TESE 2018 Babesia Caballi

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia caballi

E Theileria equi EM EQUÍDEOS DO ESTADO DE MATO
GROSSO.
Fabio Bernardo Schein
CUIABÁ – MT
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia caballi

E Theileria equi EM EQUÍDEOS DO ESTADO DE MATO
GROSSO.
Autor: Fabio Bernardo Schein

Orientador: Prof. Dr. Richard de Campos Pacheco
Co-Orientador: Profa. Dra. Rísia Lopes Negreiros
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Ciências Veterinárias, área de concentração: Sanidade Animal,
da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal
de Mato Grosso para a obtenção do título de Doutor em
Ciências Veterinárias.
CUIABÁ - MT
2018
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
S319i Schein, Fabio Bernardo.

INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia
caballi E Theileria equi EM EQUÍDEOS DO ESTADO DE
MATO GROSSO / Fabio Bernardo Schein. -- 2018
116 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientador: Prof. Dr. Richard de
Campos Pacheco. Co-orientador:
Dra. Rísia Lopes Negreiros.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Mato Grosso,
Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária, Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Cuiabá, 2018.
Inclui bibliografia.
1. Piroplasmose equina. 2. Brasil. 3. Fatores

associados ao risco. 4. Análise filogenética. I. Título.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.

DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha família

pela compreensão e apoio durante este
período bastante atribulado de minha
vida.
Aos meus pais que sempre me
incentivaram, destacando a importância
da continuidade dos estudos, da
atualização e da contradição entre a
certeza crescente de nossa infinita
ignorância frente à busca constante pelo
saber.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me fortalecido em todos os momentos desta

caminhada, quando pensava não ter mais forças para continuar era Ele quem me
renovava.
Em especial, agradeço a minha esposa e minhas filhas pelo apoio nos

momentos difíceis, pelo incentivo, pelo auxílio, e principalmente pela compreensão
que tiveram nos momentos em que estive ausente.
Agradeço imensamente ao meu orientador, Professor Dr. Richard de Campos

Pacheco pela orientação, pelo incentivo, pelo apoio, pela dedicação, pelas
cobranças, pela franqueza, por todos os momentos que certamente fizeram parte do
meu aprendizado e serão inesquecíveis por toda minha vida.
Agradeço as colegas e amigas Rute Witter, Thábata dos Anjos Pacheco e

Maerle Oliveira Maia pelo apoio com o experimento.
Agradeço aos professores Dr. Luciano Nakazato e Dra. Valéria Dutra pela
colaboração.
Agradeço ao amigo e colega MSc. Marcelo Barros pelo apoio com o banco de
dados durante este trabalho. A todos os colegas do Instituto de Defesa Agropecuária
do Estado de Mato Grosso que colaboraram com este projeto, em especial, com
muito carinho, a Ex-Presidente MSc. Maria Auxiliadora Rocha Diniz e a minha Co-
Orientadora Dra Rísia Lopes Negreiros por compartilharem as amostras utilizadas
neste experimento.
Agradeço a ex-estagiária Maicslayne Azevedo pelo apoio com a pesagem das

amostras.
Agradeço ao amigo, colega e chefe, professor Dr. Lázaro Camargo e a todos

os colegas pelo apoio e compreensão para que esta etapa pudesse ser realizada.
Agradeço a colega Livia Saab Muraro pela ajuda com a extração de algumas
amostras.
Agradeço ao professor Anderson C.S. Oliveira, Elianara Martins de Almeida e
aos demais do Departamento de Estatística da Universidade Federal de Mato
Grosso que colaboraram com este trabalho.
Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso pelo

apoio financeiro (Processo número: 223183/2015), sem o qual este trabalho não
poderia ser realizado.
Por fim, agradeço a todos que de forma direta ou indireta contribuíram para
realizar este trabalho.
EPÍGRAFE
“Jamais deixe o que é importante na vida para realizar o que é urgente.”

Autor desconhecido.
RESUMO
INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia caballi E Theileria equi EM

EQUÍDEOS DO ESTADO DE MATO GROSSO.
A piroplasmose equina é uma doença transmitida por carrapatos, causada pelos

hemoprotozoários Theileria equi e Babesia caballi. Tem importância econômica
devido ao impacto no movimento internacional de cavalos para o comércio e para a
participação em eventos. O objetivo deste estudo foi pesquisar a distribuição da T.
equi e da B. caballi em equídeos do estado de Mato Grosso, por meio de métodos
moleculares, e identificar fatores de risco associados à positividade, além de avaliar
a diversidade genética dos agentes. Foram examinados 1624 equídeos, distribuídos
em 973 propriedades, e os dados epidemiológicos de cada animal e propriedade. A
identificação dos piroplasmídeos foi realizada pela reação em cadeia da polimerase
(PCR), por meio da amplificação de um fragmento do gene EMA-1 (Erythrocyte
merozoite antigen 1) de T. equi () e de um fragmento do gene RAP-1 (Rhoptry
associated protein-1) de B. caballi. Para caracterização molecular e estudos
filogenéticos, foram utilizadas 13 e 60 sequências dos genes RAP-1 e EMA-1,
respectivamente, para construção de um dendograma utilizando máxima parcimônia.
A prevalência molecular da infeção por B. caballi em animais foi de 2,74%, e de T.
equi foi de 25,91%. Na análise das variáveis, equídeos criados no Pantanal tem
menos chance de serem infectados por B. caballi e T. equi em 2,9% e 19,65%
respectivamente. Animais com idade entre 6 meses a 2 anos e 11 meses
apresentaram 1,20 vezes mais chance de serem infectados pela T. equi, enquanto
animais com idade acima de 10 anos apresentaram 10,08% menos chance de
estarem infectados por T. equi. A prevalência de propriedades positivas foi de
4,11%, para B. caballi e de 28,16% para T. equi. A localização da propriedade no
bioma Pantanal, fez com que diminuísse a chance de ser positiva para T. equi em
56,23%, e as propriedades que utilizavam os equídeos para a realização do serviço
da fazenda tinham menos chance de terem animais infectados por T. equi em
83,02%. Na análise filogenética, as sequências de B. caballi apresentaram
variabilidade intraespecífica de 1,95%, contrastando com 2,99% em T. equi, contudo
não nos permitiram distinguir os subgrupos relacionados aos diferentes biomas. A
piroplasmose equina ocorre em todo o estado de Mato Grosso, com maior
prevalência, de ambos os agentes, em animais e em propriedades no bioma
Amazônico, seguida do Cerrado e do Pantanal.
Palavras chave: Análise filogenética, Brasil, fatores associados ao risco, Brasil

piroplasmose.
ABSTRACT
INFECTION AND GENETIC DIVERSITY OF Babesia caballi AND Theileria

equi IN EQUINES, MATO GROSSO, BRAZIL.
Equine piroplasmosis is a tick-borne disease caused by the hemoprotozoa Theileria

equi and Babesia caballi. It has economic importance due to the impact on the
international movement of horses for trade and for participation in events. The aim of
this study was to investigate the distribution of T. equi and B. caballi in equidae from
the Mato Grosso state, by molecular methods to identify risk factors associated with
positivity and to evaluate the genetic diversity of the agents. We examined 1624
equidae, distributed in 973 farms, and the epidemiological data of animal and
property. Polymerase chain reaction (PCR) was identified by amplification of a
fragment of the EMA-1 (Erythrocyte merozoite antigen 1) gene of T. equi gene () and
a fragment of the RAP-1 (Rhoptry associated protein-1) gene () of B. caballi. For
molecular characterization and phylogenetic studies, 13 and 60 sequences of the
RAP-1 and EMA-1 genes, respectively, were used to construct a dendogram using
maximum parsimony. The molecular prevalence of B. caballi infection in animals was
2.74%, and T. equi was 25.91%. In the analysis of the variables, equidae raised in
the Pantanal are less likely to be infected by B. caballi and T. equi in 2.9% and
19.65% respectively. Animals aged 6 months to 2 years and 11 months presented a
1.20 times greater chance of being infected by T. equi, while animals older than 10
years presented 10.08% less chance of being infected by T. equi. The prevalence of
positive properties was 4.11% for B. caballi and 28.16% for T. equi. The location of
the property in the Pantanal biome decreased the chance of being positive for T. equi
in 56.23%, and the properties that used equidae to perform the farm service were
less likely to have T. equi infected animals .equi in 83.02%. In the phylogenetic
analysis, B. caballi sequences presented intraspecific variability of 1.95%, contrasting
with 2.99% in T. equi, but they did not allow us to distinguish the subgroups related to
the different biomes. Equine piroplasmosis occurs in the state of Mato Grosso, with
higher prevalence of both agents, in animals and in properties in the Amazon biome,
followed by the Cerrado and the Pantanal.
Key words: Phylogenetic analysis, Brazil, risk factors

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Número de propriedades e número de equídeos por biomas no

estado de Mato Grosso, Brasil........................................................ 46
Tabela 2 Número de propriedades por quantitativo de equídeos no estado
de Mato Grosso, Brasil ................................................................... 47
Tabela 3 Número de animais e de propriedades amostrados por bioma no
estado de Mato Grosso, Brasil........................................................ 48
Tabela 4 Prevalência da infecção por Babesia caballi e Theileria equi
identificada pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e
número absoluto de animais positivos, de acordo com o bioma de
origem do animal no estado de Mato Grosso, Brasil ...................... 55
Tabela 5 Resultados da análise univariada dos possíveis fatores
associados ao risco para animais positivos para Babesia caballi e
animais positivos para Theileria equi no estado de Mato Grosso,
Brasil ................................................................................................ 56
Tabela 6 Estimativas para o modelo de regressão logística, considerando
as variáveis selecionadas pelo teste qui-quadrado para a infecção
de equídeos do estado de Mato Grosso, Brasil pela Babesia
caballi............................................................................................... 57
as variáveis selecionadas pelo teste qui-quadrado para a infecção
de equídeos do estado de Mato Grosso, Brasil pela Theileria equi 57
Tabela 8 Resultados da análise univariada dos possíveis fatores
associados ao risco para propriedades com no mínimo um animal
positivo para infecção por Babesia caballi ou Theileria equi no
estado de Mato Grosso, Brasil......................................................... 60
Tabela 9 Estimativas para o modelo de regressão logística, considerando a
variável selecionada pelo teste qui-quadrado para propriedades
com equídeos infectados por Babesia caballi no estado de Mato
Grosso, Brasil................................................................................... 61
as variáveis selecionadas pelo teste qui-quadrado para as
propriedades com equídeos infectados por Theileria equi no 61
estado de Mato Grosso, Brasil.........................................................
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 A: Hemácia infectada por Babesia caballi (seta); B: Hemácia

39
infecatada por Theileria equi (seta)..............................................
Figura 2 Distribuição por bioma das propriedades analisadas no estado
de Mato Grosso, Brasil para identificação de animais positivos
para Babesia caballi ou Theileria equi pela Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR) .................................................................... 48
Figura 3 Distribuição por bioma das propriedades analisadas que tiveram
pelo menos um animal positivo para Babesia caballi, Theilieria
equi ou por ambos no estado de Mato Grosso, Brasil ................. 59
Figura 4 Distribuição das propriedades positivas e negativas para a
infecção de equídeos por Babesia caballi por bioma do estado
de Mato Grosso, Brasil ................................................................. 62
Figura 5 Estimador Kernel da densidade de propriedades positivas para
a infecção de equídeos por Babesia caballi no estado de Mato
Grosso, Brasil ............................................................................... 63
Figura 6 Estimador Kernel da densidade de propriedades negativas para
a infecção de equídeos por Babesia caballi no estado de Mato
Grosso, Brasil ............................................................................... 63
Figura 7 Função de correlação marcada da distribuição espacial das
propriedades positivas e negativas para a infecção de equídeos
por Babesia caballi no estado de Mato Grosso, Brasil ................. 64
Figura 8 Estimador Kernel do risco relativo da infecção por Babesia
caballi em equídeos das propriedades rurais do estado de Mato
Grosso, Brasil ............................................................................... 65
propriedades com equídeos positivos para Babesia caballi e o
valor da prevalência da infecção em propriedades rurais do
estado de Mato Grosso, Brasil ..................................................... 65
Figura 10 Distribuição das propriedades positivas e negativas para a
infecção por Theileria equi por bioma do estado de Mato
Grosso, Brasil ............................................................................... 66
Figura 11 Estimador Kernel da densidade de propriedades com equídeos
positivos para a infecção por Theileria equi no estado de Mato
Grosso, Brasil ............................................................................... 67
Figura 12 Estimador Kernel da densidade de propriedades com equídeos
negativos para a infecção por Theileria equi no estado de Mato
Grosso, Brasil ............................................................................... 67
propriedades com equídeos positivos e negativos para a
infecção por Theileria equi no estado de Mato Grosso, Brasil ..... 68
Figura 14 Estimador Kernel do risco relativo da infecção por Theileria equi
em propriedades rurais do estado de Mato Grosso, Brasil........... 69
propriedades com equídeos positivos para Theileria equi e o
valor da prevalência da infecção em propriedades rurais do
estado de Mato Grosso, Brasil ..................................................... 70
Figura 16 Dendograma inferido pelo método de máxima parcimônia
inferida a partir de sequências do gene RAP-1de Babesia
caballi. Os números nos nós são os valores de suporte para as
ramificações principais (bootstrap acima de 500 réplicas)............ 71
Figura 17 Dendograma inferido pelo método de máxima parcimônia
inferida a partir de sequências do gene EMA-1 de Theileria equi.
Os números nos nós são os valores de suporte para as
ramificações principais (bootstrap acima de 500 réplicas). .......... 72
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Dados mundiais de prevalência da infecção por Babesia caballi

e/ou Theileria equi detectada pela Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR)........................................................................... 25
Quadro 2 Casos de piroplasmose equina ocorridos no Brasil no ano de
2016 que foram notificados à World Organization for Animal
Health (OIE)..................................................................................... 26
Quadro 3 Espécies de carrapatos vetores ou suspeitos de serem vetores
da Babesia caballi e/ou da Theileria equi, localização geográfica
e número de hospedeiros necessários para seu desenvolvimento. 32
Quadro 4 Variáveis analisadas nos testes de associações como potenciais
fatores associados ao risco para os equídeos positivos para
Babesia caballi ou Theileria equi no estado de Mato Grosso,
Brasil .............................................................................................. 51
Quadro 5 Variáveis analisadas nos testes de associações como potenciais
fatores associados ao risco para propriedades com animais
positivos para Babesia caballi ou Theileria equi equina no estado
de Mato Grosso, Brasil.................................................................... 52
LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS
CEPEA Centro de Estudos Avançados em Economia Aplicada
CNA Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil
cELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática Competitivo
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática
FC Teste de Fixação de Complemento
IFI Imunofluorescência Indireta
INDEA Instituto de Defesa Agropecuária do Estado de Mato Grosso
IC 95% Intervalo de confiança de 95%
OIE Organização Mundial de Saúde Animal
OR Odds Ratio
PCR Reação em Cadeia pela Polimerase
RT-PCR Reação da transcriptase reversa seguida da reação em cadeia pela

polimerase
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 21
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 23
2.1 Definição, taxonomia e etiologia .............................................................. 23
2.2 Epidemiologia ............................................................................................ 24
2.3 Classificação molecular de Babesia caballi e Theileria equi.................. 27
2.4 Vetores e transmissão................................................................................ 29
2.5 Ciclo biológico ........................................................................................... 36
2.6 Manifestação clínica .................................................................................. 37
2.7 Diagnóstico ................................................................................................ 38
2.8 Tratamento ................................................................................................. 42
2.9 Prevenção .................................................................................................. 43
3 OBJETIVOS ................................................................................................... 44
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 45
4.1 Local de estudo .......................................................................................... 45
4.2 Cálculo amostral ........................................................................................ 45
4.3 Coleta e preservação das amostras ......................................................... 48
4.4 Extração de DNA, PCR e sequenciamento .............................................. 49
4.5 Análise Filogenética................................................................................... 50
4.6 Aplicação do questionário ........................................................................ 51
4.7 Análise estatística ...................................................................................... 52
4.8 Análise Espacial ......................................................................................... 53
5 RESULTADOS ............................................................................................... 55
5.1 Infecção por piroplasmídeos em animais ................................................ 55
5.2 Infecção por piroplasmídeos em propriedades rurais ........................... 58
5.3 Distribuição espacial das propriedades com animais infectados por
Babesia caballi ................................................................................................. 62
Theileria equi .................................................................................................... 66
5.5 Análise Filogenética .................................................................................. 70
6 DISCUSSÃO ................................................................................................... 73
7 CONCLUSÃO ................................................................................................. 78
REFERÊNCIAS ................................................................................................. 79
ANEXO 1 ........................................................................................................... 92
ANEXO 2 ........................................................................................................... 96
21
1 INTRODUÇÃO
A equideocultura brasileira é um importante segmento do agronegócio

nacional, pois os equídeos são criados para os mais diversos propósitos (tração,
transporte, trabalho e esporte), sendo indispensáveis para a permanência e
sobrevivência do homem no campo. O Brasil possui o terceiro maior rebanho
equino do mundo, que movimenta aproximadamente R$ 7,3 bilhões ao ano e
ocupam, diretamente, cerca de 640 mil pessoas. São 5,9 milhões de animais dos
quais 85% estão localizados nas propriedades rurais executando serviços de
apoio às atividades agropecuárias (BRASIL - CEPEA, 2016).
O crescimento da equideocultura no estado de Mato Grosso tem ocorrido
juntamente com o crescimento da pecuária de corte. Apesar de possuir o maior
rebanho de bovinos de corte do país, possui apenas o sexto maior rebanho de
equinos do Brasil, com aproximadamente 306.931 equinos em 53.710
propriedades distribuídas nos três biomas que compõem o estado: Amazônico,
Cerrado e Pantanal (BRASIL - CEPEA, 2016; BARROS, 2017).
A piroplasmose equina, causada por Theileria equi e Babesia caballi é uma
importante doença transmitida por carrapatos, que afeta equídeos em todo o
mundo e impacta de maneira significativa na indústria equídea (WISE et al.,
2013).
As taxas de infecção de equídeos domésticos pelos agentes da
piroplasmose equina em regiões endêmicas são muitas vezes acima de 60% e,
em algumas regiões, mais de 90% dos animais são infectados com um ou ambos
os protozoários. A maioria destes animais é persistentemente infectada sem
qualquer sinal de doença clínica. O movimento desses animais em regiões com
vetores competentes, os carrapatos, pode ser uma fonte de infecção para as
populações de cavalos suscetíveis. Estas condições são a base para a
disseminação desses protozoários. O aumento do trânsito internacional de
cavalos, o desenvolvimento de populações de carrapatos com maior resistência a
acaricidas químicos e as mudanças climáticas e de uso da terra, também são
fatores importantes que aumentam o risco de dispersão da infecção para regiões
22
livres. A má gestão das populações de equídeos, incluindo cuidados veterinários

inadequados, má nutrição e excesso de trabalho podem exacerbar os impactos da
infecção (SCOLES e UETI, 2015).
Dados de prevalência da piroplasmose equina no estado são escassos
(BARROS et al., 2015), sendo que no Brasil, estudos prévios utilizando métodos
sorológicos mostraram que a piroplasmose equina é endêmica, com prevalências
variando de 19,4% a 100% (KERBER et al., 1999; BALDANI et al., 2007; HEIM et
al., 2007; KERBER et al., 2009; SANTOS et al., 2011; MACHADO et al., 2012;
TORRES et al., 2012; VIEIRA et al., 2013; PROCHNO et al., 2014; FERREIRA et
al., 2016; GUIMARÃES et al., 2016; BRAGA et al., 2017).
Apesar da endemicidade da piroplasmose entre os equídeos no país,
estudos envolvendo a detecção molecular do(s) parasita(s) em animais
portadores (HEIM et al., 2007; BALDANI et al., 2010; PECKLE et al., 2013;
BARROS et al., 2015; FERREIRA et al., 2016; BRAGA et al., 2017) que, também
examinaram a diversidade genética dos parasitas (BRAGA et al., 2017; PECKLE
et al., 2018) são escassos.
O objetivo deste estudo é levantar a distribuição desses piroplasmídeos (T.
equi e B. caballi), por métodos moleculares em equídeos do estado de Mato
Grosso, identificar fatores de risco associados a positividade e avaliar a
diversidade genética intraespecífica.
23
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Definição, histórico, taxonomia e etiologia
A piroplasmose equina, também denominada babesiose, teileriose ou

nutaliose, é uma doença infecciosa que acomete equinos, mulas, burros e zebras,
sendo transmitida, primariamente, por carrapatos da família Ixodidae e
caracterizada por anemia hemolítica aguda. Os agentes causais são dois
hemoprotozoários do filo Apicomplexa, ordem Piroplasmida das famílias
Babesiidae e Theileriidae, Babesia caballi e Theileria equi, respectivamente
(MEHLHORN, SCHEIN, 1998; UILENBERG, 2006; ROTHSCHILD, 2013; WISE et
al., 2013; HABIBI et al., 2016; ZANET et al., 2017).
O gênero Babesia foi descoberto em 1888 por Babes, que identificou a
presença de microrganismos em eritrócitos de bovinos na Romênia e os associou
com a hemoglobinúria bovina (BABES, 1888). Em 1893, Smith e Kilborne
noearam o agente da febre do Texas nos Estados Unidos como Pyrosoma
bigeminum, e também demonstraram que tal agente havia sido transmitido por um
carrapato (SMITH e KILBORNE, 1893). Sugere-se que este foi o primeiro relato
da transmissão de um parasito protozoário por um artrópode. O nome
"piroplasma" foi usado porque os parasitos, após a multiplicação apresentam uma
forma que se assemelha ao formato de uma pera. Atualmente, o nome
piroplasmose ainda é utilizado para referirem-se as babesioses e as teilerioses
(UILENBERG, 2006).
O atual gênero Theileria sp. foi descrito por Laveran em 1901, ao identificar
um parasito intraeritrocitário em cavalos, que o denominou de Piroplasma equi.
(LAVERAN, 1901). Este parasito foi renomeado passando a ser chamado de
Nuttallia equi e, pouco depois foi novamente reclassificado como Babesia equi
(SCOLES e UETI, 2015). Em 1998, com base no seu ciclo de vida dentro do
carrapato, nos estádios linfocíticos no hospedeiro vertebrado, e por semelhanças
genéticas com outras espécies de Theileria, a espécie B. equi foi reclassificada
24
como Theileria equi por Mehlhorn e Schein (MEHLHORN e SCHEIN, 1988).

Entretanto, estudos filogenéticos indicaram que a T. equi possui características
dos gêneros Babesia sp. e Theileria sp., possivelmente colocando-a entre os dois
gêneros, o que sugere a criação de um novo gênero para a T. equi. (WISE, 2013;
SCOLES e UETI, 2015).
2.2 Epidemiologia
Os agentes da piroplasmose equina e seus vetores competentes, os

carrapatos, são endêmicos na maioria dos países com clima tropical e subtropical.
A epidemiologia da doença está diretamente relacionada com a densidade
populacional de equídeos infectados e com o número de carrapatos em uma
determinada área, o que resulta em um aumento no número de animais
infectados e, potencialmente, no surgimento da doença clínica (WISE et al.,
2013). O Quadro 1 apresenta dados mundiais de prevalência da piroplasmose
equina no mundo, detectados pela reação em cadeia da polimerase (PCR),
identificando as infecções por B. caballi e T. equi.
25
Quadro 1 - Dados mundiais de prevalência da infecção por Babesia caballi e/ou

Theileria equi detectada pela Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR).
Local Prevalência Autor
B. caballi T. equi
Israel - 26,4% STEINMANA et al., 2012
Jordânia 7,3% 18,8% QABLAN et al., 2013
Tunísia 1,92% 12,6% ROS-GARCIA et al., 2013
Tov province - Mongólia 44,8% 8,8% MUNKHJARGALET et al.,
2013
Venezuela 4,4% 3 61,8 ROSALES et al., 2013
Khuzestan – Iran - 28,5% BAHRAMI et al., 2014
North Khorasan Province 0% 45% ABEDI et al., 2014
– Iran
Costa Rica 27,7% 53,9% POSADA-GUZMÁN et al.,
2015
Centro-sul da Itália 10,3% 70.3% BARTOLOMÉ et al., 2016
19,3% 1e 36,4 % 1 e
Egito MAHMOUD et al., 2016
15,7%2 43,1 %2
Erzurum Turquia 0% 8,8% GUVEN et al., 2017
Legenda: 1 = cavalos 2 = burros 3 = Infecção mista (B. caballi e T. equi)
No mundo T. equi é mais prevalente que B. caballi, de acordo com a World

Organization for Animal Health (OIE), a América Central e do Sul, Cuba, África,
Ásia, o Oriente Médio e o Sul da Europa são considerados regiões endêmicas. Na
América do Sul, a doença é prontamente identificada em todas as regiões, com
exceção das áreas mais ao sul do Chile e da Argentina. A prevalência e
distribuição da infecção nas nações caribenhas são questionáveis, mas a
piroplasmose foi relatada na maioria das ilhas, incluindo Trinidad e Cuba. A
piroplasmose é generalizada na África e na Ásia, com a maior prevalência
relatada na África do Sul. Nem todos os países relatam casos identificados à OIE,
dificultando a compreensão precisa da distribuição atual desses protozoários. A
compilação de dados para uma lista de regiões atualmente não endêmicas é
difícil, devido à diferença na vigilância, nas restrições de importações e
exportações e da falha na notificação das doenças que ocorrem nos países
(WISE, 2013).
Os Estados Unidos da América são considerados livres de piroplasmose
equina pela OIE desde 1978, embora tenha ocorrido um caso em outubro de
2009, quando uma égua no condado de Kleberg, Texas, apresentou sinais
26
clínicos de piroplasmose, que foi confirmada por sorologia pelo Ensaio de

Imunoabsorção Enzimática Competitivo (cELISA), realizado pelo serviço
veterinário oficial. Todos os animais do rancho foram testados e 292 (81,1%) de
360 mostraram-se soropositivos para T. equi pelo mesmo teste (SCOLES et al.,
2011).
No ano de 2016, o Brasil notificou à OIE, 440 casos de piroplasmose
equina. Atualmente o site da OIE apenas informa que a doença está presente no
Brasil, mas sem dados quantitativos. O Quadro 2 compila os dados sobre o
número de animais diagnosticados com piroplasmose equina no Brasil e
informados à OIE no ano de 2016 por Estado da Federação.
Quadro 2 - Casos de piroplasmose equina ocorridos no Brasil no ano de 2016 que

foram notificados à World Organization for Animal Health (OIE).
Estado 2016
jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez
Distrito Federal - - - 1 1 4 1 1 - 1 1 -
Sergipe - - - - - 1 1 - - - - -
Paraíba - 1 - - - - - - - - - -
Paraná - - 1 24 - - 1 - - 7 - 1
Pernambuco - - - - - - - - - - 1 -
Rio de Janeiro - 1 - - - - - - 1 - 1 1
Santa Catarina - - - - 1 - - - - 1 1 -
São Paulo 35 38 35 33 - 33 33 42 34 42 30 30
Total 35 40 36 58 2 38 36 43 35 51 34 32
Fonte: Organização Mundial de Saúde Animal (OIE).
No Brasil, Ribeiro, Costa e Guimarães (1999), identificaram 60,4% de

soropositividade para Babesia equi (=T. equi), por meio da Imunofluorescência
Indireta (IFI), em amostras oriundas de animais de dez municípios do estado de
Minas Gerais. Em Araguari, ainda no mesmo estado, Heim et al. (2007)
identificaram 59,7% de positividade pela PCR para T. equi e 12,5% para B. caballi
em amostras de sangue provenientes de um abatedouro de equinos. No estado
do Paraná, Vieira et al. (2013) encontraram 78,3% de positividade para T. equi e
69,2% para B. caballi por meio do cELISA, sendo que 50% dos animais testados
foram positivos para ambos agentes.
27
Em São Paulo, Kerber et al. (2009) observaram 54,1% dos animais

amostrados positivos para B. caballi e 21,6% positivos para T. equi submetidos a
reação de fixação de complemento (FC) e cELISA. Na região da campanha do
estado do Rio Grande do Sul, Torres et al. (2012) identificaram prevalências de
anticorpos distintas para T. equi em um rebanho equino que convivia com bovinos
e compartilhava a mesma pastagem (90,9%), em relação a outro que não convivia
com bovinos (40,0%). Ainda, no estado do Rio Grande do Sul, Golynski et al.
(2008) avaliando a concordância entre os testes de ensaio de imunoabsorção
enzimática (ELISA) e IFI, encontraram prevalências de 31,6% e 31,8% para B.
equi (=T. equi). Em asnos (Equus asinus), no estado de São Paulo, Machado et
al. (2012) encontraram 73,86% de animais positivos para T equi pelo ELISA e
93,2% de positivos para B. caballi pela IFI, sendo que por meio da PCR
encontraram 31,81% de positividade para T equi e 20,45% de positividade para B.
caballi.
No estado da Paraíba, Ferreira et al. (2016) estudaram a prevalência de T.
equi em cavalos usados para vaquejada pela IFI e PCR, observando 59,60%
50,4% de positividade, respectivamente. Em São Luís, estado do Maranhão,
Braga et al. (2017), examinaram 139 equídeos (90 jumentos, 39 cavalos e 10
burros) e, identificaram pela PCR, 21,6% de positividade para T. equi e 55,4%
para B. caballi, e por ELISA identificaram 19,4% de positividade para T. equi e
25,2% para B. caballi.
No estado de Mato Grosso, Barros et al. (2015) detectaram pela PCR
0,82% (1/121) de positividade para B. caballi e 13,22% (16/121) de positividade
para T. equi em equídeos do Pantanal mato-grossense.
2.3 – Classificação molecular da Babesia caballi e Theileria equi.
Sistemas de classificação de organismos têm sido organizados desde a

antiguidade. A análise filogenética estima a relação entre os genes ou fragmentos
de genes inferindo sua história comum. A homologia é inferida quando duas
28
sequências apresentam maior similaridade do que poderia ser esperada se as

diferenças tivessem ocorrido ao acaso. Para construção de uma filogenia a partir
de uma sequência de nucleotídeos é necessário construir uma matriz de dados
baseada em um modelo de substituição de nucleotídeos (modelos evolutivos).
Para tanto, os métodos utilizados em filogenia molecular são baseados em
suposições de como o processo de evolução ocorreu. Essas suposições podem
estar implícitas, como no método de Máxima Parcimônia ou explícitas, como nos
Métodos de Distância e Máxima Verossimilhança. Eles descrevem as diferentes
possibilidades de mudança de um nucleotídeo para o outro, com o objetivo de
corrigir alterações invisíveis ao longo da filogenia (CALDART et al., 2016).
Nos Estados Unidos, Hall et al. (2013) buscando identificar diversidade
genética entre amostras de T. equi da América do Norte, observaram que todas
as amostras de T. equi identificadas no país agrupavam-se num único clado
monofilético baseado nas sequências do gene 18S RNAr. Entretanto, com o uso
de microssatélites, identificaram vários clones exclusivos que não eram
aparentes. Observaram maior diversidade genética nas amostras originárias do
estado do Texas que foram agrupadas em uma grande linhagem. As amostras
originárias da Geórgia foram agrupadas em uma subpopulação separada, distinta
do grupo do Texas, mas junto com uma amostra de Oklahoma, sugestivo de
terem fonte de infecção semelhante. As amostras originárias do Colorado,
Califórnia e Flórida não foram agrupadas com quaisquer outras sequências.
Concluíram que marcadores moleculares altamente variáveis tem a capacidade
de detectar pequenas alterações genéticas, sendo uma importante ferramenta
para o estudo da epidemiologia de doenças parasitárias, como no caso da
infecção pela T. equi. Embora a análise das sequências do gene 18S RNAr
tivesse identificado um único clado, sugerindo uma fonte limitada de introdução do
agente, com a utilização de microssatélites foi possível identificar que poucas
amostras eram, de fato, idênticas.
No Brasil, amostras positivas para B. caballi e T. equi, coletadas em um
abatedouro de equinos de animais oriundos dos estados de Goiás, Minas Gerais
e Bahia, analisadas por Heim et al. (2007) não apresentaram diferenças
29
intraespecíficas ou mesmo quando comparadas com as sequências disponíveis já

conhecidas.
Braga et al. (2017) analisaram sete sequências de T. equi e quatro de B.
caballi, com o objetivo de avaliar a diversidade genética destes piroplasmídeos
entre equídeos infectados da Ilha de São Luís, Maranhão, nordeste do Brasil e
identificaram de 99% a 100% de identidade com sequências de T. equi já
identificadas na Espanha, EUA e Brasil. As sequências de B. caballi,
apresentaram 99% de identidade com uma sequência de B. caballi já identificada
na Espanha.
Pekle et al. (2017) analisaram 20 sequências de T. equi, 10 oriundas de
equinos positivos do município de Petrópolis e dez oriundas de equinos positivos
do município de Seropédica no estado do Rio de Janeiro. Para este estudo,
utilizaram à amplificação completa do gene 18S RNAr de T. equi revelando a
presença de 12 sequências distintas de T. equi, que foram divididas em dois
clados. No primeiro clado 14 sequências brasileiras foram semelhantes com
sequências já identificadas na África do Sul, Sudão, Quênia e Estados Unidos. No
segundo clado, seis das 20 sequências brasileiras estudadas foram agrupadas
com sequências já identificadas na África do Sul, Espanha, Índia, Coréia do Sul e
Estados Unidos. Esta variação foi atribuída a história de chegada de equinos no
Brasil e a movimentação destes animais. Os autores afirmam que este fato
demonstra a dispersão de genótipos distintos de T. equi através de diferentes
continentes. Outra suposição proposta para a variação genotípica de T. equi são
os carrapatos, que carregam as formas sexuadas dos protozoários, sendo este
polimorfismo genético observado atribuído ao uso de diferentes hospedeiros
invertebrados no ciclo biológico da T. equi.
2.4 Vetores e transmissão
A transmissão da piroplasmose ocorre pela inoculação dos hemoparasitos

no sangue do hospedeiro vertebrado. A maneira mais comum é durante o
30
processo de hematofagia dos carrapatos vetores em seus hospedeiros

(MEHLHORN, SCHEIN, 1998; UILENBERG, 2006; WISE et al., 2013).
Apenas carrapatos ixodídeos são capazes de transmitir T. equi e B. caballi,
naturalmente. Na América do Norte, Dermacentor variabilis, Rhipicephalus
microplus e Amblyomma cajennense sensu lato (s.l.) transmitem T. equi,
enquanto Dermacentor nitens e Dermacentor albipictus transmitem B. caballi
(WISE et al., 2014).
B. caballi e T equi têm modos de transmissão diferentes nos carrapatos. Os
zigotos de B. caballi se multiplicam e invadem vários órgãos do carrapato,
incluindo os ovários. Desta forma, a infecção passa pelo ovário e o ovo para a
próxima geração de carrapatos, caracterizando a transmissão transovariana.
Geralmente é a fêmea do carrapato que se torna infectada, e a esporogonia
ocorre nas glândulas salivares dos carrapatos da próxima geração. Quando o
carrapato infesta um novo hospedeiro, ocorre maturação dos esporozoítos e o
hospedeiro vertebrado é infectado. Em T. equi, os zigotos não se multiplicam, mas
invadem a hemolinfa do carrapato e vão para as glândulas salivares, não há
invasão de outros órgãos, nem passagem pelos ovários. Quando o próximo
estágio do carrapato fixa-se a um novo hospedeiro, a esporogonia e a maturação
dos esporozoítos nas glândulas salivares ocorrem, e a transmissão ocorre pela
inoculação de saliva infectada, caracterizando a transmissão transestadial
(UILENBERG, 2006; WISE, 2013). Scoles e Ueti (2015), afirmam que B. caballi e
T equi também podem apresentar transmissão intraestadial e que as diferenças
no ciclo de vida de B. caballi e T. equi no carrapato, conduzem a diferentes
padrões de endemicidade para cada espécie de protozoário.
A temperatura e a umidade relativa do ar podem influenciar a sobrevivência
dos carrapatos no ambiente. Verificou-se que os carrapatos sobreviveram por
longos períodos em áreas florestadas com temperaturas regulares e maior
umidade, em comparação com campos abertos (KOUAM et al., 2010).
O movimento de animais portadores assintomáticos, em regiões com
vetores competentes, pode ser uma fonte de infecção para as populações de
cavalos suscetíveis, assim como o desenvolvimento de populações de carrapatos
com maior resistência a acaricidas químicos (SCOLES e UETI, 2015).
31
Sousa et al. (2017b) identificaram pela PCR e posterior sequenciamento,

em amostras oriundas do município de Corumbá, Pantanal sul-mato-grossense,
um cão doméstico (Canis lupus familiaris), uma raposa (Cerdocyon thous), um
Amblyomma ovale adulto e um Amblyomma sculptum positivos para B. caballi.
Além destes, um pequeno roedor (Thrichomys fosteri) também foi positivo para T.
equi.
Em um estudo na Croácia, Beck et al. (2009) confirmaram que os cães
estão infectados com uma grande variedade de espécies e subespécies de
piroplasmas grandes e pequenos, incluindo B. caballi e T. equi, dois parasitas
geralmente encontrados em cavalos.
Scoles e Ueti (2015), listaram 33 espécies de carrapatos em seis gêneros
que foram sugeridos como vetores competentes para B. caballi, T. equi ou ambos,
sendo o número de hospedeiros para o desenvolvimento de cada espécie e a
localização geográfica apresentados no Quadro 3.
32
Quadro 3 - Espécies de carrapatos vetores ou suspeitos de serem vetores da

Babesia caballi e/ou da Theileria equi, localização geográfica e
número de hospedeiros necessários para seu desenvolvimento.
Espécie de carrapato Protozoário Localização Número de
transmitido geográfica hospedeiros
dos
carrapatos
Amblyomma T. equi América do Norte 3
cajennense sensu
lato (s.l.)
Dermacentor B. caballi América do Norte 1
albipictus
Dermacentor B. caballi e T. equi Europa, África do 2a3
marginatus (=D. Norte, Oriente Médio,
reticulatus) sul da Rússia
Dermacentor nitens B. caballi América do Norte e 1
América do Sul
Dermacentor niveus B. caballi e T. equi Rússia 3
(=D. marginatus)
Dermacentor nuttalli B. caballi e T. equi Ásia (Mongólia) 3
Dermacentor pictus B. caballi Europa Oriental 3
(=D. reticulatus)
Dermacentor B. caballi e T. equi Europa e Rússia 3
reticulatus (=D.
marginatus)
Dermacentor silvarum B. caballi e T. equi Rússia 3
Dermacentor B. caballi e T. equi Estados Unidos 3
variabilis
Haemaphysalis B. caballi e T. equi Japão 3
longicornis
Hyalomma aegyptium B. caballi e T. equi Rússia e Índia 3
(=H. marginatum)
Hyalomma B. caballi e T. equi Norte da África, 2–3
anatolicum (=H. Mediterrâneo e Índia
excavatum)
Hyalomma detritum T. equi Europa Ocidental. 2
(=H. scupense) Norte da África até o
leste da China
Hyalomma dromedarii B. caballi e T. equi Europa 2–3
Hyalomma B. caballi e T. equi Norte da África 3
excavatum (=H.
anatolicum)
Hyalomma T. equi Mediterrâneo 3
lusitanicum
Hyalomma B. caballi e T. equi Norte da África e 3
marginatum (=H. Mediterrâneo
turanicum)
33
Hyalomma plumbeum B. caballi Rússia 3

(H. marginatum)
Hyalomma scupense T. equi Europa Ocidental. 1
(=H. detritum) Norte da África até o
leste da China
Hyalomma truncatum B. caballi África (Namíbia), Ásia, 3
Oriente Médio
Hyalomma turanicum B. caballi e T equi Norte da África, 3
(=H. marginatum) Mediterrâneo e Rússia
Hyalomma uralense T. equi Europa Ocidental 1–2
(=H. volgense)
Hyalomma volgense B. caballi Rússia Oriental 1–2
(=H. uralense)
Ixodes ricinus T. equi Itáia 3
Rhipicephalus B. caballi Itália e Norte da África 1
annulatus
Rhipicephalus bursa B. caballi e T. equi Itália e Norte da África 2–3
Rhipicephalus evertsi B. caballi e T. equi Sudeste da África 2
(=R. evertsi evertsi )
Rhipicephalus T. equi América do Sul 1

microplus
Rhipicephalus T. equi Sudoeste da África 2
mimeticus (=R.
evertsi mimeticus)
Rhipicephalus T. equi Leste da África 3
pulchellus
Rhipicephalus B. caballi e T. equi Cosmopolita 3
sanguineus (R. Oriente Médio e África
turanicus)
Rhipicephalus T. equi Sul da Europa e África 3
turanicus
Fonte: Adaptado de SCOLES e UETI, 2015.
No Brasil, o parasitismo de equinos por D. nitens foi, estatisticamente,

associado com equinos positivos para B. caballi, enquanto que as infestações por
A. cajennense s.l. e R. microplus foram, estatisticamente, associadas com
equinos soropositivos para T. equi (BATTSETSEG, 2001; KERBER, 2009).
Martins et al. (2016) demonstraram que o complexo A. cajennense s.l.
apresenta atualmente duas espécies no Brasil, Amblyomma cajennense sensu
stricto (s.s.) e Amblyomma sculptum, que tem áreas de distribuição diferentes no
país, apesar da ocorrência de algumas áreas de simpatria. No estado de Mato
34
Grosso foi registrada a ocorrência das duas espécies, entretanto, A. cajennense

s.s. é encontrado com maior frequência no bioma Amazônico, quase restrito a
áreas com clima equatorial, enquanto A. sculptum está restrito a áreas com clima
tropical, sendo encontrado nos biomas Cerrado e Pantanal. Peckle et al. (2013)
demonstraram que os cavalos infestados com A. cajennense s.l. no estado do Rio
de Janeiro (possivelmente A. sculptum, pela localização geográfica), eram quatro
vezes mais propensos a serem infectados por T. equi. Usando um modelo simples
de regressão logística para avaliar o nível de infestação de A. cajennense s.l. em
comparação com animais positivos para T. equi, os mesmos autores observaram
que os cavalos com infestação moderada a alta tinham 2,7 vezes mais
probabilidades de ter DNA de T. equi que os cavalos com infestações baixas ou
sem a presença de A. cajennense s.l.
A sobrevivência de D. nitens e A. cajennense s.l. pode ser comprometida
de acordo com as condições ambientais. Paula et al. (2004) demonstram a
sensibilidade das larvas de D. nitens e A. cajennense s.l. quando imergidas em
água destilada. As larvas de D. nitens apresentaram redução significativa no
percentual médio de sobrevivência quando imergidas por um período de 48 horas,
alcançando níveis de sobrevivência próximos de zero com 96 horas de imersão.
As larvas de A. cajennense s.l. apresentaram uma redução significativa no
percentual de sobrevivência somente após 72 horas de imersão, alcançando 40%
somente após 96 horas de imersão.
Loizada e Daemon (2003), testaram a sobrevivência e a oviposição de
fêmeas ingurgitadas de R. microplus, observaram uma redução na massa de ovos
e na sobrevivência destas quando imersas. O índice de eficiência reprodutiva foi
reduzido significativamente quando imersas por no mínimo 48 horas. A morte de
algumas fêmeas foi crescente a partir de 24 horas de imersão, sendo que todas
as fêmeas morreram com 72 horas de imersão. Os autores concluíram que após
48 horas em imersão, fêmeas ingurgitadas de R. microplus, deixam uma prole
menor do que deixariam em condições normais.
R. microplus é encontrado entre paralelos 32°N e 32°S, ocorrendo em toda
a América Central, norte da América do Sul, incluindo todo o território brasileiro,
oeste e sul do continente Africano, sul do continente Asiático e toda a Oceania
35
(PEREIRA et al., 2008; LÉGER et al., 2013; ALI et al., 2016). Davey et al. (1991)
demonstraram que a maior taxa de sobrevivência destas larvas ocorreu à
temperatura de 20oC e 84% de umidade relativa do ar. As maiores porcentagens
de eclosão do R. microplus ocorrem nos meses mais chuvosos, e o maior número
de carrapatos encontrados nos animais foi observado após o início da estação
chuvosa, quando a umidade relativa do ar se encontrava entre 60 a 80%
(PEREIRA, 2008; GOMES, 2015). Na região da campanha do estado do Rio
Grande do Sul, o maior parasitismo por R. microplus em equinos, que conviviam
com bovinos compartilhando a mesma pastagem, foi a causa sugerida para a
diferença na prevalência sorológica de T. equi. O rebanho equino com maior
número de animais infestados por R. microplus tinha 90,9% dos equinos positivos
para T. equi, enquanto que o rebanho com menor número de equinos parasitados
pelo carrapato apresentou prevalência de 40% (TORRES et al., 2012). De acordo
com a análise bivariada realizada por Peckle et al. (2013) a positividade de T. equi
dos cavalos criados em contato próximo com bovinos foi significativamente
diferente da positividade de T. equi dos cavalos criados na ausência de gado.
O carrapato D. nitens é mais comumente encontrado em cavalos e outros
equídeos no Brasil, sendo no estado de São Paulo, o mais prevalente dentre as
três espécies de carrapatos encontradas. D. nitens, A. cajennense s.l. e R.
microplus estavam presentes em cavalos de 95%, 50% e 10% das fazendas,
respectivamente (BORGES e LEITE, 1998; BORGES et al., 2000; LABRUNA et
al., 2002). Examinando 714 equídeos das microrregiões de Itaguaí e Serrana, no
estado do Rio de Janeiro, Santos et al. (2011) encontraram 227 animais
parasitados por D. nitens, 78 com uma infestação leve, 97 com infestação
moderada e 52 animais com infestação severa. No estado de Santa Catarina,
Lavina et al. (2014) identificaram três espécies de ixodídeos parasitando equinos:
R. microplus, D. nitens e A. cajennense s.l. No Pantanal mato-grossense, Alves et
al. (2014) coletaram 100 carrapatos de animais, sendo 90 destes A. cajennense
s.l. e 10 adultos de D. nitens. Rodrigues et al. (2016) testaram a capacidade
parasitária do carrapato D. nitens realizando a infestação experimental de
equinos, bovinos, coelhos, ovinos, cobaias, cães e aves. O ciclo biológico do D.
36
nitens foi completado apenas nos equinos e nos coelhos, demonstrando a

especificidade parasitária do D. nitens em relação aos equídeos.
Além da participação do ixodideos, a transmissão iatrogênica também pode
ocorrer, principalmente pelo compartilhamento de material contaminado por
sangue, como agulhas, por exemplo, de um indivíduo infectado em um indivíduo
suscetível (WISE et al., 2014).
Roncati et al. (2011) sugeriram a transmissão transplacentária de T. equi
após detectar, pela RT-PCR e mensurar a detecção pela PCR em tempo real,
potros positivos para este agente cinco horas após o parto, oriundos de criação
intensiva, sem acesso ao pasto, sendo filhos de éguas positivas. Verificando a
possibilidade de transmissão transplacentária de T. equi e B. caballi, Sant et al.
(2016) examinaram o sangue de 89 potros coletados nas primeiras 36 horas de
vida, pela RT-PCR. Identificaram 8% dos potros positivos para T. equi e 42,7%
para B. caballi, mostrando forte evidência de que ocorre a transmissão
transplacentária de B. caballi, podendo inclusive culminar com o aborto.
2.5 Ciclo biológico
Uma vez inoculados na corrente circulatória dos equídeos, os esporozoítos

de B. caballi invadem os eritrócitos onde se multiplicam e transformam-se em
trofozoítos e depois em merozoítos. Os eritrócitos parasitados rompem-se
liberando grande quantidade de merozoítos que invadem outros eritrócitos. A
invasão inicial de T. equi é diferente da B. caballi. Depois de inoculados com a
saliva do carrapato os esporozoítos de T. equi invadem os linfócitos do
hospedeiro vertebrado, desenvolvem-se em grandes esquizontes e,
aproximadamente nove dias depois os merozoítos são liberados invadindo os
eritrócitos e, a partir deste ponto, os ciclos dos dois agentes são semelhantes.
Alguns merozoítos transformam-se em gametócitos no sangue periférico do
hospedeiro vertebrado, após ingeridos pelo hospedeiro invertebrado, os
gametócitos transformam-se em gametas que se unem formando os zigotos. Os
37
zigotos desenvolvem-se em um período que pode variar de seis a vinte e quatro

dias, dependendo do parasito e da espécie de carrapato vetor, podendo ser
encontrados na glândula salivar dos carrapatos (UILENBERG, 2006;
SCHNITTGER et al., 2012; WISE et al., 2013; WISE et al., 2014; ZANET et al.,
2017).
2.6 Manifestação clínica
O parasitismo por um ou ambos os organismos intraeritrocitários

obrigatórios pode provocar sinais clínicos variados. A introdução de animais
suscetíveis em áreas endêmicas para T. equi, pode produzir a doença hiperaguda
levando ao colapso e morte súbita. A infecção aguda pode produzir, inicialmente,
sinais inespecíficos, como febre alta, letargia, anorexia, perda de peso e edema
periférico. Também, pode ser observada anemia com mucosas pálidas ou
ictéricas, taquicardia, taquipnéia, fraqueza, hemoglobinúria ou bilirrubinúria. Já a
infecção crônica pode resultar apenas em sinais inespecíficos, como letargia,
anorexia emagrecimento e queda do rendimento ao exercício. Animais que
tiveram a doença hiperaguda ou aguda e sobreviveram podem tornar-se
cronicamente infectados, podendo manifestar reagudizações da doença que,
comumente, são desencadeadas por fatores estressantes (SCHNITTGER, 2012;
RIBEIRO et al., 2013; ROTHSCHILD, 2013; WISE et al., 2013).
O aborto foi observado por Sousa et al. (2017a) ao sétimo mês de gestação
em uma égua de cinco anos de idade, pertencente a um rebanho de 12 éguas. As
impressões em lâminas de microscopia feitas com tecido fresco do baço, fígado e
cérebro demonstraram aproximadamente 80% dos eritrócitos parasitados por
organismos, morfologicamente, semelhantes a T. equi. O sangue do feto abortado
e das 12 éguas foi testado por PCR para T. equi e todas as amostras foram
positivas. Sant et al. (2016) estudando a transmissão transplacentária de T. equi e
B. caballi em potros, não observaram associação entre sorologia positiva para B.
caballi ou T. equi e a ocorrência do aborto, no entanto, 22 éguas do experimento
38
abortaram (19,8%), e destas, 20 éguas eram sorologicamente positivas por

cELISA para B. caballi, e três eram positivas por PCR convencional para o mesmo
agente. O exame do baço de um feto abortado com 8,5 meses de gestação foi
positivo para B. caballi por PCR em tempo real.
2.7 Diagnóstico
A piroplasmose equina pode ser diagnosticada clinicamente pela

observação e identificação dos sinais clínicos apresentados pelos animais
acometidos. A confirmação do diagnóstico clínico pode ser realizada por exames
laboratoriais, adotando métodos diretos ou indiretos de diagnóstico (UILENBERG,
2006; ZOBBA et al., 2008; SCHNITTGER et al., 2012; WISE et al., 2013).
O esfregaço sanguíneo ainda é um dos métodos de diagnóstico mais
utilizados na rotina clínica, sendo rápido e barato. Entretanto, depende da
habilidade do examinador e da carga parasitária. É realizada a coleta de sangue
periférico, geralmente em algum vaso auricular, em frasco com anticoagulante.
Em seguida é feito o esfregaço sanguíneo em lâmina de microscopia e corado por
panótico rápido ou Giemsa e secos ao ar. O esfregaço deve ser observado em
microscópio óptico com aumento de 1000 vezes. O resultado é positivo quando
um dos agentes da piroplasmose é visualizado no interior de alguma célula
sanguínea, conforme observado na Figura 1. A punção de baço também pode ser
usada, é mais sensível que o esfregaço sanguíneo, porém é um método mais
invasivo (FONSECA et al., 2011; IBRAHIM et al., 2011; HABIBI et al., 2016;
LEMPEREUR et al., 2017).
39
Figura 1 - A: Hemácia infectada por Babesia caballi (seta); B: Hemácia infectada

por Theileria equi (seta). Fonte: PIOTTO, 2009.
O diagnóstico sorológico também pode ser usado, este indica a presença

de anticorpos específicos contra B. caballi ou T. equi. Entretanto, apenas indica
que já houve contato do hospedeiro com o agente, não indicando, precisamente,
infecção no momento do exame (BALDANI et al., 2004; MANS, B. J.; PIENAAR,
R.; LATIF, 2015; LEMPEREUR et al., 2017).
Atualmente, o teste de IFI e o cELISA são os principais testes utilizados
para o diagnóstico sorológico da piroplasmose equina, substituindo o Teste de
Fixação de Complemento (FC) que por muitos anos foi o teste sorológico
principal. O teste Imunofluorescência Indireta (IFI) e cELISA demonstraram ser
altamente específicos para cada uma das duas espécies de agentes envolvidos.
Os testes de ELISA indiretos, também podem ser usados para detectar anticorpos
para ambas as espécies em cavalos infectados, embora ocorram reações
cruzadas entre T. equi e B. caballi. A aplicação de proteínas recombinantes de
merozoítos de T. equi e B. caballi em ensaios de diagnóstico parece ser muito
promissora na determinação precisa da infecção por piroplasmose equina (OIE,
2009).
Uma proteína recombinante purificada, a His6-EMA1, produzida a partir do
gene do Equi Merozoite Antigen 1 (EMA-1) foi testada no ELISA para a detecção
de anticorpos anti-T. equi em equinos. O teste de ELISA diferenciou claramente
entre soros de equinos infectados por T. equi, soros de animais infectados por B.
caballi e soro de equino sadio. Do total de 170 amostras de soro de equinos que
foram examinadas para o diagnóstico da infecção por T. equi por ELISA,
40
utilizando a proteína His6-EMA-1, 95,88% (163/170) foram positivas para T. equi.

De acordo com os autores, os resultados sugerem que a proteína His6-EMA1
expressa em E. coli pode ser um antígeno confiável para diagnóstico imunológico
pelo teste de ELISA (BALDANI et al., 2011).
O diagnóstico pela PCR tem sido bastante explorado para a detecção de
fragmentos de DNA de B. caballi ou T. equi. É considerado um dos melhores
métodos, senão o melhor pela sensibilidade e especificidade apresentada.
Quando comparado com o diagnóstico por esfregaço sanguíneo tem indicado um
número maior de animais positivos por não depender da habilidade do operador
durante a leitura e por apresentar reação positiva, mesmo em casos de baixa
parasitemia. Quando comparado com o diagnóstico sorológico, tem indicado um
número menor de positivos, pois reage apenas quando a amostra tem o parasito,
eliminando os resultados falso positivos que ocorrem com a sorologia nos casos
de infecções anteriores já curadas. Entretanto, o limite teórico de detecção dos
ensaios pela PCR é de três moléculas de DNA do parasito por ensaio, fatores
como, a robustez da enzima polimerase, a presença de inibidores na amostra, o
número de ciclos com temperatura efetiva, a sensibilidade dos equipamentos, a
eficiência na extração de DNA, o número de parasitos (cópias genômicas) por
amostra de células e nível de parasitemia podem afetar o resultado do exame
(ALHASSAN et al., 2005; BUSTIN 2010; IBRAHIM et al., 2011; MANS et al.,
2015).
Alhassan et al. (2005) utilizando o modelo de diluições seriadas de
Birkenheuer et al. (2003) desenvolveram uma PCR multiplex para o diagnóstico
de B. caballi e T. equi. De acordo com os autores, a PCR multiplex apresenta
especificidade satisfatória confirmada pelo sequenciamento do material
amplificado. Houve concordância total dos resultados entre a PCR multiplex e a
PCR convencional usando os oligonucleotídeos do gene Rhoptry associated
protein-1 (RAP-1) para B. caballi e do gene Erythrocyte merozoite antigen 1 (EMA-
1) para T. equi.
Baldani et al. (2008) compararam o cultivo in vitro, a PCR convencional e a
nested PCR para o diagnóstico de T. equi em equinos submetidos a estresse
induzido por exercício. Não observaram diferença significativa entre as amostras
41
obtidas de animais em repouso e após exercícios. A nested PCR, utilizando

oligonucleotídeos escolhidos para parearem com as regiões 396 pares de base
(pb) e 102 pb do gene EMA-1, permitiu a visualização de produtos de amplificação
em todos os equinos testados, mas não foram observadas diferenças na
sensibilidade entre os ensaios de PCR convencional e nested PCR.
A nested PCR utilizando primers do gene EMA-1, também foi usada por
Ayala-Valdovinos (2017), para o diagnóstico e prevalência de cavalos infectados
por T. equi no oeste do México. Todas as amostras testadas por PCR
convencional foram testadas por nested PCR, sendo observado resultados
consistentes em ambos os testes.
Avaliando a PCR convencional, a nested PCR e a PCR multiplex com
oligonucleotídeos desenhados baseados na sequência do gene ribossomal 18S,
Leal et al. (2011) relataram que a PCR convencional apresentou alta sensibilidade
e especificidade para o diagnóstico da infecção por T. equi, comparável a nested
PCR, mas com a vantagem de uma maior velocidade na obtenção de resultados e
menores custos e riscos de contaminação laboratorial. De acordo com os autores,
isso credencia a PCR convencional para estudos epidemiológicos e para
determinações em cavalos infectados.
A PCR em tempo real foi usada por Sant et al. (2016) para a quantificação
de DNA de T. equi e B. caballi em potros para avaliar a transmissão
transplacentária. A quantificação de T. equi e B. caballi baseou-se no gene EMA-1
de T. equi e no gene ribossomal 18 S de B. caballi. Foram feitas cinco diluições
seriadas dos controles positivos para T. equi e B. caballi iniciando de 1:10 usando
água livre de RNAse/DNAse para gerar uma curva padrão de piroplasmas
equinos nas amostras sabidamente positivas. Os valores das curvas padrão dos
controles positivos foram utilizadas para determinar se as amostras examinadas
eram positivas ou negativas para os piroplasmas. A estatística Kappa para
concordância entre os resultados de PCR convencional e da PCR em tempo real
neste estudo foi k = 0,513 (IC 95% 0,15-0,88), (p <0,001) indicando concordância
moderada.
42
2.8 Tratamento
Para o tratamento da piroplasmose equina, Osman (2016), avaliou o uso do

dipropionato de imidocarb na dose de 2,2 mg/kg em duas administrações com
intervalo de 24 horas entre elas, associado ao tratamento de suporte com fósforo
e vitamina B12 e dois litros de solução de dextrose a 10% administrados uma vez
ao dia por cinco dias para o tratamento da piroplasmose equina provocada pela B.
caballi. Este protocolo mostrou-se altamente eficaz com 100% de cura, tendo um
resultado mais rápido nos animais que manifestavam a doença aguda. Entretanto,
40% dos animais tratados apresentaram efeitos colaterais como salivação, cólica
e decúbito que rapidamente desapareceram. O controle dos carrapatos nos
animais e no ambiente também foi indicado.
Grause et al. (2013) trataram seis cavalos infectados, experimentalmente,
por T. equi com dipropionato de imidocarb na dose de 4 mg/kg em quatro
administrações com intervalo de 72 horas entre elas. A infecção foi eliminada em
cinco dos seis animais infectados. A eliminação da infecção foi demonstrada por
meio de três resultados negativos de nested PCR. Além disso, os resultados
negativos e positivos foram confirmados pela transmissão experimental de sangue
de cavalos tratados e não tratados para animais susceptíveis. Esses dados
corroboram com os de Ueti et al. (2012) que indicam o uso da nested PCR e da
pesquisa de anticorpos por cELISA para comprovar a eliminação da T. equi dos
animais tratados com dipropionato de imidocarb, e indicam o uso deste
medicamento para o tratamento dos casos de piroplasmose por T. equi. Segundo
Scoles e Ueti (2015) atualmente este é o tratamento mais indicado para a
eliminação da infecção por ambos os parasitas durante infecções crônicas.
A diminazina e o diacetato de diaminazeno também se mostraram
eficientes no tratamento da piroplasmose equina aguda (contra T. equi e B.
caballi) em uma dose de 3,5 mg/kg em duas aplicações com intervalo de 48 horas
entre elas. Efeitos colaterais como dificuldade respiratória e letargia foram
relatados. A oxitetraciclina foi eficaz contra T. equi, mas não contra B. caballi na
dose de 5 - 6 mg / kg uma vez por dia durante sete dias (WISE et al., 2013; WISE
43
et al., 2014). Conforme Ueti e Knowles (2018) essas drogas não demonstraram
eliminar a infecção de T. equi ou B. caballi.
2.9 Prevenção
A prevenção da piroplasmose equina nos países endêmicos deve priorizar

o controle dos carrapatos. Isso pode ser feito com medidas para controlar a
população dos vetores, mas também acontece naturalmente em áreas de baixa
temperatura e umidade. Os acaricidas têm sido amplamente utilizados no controle
de carrapatos com redução na transmissão dos agentes etiológicos da
piroplasmose equina, e têm servido como o principal meio de controle de
carrapatos, sendo consideradas cruciais como uma solução de curto prazo para
controlar as infestações de carrapatos em cavalos. O uso de pastejo rotacionado
também pode ser uma medida adicional utilizada para o controle (KERBER et al.,
1999; UETI e KNOWLES, 2018).
Conhecendo as espécies de carrapatos que são vetores competentes, a
disseminação destes parasitos pode ser controlada por exigências de testes
diagnósticos e limites no movimento regional de equídeos com base na presença
ou ausência de tais vetores competentes, além de evitar a exposição de equídeos
suscetíveis e o surgimento de novos focos da doença (UILENBERG 2006;
SCOLES et al., 2011).
Vários estudos investigaram o uso de vacinas para induzir imunidade
protetora contra a piroplasmose, mas nenhum deles foi completamente efetivo na
prevenção da infecção (WISE et al., 2014). Wise et al. (2013) sugerem que a
infecção natural ocorrida à campo produza imunidade suficiente para proteger os
animais de doenças recorrentes após exposições subsequentes.
44
3 OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi determinar a prevalência molecular de B.

caballi e T. equi em equídeos do estado de Mato Grosso, assim como, identificar
fatores associados ao risco da infecção dos animais, além de analisar a
diversidade genética de B. caballi e T. equi na área de estudo.
45
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de estudo
Localizado na região Centro-Oeste do Brasil, o estado de Mato Grosso

possui 141 municípios, ocupando uma área de 903.202,446 km2 e com uma
população estimada de 3.305.531 habitantes (BRASIL, 2015, MATO GROSSO,
2017).
O estado de Mato Grosso possui clima tropical úmido, com temperatura
média anual entre 22,39o e 26,56o C. As maiores temperaturas foram identificadas
no nordeste do estado e as menores temperaturas ocorrem no sul, o que,
segundo os autores, pode ser explicado pelo efeito latitudinal. A precipitação
anual do estado varia entre 1.200 e 2.200 milímetros com os valores decrescendo
no sentido norte sul. Em Mato Grosso há duas estações, uma chuvosa, de
outubro a abril, e outra seca, de maio a setembro. No início do período chuvoso a
pluviosidade é maior no bioma Amazônico, visto que as massas de ar quente e
úmido formados na região amazônica ficam mais fortes e deslocam-se mais ao
sul do estado com o avanço do período chuvoso. Na região do Pantanal, há uma
maior distribuição da precipitação durante o ano, atribuída a grande umidade ali
presente, ocasionando chuvas do tipo convectivas, durante o período de seca
(RAMOS et al., 2017).
4.2 Cálculo amostral
Para o cálculo amostral, a população de equídeos do estado foi fixada em

três estratos (biomas): Amazônico, Cerrado e Pantanal, de acordo com os dados
disponibilizados pelo INDEA-MT (MATO GROSSO, 2014). A Tabela 1 apresenta o
46
número de propriedades e o número de equídeos distribuídos por bioma no

estado de Mato Grosso utilizados para o cálculo amostral.
Tabela 1 - Número de propriedades e número de equídeos por biomas no estado
de Mato Grosso, Brasil.
Bioma Nº de propriedades Nº de equinos
Amazônico 32.069 165.413
Cerrado 18.114 110.656
Pantanal 3.527 30.862
TOTAL 53.710 306.931
Fonte: Barros, 2017
Para calcular o tamanho da amostra foi considerada uma proporção

estimada de 50% de prevalência para cada agente (p = 0,5) e 3% de erro máximo
da estimativa (d = 0,03). A expressão algébrica abaixo foi utilizada na estimação
de proporções:
Np(12 p)
n0   d 
deff
(N 1)   p(1 p)
 z /2 


 N=306.931 é o tamanho da população.

 p=0,5 é a proporção a ser estimada
 d=0,03 é a margem de erro ou erro máximo da estimativa
Z  1, 96
 2 é um valor tabelado da distribuição normal.
 deff=1,45 o efeito do delineamento
Dessa forma, foi calculado um número mínimo de 1542 equídeos a serem

amostrados em todo o estado. Admitindo uma possível perda de 10% das
amostras, o tamanho amostral máximo foi definido em 1696 equídeos (1542 +
154), sendo admitida a análise de qualquer número amostral (n) intermediário a
estes.
A amostragem foi realizada em dois estágios, inicialmente foram sorteadas
aleatoriamente as propriedades a serem amostradas em cada bioma,
47
posteriormente foram sorteados os equídeos a serem amostrados por propriedade

observando-se o número de equídeos existente na propriedade.
A Tabela 2 apresenta o número de equídeos por propriedade, com a
frequência absoluta, relativa e acumulada destes dados no estado de Mato
Grosso, dados estes, utilizados para o cálculo amostral.
Tabela 2 - Número de propriedades por quantitativo de equídeos no estado de

Mato Grosso, Brasil.
Número de animais por Frequência Frequência Frequência
propriedade Absoluta relativa relativa acumulada
1 13809 0,26 0,26
2 12251 0,23 0,49
3 7306 0,14 0,62
4 5090 0,09 0,72
5 3131 0,06 0,77
6 2144 0,04 0,81
7 1503 0,03 0,84
8 1194 0,02 0,86
9 819 0,02 0,88
10 818 0,02 0,89
> 10 5645 0,11 1,00
TOTAL 53.710 1,00
Fonte: MATO GROSSO, 2014
A média no estado era de cinco equídeos por propriedade, mas 77% das
propriedades tinham até cinco animais, sendo assim, amostrou-se um animal em
propriedades com cinco animais ou menos de cinco. Em propriedades com mais
de cinco animais foram amostrados, aleatoriamente, cinco. Sendo assim, o
número de animais e de propriedades que foram amostrados em cada bioma está
descrito na Tabela 3, e a distribuição das propriedades amostradas está ilustrada
na Figura 2.
48
Tabela 3 - Número de animais e de propriedades amostrados por bioma no

estado de Mato Grosso, Brasil.
Número de Número de
propriedades propriedades
Número de Número de com menos de com mais de
Bioma Animais Propriedades cinco animais cinco animais
Amazôniaco 661 394 322 72
Cerrado 498 312 248 64
Pantanal 465 267 204 63
Total 1.624 973 774 199
Figura 2 - Distribuição por bioma das propriedades analisadas no estado de Mato

Grosso, Brasil para identificação de animais positivos para Babesia
caballi ou Theileria equi pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
4.3 Coleta e preservação das amostras
As amostras sanguíneas foram coletadas entre os meses de setembro a

dezembro de 2014 para o levantamento epidemiológico da Anemia Infecciosa
Equina no estado de Mato Grosso, realizado pelo Instituto de Defesa
Agropecuária do Estado de Mato Grosso (INDEA-MT). As amostras foram
49
coletadas em tubo de ensaio estéril, sem anticoagulante separou-se o soro

sanguíneo por centrifugação. O coágulo foi armazenado congelado em freezer
convencional a – 20 oC.
4.4 Extração de DNA, PCR e sequenciamento
Um fragmento de 60 mg do coágulo foi submetido à extração de DNA,

conforme protocolo de fenol-clorofórmio-isoamílico descrito por Sambrook &
Russel (2001). A fim de verificar a presença de DNA amplificável, 163 amostras
selecionadas aleatoriamente foram submetidas a ensaios de PCR de controle
interno visando fragmentos de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH),
como descrito anteriormente (BIRKENHEUER et al., 2003). Cada amostra de
DNA extraído foi submetida à análise de PCR, utilizando pares de primers
espécie-específicos baseados nos genes RAP-1 (Rhoptry associated protein-1) ()
para B. caballi (senso: BC 48 – 5‟ GGCTCCCAGCGACTCTGTGG – 3‟ e anti-
senso: BC 48 – 5‟ CTTAAGTGCCCTCTTGATGC – 3‟), e EMA-1 (Erythrocyte
merozoite antigen 1) () para T. equi (senso EMA-1 - 5‟
GCATCCATTGCCATTTCGAG – 3‟ e anti-senso EMA-1 – 5‟
TGCGCCATAGACGGAGAAGC– 3‟), que amplificaram fragmentos de DNA de
570 e 750 pares de bases respectivamente. Este procedimento de análise de
PCR foi adaptado de Alhassan et al. (2005). A solução da reação da PCR foi
preparada conforme segue: 1,5µl de DNA da amostra para B. caballi ou 2µl para
T. equi, 2,5 µl de tamp 10x PCR, 4,0µl de mistura MdNTP, 0,15µl de Taq DNA
polimerase (Sigma-Aldrich), 0,5µl de cada primer na concentração de 10 pmol/ml
de B. caballi e T. equi, por fim, a solução foi completada com 15,35µl de água
destilada estéril para B. caballi ou 15,85µl para T. equi, o volume total da solução
foi de 25µl.
As condições de amplificação para B. caballi e T. equi foram as seguintes:
40 ciclos com ativação enzimática inicial a 96 oC por 10 min, desnaturação a 96
oC por 1 min, anelamento de primer a 60,5 oC por 1 min, extensão a 72 oC por 1
50
min e extensão final a 72 oC por 10 min. Para todos os ensaios de PCR, amostras
de DNA de B. caballi e T. equi obtidas de cavalos naturalmente infectados
(BARROS et al., 2015) e água estéril ultra-pura foram utilizadas como controles
positivo e negativo, respectivamente. Os tamanhos dos produtos de PCR foram
analisados em gel de agarose a 1,5% corado com GelRed ™ Nucleic Acid Gel
Stain e visualizados num sistema ChemiDoc XRS.
Como controle negativo foi usado água ultrapura, e como controles
positivos foram utilizados amostras de DNA genômico de sangue de equinos
naturalmente infectados por B. caballi e T. equi, previamente identificados e
confirmados por sequenciamento (BARROS et al., 2015).
Amostras positivas na PCR para B. caballi e T. equi foram purificados
utilizando-se o kit de purificação GFX PCR® (GE Healthcare Life Sciences do
Brasil®) e, sequenciados em sequenciador automático (ABI-PRISM 3500 Genetic
Analyzer, Foster City, CA).
4.5 Análise Filogenética
Para a análise filogenética foram utilizadas apenas as amostras com as

melhores sequências “forward” e “reverse”. Utilizamos fragmentos de 569 e 675
pb dos genes RAP-1 e EMA-1, de B. caballi e T. equi, respectivamente. O DNA de
amostras positivas foi purificado e sequenciado em um sequenciador automático
(ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer, Foster City, CA). As sequências obtidas dos
dois genes utilizados como alvo foram submetidas a alinhamentos múltiplos pelo
programa Clustal X (THOMPSON et al., 1997), alterando os parâmetros relativos
à inserção de “indels” (peso de inserção=1, extensão=1) e, manualmente
ajustados no programa GeneDoc v. 2.6.01 (NICHOLAS et al., 1997). As árvores
filogenéticas foram inferidas pelo método de máxima parcimônia (MP). As árvores
de MP foram construídas utilizando o programa PAUP* v. 4.0b10 (SWOFFORD,
2002) via busca heurística com 500 replicatas de adição aleatória dos terminais
seguida de troca de ramos (“RAS-TBR Branch-breaking”). As análises de suporte
51
por “bootstrap” foram feitas em 500 replicatas com os mesmos parâmetros. Para a
construção do dendrograma final foram utilizados apenas os diagramas obtidos
nas últimas 150 replicatas. Para a verificação de suporte de ramos foram
utilizados os valores de probabilidade a posteriori obtidos com o programa
MrBayes.
4.6 Aplicação de questionário
Na ocasião da colheita do sangue realizada pelo INDEA/MT, foi aplicado

um questionário sanitário (anexo 1), com o intuito de identificar e registrar as
condições sanitárias do rebanho equídeo. Foram abordadas variáveis referentes
aos dados zootécnicos dos animais, ao manejo adotado nas fazendas e adoção
de medidas de controle de enfermidades. O Quadro 4, apresenta as variáveis
analisadas nos testes de associações como potenciais fatores de risco para os
equídeos positivos para infecção por piroplasmídeos.
Quadro 4 - Variáveis analisadas nos testes de associações como potenciais

fatores associados ao risco para os equídeos positivos para Babesia
caballi ou Theileira equi no estado de Mato Grosso, Brasil.
Variável Possível resposta
Bioma em que o animal se encontra Amazônico, Cerrado ou Pantanal
Espécie Equino ou Muar/Asinino
Sexo Macho ou Fêmea
Está na faixa etária entre 6 meses e Sim ou Não
dois anos e 11 meses
Está na faixa etária entre 3 anos e 10 Sim ou Não
anos
Está na faixa etária maior que 10 anos Sim ou Não
Finalidade do animal Serviço ou Esporte/Lazer
Também foram observadas e registradas características das propriedades

analisadas, como a localização por georreferenciamento, e variáveis referentes às
propriedades com potencial fator de risco sanitário. O Quadro 5, apresenta as
variáveis selecionadas para os testes de associações como potenciais fatores
52
associados ao risco para propriedades com animais positivos para a infecção por
piroplasmídeos.
Quadro 5 - Variáveis analisadas nos testes de associações como potenciais fatores

associados ao risco para propriedades com animais positivos para
Babesia caballi e/ou Theileira equi no estado de Mato Grosso, Brasil.
Variável Possível resposta
Bioma Amazônico, Cerrado ou Pantanal
Tipo de exploração Fazenda de Criação ou
Haras/Sociedade Hípica
Finalidade do Rebanho Serviço ou Esporte/Lazer
Tipo de manejo Extensivo ou Semi-intensivo /
Intensivo
Densidade de equídeos por área Muito denso1 ou Pouco denso2
Compartilha agulha entre os animais Sim / Não
Tem áreas alagadas na propriedade Sim / Não
Tem assistência veterinária Sim / Não
Legenda: 1 = área igual ou menor que 5 hectares por equídeo; 2 = área maior que 5 hectares por
equídeo.
4.7 Análise estatística e cálculo de prevalência
Os valores de prevalência foram calculados separadamente por animais e

propriedades, e expressos na forma de intervalo de confiança (THRUSFIELD,
2007).
O cálculo da prevalência de animais foi realizado de forma ponderada
(DOHOO et al., 2003). A seguinte expressão foi utilizada para o peso de cada
animal:
População total de equídeos na População total de equídeos na

propriedade X região
Total de equídeos amostrados na Total de equídeos amostrados na
propriedade região
Para análise de propriedades foi considerado que uma propriedade seria

positiva se houvesse pelo menos um animal positivo na PCR. Assim, foi
53
construído um modelo de regressão logística múltipla “t” seguindo uma série de

etapas:
Para as variáveis contínuas foi realizado um teste de linearidade, por meio
do gráfico de log-odds. Quando a avaliação visual indicou uma tendência não
linear, a variável contínua foi categorizada.
Para as variáveis categóricas foi realizada um teste qui-quadrado ou exato
de fisher, entre o resultado e as várias variáveis preditoras, e todas as variáveis
com um valor de p <0,20 foram incorporadas ao modelo.
As variáveis selecionadas foram testadas quanto à colinearidade, incluindo
análise de multi-colinearidade para assegurar um fator de inflação de variância
média (VIF) <10 antes de ser utilizado nos modelos.
O modelo foi construído inserindo todas as variáveis selecionadas nas
etapas anteriores, sendo as variáveis menos significativas (de acordo com a
estatística de Wald), foram removidas e a análise de regressão logística foi
repetida. Este processo foi repetido, o modelo ajustado comparado com o anterior
por meio do teste de razão de verossimilhança, para verificar o confundimento.
Nos casos em que houve uma alteração nas estimativas dos parâmetros de mais
de 30%, a variável removida foi considerada um fator de confusão e novamente
incluída no modelo.
4.8 Análise espacial
A análise espacial foi realizada separadamente para as propriedades com

animais infectados por B. caballi e para propriedades com animais infectados por
T. equi, utilizando-se o estimador de intensidade de Kernel com objetivo de
analisar o comportamento de padrões de pontos e estimar a intensidade pontual
do processo em toda a região de estudo.
A partir do estimador Kernel é possível gerar um mapa de risco com os
dados de ponto espacial, dado por: R(s) = λ1(s) / λ0(s); em que: λ1(s) é o
estimador de densidade kernel dos positivos; e λ0(s) é o estimador de densidade
54
kernel dos negativos. A suposição básica é que o risco é constante em todo o

n n n n
espaço e é dado por: R0(s) = 1/ 0 em que: 1 é o total de locais positivos e 0 éo
total de locais negativos.
A significância do teste foi obtida por meio de um teste de Monte Carlo
(KELSALL e DIGGLE, 1995). Para verificar a existência de um padrão espacial foi
utilizada à função de correlação marcada (OLINDA e SCALON, 2010). As análises
foram realizadas por meio do software R Core Team (2015), utilizando o pacote
Spatstat (BADDELEY e TURNER, 2005). Todas as informações geradas pelo
trabalho de campo e de laboratório foram inseridas em um banco de dados
específico, utilizado nas análises epidemiológicas.
Os Comitês de Bioética em Pesquisa Animal da Universidade de Cuiabá
(UNIC) e da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) aprovaram o presente
estudo, sob os protocolos 008/2015 e 23108.016503/14-9, respectivamente.
55
5 RESULTADOS
5.1 Piroplasmídeos em animais
A prevalência de piroplasmídeos em equídeos no estado de Mato Grosso

por B. caballi foi de 2,74% (IC 95; 1,76%; 3,71%). O bioma Amazônico apresentou
a prevalência mais alta, 3,63%, (IC 95%; 2,20%; 5,06%), seguido do Cerrado
3,41%, (IC 95% 1,82%; 5,01%). A menor prevalência da infecção por B. caballi
em animais foi observada no bioma Pantanal 0,86%, (IC 95%; 0,02%; 1,70%). A
prevalência de piroplasmídeos em equídeos no estado de Mato Grosso provocada
pela T. equi foi de 25,91% (IC 95%; 21,67%; 30,15%). A prevalência mais alta foi
identificada no bioma Amazônico 30,26%, (IC 95%; 26,76%; 33,76%), seguido do
Cerrado 28,31%, (IC 95%; 24,36%; 32,27%) e do Pantanal 12,69%, (IC 95%;
9,66%; 15,71%). A infecção por ambos agentes foi observada em 32 animais
(frequência de 1,96%). Destes, 17 pertenciam ao bioma Amazônico (frequência
de 1,04%), 11 ao Cerrado (frequência de 0,68%) e quatro ao Pantanal (frequência
de 0,24%), (Tabela 4).
Tabela 4 - Prevalência da infecção por Babesia caballi e Theileria equi identificada

pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e número absoluto de
animais positivos, de acordo com o bioma de origem do animal no
estado de Mato Grosso, Brasil.
Bioma Animais positivos Animais positivos Co-infecção
para B. caballi para T. equi
Número Prevalência Número Prevalência Frequência
N. de (%) de (%) (%)
Amostras positivos positivos
testadas
Amazônico 661 24 3,63 200 30,26 17 (1,04%)
Cerrado 498 17 3,41 141 28,31 11 (0,68%)
Pantanal 465 4 0,86 59 12,69 4 (0,24%)
Total 1624 45 2,74 400 25,91 32 (1,96%)
A Tabela 5 sintetiza o resultado das informações referentes às variáveis

selecionadas que foram coletadas com a entrevista e aplicação do questionário
56
(Anexo 1), analisadas pelo teste qui-quadrado ou exato de Fisher, da população

equídea positiva para a infecção por B. caballi e da população positiva para T.
equi.
Tabela 5 - Resultados da análise univariada dos possíveis fatores associados ao

risco para animais positivos para Babesia caballi e animais positivos
para Theileria equi no estado de Mato Grosso, Brasil.
Variável Positivos para B. caballi Positivos para T. equi
Prevalência Valor de p Prevalência Valor de p
Bioma 0,004314 6.581e-06
Amazônico 3,63%, 30,26%
Cerrado 4,41% 28,31%
Pantanal 0,86% 12,69%
Frequência Frequência
relativa (no) relativa (no)
Espécie 0,4046 0,6796
Equino 86,67% (39) 88,75% (355)
Muar ou asinino 13,33% (06) 11,25% (45)
Sexo 0,1966 0,7164
Macho 62,22% (28) 56,75% (227)
Fêmea 37,78% (17) 43,25% (173)
Faixa etária
De 6 meses a 2 26,66% (12) 0,0006972 19,75% (79) 8.432 e-06
anos e 11 meses
De 3 a 10 anos 55,55% (25) 0,3666 63,25% (253) 0,7821
Acima de 10 anos 17,79% (08) 0,02756 17,00% (68) 0,004825
Finalidade do 0,2951 0,4232
animal
Serviço 97,78% (44) 90,00% (360)
Esporte e/ou Lazer 2,22% (01) 10,00% (40)
Dos resultados descritos acima, apenas o bioma e a faixa etária de 6

meses a 2 anos e 11 meses atingiram nível de significância estatística (p < 0,20),
para os animais com resultado positivo para a infecção por B. caballi, sendo
inseridas no modelo de regressão logística para a análise de risco (Tabela 6).
57
Tabela 6 - Estimativas para o modelo de regressão logística, considerando as

variáveis selecionadas pelo teste qui-quadrado para a infecção de
equídeos do estado de Mato Grosso, Brasil pela Babesia caballi.
Variáveis Estimativas Valor p Oddsratio 2,50% 97,50%
Intercepto 0,03 <0,01 1,03 1,01 1,04
Cerrado 0,005 0,65 1,00 0,98 1,03
Pantanal -0,02 <0,01 0,97 0,95 0,98
Idade de 6 meses a
dois anos e 11 meses 0,05 0,05 1,05 0,99 1,10
Idade mais de 10
anos -0,01 0,07 0,98 0,97 1,00
Na análise de risco apenas o bioma Pantanal foi estatisticamente

significativo (p < 0,05), os animais criados no Pantanal têm 2,9% menos chance
de serem infectados por B. caballi.
As variáveis “bioma”, “idade de 6 meses a dois anos e 11 meses” e “idade
acima de 10 anos” atingiram nível de significância estatística (p < 0,20), para os
animais com resultado positivo para a infecção por T. equi, sendo assim inseridas
no modelo de regressão logística para a análise de risco. A Tabela 7 apresenta as
estimativas para o modelo de regressão logística, considerando as variáveis
“bioma”, “idade de 6 meses a dois anos e 11 meses” e “idade acima de 10 anos”
selecionadas pelo teste qui-quadrado para equídeos infectados pela T. equi no
estado de Mato Grosso.

variáveis selecionadas pelo teste qui-quadrado para a infecção de
equídeos do estado de Mato Grosso, Brasil pela Theileria equi.
Odds
Variáveis Estimativas Valor p ratio 2,50% 97,50%
Intercepto 0,33 <0,01 1,40 1,30 1,51
Cerrado -0,01 0,71 0,98 0,88 1,08
Pantanal -0,21 <0,01 0,80 0,738 0,87
Idade de 6 meses a
dois anos e 11 meses 0,18 <0,01 1,20 1,08 1,34
Idade mais de 10 anos -0,10 <0,01 0,89 0,84 0,95
Na análise de risco as variáveis o “bioma”, “idade de 6 meses a dois anos e

11 meses” e “idade acima de 10 anos” foram estatisticamente significativas (p <
58
0,05). Equídeos criados no bioma Pantanal tem 19,65% menos chance de serem
infectados por T. equi. A faixa etária de equídeos entre seis meses a dois anos e
onze meses faz com que aumente a chance do animal ter a infecção por T. equi
em 1,2058 vezes (20,58%), mas a faixa etária de equídeos com idade acima de
10 anos faz com que diminua a chance do animal ter a infecção por T. equi em
10,08%.
5.2 – Infecção por piroplasmídeos em propriedades rurais
A prevalência de propriedades com no mínimo um animal infectado por B.

caballi no estado de Mato Grosso foi de 4,11% (IC 95%; 2,86%; 5,36%). No bioma
Amazônico a prevalência foi de 5,33%, (IC 95%; 3,11%; 7,55%), seguido do
Cerrado com 4,81%, (IC 95%; 2,43%; 7,18%) e do Pantanal com 1,50%, (IC 95%;
0,04%; 2,96%). Já a prevalência da infecção por T. equi em propriedades rurais
no estado de Mato Grosso foi de 28,16% (IC 95%; 25,33%; 30,99%). No bioma
Amazônico foi de 35,03% (IC 95% 30,31%; 39,74%), no Cerrado foi de 27,88%
(IC 95%; 22,91%; 32,86%) e no Pantanal foi de 18,35% (IC 95%; 13,71%;
23,00%). A Figura 3 apresenta a distribuição por bioma, das propriedades
analisadas que tiveram pelo menos um animal positivo para piroplasmídeos no
estado de Mato Grosso.
59
Figura 3 - Distribuição por bioma das propriedades analisadas que tiveram pelo
menos um animal positivo para infecção por Babesia caballi, Theilieria
equi ou por ambos no estado de Mato Grosso, Brasil.
A Tabela 8 apresenta o resultado da análise univariada dos possíveis

fatores associados ao risco para propriedades com no mínimo um animal positivo
para infecção por B. caballi ou por T. equi no estado de Mato Grosso.
60
Tabela 8 - Resultados da análise univariada dos possíveis fatores associados ao

risco para propriedades com no mínimo um animal positivo para
infecção por Babesia caballi ou Theileria equi no estado de Mato
Grosso, Brasil.
Variável Propriedades positivas Propriedades positivas para
para B. caballi T. equi
Prevalência Valor de p Prevalência Valor de p
Bioma 0.03 <0,01
Amazônico 5,33% 30,03%
Cerrado 4,81% 27,88%
Pantanal 1,5% 18,35%
Tipo de exploração Frequência 1,0 Frequência
0.62
Relativa (no) relativa (no)
Fazenda de criação 100% (40) 0,73% (272)
Haras/Sociedade 0% (00) 99,27% (002)
Hípica
Finalidade do rebanho 1,0 <0.01
Serviço 97,5% (39) 94,89% (260)
Esporte/lazer 2,5% (01) 5,11% (014)
Tipo de manejo 0.72 0.09
Extensivo 97,5% (39) 96,35% (264)
Semi- 2,5% (01) 3,65% (010)
intensivo/Intensivo
Densidade animal/área 0.56 0.80
Muito denso 1 65% (26) 60,22% (165)
Pouco denso2 35% (14) 39,78% (109)
Compartilha agulha 0.75 0.65
Sim 32,5% (13) 30,29% (83)
Não 67,5% (27) 69,71% (191)
Tem áreas alagadas 0.95 0.65
Sim 32,5% (13) 32,84% (90)
Não 67,5% (27) 67,16% (184)
Assistência veterinária 0.67 0.42
Sim 5,0% (02) 5,11% (14)
Não 95% (38) 94,89% (260)
Legenda: 1 = área igual ou menor que 5 hectares por equídeo; 2 = área maior que 5 hectares por
equídeo
Apenas a variável “bioma” atingiu nível de significância estatística (p <

0,20), para as propriedades com resultado positivo para a infecção por B. caballi,
sendo assim, inserida no modelo de regressão logística para a análise dos fatores
associados ao risco (Tabela 9).
61
Tabela 9 - Estimativas para o modelo de regressão logística, considerando a

variável selecionada pelo teste qui-quadrado para propriedades com
equídeos infectados pela Babesia caballi no estado de Mato Grosso,
Brasil.
Variáveis Estimativas Valor p OR 2,50% 97,50%
Intercepto -2,87 <0,01 0,05 0,03 0,08
Cerrado -0,10 0,75 0,89 0,44 1,75
Pantanal -1,30 0,01 0,27 0,07 0,71
Na análise de risco, o bioma Pantanal atingiu nível de significância

estatística (p < 0,05), a propriedade que pertence a este bioma tem 72,99%
menos chances de ter equídeos infectados por B. caballi.
As variáveis “bioma” “finalidade do rebanho” e “tipo de manejo” atingiram

nível de significância estatística (p < 0,20), para as propriedades com resultado
positivo para a infecção por T. equi, sendo inseridas no modelo de regressão
logística para a análise dos fatores associados ao risco (Tabela 9).

variáveis selecionadas pelo teste qui-quadrado para as propriedades
com equídeos infectados por Theileria equi no estado de Mato
Grosso, Brasil.
Variáveis Estimativa Valor-p OR 2,50% 97,50%
Intercepto 0,34 0,50 1,41 0,50 3,94
Cerrado -0,29 0,08 0,74 0,53 1,03
Pantanal -0,29 <0,01 0,43 0,29 0,63
Finalidade do rebanho -17,73 <0,01 0,16 0,06 0,42
Tipo de manejo 0,77 0,05 2,16 1,02 5,15
A localização da propriedade no bioma Pantanal fez com que diminuísse a

chance da propriedade ter equídeos positivos para a infecção por T. equi em
56,23%. As propriedades que utilizavam os equídeos para a realização do serviço
da fazenda tinham menos chance de ter animais infectados por T. equi em
83,02%.
62
5.3 –Distribuição espacial das propriedades com animais infectados por

B. caballi.
A distribuição das propriedades positivas e negativas para a infecção por B.

caballi por bioma do estado de Mato Grosso, estão apresentadas na Figura 4.
Figura 4 - Distribuição das propriedades positivas e negativas para a infecção de

equídeos por Babesia caballi por bioma do estado de Mato Grosso,
Brasil.
A Figura 5 apresentada a distribuição espacial das propriedades positivas

para B. caballi, obtida por meio do estimador kernel, onde observa-se uma
variação de zero a duas propriedades positivas, sendo que a maior concentração
encontra-se nas regiões nordeste e sudeste do estado de Mato Grosso.
63
Figura 5 - Estimador Kernel da densidade de propriedades positivas para a

infecção de equídeos por Babesia caballi no estado de Mato Grosso,
Brasil.
A Figura 6 apresentada a distribuição espacial das propriedades negativas

para B. caballi, obtida por meio do estimador kernel, onde se observa uma
variação de 10 a 50 propriedade negativas, sendo que a maior concentração se
encontra na região do Pantanal, no sul do estado de Mato Grosso.
Figura 6 - Estimador Kernel da densidade de propriedades negativas para a

infecção de equídeos por Babesia caballi no estado de Mato Grosso,
Brasil.
64
A função de correlação marcada da distribuição espacial das propriedades

positivas e negativas está apresentada na Figura 7. Verifica-se que há relação
entre a localização da propriedade e a sua positividade, pois existem pontos fora
do intervalo de confiança, indicando que a positividade da propriedade está
relacionada com a sua localização e esta relação tende a formar agrupamentos
“clusters”. As propriedades positivas estão próximas a propriedades positivas e
propriedades negativas estão próximas a propriedades negativas.
Figura 7 - Função de correlação marcada da distribuição espacial das

propriedades positivas e negativas para a infecção de equídeos por
Babesia caballi no estado de Mato Grosso, Brasil.
Na Figura 8 é apresentada a distribuição espacial do risco relativo da

presença de equídeos positivos para a infecção por B. caballi nas propriedades
rurais do estado de Mato Grosso, verifica-se que o risco da doença varia de 0,05
a 0,2, sendo considerado constante no espaço (valor p=0,052).
Independentemente da localização, as propriedades tem o mesmo risco de ter
animais infectados por B. caballi.
65
Figura 8 - Estimador Kernel do risco relativo da infecçãopor Babesia caballi em

equídeos das propriedades rurais do estado de Mato Grosso, Brasil.
Na Figura 9 é apresentada a função de correlação marcada da distribuição

espacial das propriedades com animais positivos para a infecção por B. caballi e o
valor da prevalência da infecção na propriedade. Verifica-se que não há relação
entre a localização da propriedade e o valor da prevalência da infecção por B.
caballi em seus animais, pois não existem pontos fora do intervalo de confiança.

propriedades com equídeos positivos para Babesia caballi e o valor da
prevalência da infecção em propriedades rurais do estado de Mato
Grosso, Brasil.
66

T. equi.
A distribuição das propriedades positivas e negativas para a infecção por T.

equi por bioma do estado de Mato Grosso, está apresentada na Figura 10.
Figura 10 - Distribuição das propriedades positivas e negativas para a infecção

por Theileria equi por bioma do estado de Mato Grosso, Brasil.
A Figura 11 apresentada a distribuição espacial das propriedades positivas

para T. equi, obtida por meio do estimador kernel, onde se observa uma variação
de 1 a 4 propriedades positivas, sendo que as maiores concentrações se
encontram nas regiões nordeste e sudoeste do estado de Mato Grosso.
67
Figura 11 - Estimador Kernel da densidade de propriedades com equídeos

positivos para a infecção por Theileria equi no estado de Mato
Grosso, Brasil.
A Figura 12 apresentada a distribuição espacial das propriedades negativas

para T. equi, obtida por meio do estimador kernel, onde se observa uma variação
de 10 a 40 propriedades negativas, sendo que a maior concentração encontra-se
na região do Pantanal, no sul do estado de Mato Grosso.
Figura 12 - Estimador Kernel da densidade de propriedades com equídeos

negativos para a infecção por Theileria equi no estado de Mato
Grosso, Brasil.
68
A função de correlação marcada da distribuição espacial das propriedades

positivas e negativas para a infecção por T. equi está apresentada na Figura 13.
Verifica-se que há relação entre a localização da propriedade e a sua positividade,
pois existem pontos a cima, fora do intervalo de confiança, esta relação tende a
formar agrupamentos “clusters”. As propriedades positivas estão próximas das
propriedades positivas e propriedades negativas estão próximas das propriedades
negativas.

propriedades com equídeos positivos e negativos para a infecção por
Theileria equi no estado de Mato Grosso, Brasil.
Na Figura 14 é apresentada a distribuição espacial do risco relativo da

presença de equídeos positivos para a infecção por T. equi, nas propriedades
rurais do estado de Mato Grosso, verifica-se que o risco da doença varia de 0,5 a
1,5, e não pode ser considerado constante no espaço (valor p=0,041). As
propriedades têm maior ou menor risco de ter equídeos infectados pela T. equi
dependendo da sua localização. Observa-se que as áreas que apresentam maior
risco estão a oeste e a noroeste do estado.
69
Figura 14 - Estimador Kernel do risco relativo da infecção por Theileria equi em

propriedades rurais do estado de Mato Grosso, Brasil.
Na Figura 15 é apresentada a função de correlação marcada da

distribuição espacial das propriedades com animais positivos para a infecção por
T. equi e o valor da prevalência da infecção na propriedade. Verifica-se que não
há relação entre a localização da propriedade e o valor da prevalência da infecção
por T. equi, pois não existem pontos fora do intervalo de confiança, indicando que
a localização da propriedade não está relacionada com o valor da prevalência da
infeção por T. equi em seus animais.
70

propriedades com equídeos positivos para Theileria equi e o valor
da prevalência da infecção em propriedades rurais do estado de
Mato Grosso, Brasil.
5.5 - Análise filogenética
As sequências de B. caballi apresentaram variabilidade intraespecífica de

1,95%, contrastando com 2,99% em T. equi. Dendrogramas baseados na máxima
parcimônia para B. caballi e T. equi demonstraram a presença de subgrupos
conforme observamos nas Figuras 16 e 17, respectivamente, com altos valores de
sustentação dos ramos. Os números de acesso à sequência de nucleotídeos do
GenBank gerados no presente estudo são: MG906574- MG906586 para
sequências parciais do gene RAP-1de B. caballi e MG906587– MG906646 para
sequências parciais do gene EMA-1 de T. equi.
71
Figura 16 – Dendograma inferido pelo método de máxima parcimônia inferida a

partir de sequências do gene RAP-1de Babesia caballi. Os números
nos nós são os valores de suporte para as ramificações principais
(bootstrap acima de 500 réplicas).
72
Figura 17 – Dendograma inferido pelo método de máxima parcimônia inferida a

partir de sequências do gene EMA-1 de Theileria equi. Os números
nos nós são os valores de suporte para as ramificações principais
(bootstrap acima de 500 réplicas).
73
6 DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliou-se a prevalência da infecção por

piroplasmídeos (B. caballi e T. equi) em equídeos no estado de Mato Grosso, por
meio de métodos moleculares, em 1.624 equídeos (1.389 equinos, 227 muares, 8
asininos) de 973 fazendas do estado do Mato Grosso, envolvendo três diferentes
biomas: o Amazônico, o Cerrado e Pantanal. Também foram analisadas variáveis
associadas à ocorrência de infecção nos rebanhos equídeos, bem como a
diversidade genética interespecífica de B. caballi e T. equi.
Apesar da B. caballi e da T. equi terem sido previamente detectadas no
Pantanal mato-grossense (BARROS et al., 2015), este é o primeiro estudo
epidemiológico que pesquisou a prevalência de piroplasmídeos em equídeos de
todo o estado. Observamos que a piroplasmose é frequente em Mato Grosso,
com maior prevalência de T. equi (25,91%; IC95%; 21,67%; 30,15%) do que B.
caballi (2,74%; IC 95; 1,76%; 3,71%) entre equídeos. Esses resultados são
semelhantes aos encontrados em outros estudos realizados no Brasil (HEIM et
al., 2007; VIEIRA et al., 2018), e em outros países (POSADA-GUZMÁN et al.,
2015; GUVEN et al., 2017). Isso pode ser devido a diferenças na biologia dos
vetores, bem como diferenças na persistência do parasito no hospedeiro equídeo
(SCOLES e UETI, 2015).
Na maioria dos casos, os equídeos infectados pela T. equi desenvolvem
uma infecção crônica e quando tratados podem manter a infecção (GRAUSE et
al., 2013), tornando-se portadores assintomáticos. Já os equídeos infectados pela
B. caballi podem apresentar uma infecção auto limitante, sem mesmo receberem
o tratamento (WISE et al., 2013). Somado a estes fatores, considera-se o R.
microplus o único vetor biológico conhecido, responsável pela transmissão
intraestadial e transestadial de T. equi na América do Sul, e o D. nitens é
reconhecido como o único vetor capaz de realizar a transmissão transovariana de
B. caballi nas Américas (SCOLES e UETI, 2015).
No Brasil foi demonstrada uma relação entre a prevalência da infecção por
T. equi em equídeos que compartilham a pastagem com bovinos (TORRES et al.,
74
2012). Os bovinos são os principais hospedeiros para o R. microplus, e sabe-se

que a infestação de outras espécies de hospedeiros com este carrapato depende
deste compartilhamento (LABRUNA et al., 2001; PECKLE et al., 2013).
No presente estudo observamos que as fazendas localizadas no Pantanal
são menos propensas a ter animais infectados com B. caballi e T. equi. Além
disso, os animais criados no Pantanal eram menos propensos a serem infectados
com ambos agentes. O Pantanal é caracterizado por ciclos de enchentes e secas,
onde mais de 80% das planícies estão submersas durante o período chuvoso
(ALHO, 2008). Portanto, a inundação total ou parcial de pastagens pode eliminar
os carrapatos da vegetação e também afetar a sobrevivência do mesmo. Ramos
et al. (2015) estudaram relações ecológicas entre bovinos Nelore (Bos indicus) e
carrapatos no Pantanal brasileiro, e apesar de R. microplus (vetor conhecido de T.
equi) ser a espécie de carrapato mais abundante em bovinos, a maior prevalência
global de carrapatos em bovinos na estação seca foi de ninfas de Amblyomma
sculptum. Além disso, durante todo o estudo, R. microplus não foi encontrado no
meio ambiente.
Segundo Campbell e Glines (1979) as condições de maior ou menor
inundação de terra têm grande influência na biologia dos ixodídeos, além de
outros fatores ambientais, como temperatura e umidade ambiente. Louzada e
Daemon (2003), verificaram os efeitos da imersão de fêmeas ingurgitadas de R.
microplus, e observaram um efeito negativo nos parâmetros de reprodução,
através de um efeito negativo sobre o peso dos ovos, alterações na postura e na
eclosão. Além disso, Paula et al. (2004) observaram que a imersão em água é
prejudicial à fase de vida livre das larvas de D. nitens (vetor conhecido de B.
caballi). Assim, as diferenças entre os biomas e suas condições edafoclimáticas
devem influenciar a epidemiologia da infecção por piroplasmídeos em equídeos.
A prevalência sorológica de T. equi em um rebanho tende a aumentar
juntamente com a idade dos animais, o que foi atribuído ao estado de portador
crônico em que comumente são encontrados os animais mais velhos (DE WAAL,
1992). No estado do Rio de Janeiro, Santos et al. (2011) identificaram uma
prevalência de 87,5% para T. equi em equídeos com idade entre seis meses e um
ano em um rebanho 714 animais examinados. Considerando a ausência de
75
imunidade passiva nessa faixa etária, os autores supõem que a primeira infecção
por T. equi possivelmente tenha ocorrido entre seis meses e um ano ou até
mesmo antes disso. Neste estudo, observamos que equídeos com idade entre
seis meses e dois anos e onze meses têm um risco 1,2 vezes maior de infecção
por T. equi, entretanto, animais com mais de 10 anos têm uma diminuição de
10,08% na chance de estarem infectados com T. equi. Nossos resultados estão
de acordo com Bartolomé Del Pino et al. (2016) que também mostraram
prevalência para T. equi diminuindo com a idade, conforme detectado pela PCR.
No entanto, eles são contrários a alguns relatos na literatura que destacaram um
aumento cumulativo dependente da idade na prevalência de T. equi pela PCR
(RÜEGG et al., 2008), e para outros que não mostraram associação com a idade
e taxas de infecção (PECKLE et al., 2013). Assim, as circunstâncias que
influenciam as taxas de positividade para a infecção por T. equi durante a vida de
um equino requerem estudos adicionais devido à sensibilidade dos vários
métodos usados em estudos envolvendo a interação parasita-hospedeiro
(BARTOLOMÉ DEL PINO et al., 2016). De fato, as associações entre idade e
infecção relatadas na literatura podem ser devidas ao pequeno tamanho da
amostra de animais em algumas categorias, o que, possivelmente, poderia
interferir na análise dos dados (SANTOS et al., 2011).
Observamos que as propriedades que utilizavam os equídeos para o
serviço (260 de 274) apresentaram menor chance de terem animais infectados
por T. equi em 83,02%. Vários trabalhos avaliaram fatores de risco associados à
piroplasmose em equinos (SANTOS et al., 2011; STEINMAN et al., 2012;
GARCÍA-BOCANEGRA et al., 2013; SUMBRIA et al., 2016), mas nenhum destes
avaliou a associação e o risco da finalidade do rebanho frente a positividade para
a infecção por piroplasmídeos. Abutarbush et al. (2012) identificaram a criação
extensiva, como fator de risco com 11 vezes mais chance de ter equinos
infectados pela T. equi. do que equinos confinados ou semi-confinados. Kouam et
al. (2010) observaram risco três vezes maior de infecção por B. caballi, e T. equi,
isoladamente, e de infecção mista em equinos de fazenda do que em equinos
usados para recreação. O uso de equídeos para serviço aproxima os animais dos
humanos o que facilita a visualização de carrapatos (vetores dos piroplasmídeos),
76
e permite um melhor controle destes ectoparasitas. Este melhor controle

possivelmente seja a causa do menor risco de infecção nestes animais.
Houve relação entre a localização da propriedade e a sua positividade para
ambos os agentes. Observando a função de correlação marcada da distribuição
espacial das propriedades positivas e negativas para B. caballi (Figura 7) e T. equi
(Figura 13), verificamos que existe uma relação de aglomeração. As propriedades
positivas estão próximas das propriedades positivas e propriedades negativas
estão próximas das propriedades negativas. Apesar de não ter sido estudado o
movimento dos animais entre as propriedades neste trabalho, Scoles e Ueti
(2015) afirmam que o movimento de animais portadores assintomáticos, em
regiões com vetores competentes, os carrapatos, pode ser uma fonte de infecção
para as populações de cavalos suscetíveis, sugerindo que o trânsito de animais
entre propriedades possa ser a causa para esta aglomeração.
As propriedades rurais do estado de Mato Grosso tem maior ou menor
risco de terem equídeos infectados pela T. equi, de acordo com sua localização
(valor p=0,041). Observou-se que as áreas que apresentam maior risco estão a
oeste e a noroeste do estado (Figura 14), pertencentes ao bioma Amazônico, que
apresentou maior prevalência da infeção por T. equi em equídeos e propriedades,
e tem condições climáticas mais favoráveis para a manutenção dos vetores
(RAMOS et al., 2017; LABRUNA et al., 2002). Além disso, nas áreas com maior
risco estão os municípios de Comodoro, Juína, Aripuanã e Colniza, juntos, estes
quatro municípios detém 6,83% do rebanho bovino do estado de Mato Grosso,
quase dois milhões de cabeças em criação extensiva (MATO GROSSO, 2017). É
conhecido que o R. microplus é o único vetor biológico que transmite a T. equi na
América do Sul (SCOLES e UETI, 2015), e que o compartilhamento das
pastagens entre bovinos e equinos aumenta a prevalência da infecção por T. equi
(LABRUNA et al., 2001; TORRES et al., 2012), assim, possibilitando maiores risco
de infecção da população equídea nesta região do estado.
No Brasil existem poucos estudos filogenéticos que caracterizam os
piroplasmas de equinos infectados no país. Nosso trabalho, analisando as
sequências dos genes de B. caballi e T. equi de equídeos infectados dos três
biomas (Amazônico. Cerrado e Pantanal), do estado do Mato Grosso identificou
77
divergência de sequências para B. caballi de 1,95% e 2,99% para T. equi. Braga

et al. (2017), e Peckle et al. (2018) avaliando sequências do gene RNAr 18S de
amostras brasileiras observaram variabilidade entre 0,5% e 2,1% para T. equi,
que possibilitou a separação de diferentes genótipos.
A divergência intraespecífica de T. equi encontrada no gene EMA-1 foi
maior que a apresentada pelo gene 18S. No entanto, não foi possível distinguir os
subgrupos/genótipos relacionados aos biomas estudados. A ausência de padrões
claros relacionados ao bioma pode ser atribuído às migrações internas dos
animais, impossibilitando a formação de barreiras ou isolamento geográfico
necessários para identificar os agrupamentos, “clusters”.
Outros estudos com a geração de novas sequências de B. caballi e T. equi
de diferentes regiões e biomas brasileiros poderiam minimizar os efeitos do
tráfego animal na análise da variabilidade intraespecífica.
78
7 CONCLUSÃO
A piroplasmose equina ocorre nos três biomas do estado do Mato Grosso,

sendo que a prevalência da infeção por T. equi é quase dez vezes maior que a
prevalência da infecção por B. caballi. O bioma Amazônico apresenta o maior
número de animais e fazendas infectadas por ambos os agentes (B. caballi e T.
equi), enquanto fazendas localizadas no Pantanal e animais criados neste bioma
tem menor probabilidade de serem infectados com ambos os protozoários. Existe
maior risco de infeção de equídeos por T. equi nas regiões oeste e noroeste do
estado. Animais entre seis meses e dois anos e onze meses de idade correm um
risco maior de infecção por T. equi. Curiosamente, os animais com idade superior
a dez anos mostraram estar em risco reduzido de infecção por T. equi. A análise
intraespecífica das sequências obtidas para B. caballi e T. equi não nos permitiu
distinguir os subgrupos / genótipos relacionados aos diferentes biomas da área
estudada.
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ANEXO 1
93
94
95
96
ANEXO 2
Artigo aceito para publicação

Revista: Brazilian Journal of Veterinary Parasitology
Fator de impacto JCR 2016: 1.139 Classificação Qualis/Capes: A2
ISSN 1984-2961 (Electronic)
www.cbpv.org.br/rbpv
Braz. J. Vet. Parasitol., Jaboticabal, Ahead of Print, 2018
Doi: https://doi.org/10.1590/S1984-296120180048
Molecular survey and genetic diversity of piroplasmids in

equids from Midwestern Brazil
Levantamento molecular e diversidade genética de piroplasmídeos em equídeos do Centro-Oeste do Brasil
Fabio Bernardo Schein1,2; Maerle Oliveira Maia1; Rute Witter1,3; Arlei Marcili4; Lázaro Manoel de Camargo2;
Valéria Dutra1; Luciano Nakazato1; Stefhano Luís Candido1; Elianara Martins de Almeida5;
Anderson Castro Soares de Oliveira1,5; Richard de Campos Pacheco1*
1
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias – PPGVET, Faculdade de Medicina Veterinária – FAVET, Universidade Federal
de Mato Grosso – UFMT, Cuiabá, MT, Brasil
2
Faculdade de Medicine Veterinária, Universidade de Cuiabá – UNIC, Cuiabá, MT, Brasil
3
Instituto Federal de Rondônia – IFRO, Jaru, RO, Brasil
4
Programa de Pós-graduação em Medicina e Bem-Estar Animal, Universidade de Santo Amaro – UNISA, São Paulo, SP, Brasil
5
Departmento de Estatística, Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT, Cuiabá, MT, Brasil
Received May 04, 2018

Accepted June 06, 2018
Abstract
We evaluated the distribution of piroplasmids in equids from the Mato Grosso state in Midwestern Brazil using
molecular methods and the interspecific genetic diversity. For this, 1,624 blood samples of equids from 973 farms
were examined by PCR, using primer pairs that amplify a fragment of the genes rap-1 and ema-1 of Babesia caballi
and Theileria equi, respectively. For molecular characterization and phylogenetic studies, 13 and 60 sequences of the
rap-1 and ema-1 genes, respectively, were used to build a dendogram using maximum parsimony. B. caballi and T. equi
were detected in 4.11% and 28.16% of the farms, respectively, and molecular prevalence was 2.74% for B. caballi and
25.91% for T. equi. fte location of the farms and animals raised in the Pantanal ecoregion influence the probability of
equids testing positive for B. caballi and T. equi. Moreover, age and herd purpose were variables significantly associated
with T. equi infection. fte sequences of B. caballi presented 1.95% intraspecific variability, contrasting with 2.99% in
T. equi. Dendrograms for both species demonstrated the presence of subgroups with high values of support of branches.
However, it is not possible to associate these groups with geographic origin and/or ecoregion.
Keywords: Babesia caballi, Theileria equi, equine babesiosis, equine piroplasmosis, phylogenetic analysis.
Resumo
Foi avaliada a distribuição de piroplasmídeos em equídeos do Estado de Mato Grosso, no Centro-Oeste do Brasil,
utilizando-se métodos moleculares e a diversidade genética interespecífica. Para isso, 1.624 amostras de sangue de
equídeos de 973 fazendas foram examinadas pela PCR, usando pares de oligonucleotídeos que amplificam um fragmento
dos genes rap-1and ema-1 de Babesia caballi e Theileria equi, respectivamente. Para caracterização molecular e estudos
filogenéticos, foram utilizadas 13 e 60 sequências dos genes rap-1 e ema-1, respectivamente, para construção de um
dendograma utilizando máxima parcimônia. B. caballi e T. equi foram detectados em 4,11% e 28,16% das fazendas,
respectivamente, e a prevalência molecular foi de 2,74% para B. caballi e 25,91% para T. equi. A localização das fazendas
e animais criados na ecorregião do Pantanal influenciam a probabilidade de equídeos serem positivos para B. caballi e
T. equi. Além disso, idade e propósito do rebanho foram variáveis, significativamente, associadas à infecção por T. equi.
As sequências de B. caballi apresentaram variabilidade intraespecífica de 1,95%, contrastando com 2,99% em T. equi.
Dendrogramas para ambas as espécies demonstraram a presença de subgrupos com altos valores de sustentação dos
ramos. No entanto, não é possível associar esses grupos com origem geográfica e/ou ecorregião.
Palavras-chave: Babesia caballi, Theileria equi, babesiose equina, piroplasmose equina, análise filogenética.
*Corresponding author: Richard de Campos Pacheco. Faculdade de Medicina

Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT, Av. Fernando
Corrêa da Costa, 2367, Boa Esperança, CEP 78060-900, Cuiabá, MT, Brasil.
e-mail: richard@ufmt.br
ftis is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution,
and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
2/9 Schein, F.B. et al. Braz. J. Vet. Parasitol.
Introduction Materials and Methods

Equine piroplasmosis is a tick-borne disease of horses and other Study Area
Equidae (donkeys, mules, and zebras) caused by the hemoprotozoan
parasites Theileria equi and Babesia caballi (WISE et al., 2013; With nearly one thousand square kilometers, the state of
WISE et al., 2014). ftese two parasites are classified within the Mato Grosso is located in Midwestern Brazil, encompassing
phylum Apicomplexa, and despite their biological differences, they biotic elements from Amazonia, Cerrado (Brazilian savannah),
cause a similar pathology and have similar life cycles and vector and Pantanal ecoregions. Southern Amazon forests correspond to
relationships. Acute disease is characterized by fever, malaise and nearly 53% of the state and are located in its northern portion.
reduced appetite, increased pulse rate and respiration, anorexia, fte Cerrado – a huge tropical savannah that extends across the
constipation followed by diarrhea, tachycardia, petechiae, Brazilian Central Plateau – occupies nearly 40% of the state,
splenomegaly, thrombocytopenia, and hemolytic anemia leading to in its central portion; and the Pantanal – the largest tropical
hemoglobinuria and icterus (MEHLHORN & SCHEIN, 1998; wetland in the world – occupies another 7% of the state area, in
UILENBERG, 2006; ROTHSCHILD, 2013; WISE et al., 2013; its southwestern portion (BRASIL, 2014).
HABIBI et al., 2016). Blood samples were collected during the course of a previous
Horses that recover from acute disease remain chronically-infected study on the epidemiology of equine infectious anemia (EIA)
carriers without any overt signs of disease and can be reservoirs within the three ecoregions in the state of Mato Grosso. ftis study
for the transmission of these protozoan pathogens with ticks as was conducted from September to December 2014 (BARROS,
a major vector. Parasitemia is often too low to detect on blood 2017). fte stored samples were made available for this study after
smears, but infected animals can be identified by serology or the conclusion of the previous study.
polymerase chain reaction (PCR) (WISE et al., 2013; WISE et al., Concomitant with sampling, each farmer was asked to fill
2014; SCOLES & UETI, 2015). Ticks are the definitive hosts out a questionnaire for subsequent epidemiological data analysis.
for both T. equi and B. caballi, and in Brazil, these two parasites
are mainly transmitted by Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Sampling procedures
and Dermacentor nitens, respectively (SCOLES & UETI 2015).
Furthermore, equine piroplasmosis has an economic importance
According to the Mato Grosso Institute for Agricultural
because of the potential effect of the international movement Defense (INDEA/MT, 2014), there are currently 306,931 equids
of these horses for trade and for participation in international
on 53,710 farms distributed through three ecoregions (Cerrado,
sporting events (WISE et al., 2013; WISE et al., 2014; SCOLES Pantanal and Amazonia) in the state, as observed in table 1.
& UETI, 2015). fte sample size was determined by the statistical formula
Piroplasmosis occurs in most countries around the world
and infection is maintained within equine populations as long as n0=[Np(1-p)/(N-1)(d/Z α/2 )2+p(1-p)].deff (SCHAEFFER et al.,
2011). ftis formula considered population size (306,931 animals);
competent vectors are present. According to the World Organization
50% estimated prevalence (due the absence of prior studies and
for Animal Health (OIE), Central and South America, Cuba, Africa,
the maximum number of occurrences stay around 50% on the
Asia, the Middle East, and Southern Europe are considered to
normal distribution); 3% maximum error (d); 95% confidence
be endemic regions. Within South America, the disease is readily
interval (CI); and a design effect of 1.45 (deff). fte sample size was
identified in all regions, except for the southernmost areas of Chile
adjusted from 1,542 to 1,624 animals (1,389 equines, 227 donkeys
and Argentina (WISE et al., 2013). In Brazil, previous studies
and eight asinines) for the possibility of loss, and then distributed
using serological methods have shown that equine piroplasmosis
among the three ecoregions (Table 1). Considering that 77% of
is endemic, with prevalence rates varying from 19.4% to 100%
the farms had no more than five equids, the following criteria were
(KERBER et al., 1999; HEIM et al., 2007; KERBER et al., 2009;
used: only one animal was sampled on farms with five or fewer
BALDANI et al., 2010; SANTOS et al., 2011; MACHADO et al.,
2012; TORRES et al., 2012; VIEIRA et al., 2013; PROCHNO et al.,
2014; FERREIRA et al., 2016; GUIMARÃES et al., 2016; Table 1. Columns left to right: (1) Ecoregion in Mato Grosso state,
BRAGA et al., 2017). Brazil. (2) Total number of farms in each ecoregion. (3) Number of
Despite the endemicity of piroplasmosis among equids in farms sampled in the current survey. (4) Total number of equids in
Brazil, studies involving the molecular detection of the parasite each ecoregion. (5) Number of equids sampled in the current survey.
in carrier animals (HEIM et al., 2007; BALDANI et al., 2010; All the data were collected between September and December 2014.
PECKLE et al., 2013; MACHADO et al., 2012; BARROS et al., No. of No. of
No. of No. of
2015; FERREIRA et al., 2016; BRAGA et al., 2017) that have also Ecoregion1 sampled sampled
farms2 equids4
examined genetic diversity (BRAGA et al., 2017; PECKLE et al., farms3 equids5
2018) are scarce. fte aim of this study is to survey the distribution Amazonia 32,069 394 165,413 661
of piroplasmid (T. equi and B. caballi) parasites using molecular Cerrado 18,114 312 110,656 498
methods in equids from the Mato Grosso state and evaluate the Pantanal 3,527 267 30,862 465
interspecific genetic diversity. Total 53,710 973 306,931 1,624
Ahead of Print, 2018 Equine piroplasmosis in Midwestern Brazil 3/9
equids, while five animals were randomly sampled on farms that of 570 and 750 base pairs (bp), respectively. ftis PCR analysis
had more than five equids. procedure was adapted from Alhassan et al. (2005). fte reaction
Sampling was performed in two stages: selection of farms mixture consisted of 1.5 μl template DNA (B. caballi) or 2 μl
and selection of Equidae. Selection procedures were as follows: (T. equi), 2.5 μl 10× PCR buffer, 4.0 μl MdNTP mix, 0.15 μl
a pre-established number of random farms (primary sampling Taq DNA polymerase (Sigma-Aldrich), 0.5 μl each of 10 pmol
units) was selected, which resulted in the sampling of 973 farms B. caballi and T. equi specific primers, and 15.35 μl of distilled
(Table 1). Next, a random selection of equids on each farm water (B. caballi) or 15.85 μl (T. equi), for a total volume of 25 μl.
(secondary sampling units) was performed. Figure 1 shows the fte amplification conditions for B. caballi and T. equi were as follows:
distribution of the farms sampled for the screening of B. caballi 40 cycles with an initial enzyme activation at 96 °C for 10 min,
and T. equi infection in the three ecoregions (Amazonia, Pantanal
denaturation at 96°C for 1 min, primer annealing at 60.5 °C for
and Cerrado) of the state of Mato Grosso.
1 min, extension at 72 °C for 1 min and final extension at 72 °C
for 10 min. For all PCR assay, B. caballi and T. equi DNA samples
DNA extraction and PCR obtained from naturally infected horse (BARROS et al., 2015)
and ultra-pure sterile water were used as positive and negative
DNA was extracted from 60 μg of each blood clot sample
controls, respectively. PCR product sizes were analyzed on 1.5%
by the phenol-chloroform- isoamyl method as described by
agarose gel stained with GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, and
Sambrook & Russel (2001). In order to verify the presence of
amplifiable DNA, 163 randomly selected samples were submitted visualized in a ChemiDoc XRS system.
to internal control PCR assays targeting fragments of mammalian
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), as Sequencing and phylogenetic analysis
previously described (BIRKENHEUER et al., 2003). Each
sample of extracted DNA was submitted for PCR analysis, For molecular characterization and phylogenetic studies of
using species-specific primer pairs based on the genes rap-1 for B. caballi and T. equi isolates, fragments of 569 and 675 bp from
B. caballi and ema-1 for T. equi, which amplified DNA fragments rap-1 and ema-1 genes, respectively, were used. DNA from positive
Figure 1. Distribution of farms sampled for the detection of Babesia caballi and Theileria equi in equids from the three ecoregions (Pantanal,
Cerrado and Amazonia) of the Mato Grosso state, Brazil, between September and December 2014.
samples was purified and sequenced in an automated sequencer recreation). Statistical analysis was performed using the R statistical
(ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer, Foster City, CA). software package (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2015).
All the sequences obtained were aligned with sequences previously ftis study was approved by the Animal Research Ethics
determined for B. caballi and T. equi, available in GenBank, Committee of the Federal University of Mato Grosso, under
using ClustalX (THOMPSON et al., 1997). fte sequences were reference no. 23108.016503/14-9.
adjusted manually using GeneDoc (NICHOLAS et al., 1997).
fte rap-1 and ema-1 sequences were used to build a dendogram
using maximum parsimony, as implemented in PAUP version
Results
4.0b10 (SWOFFORD, 2002), with 500 bootstrap replicates, B. caballi and T. equi were detected in at least one animal on
random stepwise addition starting trees (with random addition
40 and on 274 of 973 analyzed farms (Figure 1), resulting in a
sequences), and TBR branch swapping.
herd prevalence of 4.11% (CI 95%, 2.86%; 5.36%) and 28.16%
(CI 95%; 25.33%; 30.99%), respectively. We observed distribution
Prevalence and statistical analysis of herd prevalence for B. caballi and T. equi, respectively, through
the three ecoregions (biomes) of the Mato Grosso as follows: 5.33%
Piroplasmid prevalence on each farm was analyzed based on (CI 95%; 3.11%; 7.55%) and 35.03% (CI 95%; 30.31%; 39.74%)
the logic that a farm would be considered positive if at least one in the Amazonia, 4.81% (CI 95%; 2.43%; 7.18%) and 27.88%
animal tested positive. A multiple logistic regression model was (CI 95%; 22.91%; 32.86%) in the Cerrado, and 1.50% (CI 95%;
created in several steps as follows: 1. For continuous variables, a 0.04%; 2.96%) and 18.35% (CI 95%; 13.71%; 23.00%) in the
linearity test was performed using graphs for log odds. When the Pantanal ecoregion. All 163 selected DNA samples amplified the
visual evaluation indicated a nonlinear trend, the continuous predicted product for GAPDH gene.
variable was categorized. fte optimization methodology of the Moreover, molecular prevalence of the total population was
software package CatPredi R was used (R DEVELOPMENT 2.74% (CI 95%; 1.76%; 3.71%) and 25.91% (CI 95%; 21.67%;
CORE TEAM, 2015). 2. For the categorical variables, a chi-square 30.15%) for B. caballi and T. equi, respectively, and mixed infection
or exact Fisher test was performed on the results and various was detected in 1.97% (32/1624). Distribution of prevalence
predictor variables. All variables with a value of p <0.20 were among the three ecoregions (biomes) are as follows for B. caballi
incorporated into the model. 3. fte selected variables were tested and T. equi, respectively: 3.63% (CI 95%; 2.20%; 5.06%) and
for collinearity including a multicollinearity analysis according to
30.26% (CI 95%; 26.76%; 33.76%) from the Amazonia, 3.41%
Vatcheva et al. (2016), to ensure a mean variance inflation factor
(CI 95%; 1.82%; 5.01%) and 28.31% (CI 95%; 24.36%; 32.27%)
(VIF) <10 prior to applying them in the models. 4. fte model was
from the Cerrado, and 0.86% (CI 95%; 0.02%; 1.70%) and
constructed by inserting all the variables selected in the previous
12.69% (CI 95%; 9.66%; 15.71%) from the Pantanal ecoregion.
steps. fte less-significant variables (according to the Wald test)
In the multivariate analysis, after the model was applied,
were then removed and the logistic regression analysis was then
location (ecoregion) was the only variable found to be significantly
repeated. ftis process was repeated, and the adjusted model was
associated with the prevalence of babesiosis on farms. Farms in the
compared to the previous one by a likelihood ratio test to check for
Pantanal ecoregion were 73% less likely to have equine infected
confounding factors. When there was a change of more than 30%
with B. caballi. Table 2 describes the relationship between the
in the parameter estimates, the removed variable was considered
positive farms and the variable of the logistic model. Furthermore,
to be a confounding factor and again included in the model.
animals raised in the Pantanal ecoregion were 3% less likely to be
fte variables used to construct the herd model were ecoregion
infected with B. caballi (Table 3).
(biome), type of holding (farm, breeding facility or horseback riding
Two variables were found to be significantly associated with
facility), herd purpose (service, sport/recreation or reproduction),
the prevalence of theileriosis on farms: location (ecoregion) in the
type of management (extensive, intensive or semi-extensive),
state, and herd purpose. Table 4 describes the relationship between
needle/syringe sharing among animals, flooded area at the farm,
the positive farms and the variables of the logistic model. Farms in
veterinary assistance, and animal density (greater than 5 hectares
per animal or less than 5 hectares per animal). the Pantanal ecoregion were 57% less likely to have equine infected
fte animals were analyzed following the same steps used to with T. equi, and farms that used equids to perform service were
analyze the farms. However, a complex analysis, according to Korn 84% less likely to have T. equi infected animals.
& Graubard (1999), was applied to the tests to correct the effect of
the weighted values used for the selection of animals. fte following Table 2. Results of the logistic regression model for risk factors
formula was used to determine the weighted value of each animal: associated with Babesia caballi herd prevalence on the 973 farms
(# total animals/# total animals sampled) x (# total animals on sampled in the state of Mato Grosso, Brazil, between September
the farm/# total animals sampled on the farm). and December 2014.
fte model was built using the following variables: ecoregion Odds
Associated variable Estimate p-value CI 95%
(biome), animal species, sex, age (classified as greater than six months Ratio
and less than 3 years, greater than 3 years and less than 10 years, Location in the -1.30 0.01 0.27 0.07 0.71
or greater ten than years), and animal purpose (work or sports/ Pantanal
Age and location of equids were variables significantly associated Discussion

with T. equi infection. Equids between six months and three years
old were 1.2 times (20%), more likely to be infected with T. equi, In this study, we investigated the occurrence of piroplasmids
and equines older than 10 years were 10% less likely to have T.equi (T. equi and B. caballi) using molecular methods in 1,624 equids
infection. Furthermore, animals raised in the Pantanal ecoregion (1,389 equine, 227 donkeys, eight asinines) from 973 farms from an
were 20% less likely to be infected with T. equi. Table 5 describes extensive region of Midwestern Brazil, which covers three different
the relationship between the prevalence of infection by T. equi in ecoregions (Amazonia, Cerrado and Pantanal) of the Mato Grosso
the Equidae population and the variables of the logistic model of state. Furthermore, we evaluated variables (risk factor) thought
the 1,624 animals sampled. to be associated with the occurrence of infection in animals and
ftirteen sequences of B. caballi were obtained from 13 farms Equidae herds, as well as the interspecific genetic diversity of
and 60 sequences of T. equi were obtained from 52 properties. B. caballi and T. equi.
fte sequences of B. caballi presented 1.95% intraspecific Despite the fact that B. caballi and T. equi have previously
variability, contrasting with 2.99% in T. equi. Dendrograms based been detected in the Pantanal ecoregion (BARROS et al., 2015),
on maximum parsimony for B. caballi (Figure 2) and T. equi this is the first study, to our knowledge, to show the prevalence of
(Figure 3) demonstrated the presence of subgroups with high piroplasmids in Equidae in the entire state. Herein, we confirm
support values of branches (Figure 3). fte GenBank nucleotide that infection is widespread in the studied region, with higher
sequence accession numbers generated in the present study are: prevalence of T. equi (25.91%) than B. caballi (2.74%) among
MG906574- MG906586 for partial sequences of the rap-1 gene equids. ftese findings are similar to those found in other studies
of B. caballi and MG906587– MG906646 for partial sequences conducted in Brazil (HEIM et al., 2007; VIEIRA et al., 2018) and
of the ema-1 gene of T. equi. other countries (POSADA-GUZMÁN et al., 2015; GUVEN et al.,
2017). ftis may reflect differences in the biology of the vectors,
as well as differences in persistence of the parasite in the equine
Table 3. Results of the logistical regression model for risk factors
associated with the prevalence of infection by Babesia caballi in
individual equids from the state of Mato Grosso, Brazil, between
September and December 2014.
Odds
Ratio
Location in the -0.02 <0.01 0.97 0.95 0.98
Pantanal
Table 4. Results of the logistic regression model for risk factors

associated with Theileria equi herd prevalence on the 973 farms
sampled in the state of Mato Grosso, Brazil, between September
and December 2014.
Odds
Ratio
Location in the Pantanal -0.29 < 0.01 0.43 0.29 0.63
Herd purpose -17.73 < 0.01 0.16 0.06 0.42
(service, sport/recreation
or reproduction)
Table 5. Results of the logistical regression model for risk factors

associated with the prevalence of infection by Theileria equi in
individual equids from the state of Mato Grosso, Brazil, between
September and December 2014.
Odds
Ratio
Age* (greater than six 0.18 <0.01 1.2 1.08 1.33
months and less than
three years)
Age (greater than ten -0.09 <0.01 0.9 0.85 0.95
years)
Location in the Pantanal -0.21 <0.01 0.8 0.73 0.87 Figure 2. Maximum parsimony tree inferred from rap-1 gene sequences
*Animal age, classified as greater than six months and less than 3 years, greater of Babesia caballi. Numbers at nodes are the support values for the
than 3 years and less than 10 years and greater than ten years. major branches (bootstrap over 500 replicates).
Figure 3. Maximum parsimony tree inferred from ema-1 gene sequences of Theileria equi. Numbers at nodes are the support values for the
major branches (bootstrap over 500 replicates).
host (SCOLES & UETI, 2015). In most cases, the horses develop T. equi in South America, while D. nitens is the only transovarial
a chronic infection and become asymptomatic carriers. While vector for B. caballi in the Americas (SCOLES & UETI, 2015).
horses infected with B. caballi can undergo self-clearance of the Unexpectedly, when the purpose of the herd was for service,
parasite without treatment, this is a lifelong chronic infection for the likelihood of a farm to be positive for T. equi decreased by
equids infected with T. equi (WISE et al., 2013). Furthermore, the 83.02%, once horse’s activities related to work have already been
tick vector R. (B.) microplus is the only known biological vector described as factors that affect the likelihood of infection by
responsible for the intrastadial and transstadial transmission of T. equi (PECKLE et al., 2013; ABUTARBUSH et al., 2012).
Furthermore, the activities that the horse exerts on the farm, PINO et al., 2016). Indeed, the associations of age and infection
mainly, cattle handling, allows move into large pasture perimeters that are reported in the literature may be due to the small sample
and may increase their chances of infestation by potential tick size of animals in some categories, which could possibly interfere
vector (PECKLE et al., 2013). with the analysis of the data (SANTOS et al., 2011).
In the present study, farms located in the Pantanal are less likely Characterizations of piroplasm sequences from Brazilian horses
to have animals infected with B. caballi and T. equi. Moreover, are scarce. Intraspecific analysis of the sequences obtained from
animals raised in the Pantanal ecoregion were less likely to be equids of different ecoregions in the state of Mato Grosso showed
infected with both protozoans (B. caballi and T. equi). In fact, the 1.95% sequence divergence for B. caballi and 2.99% for T. equi.
lowest prevalence among farms and the Equidae population, both Studies based on ribosomal (18S) genes demonstrated variability
B. caballi and T. equi, were observed in the Pantanal ecoregion. between 0.5% and 2.1% for T. equi, allowing the segregation into
fte Pantanal ecosystem is characterized by flood and drought different genotypes (BRAGA et al., 2017; PECKLE et al., 2018).
cycles, where over 80% of the plains are submerged during the fte intraspecific divergence of T. equi found within the ema-1
rainy period (ALHO, 2008). fterefore, the total or partial gene was greater than that presented by the 18S gene. However,
flooding of pastures may eliminate ticks from the vegetation, and it was not possible to distinguish between subgroups/genotypes
could also affect tick survival. Ramos et al. (2016) have studied related to the different ecogeographic regions studied. fte absence
ecological relationships between Nellore cattle (Bos indicus) and of clear patterns related to the geographic region and/or ecoregion
ticks within the Brazilian Pantanal, and although R. (B.) microplus may be due to the internal migrations of the animals, making it
(the known vector of T. equi) was the most abundant tick species impossible to form the barriers or geographic isolation needed
on cattle (primary tick-host), the overall highest tick prevalence to identify clusters.
on bovines in the dry season was that of Amblyomma sculptum Further studies with the generation of new sequences of
nymphs. Additionally, during the entire study, R. (B.) microplus B. caballi and T. equi from different regions and Brazilian biomes
was not found in the environment. could minimize the effects of animal traffic in the analysis of
According to Campbell & Glines (1979), conditions of greater intraspecific variability.
or lesser flooding of land have a great influence on the biology
of Ixodidae, in addition to other environmental factors such as
ambient temperature and humidity. Louzada & Daemon (2003) Conclusions
and Santos et al. (2012) have verified the effects of the immersion
of engorged females of R. (B.) microplus, and observed a negative Equine piroplasmosis occurs throughout the three ecoregions
effect on reproduction parameters, through a negative effect over of the Mato Grosso state in Midwestern Brazil, with the Amazonia
the weight of the eggs, alterations in the egg-laying and in the ecoregion containing the largest number of animals and farms
hatching. Moreover, Paula et al. (2004) have observed that immersion infected by both agents (B. caballi and T. equi), while farms
in water is deleterious to the free-living phase of D. nitens larvae and animals raised in the Pantanal ecoregion were less likely to
(the known vector of B. caballi). ftus, the differences between be infected with both protozoans. Animals between six months
ecoregions and their edaphoclimatic conditions should influence and two years and eleven months old are at an increased risk of
the epidemiology of equine piroplasmosis. T. equi infection. Interestingly, animals over the age of ten years
T. equi seroprevalence rates increase with age, with the older
were shown to be at reduced risk of T. equi infection. Intraspecific
group related to a chronic infectious status (DE WAAL, 1992).
analysis of the sequences obtained for B. caballi and T. equi did
Santos et al. (2011) have observed in 714 equids (702 horses and
not allow us to distinguish between subgroups/genotypes related
12 mules) from the Rio de Janeiro state, that animals aged six to
12 months showed 87.5% of T. equi seropositivity. Furthermore, to the different ecogeographic regions under area studied.
considering the absence of maternal antibodies in this age group,
they have suggested that the first T. equi infection occurred between Acknowledgements
six and 12 months of age or possibly even younger since there
is no passive immunity in animals over six months old. We also fte authors gratefully acknowledge INDEA/MT for its
observed by molecular methods that equines older than six months technical support during the field work and for providing samples,
and less than three years have a 1.2-fold increased risk of T. equi as well as to FAPEMAT, Foundation for Research Support of
infection, however animals older than 10 years have a 10.08% the State of Mato Grosso (grant #223183/2015) for its financial
decrease in the chance of being infected with T. equi. Our results
support of this work, and CNPq (National Council for Scientific
are in agreement with Bartolomé Del Pino et al. (2016), who also
and Technological Development) for the awarding a research
showed prevalence for T. equi decreasing with age as detected by
productivity grant to L. Nakazato, R.C. Pacheco and V. Dutra.
PCR. However, they are contrary to some reports in literature
that have highlighted a cumulative age-dependent increase in the
PCR-prevalence of T. equi (RÜEGG et al., 2008) and to others References
that have shown no association with age and infection rates
(PECKLE et al., 2013). Hence, the circumstances that influence Abutarbush SM, Alqawasmeh DM, Mukbel MR, Al-Majali AM. Equine
positivity rates of T. equi during the lifetime of a horse, require Babesiosis: seroprevalence, risk factors and comparison of different
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA

INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia caballi

Fabio Bernardo Schein

INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia caballi

Autor: Fabio Bernardo Schein

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em

S319i Schein, Fabio Bernardo.

1. Piroplasmose equina. 2. Brasil. 3. Fatores

Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.

Dedico este trabalho a minha família

Agradeço a Deus por ter me fortalecido em todos os momentos desta

Em especial, agradeço a minha esposa e minhas filhas pelo apoio nos

Agradeço imensamente ao meu orientador, Professor Dr. Richard de Campos

Agradeço as colegas e amigas Rute Witter, Thábata dos Anjos Pacheco e

Agradeço a ex-estagiária Maicslayne Azevedo pelo apoio com a pesagem das

Agradeço ao amigo, colega e chefe, professor Dr. Lázaro Camargo e a todos

Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso pelo

“Jamais deixe o que é importante na vida para realizar o que é urgente.”

INFECÇÃO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Babesia caballi E Theileria equi EM

A piroplasmose equina é uma doença transmitida por carrapatos, causada pelos

Palavras chave: Análise filogenética, Brasil, fatores associados ao risco, Brasil

INFECTION AND GENETIC DIVERSITY OF Babesia caballi AND Theileria

Equine piroplasmosis is a tick-borne disease caused by the hemoprotozoa Theileria

Key words: Phylogenetic analysis, Brazil, risk factors

Tabela 1 Número de propriedades e número de equídeos por biomas no

Figura 1 A: Hemácia infectada por Babesia caballi (seta); B: Hemácia

Quadro 1 Dados mundiais de prevalência da infecção por Babesia caballi

CEPEA Centro de Estudos Avançados em Economia Aplicada

CNA Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil

cELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática Competitivo

ELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática

FC Teste de Fixação de Complemento

IFI Imunofluorescência Indireta

INDEA Instituto de Defesa Agropecuária do Estado de Mato Grosso

IC 95% Intervalo de confiança de 95%

OIE Organização Mundial de Saúde Animal

PCR Reação em Cadeia pela Polimerase

RT-PCR Reação da transcriptase reversa seguida da reação em cadeia pela

A equideocultura brasileira é um importante segmento do agronegócio

livres. A má gestão das populações de equídeos, incluindo cuidados veterinários

2.1 Definição, histórico, taxonomia e etiologia

A piroplasmose equina, também denominada babesiose, teileriose ou

como Theileria equi por Mehlhorn e Schein (MEHLHORN e SCHEIN, 1988).

Os agentes da piroplasmose equina e seus vetores competentes, os

Quadro 1 - Dados mundiais de prevalência da infecção por Babesia caballi e/ou

No mundo T. equi é mais prevalente que B. caballi, de acordo com a World

clínicos de piroplasmose, que foi confirmada por sorologia pelo Ensaio de

Quadro 2 - Casos de piroplasmose equina ocorridos no Brasil no ano de 2016 que

No Brasil, Ribeiro, Costa e Guimarães (1999), identificaram 60,4% de

Em São Paulo, Kerber et al. (2009) observaram 54,1% dos animais

2.3 – Classificação molecular da Babesia caballi e Theileria equi.

Sistemas de classificação de organismos têm sido organizados desde a

sequências apresentam maior similaridade do que poderia ser esperada se as

intraespecíficas ou mesmo quando comparadas com as sequências disponíveis já

2.4 Vetores e transmissão

A transmissão da piroplasmose ocorre pela inoculação dos hemoparasitos

processo de hematofagia dos carrapatos vetores em seus hospedeiros

Sousa et al. (2017b) identificaram pela PCR e posterior sequenciamento,

Quadro 3 - Espécies de carrapatos vetores ou suspeitos de serem vetores da

Hyalomma plumbeum B. caballi Rússia 3

Rhipicephalus T. equi América do Sul 1

No Brasil, o parasitismo de equinos por D. nitens foi, estatisticamente,

Grosso foi registrada a ocorrência das duas espécies, entretanto, A. cajennense