo método Lowry.
Para produção de H2 em lote, foram inoculados 250 ml de hidrolisado de biomassa
de choupo com 20g/L de concentração total de açúcar com 10 mg de proteína em frascos
reagentes não estéril. Em cada reator, o pH foi verificado e ajustado diariamente para 7,0
utilizando NaOH ou HCl, seguido de lavagem com gás argônio para manter condições
anaeróbicas. Os gases liberados na fermentação foram coletados usando o método de
deslocamento de água e analisados até que a produção de H2 cessou.
Diferentes concentrações de açúcares foram preparadas diluindo o hidrolisado de
biomassa em água da torneira não estéril e usando-a como alimento para produção de H2.
Para avaliar a influência dos nutrientes, o hidrolisado de biomassa foi misturado
com três meios diferentes: meio mineral, meio de crescimento e levedura e meio de
extrato de malte. As concentrações finais dos diferentes meios foram de 0,05, 0,1, 0,5 e
1,0X com uma concentração de açúcar de 2,5g/L. Os hidrolisados de biomassa
suplementados com meio foram usados para produzir H2.
O aumento de escala da produção de H2 com DMC foi realizado usando volumes
de trabalho de 0,75, 1,5 e 4L de alimentação em reatores de 1, 2 e 5L usando hidrolisado
de biomassa a uma concentração de açúcar de 2,5 g/L suplementado com o terceiro tipo
de meio citado anteriormente.
Coir de coco (CC) e casca de amendoim foram secos e usados para imobilizar a
bactéria utilizada pelo método de absorção. Frascos de 1L de volume foram preenchidos
com 800ml contendo 15% de suporte preenchidos com hidrolisado diluído com 2,5g/L de
açúcares totais suplementados com o terceiro tipo de meio utilizado. A produção de H2
de cultura contínua foi conduzida com um tempo de retenção hidráulica de 4 dias durante
um período equivalente a 10 ciclos a 37°C. Todas as operações foram realizadas em
condições não estéreis. Alimentação sem inóculo foi usada como controle. Toda a
operação foi conduzida em condições não estéreis.
Um ensaio de atividades foi conduzido para determinar a celulase usando p-
nitrofenil-b-glucopiranosídeo como substrato. O método de deslocamento de água foi
usado para medir o biogás gerado e a composição foi analisada usando gás cromatografia
equipada com um detector de condutividade térmica usando argônio como gás de arraste.
A concentração de ácidos graxos voláteis foi analisada através da casca de amendoim
usando detector de ionização de chama. A concentração de açúcar foi medida usando o
método de ácido dinitrosalicílico. O rendimento de H2 foi calculado com base no açúcar
usado. Todos os experimentos foram realizados em triplicata, e a significância estatística
foi determinada por meio de análise de variância.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A produção biológica de H2 foi amplamente relatada usando culturas bacterianas
puras com diferentes açúcares como substrato primário. Para alcançar a produção de H2
acessível, biorresíduos têm sido sugeridos como uma alimentação alternativa aos
açúcares puros. Esses materiais são de natureza complexa e as culturas puras são
incapazes de metaboliza-los completamente. Vários métodos enzimáticos e microbianos
foram avaliados para produzir açúcares a partir de resíduos lignocelulósicos. Os métodos
enzimáticos são bastante eficientes e resultam em altos rendimentos de açucares totais.
Por ser caro o método utilizando enzimas, é desejável explorar a capacidade das bactérias
de produzirem enzimas com alta atividade hidrolítica. Em uma pesquisa se obteve como
resultado rendimentos de H2 na faixa de 0,70 e 1,72 mol/mol de hexose usando inóculo
enriquecido com bactérias indefinidas como produtores de H2 em lote e condições de
cultura contínua. O uso de DMC combinado com imobilização é esperado para aumentar
os rendimentos de H2. Em trabalhos anteriores, açúcares puros foram usados como
alimentos para definir o potencial de produção de H2 em bactérias. Os estudos
subsequentes focaram em: i) biorresíduos facilmente biodegradáveis como alimentação;
ii) uso de culturas bacterianas hidrolíticas definidas em associação com produtores de H2
em um processo de duas fases. O foco deste estudo foi desenvolver a produção de H2
usando DMC imobilizado sob regime de cultura contínua.
A produção de H2 a partir de hidrolisado de biomassa em cultura pura, com um
hidrolisado contendo 20g/L de açúcares totais produzidos foi obtido 125 e 400ml de H2
de 250 ml de alimento após a digestão por um período de 5 dias. A composição do biogás
variou de acordo com a cepa bacteriana utilizada, contendo 21,6 e 58,9% de H2 com um
eficaz rendimento de 0,21 e 0,67 mol de H2 / mol de hexose. O bioprocesso foi
considerado eficiente e metabolizado 92,6 e 96,3% do açúcar presente na ração.
Alimentar sem inóculo não mostrou qualquer produção de H2 em condições semelhantes.
Um estudo anterior mostrou que K. aerogenes produz apenas 0,39 mol de H2/mol de
hexose sob condições de cultura em lote, apesar da completa metabolização de açúcares
presentes no hidrolisado de madeira. A cultura de B. subtilis e Clostridium pasteurianum
rende apenas 0,33 mol de H2/mol de hexose apesar de consumir 70 g/L de hidrolisado de
bagaço da cana, ou seja, teor de açúcar 3,5x maior em comparação com o presente estudo.
A taxa de produtividade máxima de H2 usando B. thuringiensis foi de 35,6 ml/L, que é
quase duas vezes superior ao relatado para uma combinação de Escherichia e hidrolisado
de palha de trigo. Essas observações indicam que o potencial de produção de H2 de
diferentes cepas são inerentemente variáveis.
 Diferente das cepas bacterianas individuais, o DMC é composto por seis cepas
que resultaram na produção de 780ml de H2, que foi 1,9 vezes superior ao melhor
rendimento de H2 obtido usando culturas puras. O rendimento de H2 de 1,30 mol de
hexose indica que algumas cepas bacterianas trabalham em harmonia com os produtores
de H2. No presente estudo, a produção de H2 utilizando DMC parece ser mais eficaz do
que se relatou em culturas mistas indefinidas usando bioresíduos mistos. As interações
sinérgicas entre Bacillus, Klebsiella e Proteus em DMC mostraram-se eficazes para
aumentar o rendimento de H2 em comparação com outras culturas puras. Em 56
combinações de culturas mistas de duas a cinco bactérias, os rendimentos de H2 variam
de 0,25 a 1,12 mol de hexose. Nesse estudo o DMC selecionado foi usado sob condições
não estéreis para produção de hidrogênio a partir da biomassa de choupo. A abordagem
teve como base nas interações sinérgicas operando em seleção natural competitiva entre
diferentes culturas bacterianas.
Como o DMC provou ser um inóculo melhor do que individual de cepas, o
próximo objetivo do estudo foi estudar o efeito da concentração de alimento na produção
de H2. O hidrolisado obtido após o pré-tratamento da alimentação foi diluído para
diferentes concentrações tais que a razão alimento-micróbio diminuiu. Pode-se concluído
que a proporção ideal de 1:7 alimento-micróbio levou a concentração de açúcar ideal para
produção de H2 e que 2,21 mol de H2 de hexose é um rendimento significativamente
maior do que o obtido anteriormente.
Outro parâmetro que pode influenciar a produção de H2 é presença de nutrientes
na ração. Em diferentes meios, também é observado a influência na produção de H2.
Entre esses meios, o YMG foi o mais eficaz, com concentrações de 1,0, 0,5, 0,1 e 0,05X
com rendimentos de 2,14, 2,47, 2,39 e 2,59 mol respectivamente, com utilização quase
completa de açúcar em meio YMG 0,1X. Nesse estudo, o rendimento máximo de H2 foi
4,9 vezes maior em comparação com o obtido anteriormente. É possível concluir que uma
concentração muito baixa, como 0,05X, é eficaz, embora o maior rendimento de H2 foi
obtido na concentração de 0,1X.
Uma abordagem para demonstrar a eficiência e acessibilidade de bioprocessos é
seu aumento de escala. As observações relatadas antes na produção de H2 correspondeu
a 0,25L de alimentação. Ampliando o processo de 3 a 16 vezes resultou-se em
rendimentos consistentes e maiores. Logo, é possível aumentar a escala do processo com
uma eficiência razoável.
A digestão contínua da cultura de biorresíduos para gerar H2 é recomendada para
alcançar uma produção consistente e fornecimento regular em grande escala. A principal
limitação na cultura contínua no reator é a drástica eliminação das células, resultando em
um rápido declínio de H2.
De forma resumida, o DMC provou ser eficaz na utilização de biomassa de choupo
hidrolisado para produção de H2 em modo de cultura contínua sob condições não estéreis.
O aumento de escala para o volume de alimentação de 4,0 L resultou em rendimentos
comparáveis com aqueles observados em uma escala menor (250ml), demonstrando ainda
mais potencial do sistema para produção de H2 em grande escala.
 6. CONCLUSÃO
O estudo demonstra a influência benéfica do DMC composto por Klebsiella,
Bacillus e Proteus para melhorar a produção de hidrolisado de biomassa de choupo em
ambiente não estéril em comparação com culturas puras. A evidência inicial foi a
produção de H2 6,2 vezes maior em comparação com o das cepas puras correspondentes
sob condições de lote. Sob cultura contínua, a imobilização de DMC permitiu uma
produção de H2 4,0 vezes maior em comparação com B. thuringiensis como o melhor
produtor de cultura pura. O uso de biorresíduos ajuda a produzir combustível mais limpo
e contornar o problema do descarte de resíduos e questões de gerenciamento de maneira
ecologicamente correta.

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Foi percebido uma certa repetição na apresentação das conclusões. Na parte de

resultados o autor já faz uma breve conclusão, colocando a eficiência do estudo em
evidência.