Apostila CLCNAT 2022.

COORDENAÇÃO DE SANEAMENTO AMBIENTAL - CSA
LABORATÓRIO DE SANEAMENTO -LABSAN

CAMPUS ARACAJU
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos e

Microbiológicos de Amostras de Efluentes Domésticos
Aracaju/SE
Sumário
1 ªParte ....................................................................................................................................................9
INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO......................................................................................................... 9
1.0 SEGURANÇA EM LABORATÓRIO...................................................................................................10
1.1. BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO........................................................................................ 10
1.3 HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS........................................................................................................ 16
2.0 MANUSEIO DE PRODUTOS QUÍMICOS..........................................................................................19
2.1 DIAGRAMA DE HOMMEL........................................................................................................... 19
2.2 PICTOGRAMAS............................................................................................................................20
2.3 SISTEMA SAF-T-DATA™.............................................................................................................21
2.4 DESCARTE DE MATERIAL......................................................................................................... 23
2.4.1 Resíduos Que Podem Ser Descartados Diretamente Na Pia Ou No Lixo........................ 23
3.0 CONCEITOS BÁSICOS DE MEDIÇÃO.............................................................................................. 25
4.0 AS VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIO................................................................ 27
4.1 TIPOS DE VIDRARIAS E SUAS FUNÇÕES.................................................................................. 27
4.1.1 Vidraria e Equipamentos Básicos do Laboratório de Saneamento.................................29
4.2 MANUSEIO, LIMPEZA E ESTERILIZAÇÃO DE VIDRARIAS...................................................... 39
4.2.1 Lavagem............................................................................................................................... 39
A) Álcool a 70%(etanol ou isopropílico):....................................................................................... 40
B) Hipoclorito de sódio 5%:.............................................................................................................40
C) Banho ácido.................................................................................................................................. 40
4.2.2 Autoclavação / Esterilização.............................................................................................. 41
4.3 NOÇÕES DE USO E CUIDADOS COM MICROPIPETAS..............................................................41
4.3.1 Tomada de alíquota utilizando micropipeta..................................................................... 42
5.0 IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS E SOLUÇÕES NO LABORATÓRIO..........................................44
2 ªParte ..................................................................................................................................................46
ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS..........................................................................46
1.0 DETERMINAÇÃO DA COR - Método - 2120 E............................................................................... 47
1.1 DEFINIÇÃO..................................................................................................................................47
1.2 COR APARENTE.......................................................................................................................... 47
1.2.1 Equipamentos, vidrarias e materiais................................................................................. 47
1.2.2 Procedimento experimental...............................................................................................48
1.3 COR VERDADEIRA (Real) - Método - 2120E............................................................................ 49
1.4 INTERFERENTES........................................................................................................................50
1.5 RESULTADO................................................................................................................................ 50
1.6 PRESERVAÇÃO DA AMOSTRA...................................................................................................50
2.0 DETERMINAÇÃO DA TURBIDEZ (2130 B Método Nefelométrico)............................................ 51
2.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO............................................................................................................ 51
2.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E MATERIAIS........................................................................... 51
2.3 REAGENTES................................................................................................................................ 51
2.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL........................................................................................... 51
a) Preparação do equipamento: Turbidímetro TB- 1000P...........................................................51
2.5 RESULTADO................................................................................................................................ 53
2.6 INTERFERENTES........................................................................................................................53
2.7 PRESERVAÇÃO DA AMOSTRA...................................................................................................53
3.0 RESÍDUOS OU SÓLIDOS (2540 SÓLIDOS).................................................................................... 54
3.1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................................54
3.2 SÓLIDOS TOTAIS à 103–105 °C 2540 B....................................................................................55
3.2.1 Princípio do método............................................................................................................55
a)Preparação da cápsula:.................................................................................................................55
b) Preparação da amostra:...............................................................................................................56
c) Cálculo:.......................................................................................................................................... 56
3.3 SÓLIDOS FIXOS E VOLÁTEIS à 550 ° C 2540 E.........................................................................57
3.3.1 Princípio do método............................................................................................................57
a) Cálculos Sólidos Fixos:................................................................................................................. 57
b) Cálculo para Determinação de Sólidos Totais Voláteis.............................................................58
3.4 PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS............................................................................................... 58
4.0 DETERMINAÇÃO DE RESÍDUO SEDIMENTÁVEL EM ÁGUAS, MÉTODO DO
CONE IMHOFF....................................................................................................................................... 60
4.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS.......................................................................................61
5.0 DETERMINAÇÃO DO pH MÉTODO ELETROMÉTRICO................................................................ 63
5.1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................................63
5.3 EQUIPAMENTOS VIDRARIAS E MATERIAIS............................................................................ 65
5.4 REAGENTES................................................................................................................................ 65
5.5 PROCEDIMENTO E XPERIMENTAL.......................................................................................... 65
5.6 LEITURA DA AMOSTRA............................................................................................................. 65
6.0 DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO – DBO.............................................................................67
6.2 EQUIPAMENTOS VIDRARIAS E MATERIAIS............................................................................ 67
6.3 REAGENTES................................................................................................................................ 67
6.4.1 Volume da Amostra.............................................................................................................68
6.4.2 Preparação da Amostra de água........................................................................................ 68
6.5 INTERPRETANDO OS RESULTADOS.........................................................................................70
7.0 DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO –DQO (5220 - Refluxo Fechado, Método
Colorimétrico)....................................................................................................................................... 72
7.3 REAGENTES................................................................................................................................ 73
a) Solução de digestão (K2Cr2O7+ H2SO4+ HgSO4)......................................................................... 73
b) Reagente de ácido sulfúrico (H2SO4 +Ag2SO4)........................................................................... 73
c) Padrão de hidrogeno ftalato de potássio (KHP)........................................................................ 73
7.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - (Realizar na capela de exaustão)..................................73
1) Preparação da Amostra (analisar as amostras em duplicata)................................................. 73
2) Preparação do Bloco Digestor.....................................................................................................74
3) Leitura Espectrofotométrica da DQO......................................................................................... 74
7.5 DICAS DE CUIDADOS BÁSICOS..................................................................................................75
7.6 CÁLCULO..................................................................................................................................... 75
7.8 PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO.......................................................................................... 76
8.0 CLORETOS....................................................................................................................................... 78
8.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E MATERIAIS............................................................................78
8.3 REAGENTES................................................................................................................................ 78
8.3.1 Preparo das soluções.......................................................................................................... 79
8.3.2 Cálculos da concentração das soluções............................................................................. 80
8.5 CÁLCULOS................................................................................................................................... 81
9.0 NITROGÊNIO AMONIACAL - NH3 (4500 3- B - Destilação Preliminar e 4500
NH3 -C - Método Titulométrico)....................................................................................................... 82
9.4 REAGENTES................................................................................................................................ 82
a) Água isenta de amônia:................................................................................................................82
b) Solução tampão de borato - Na2B4O7 10 H2O.............................................................................83
c) Solução de Hidróxido de sódio -NaOH 0,1 N..............................................................................83
d) Solução de Hidróxido de sódio - NaOH 6 N................................................................................83
e) Solução indicadora mista.............................................................................................................83
f) Solução absorvente de Ácido Bórico - H3BO3............................................................................. 83
g) Solução titulante padrão de ácido sulfúrico - H2SO4 0,02N...................................................... 83
h) Indicador Vermelho de Metila 0,1%...........................................................................................84
i) Padronização da Solução de Ácido Sulfúrico - H2SO4 0,02N contra padrão primário
Tetraborato de Sódio - Na2B4O7 10 H2O......................................................................................... 84
a) Preparação do equipamento:...................................................................................................... 85
b) Preparação da amostra:...............................................................................................................85
c) Destilação das amostras:............................................................................................................. 85
d) Titulação da amostra................................................................................................................... 86
9.6 CÁLCULOS................................................................................................................................... 86
10.0 FÓSFORO TOTAL (4500-P E. - Método do Ácido Ascórbico).................................................... 87
10.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO.......................................................................................................... 87
10.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E MATERIAIS......................................................................... 87
10.3 REAGENTES.............................................................................................................................. 87
a) Ácido sulfúrico H2SO4 5N:............................................................................................................88
b) Solução de tartarato de antimônio e potássio:.......................................................................... 88
c) Solução de molibdato de amônio:............................................................................................... 88
d) Ácido ascórbico 0,1 M:.................................................................................................................88
e) Reagente combinado:...................................................................................................................88
f) Solução estoque de Fosfato a 50,0 µg PO43 -P/mL (para a curva de calibração):.................... 89
g) Solução padrão de Fosfato a 5,0 mg PO43 -P/L (para a curva de calibração):......................... 89
h) Solução indicadora de Fenolftaleína.......................................................................................... 89
i) Solução de Hidróxido de Sódio 1M:.............................................................................................89
j) Solução de ácido sulfúrico (para a digestão):............................................................................. 89
10.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................... 89
k) Digestão das amostras e do branco com Persulfato de Potássio:............................................ 89
l) Preparação da amostra para a leitura no Espectrofotômetro...................................................90
c) Correção da interferência da turbidez ou cor :.......................................................................... 90
10.5 CÁLCULO...................................................................................................................................91
10.6 PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS.............................................................................................91
10.7 PREPARO DA CURVA PADRÃO............................................................................................... 92
11.0 MEDIDOR MULTIPARÂMETROS AK 88...................................................................................... 93
11.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO.......................................................................................................... 93
11.2 INSTRUÇÕES DE OPERAÇÃO...................................................................................................95
11.3 OPERAÇÃO DO AK 88...............................................................................................................97
11.3.1 pH (ajuste/Calibração)..................................................................................................... 97
11.3.2 pH Medição........................................................................................................................ 98
11.3.3 Registro das Medições no AK 88 -MEM...........................................................................98
11.3.4 Visualização dos Registros na Memória -RECALL..........................................................99
11.3.5 Condutividade/Salinidade -Medição............................................................................... 99
11.3.6 Oxigênio Dissolvido (OD) - Ajuste (Calibração)........................................................... 100
11.3.7 Oxigênio Dissolvido (OD) - Medição..............................................................................100
11.3.8 Mensagens de erro Causa x Solução............................................................................. 101
12.0 SONDA MULTIPARÂMETROS....................................................................................................102
12.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO........................................................................................................102
12.2 PARTES NOMES E FUNÇÕES (Figura 9)...............................................................................103
12.2.1 Sensores (Figura 11)...................................................................................................... 104
12.2.2 Display............................................................................................................................. 104
12.2.3 Chaves de Operação (Figura 13)....................................................................................105
12.2.4Conectando a unidade de controle e a sonda do sensor (Figura 14).......................... 105
12.3 CALIBRAÇÃO.......................................................................................................................... 106
12.4 MEDIÇÃO................................................................................................................................ 107
12.5 OPERAÇÃO DE DADOS...........................................................................................................108
12.6 REALIZANDO ANÁLISE..........................................................................................................110
12.7 VERIFICANDO OS DADOS......................................................................................................111
12.8 TRABALHANDO OS DADOS...................................................................................................111
13.0 COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES (E. coli)..........................................................113
13.1 INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 113
13.2 COLIFORMES TOTAIS E E. COLI PELO MÉTODO COLILERT...............................................114
13.2.1. Princípio do método.......................................................................................................114
13.2.2. Equipamentos, vidrarias e reagentes........................................................................... 114
13.2.3. Reagentes........................................................................................................................115
13.2.4. Procedimento experimental..........................................................................................116
13.2.5. Resultados...................................................................................................................... 116
13.3. COLIFORMES TERMOTOLERANTES PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO DE
MEMBRANA.................................................................................................................................... 118
13.3.1. Princípio do método.......................................................................................................118
13.3.2. Equipamentos, vidrarias e reagentes........................................................................... 118
13.3.3. Amostragem................................................................................................................... 119
13.3.4 Preparação do porta-filtro............................................................................................. 120
13.3.5 Preparação dos meios de cultura e soluções................................................................ 120
13.3.6 Preparação da amostra para filtração...........................................................................122
13.3.7 Filtração da amostra e incubação.................................................................................. 123
13.3.8 Leitura..............................................................................................................................124
13.3.9 Resultado......................................................................................................................... 126
13.3.10 Expressão dos resultados.............................................................................................127
13.3.11 Procedimento de verificação de colônias................................................................... 128
13.3.12 Descarte do material.................................................................................................... 129
14.0 MÉTODO DE DETECÇÃO PARA SALMONELLA (PRESENÇA/AUSÊNCIA).............................. 130
14.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO........................................................................................................130
14.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E REAGENTES......................................................................131
14.3 REAGENTES............................................................................................................................131
14.4 PROCEDIMENTO PARA ESGOTO.......................................................................................... 132
14.5 LEITURA DAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE SALMONELLA SP. NO MEIO
DE IAL (CONFERIR TABELA 8):.................................................................................................... 133
14.6 RESULTADOS..........................................................................................................................135
15.0 ENUMERAÇÃO DE OVOS DE HELMINTOS................................................................................139
15.1 PRINCIPIO DO MÉTODO........................................................................................................139
15.2 PREPARO DE SOLUÇÕES....................................................................................................... 140
15.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................................................................................... 140
15.4 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS............................................................................................143
15.4.1 Considerações preliminares para diferenciação dos ovos de helmintos................... 143
15.4.2 Critérios para diferenciação de ovos de helmintos......................................................144
15.5 ANÁLISE DE VIABILIDADE DE OVOS DE HELMINTOS EM ÁGUAS RESIDUÁRIAS
BRUTAS........................................................................................................................................... 147
15.5.1 Equipamentos, materiais e reagentes........................................................................... 147
15.5.2 Preparo de soluções........................................................................................................148
15.5.3 Coleta de amostras..........................................................................................................148
15.5.4 Procedimento experimental.......................................................................................... 148
15.5.5 Expressão dos resultados...............................................................................................149
TRATADAS...................................................................................................................................... 150
15.6.1 Equipamentos, materiais e reagentes........................................................................... 151
15.6.2 Preparo de soluções........................................................................................................151
15.6.3 Coleta de amostras..........................................................................................................152
15.6.4 Procedimento experimental.......................................................................................... 152
15.6.5 Expressão dos resultados...............................................................................................153
16.0 RESUMO DAS PRESERVAÇÕES DAS AMOSTRAS..................................................................... 155
16.1 REAGENTES E MATERIAIS....................................................................................................155
16.2 PROCEDIMENTO.................................................................................................................... 155
16.2.1 Condições de preservação e armazenamento de amostras antes do ensaio............. 155
16.2.2 Armazenamento de amostras após o ensaio................................................................ 155
COORDENAÇÃO DE SANEAMENTO AMBIENTAL -
CSA LABORATÓRIO DE SANEAMENTO -LABSAN
CAMPUS ARACAJU
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos de

Amostras de Efluentes Domésticos
1 ªParte
INTRODUÇÃO AO
LABORATÓRIO
Aracaju/SE
10
1.0 SEGURANÇA EM LABORATÓRIO
Os acidentes ocorridos nos laboratórios de aulas e pesquisas são muito comuns e

normalmente estão ligados a atitudes impróprias (brincadeiras), mau uso por parte
do operador com os equipamentos ou desconhecimento dos mesmos, uso incorreto
dos EPI’S (Equipamentos de Proteção Individual), como jaleco aberto ou a falta do
sapato adequado. Por isso todo laboratório tem normas de segurança a serem
seguidas por todos os usuários, a fim de evitar acidentes em suas dependências.
1.1. BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO
As Boas Práticas de Laboratório (BPL) é um conjunto de ações com o objetivo de

proporcionar uma diminuição nos riscos do ambiente laboratorial. Estas medidas são
constituídas por atividades organizacionais do ambiente de trabalho e por
procedimentos básicos como a utilização de Equipamentos de Proteção Individual
(EPIs) e Equipamentos de Proteção Coletivos (EPCs), limpeza e higienização do
ambiente laboratorial entre outras.
Recomenda-se:
1) Ao entrar no laboratório, observar o local dos acessórios de segurança, tais
como: chuveiro de segurança, lava-olhos, pontos de água corrente, extintores
de incêndio, etc; verificar os tipos de fogo que os extintores podem apagar;
localizar a chave geral de eletricidade e aprender como desligá-la; identificar as
saídas de emergência; observar sempre antes de plugar tomada de aparelho à
tomada, sua voltagem;
2) Não comer, beber ou fumar no laboratório;
3) Não utilizar equipamentos do laboratório para aquecer ou refrigerar alimentos;
4) Manter objetos pessoais, bolsas ou roupas nos vestuários ou armários;
5) Usar os EPI’s e EPC’s de maneira correta, sendo a sua utilização recomendada
de acordo com o risco que o manipulador será exposto;
6) Use sempre jaleco ou avental enquanto estiver no laboratório. As roupas
utilizadas não devem sair do recinto de trabalho e devem ser desinfectadas por
procedimentos adequados (deixar de molho em água sanitária e lavar
11
separadamente das outras roupas do cotidiano);

7) Não brincar com o material de laboratório;
8) Não permitir a entrada de pessoas estranhas e crianças no laboratório;
9) Evitar a presença de animais e plantas que não estejam relacionados com os
trabalhos no laboratório;
10) Não colocar qualquer material na boca, por exemplo: Caneta;
11) Nunca pipetar líquidos com a boca. Utilizar a pera de sucção ou pipetador.
12) Não tentar identificar um produto químico pelo odor nem pelo sabor;
13) Antes de usar reagentes que não conheça, consulte a FISPQ (Ficha de
Informações de Segurança de Produto Químico) ou o professor/monitor.
14) Não atender celular quando estiver manipulando produtos no laboratório;
15) Não usar sandálias ou sapatos abertos, shorts e outras vestimentas não
recomendadas no ambiente laboratorial;
16) Prender os cabelos longos, ao realizar qualquer experiência no laboratório;
17) Não utilizar lentes de contato dentro do laboratório a fim de evitar lesões
oculares;
18) Não se distrair, durante o trabalho no laboratório, com conversas, jogos ou
ouvindo música alta, principalmente com fones de ouvido;
19) As operações com manipulação de ácidos, compostos tóxicos e outras
substâncias que exalem vapores devem ser realizadas na capela de exaustão de
gases e/ou com o exaustor do laboratório ligado.
20) Não deixar vidro quente sem identificação em lugares onde possam pegá-los
inadvertidamente. Nem deixar frascos ou vidrarias próximos à borda das
bancadas.
21) Para trabalhar com águas contaminadas, ou potencialmente contaminadas,
proceder à vacinação contra febre tifoide, tétano e outras, a critério médico;
22) Saber operar corretamente os equipamentos e aparelhagens do laboratório,
conhecendo os riscos, usos e limitações;
23) Manter a bancada sempre limpa e organizada;
24) Evitar trabalhar sozinho no laboratório; avise a coordenação; quando trabalhar
tarde da noite ou nos finais de semana, avise a portaria para que os vigias
visitem periodicamente o local;
25) As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas pelo menos uma vez
12
por dia e sempre que ocorrer caso de derramamento de substâncias

potencialmente perigosas (utilize solução alcoólica 70 % ou solução de
hipoclorito de sódio);
26) Todos os líquidos e sólidos contaminados devem ser descontaminados em
autoclave antes de eliminados, após a utilização para fins de pesquisa e
didáticos;
27) Lavar as mãos depois de haver manipulado materiais infectados e ao deixar as
dependências do laboratório, de preferência utilizar álcool 70 % no enxague
das mãos;
28) Lavar as mãos ao sair do laboratório;
29) Comunicar a coordenação de laboratórios a ocorrência de qualquer acidente,
por mais simples que seja e;
30) Ao sair do laboratório observar se todos os equipamentos estão desligados as
torneiras fechadas para depois apagar as luzes e devolver a chave no setor de
chaves ou na coordenação de laboratórios.
1.2 EPI – EQUIPAMENTO DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL E EPC – EQUIPAMENTO

DE PROTEÇÃO COLETIVA
Esse EPI deve ser utilizado no momento em que se

entra no laboratório e retirado ao sair. É muito
importante que o jaleco seja retirado ao sair do
laboratório, e ele não deve entrar em contato com
outras roupas e objetos para não contaminá-los,
mesmo no momento de higienização do jaleco.
Jaleco ou avental
Óculos de proteção ou de segurança tem a função de

proteger os olhos contra respingos de produtos
químicos, e outros particulados. Este EPI deve possuir
C.A. (Certificado de Aprovação), leveza, confortabilidade,
tratamentos anti-risco e antiembaçante e proteção
lateral.
Óculos de proteção
13
Um dos equipamentos mais importantes, pois protege

as partes do corpo com maior risco de exposição: as
mãos. Há vários tipos de luvas e sua utilização deve ser
de acordo com o produto a ser manuseado.
Luvas
Máscaras e respiradores são equipamentos de proteção

que tem como objetivo evitar a inalação de vapores
orgânicos, névoas ou finas partículas. Eles são usados
apenas quando as medidas de proteção coletiva não
existem, não podem ser implantadas ou são
Máscaras e respiradores insuficientes
Ele é utilizado quando ocorre um acidente em que o

produto químico entra em contato com a pele ou com os
olhos, e o chuveiro deve ser acionado banhando o local
afetado com água por 15 minutos
Chuveiro de segurança e
lava-olhos
Bota de segurança ou sapato fechado é o calçado que

deve ser utilizado em toda prática de laboratório.
Bota de segurança ou
sapato fechado
Alguns cuidados devem ser tomados para uma boa conservação das luvas. Entre eles,
estão:
✔ As luvas devem ser inspecionadas antes e depois do uso, observando atentamente
os sinais de deterioração, pequenos orifícios, descoloração e ressecamento;

✔ Luvas descartáveis não devem ser reutilizadas;
✔ As luvas não descartáveis devem ser lavadas, secadas e guardadas longe do local
14
onde são manipulados produtos químicos.

A eficiência das luvas é medida por meio de três parâmetros:
✔ Degradação: mudança em alguma das características físicas da luva;
✔ Permeação: velocidade com que uma substância permeia através da luva;
✔ Tempo de Resistência: tempo decorrido entre o contato inicial com o lado
externo da luva e a ocorrência do produto químico no seu interior.
Luvas mais resistentes incluem Borracha Natural, Neoprene, Nitrílicas, Butílicas, Viton
e Cloreto de Polivinila.
Existem outros cuidados que devem ser lembrados no momento do uso das luvas: é
importante que estas se encaixem corretamente nas mãos, portanto elas devem ser do
tamanho correto às mãos do usuário.
O Quadro 1 a seguir descrevem algumas categorias gerais de resistência das luvas que
servirão de orientação no momento da escolha .
15
Quadro 1 - Material da luva e indicações
Material Recomendado para: Material Recomendado para:
Solventes aromáticos, Oxidantes, ácidos,

alifáticos e bases alcoóis, fenol,
halogenados.Ruim anilina
para soluções
Acetato de aquosas.
polivinila (PVA)
Utilizado em todos os Formaldeído,

setores glutaraldeído,
industriais (para alvejante,ácido
ácidos e álcalis) clorídrico, ácido
fosfórico, materiais
Nitrila (luvas de cáusticos.
procedimento
Ácidos,álcalis diluídos, Todos acima, mais

alcoois, hidrocarbonetos
sais e cetonas alifáticos, alcoóis,
óleos, gasolina
(luvas utilitárias)
Ácidos,álcalis diluídos, Aromático, alifático,

alcoois, solventes clorados,
cetonas,ésteres alcoois
Altas temperaturas. Soluções aquosas,

Não possui alguns alcoóis,
resistência química ácidos fracos e bases
Kevlar Látex
16
Além do correto calçamento das luvas, a técnica correta de remoção das luvas deve
ser observada para que se evite a contaminação das mãos (Figura 1).
Figura 1 - Remoção das Luvas
1.3 HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS
A higienização das mãos apresenta as seguintes finalidades:
✔ Remoção de sujidade, suor, oleosidade, pêlos, células descamativas e da
microbiota da pele, interrompendo a transmissão de infecções veiculadas ao

contacto.
✔ Prevenção e redução das infeções causadas pelas transmissões cruzadas.
O ato de lavar as mãos com água e sabão, através de técnica adequada, objetiva
remover mecanicamente a sujidade e a maioria da flora transitória da pele (Figura 2).
17
Figura 2 -Higienização das Mãos

18
19
2.0 MANUSEIO DE PRODUTOS QUÍMICOS
Boa parte das substâncias químicas são perigosas por natureza, podendo tornarem-se
piores quando aquecidas ou misturadas a outras. Compreender as propriedades
perigosas de cada produto e das suas misturas ajuda-nos a minimizar riscos de
acidentes dentro do laboratório.
Ao manusear produtos químicos deve-se ter em mente a prática de medidas
preventivas que garantam a segurança e a saúde do usuário, tais como a leitura dos
rótulos dos frascos e Fichas de Informação de Segurança de Produtos Químicos
(FISPQ), bem como, a utilização dos EPI's e EPC's apropriados.
2.1 DIAGRAMA DE HOMMEL
Também conhecido como Diamante de Risco ou diamante do perigo mundialmente

conhecido pelo código NFPA 704 (National Fire Protection Association). Nela, são
utilizados losangos que expressam tipos de risco em graus que variam de 0 a 4
(Figura 3), cada qual especificado por uma cor (branco, azul, amarelo e vermelho),
que representam, respectivamente, riscos específicos, risco à saúde, reatividade e
inflamabilidade.
Figura 3 - DIAGRAMA DE HOMMEL

20
2.2 PICTOGRAMAS
Pictogramas são símbolos gráficos que identificam determinadas características das

substâncias químicas. Alguns exemplos são apresentados no Quadro 2.
Quadro 2 - PICTOGRAMAS
Símbolo Exemplo de pictograma Alguns exemplos de pictogramas

gerado para o GHS gerados para o Transporte
21
Não refereciados na legislação de

transporte
2.3 SISTEMA SAF-T-DATA™
Sistema encontrado usualmente em reagentes do fabricante J.T. Baker que consiste num
guia informativo de rótulo sobre riscos e perigos, uso de EPI’s (Equipamentos de
Proteção Individual) e EPC’s (Equipamentos de Proteção Coletiva), com códigos de cores
para armazenagem compatível (Figura 4).
As franjas indicam o armazenamento individual, em separado de qualquer outra
substância, indicando que a substância não é compatível com outros reagentes da cor de
sua classe. Os quadrados da parte superior (em inglês) indicam riscos e perigos
conforme descrito abaixo:
22
Risco a saúde Inflamabilidade Reatividade Contato

0- nenhum 0- nenhum 0- nenhum 0- nenhum
1- Leve 1- Leve 1- Leve 1- Leve
2- moderado 2- moderado 2- moderado 2- moderado
3- severo 3- severo 3- severo 3- severo
4-extremo 4-extremo 4-extremo 4-extremo
Os quadrados inferiores informam os EPI´s e EPC’s que devem ser utilizados (símbolos).
As cores indicam o armazenamento compatível
Inflamável
Tóxico
Reativo
Corrosivo
:
Sem riscos conhecidos
Figura 4 - SISTEMA SAF-T-DATA™
Inflamável com franja: indica o Reativo

armazenamento individual, em separado de
qualquer outra substância
23
2.4 DESCARTE DE MATERIAL
Materiais que estiveram em contacto com amostras potencialmente infectantes

devem ser descontaminados antes de saírem da área de trabalho onde foram
manipulados.
Fazer sempre uma limpeza prévia, com água, antes de descartar frascos de reagentes
vazios e descartar todos e quaisquer materiais de vidro trincado ou que possa
oferecer perigo quando do seu uso.
Os Principais Tipos de Resíduos:
a) Resíduos Biológicos – São produtos resultantes de atividades em laboratório
ricos em materiais biológicos que devem ser descontaminados antes de serem
encaminhados para descarte final;
b) Resíduos Químicos – São produtos resultantes que devem ser descartados de
acordo com as suas características químicas;
c) Resíduos não contaminados – São aqueles que não entraram em contacto
com substâncias químicas ou biológicas, podendo ser considerados como
resíduo doméstico.
2.4.1 Resíduos Que Podem Ser Descartados Diretamente Na Pia Ou No Lixo
Segundo as normas da ABNT (NBR 12809 e 10004), o resíduo que não for
classificado como perigoso pode ser tratado como lixo comum e, portanto, pode ser
descartado no lixo ou no esgoto urbano. Entretanto, no caso de resíduos químicos
toda atenção e cuidado devem ser tomados. A melhor opção é nunca descartar em
lixo ou rede de esgoto. Verifique a possibilidade de doação, reciclagem ou
recuperação. Procure sempre usar o bom senso. Se a opção de descarte na rede de
esgoto ou no lixo comum for a mais adequada, algumas regras devem ser seguidas
rigorosamente.
No LABSAN há resíduos biológicos das análises de coliformes que são colocados
em saco branco (Figura 5) e autoclavado antes de descartados no lixo comum.
24
Figura 5- Saco autoclavável
Os resíduos das análises de DQO são armazenados em garrafas “Pets” e tratados antes
do descarte.
O pH de soluções aquosas deve estar na faixa 6,0 – 8,0. Submeter as soluções que
estejam fora desta faixa de pH a uma neutralização; somente após este cuidado descarte
o resíduo.
Misturas contendo compostos pouco solúveis em água, em concentrações inferiores a
2% podem ser descartados em pia.
Compostos com ponto de ebulição inferior a 50 °C não devem ser descartados na pia,
mesmo que extremamente solúveis em água e pouco tóxicos. Lembrar que substâncias
inflamáveis podem ser um perigo potencial de incêndio ou explosão. Gases nocivos ou
mal cheirosos ou substâncias capazes de criar incomodo público não podem ser
descartados como resíduos não perigosos.
Para as demais análises é medido pH, neutralizado, diluído e descartado na lavagem.
O descarte do resíduo químico em lixo comum somente poderá ser efetuado se o
composto se enquadrar em todas as regras descritas. A não obediência de pelo menos
uma das regras inviabilizará o descarte em lixo comum ou esgoto.
25
3.0CONCEITOS BÁSICOS DE MEDIÇÃO
O resultado de uma análise química é função direta do cuidado, da manipulação e da

correta aplicação da metodologia analítica, no qual pequenos descuidos podem significar
grandes erros, sobretudo, em determinação de parâmetros em amostras com
concentração da ordem de miligrama por litro. Uma das mais comuns fontes de erros
encontra-se no preparo ou na manipulação das vidrarias volumétricas empregadas nas
análises, são erros primários, que, uma vez evitados, podem significar um aumento do
grau de confiabilidade do resultado. Entre os procedimentos que auxiliam a evitar esses
tipos de erros, pode-se citar:
a) Temperatura: a capacidade de uma vidraria volumétrica varia com a
temperatura, logo, deve-se utilizá-las sempre em temperaturas próximas à aferição. Da
mesma forma, a densidade do líquido também varia com a temperatura, portanto, deve-
se utilizá-los somente em temperatura ambiente;
b) Limpeza da vidraria: presença de material gorduroso pode aumentar o erro
na leitura devido a má formação do menisco, além do que, tal “sujeira” pode servir como
interferente, alterando o valor do resultado da análise.
c) Ajuste do menisco: deve-se tomar muito cuidado com o erro de paralaxe: o
menisco deve estar posicionado de maneira que sua parte inferior tangencie
horizontalmente a parte superior da linha do líquido (Figura 6), tendo a linha da visão
no mesmo plano.
Figura 6 – Ajuste do menisco
d) Pipetas volumétricas e graduadas: deve-se utilizar uma pera para sucção,

devendo-se passar alguns milímetros acima da linha de graduação final, em seguida,
deve-se secar a ponta da pipeta com papel higiênico, e ajustar o menisco. Feito isso,
pode-se transferir o volume para outro frasco. Existem dois tipos de pipetas:
✔ Pipetas volumétricas de sopro: possuem dois traços horizontais na porção
superior, e no momento da transferência do líquido pipetado para outro frasco, deve-se
26
“expulsar” o volume restante que permanece na ponta da pipeta, uma vez que ele, nesse
tipo de pipeta, é considerado parte integrante do volume total pipetado; para tanto,
deve-se utilizar a pera de sucção para “soprar” esse volume para o frasco.
✔ Pipetas volumétricas comuns: apresentam apenas um traço horizontal na
porção superior, deve ser desconsiderado o volume restante na ponta da pipeta a final
do escoamento, ou seja, não deve-se “soprar” esse volume para o frasco; para tanto,
deve-se apenas encostar a ponta da pipeta até o término do escoamento e permanecer
por alguns segundos após esse momento.
27
4.0 AS VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIO
São em sua maioria, instrumentos de vidro cristal ou temperado, para que as medidas
sejam precisas e o recipiente não reaja com a substância contida nele. Entretanto, as
vidrarias de laboratório devem ser tratadas com o maior cuidado possível,
principalmente porque o vidro utilizado é mais trabalhado que quaisquer outros vidros,
por isso mais caros. Os materiais de metal podem servir para suporte e manuseio das
vidrarias. Existem também materiais de porcelana, de borracha ou plástico e materiais
que são fontes de aquecimento.
4.1 TIPOS DE VIDRARIAS E SUAS FUNÇÕES
Geralmente a vidraria de laboratório apresenta graduações e marcas volumétricas em

suas paredes. Essa marcação pode ser de maior ou de menor precisão conforme o tipo
de vidraria e sua função.
Em alguns casos, a vidraria não apresenta marcação.

28
As vidrarias também podem apresentar cores e materiais diferenciados:

Vidro cristal: vidro de alta qualidade e transparência, geralmente denominado vidro
boro que possui maior resistência a choques térmicos, mecânicos e químicos.
Vidro âmbar: é o vidro escurecido, utilizado na maioria das vezes para diminuir o efeito
da luz no armazenamento de compostos fotossensíveis.
Plástico: Atualmente alguns equipamentos estão sendo fabricados com plástico, em sua
maioria por razões econômicas, porém sem apresentar muitas das qualidades do vidro.
Outros materiais: porcelana, borrachas, metais, entre outros também podem ser
encontrados entre os materiais que compõem as vidrarias de laboratórios.
Além das marcações, da precisão e do tipo de material, a função da vidraria também é
determinada pelo seu formato. Alguns equipamentos têm formato específico para
algumas vidrarias (ex. algumas mantas aquecedoras) e da mesma forma algumas
vidrarias tem formatos específicos para o equipamento (ex. tubos falcon).
29
4.1.1 Vidraria e Equipamentos Básicos do Laboratório de Saneamento
Tubos de ensaio: um dos utensílios mais úteis em laboratório,

usado para fazer reações em pequena escala, químicas e
microbiológicas;
Estante para tubos de ensaio: suporte de tubos de ensaio;
Vidro de relógio: Peça de Vidro de forma côncava, é usada em

análises e evaporações além de auxiliar na pesagem de
substâncias não voláteis e não higroscópicas;
Espátula: usada para transferência de substâncias sólidas;
Béquer: instrumento de uso geral em laboratório. É

empregado para administrar reações entre soluções, dissolver
substâncias sólidas, efetuar reações de precipitação e aquecer
líquidos;
Bastão de Vidro: usado para agitar soluções, transporte de

líquidos na filtração e outros.
30
Erlenmeyer: executa as mesmas funções do béquer, só que

com uma diferença, seu formato afunilado permite agitação
sem que haja risco de perda do material agitado. Esta função é
essencial em titulações;
Proveta: equipamento para medir e transferir volumes

variáveis de líquidos. Vidraria de precisão;
Pipeta: utensílio para medir e transferir líquidos, o líquido

entra por um orifício na extremidade inferior através da
sucção. Vidraria de precisão para pequenos volumes. Pode ser
volumétrica (para um volume específico) ou graduada (para
volumes variados dentre de um intervalo);
Pipeta Pasteur: é usada para transferência de líquidos em

geral através de aspiração e dispensação feita através do bulbo
para sucção. Geralmente feita de plástico, ela não possui
precisão como outros tipos de pipeta;
Bureta: instrumento utilizado em titulações para medidas

precisas de líquidos. A bureta é ideal para análises
volumétricas porque possui graduação em seu comprimento
para facilitar a leitura de volume escoado;
31
Bureta digital: instrumento utilizado em titulações para

medidas precisas de líquidos;
Cone Imhoff: Utilizado na determinação de materiais

sedimentáveis
Funil de separação: Utilizado na separação de misturas

heterogêneas de líquidos não miscíveis e na extração
líquido/líquido;
Funil de haste longa/curta: utilizado para filtrar soluções com

o auxílio de papel de filtro ou para transferir líquidos de um
recipiente para outro;
Funil de Buchner: Utilizado em filtrações a vácuo. Pode ser

usado com a função de filtro em conjunto com o kitassato;
32
Conjunto de filtração: Utilizado em filtrações a vácuo;
Kitassato: Utilizado em conjunto com o Funil de Buchner em

filtrações a vácuo;
Balão Volumétrico: Possui volume definido e é utilizado para o

preparo de soluções com quantidades mais precisas;
Balão de fundo redondo: Utilizado em sistemas de refluxo e

evaporação a vácuo;
Balão de fundo chato: Recipiente para conter líquidos ou

soluções, é usado em reações com desprendimento de gases;
33
Picnômetro: Usado para determinar a densidade de líquidos;
Almofariz com pistilo: Usado na trituração e pulverização de

sólidos em pequena escala;
Cadinho: Utilizado para aquecimento a seco a temperaturas

altas num processo denominado calcinação;
Cápsula de porcelana: Peça de porcelana usada para evaporar

líquidos das soluções e na secagem de substâncias. Podem ser
utilizadas em estufas desde que se respeite o limite de 500ºC;
Dessecador: Usado para guardar substâncias em atmosfera

com baixo índice de umidade, geralmente para seu
resfriamento;
Pinça metálica Casteloy: Usada para transporte de cadinhos e

outros fins;
34
Garra metálica: utensílio metálico destinado a segurar peças

de laboratório;
Anel para funil: utilizado como suporte de funis;
Mufa: suporte para a garra de condensador;
Pinça de Morh: usada para impedir ou diminuir fluxos gasosos;
Suporte Universal;
pera: Usada para pipetar soluções;

35
Pipetador : Usado para pipetar soluções;
Pisseta : Utilizada para água destilada;
Bomba a vácuo: Utilizada na filtração;
Estufa Elétrica: Para secagem de materiais (reagentes e

vidraria) até 150ºC e Estufa bacteriológica até 60ºC;
Mufla: Para calcinação de amostras e determinação de sólidos

até 1500°C;
Banho-Maria: Para aquecimentos até 100 ºC (temperaturas

acima do ponto de ebulição da água não são apropriadas
devido ao risco de acidentes por queimaduras);
36
Placa aquecedora: aquecimento de soluções;
Bloco digestor: Utilizado na digestão de DQO;
Autoclave: Utilizado na digestão de fósforo, bem com na

esterilização de materiais;
Seladora: Utilizada na selagem da cartela de coliformes;
Lâmpada Ultravioleta: Para contagem dos Coliformes;

37
Placa de Agitação Magnética com Aquecimento Para

aquecimentos diversos e, também, para
agitar/dissolver/homogeneizar líquidos por meio de uma
barra magnética;
Vortex: para agitação de tubos de ensaio;
Destilador de Nitrogênio: Para realizar a análise de nitrogênio

amoniacal;
Determinador de Demanda Bioquímica de Oxigênio: DBO

OxiDirect;
Câmara incubadora DBO: Incubação para Demanda

Bioquímica de oxigênio ou microbiologia com temperatura
controlada;
38
Colorímetro portátil: utilizado na determinação da cor

verdadeira e aparente;
Turbidímetro portátil: utilizado na determinação da Turbidez;
Peagâmetro de bancada: utilizado para medir o pH de

amostras e soluções;
Condutivímetro: utilizado na determinação da condutividade;
Medidor Multiparâmetros: medidor AK88 - utilizado para

medir OD/pH/Cond /Salinidade e Temp.
39
Medidor Multiparâmetros: medidor HORIBA U52G - utilizado

na realização de diversas análises.
Micropipeta: instrumento volumétrico que permite a medição

e transferência de pequenos volumes de forma precisa.
4.2 MANUSEIO, LIMPEZA E ESTERILIZAÇÃO DE VIDRARIAS
Toda a vidraria empregada em laboratório deve ser limpa e livre de substâncias

estranhas para não afetar os resultados de análises e preparações de soluções.
Marcações com caneta, resíduos químicos, resíduos biológicos, sujidades, tudo deve ser
removido da vidraria durante o processo de limpeza.
4.2.1 Lavagem
Deve-se lavar a vidraria imediatamente após o uso, caso uma lavagem completa não for
possível, o procedimento é colocar a vidraria de molho em água com detergente. Caso
isso não seja feito, a remoção dos resíduos poderá se tornar impossível. Ao lavar um
recipiente pode-se usar sabão, detergente ou pó de limpeza, não permitindo que ácidos
entrem em contato com recipientes recém-lavados antes de enxaguá-los muito bem e se
certificar que o sabão (ou detergente) foi completamente removido, pois se isso
acontecer, uma camada de graxa poderá se formar. A remoção de todo e qualquer
resíduo de sabão, detergente e outros materiais de limpeza faz-se absolutamente
necessária antes da utilização dos materiais de vidro. Após a limpeza, os aparatos
precisam ser completamente enxaguados com água de torneira. Enchem-se os frascos
com água, agitando bem e esvaziando logo em seguida, repetindo este procedimento por
40
cinco ou seis vezes para a remoção de qualquer resíduo de sabão ou outro material de
limpeza. Então enxaguar os aparatos com três ou quatro porções de água destilada.
A) Álcool a 70%(etanol ou isopropílico):

O álcool a 70% (v/v) é um dos desinfetantes mais empregados no laboratório. É
bastante utilizado para desinfecção da pele, bancada e equipamentos.
Procedimento:
Após a limpeza com água e sabão deve-se esfregar um pano ou algodão umedecido
com a solução de álcool a 70% e deixar a superfície a ser descontaminada em
contacto com a solução por no mínimo 15 minutos.
Preparo do Álcool a 70% (v/v):

Etanol a 95º (p/v). --------------------------73,7mL
Água destilada q.s.p ------------------------completar o volume para 100 mL
B) Hipoclorito de sódio 5%:

Recomenda-se a sua aplicação para descontaminação de pisos, vidrarias, inativação
química de material biológico.
Procedimento:
Após a limpeza com água e sabão deve-se passar pano ou material absorvente com a
solução de hipoclorito 5% no piso, ou submergir vidraria em solução, garantindo
que a solução esteja em contacto com toda parede do objeto a ser descontaminado.
C) Banho ácido
Trata-se de uma metodologia indicada para a limpeza de vidrarias impregnadas pela
análise de metais, ou no preparo de frascos para coleta de amostras para análise de
metais (A vidraria é submersa em uma solução de ácido nítrico 1:1, onde permanece
por até 12 horas) na lavagem de vidraria para análise de Nitrogênio Amoniacal,
Fósforo e DQO, utiliza ácido clorídrico a 10%
Procedimento:
Após a limpeza com água e sabão deve-se passar a solução de HCL 10% na vidraria e
retirar logo em seguida com água de torneira, repetindo este procedimento por
41
cinco ou seis vezes para a remoção de qualquer resíduo e em seguida, enxaguar a

vidraria com três ou quatro porções de água destilada.
Preparo do HCl a 10%.

Dados: V= 1L ; p/p 37,2% e d = 1,18 g/mL
T1 xV1 = T2 xV2
37,2 x V1 = 10 x 1
V1 = 0,2688 L ou 268,82 mL
Correção pela densidade: V1 = 268,82/1,18 = 227,81 mL
4.2.2 Autoclavação / Esterilização
É o Procedimento de inativação com calor úmido à alta pressão. É utilizada na

esterilização de utensílios laboratoriais, bem como descontaminação de material para
descarte. Depois de descontaminado (o resíduo) é encaminhado para coleta externa.
4.3 NOÇÕES DE USO E CUIDADOS COM MICROPIPETAS
Alguns cuidados são necessários ao se fazer uso da micropipeta a fim de evitar

acidentes, danos ao equipamento ou mesmo contaminação da amostra a ser analisada.
Somente utilize o instrumento para pipetar líquidos com temperatura superior a 4°C e
inferior a 70°C. Caso se pipete líquidos viscosos e muito aderentes e/ou líquidos com
temperatura diferente da ambiente em mais de ± 5°C, a exatidão volumétrica pode ser
prejudicada.
Busque utilizar sempre recipientes e ponteiras apropriadas a fim de evitar respingos e
derramamentos de forma a não pôr em risco nem o usuário, nem outras pessoas
próximas. Bem como, verifique o instrumento antes do uso, quanto a defeitos visíveis.
Ao trabalhar com amostras perigosas, não toque nos orifícios das ponteiras. Esta
recomendação também deve ser seguida de forma a evitar contaminação da amostra.
42
Figura 7 - Partes da micropipeta
1. Botão de pipetagem
2. Botão ejetor de ponteira
3. Tambor de ajuste do volume
4. Corpo ou Empunhadura
5. Porca de conexão
6. Ejetor de ponteira
7. Porta-cone
8. Ponteira
4.3.1 Tomada de alíquota utilizando micropipeta
➢ Ajustar o volume
Para fazer o ajuste do volume que se

deseja tomar, gire o tambor de ajuste do
volume ou o botão de pipetagem em
sentido horário para diminuir o ajuste de
volume e anti-horário para aumentar.
➢ Aspirar a amostra
Rinse a ponteira uma vez com o líquido

da amostra para ambientá-la.
Pressione o botão de pipetagem até o
primeiro estágio. Segure a pipeta verticalmente e mergulhe a ponteira na amostra.
Obs1: Deixe a ponteira imersa no líquido por alguns segundos para evitar a
entrada de ar.
Deixe o botão de pipetagem retornar suavemente. Arraste a ponteira suavemente
na parede do recipiente para evitar gotas.
Obs2: Para solventes voláteis, você deve saturar a atmosfera de ar no interior da
sua pipeta (parte interna do porta-cone) aspirando e dispensando o líquido
repetidamente antes aspirar a alíquota da amostra.
43
Obs3: Quando a temperatura do líquido for diferente da temperatura ambiente,

lave a ponteira várias vezes antes de usar.
Obs4: Não deixe o instrumento na posição horizontal quando a ponteira estiver
cheia. O líquido poderá penetrar no instrumento contaminando ele.
➢ Dispensar a amostra
Posicione a ponteira contra a parede do recipiente do recipiente.

Pressione o botão de pipetagem para baixo até o primeiro estágio e segure até
que o líquido escoe da ponteira.
Pressione o botão de pipetagem até o segundo estágio para esvaziar a ponteira
completamente.
Obs5: Para melhorar a exatidão ao trabalhar com pequenos volumes: Rinse a
ponteira com o reagente contido no recipiente que está recebendo a amostra.
Arraste a ponteira suavemente na parede do recipiente.
Deixe o botão de pipetagem retornar à posição original.
➢ Ejetar a ponteira
Pressione o botão ejetor de ponteiras. Caso a ponteira fique presa, deve ser
puxada com a mão.
➢ Após o uso
Sempre guarde o instrumento sem ponteiras conectadas, ajustado no volume

máximo para reduzir a tensão na mola do pistão e, se possível, na posição vertical.
44
5.0 IDENTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS E SOLUÇÕES NO LABORATÓRIO
Todo item dentro de um laboratório deve ser conhecido ou facilmente identificado por
aqueles que o utilizam. Quando a identificação não é possível, o item deve ser
imediatamente descartado. Por isso é fundamental a identificação de todo item estranho
trazido ou produzido dentro do laboratório. Geralmente essa identificação é feita
através de uma etiqueta afixada no item em questão. Essa etiqueta pode ser um padrão
seguido pelo laboratório, ou desenvolvida pelo próprio identificador.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
ANALITICA. Manual De Operação Da Pipetman P - Gilson Disponível em:
https://marilandabellini.files.wordpress.com/2011/08/manual_pip_fev_2008.pdf
Acesso em 29/04/2020.
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária - BIT – Boletim Informativo de

Tecnovigilância, Brasília, Número 2, abril-maio-junho 2011.
http://www.anvisa.gov.br/boletim_tecno/boletim_tecno_Junho_2011/PDF/Luvas%2
0Cir%C3%BArgicas%20e%20Luvas%20de%20Procedimentos_Considera%C3%A7%
C3%B5es%20 sobre%20o%20uso.pdf. Acesso em 19/02/2018.
BRAND. Transferpette® - F I R S T C L A S S . B R A N D. Manual de operação

Disponível em: https://www.pro-analise.com.br%2Fdownload-
arquivo%2F21%2F1471894853559.pdf&usg=AOvVaw05UsOafxaRibmR19Wx3_dO
Acesso em 29/04/2020.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Higienização das mãos: Segurança

do Paciente em Serviços de Saúde/Agência Nacional de Vigilância Sanitária: ANVISA,
2009, p. 71.
45
CONSTANTINO, Mauricio Gomes; SILVA, Gil Valdo José; DONATE, Paulo Marques.
Fundamentos de Química Experimental. São Paulo: Editora da Universidade de São
Paulo.2004, 281.p.
GILSON INC. Pipetman CLASSIC - User’s Guide Disponível em:

https://www.gilson.com/pub/static/frontend/Gilson/customtheme/en_US/images/
docs/PIPETMANCLASSIC_UG_LT801120-F.pdf Acesso em 29/04/2020.
Giraldo, Rubén Darío Osorio. Manual de técnicas de laboratorio químico. Universidad

de Antioquia, 2009.
Hirata, Mario Hiroyuki. Manual de Biossegurança 2ª ed. Manole, 2012.
University of Maryland. Department of Environmental Safety. Instructions for the

safe removal of contaminated gloves . Disponível em:
http://www.des.umd.edu/os/ppe/glove. Acesso em 20/02/2018.
UNESP - Universidade Estadual Paulista -Guia para utilização de laboratórios

químicos e biológicos - Campus de Sorocaba .2013
http://www.sorocaba.unesp.br/Home/CIPA/Treinamento_para_utilização_de_laborat
órios_quimicos_e_biologicos_ leitura.pdf. Acesso em 15/02/2018.
UNESP - Universidade Estadual Paulista - Laboratório de Resíduos Químicos -

gerenciamento de resíduos químicos normas e procedimentos gerais
http://www.sorocaba.unesp.br/Home/CIPA/normas_gerenciamento.pdf. Acesso em
20/02/2018.
USP - Universidade de São Paulo - Faculdade de Ciências Farmacêutica de Riberão

Preto - CIPA - Comissão Interna de Prevenção de Acidentes - Luvas
http://fcfrp.usp.br/cipa/seguranca/epi/uso_adequado_de_luvas_em_laboratório.pdf.
Acesso em 20/02/2018.
46
COORDENAÇÃO DE SANEAMENTO AMBIENTAL - CSA

LABORATÓRIO DE SANEAMENTO -LABSAN
CAMPUS ARACAJU
2 ªParte
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos de

Amostras de Efluentes Domésticos
ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS
Aracaju/SE
47
1.0 DETERMINAÇÃO DA COR - Método - 2120 E
1.1 DEFINIÇÃO
A cor de uma amostra de água está associada ao grau de redução de intensidade que a
luz sofre ao atravessá-la (e esta redução dá-se por absorção de parte da radiação
eletromagnética), devido à presença de sólidos dissolvidos, principalmente material em
estado coloidal orgânico e inorgânico. Dentre os colóides orgânicos pode-se mencionar
os ácidos húmico e fúlvico, substâncias naturais resultantes da decomposição parcial de
compostos orgânicos presentes em folhas, dentre outros substratos. Também os esgotos
sanitários se caracterizam por apresentarem predominantemente matéria em estado
coloidal, além de diversos efluentes industriais contendo taninos (efluentes de curtumes,
por exemplo), anilinas (efluentes de indústrias têxteis, indústrias de pigmentos, etc),
lignina e celulose (efluentes de indústrias de celulose e papel, da madeira, etc.).Há
também compostos inorgânicos capazes de possuir as propriedades e provocar os
efeitos de matéria em estado coloidal. Os principais são os óxidos de ferro e manganês,
que são abundantes em diversos tipos de solo. Alguns outros metais presentes em
efluentes industriais conferem-lhes cor mas, em geral, íons dissolvidos pouco ou quase
nada interferem na passagem da luz.
1.2 COR APARENTE
Na determinação da cor, a turbidez da amostra causa interferência, absorvendo também

parte da radiação eletromagnética. Esta coloração é dita aparente pois é como o ser
humano a vê, mas é, na verdade, em parte resultado da reflexão e dispersão da luz nas
partículas em suspensão. A diferenciação entre a cor verdadeira e a cor aparente, que é
incrementada pela turbidez, é dada pelo tamanho das partículas, isto é, pode ser
generalizado que partículas com diâmetro superior a 1,2 μm causam turbidez, já que
partículas coloidais e dissolvidas causam cor.
1.2.1 Equipamentos, vidrarias e materiais
✔ Colorimetro AquaColor Cor;

✔ Cubeta;
48
✔ Água destilada; Papel absorvente;

OBS: Se o parâmetro desejado for cor verdadeira será necessário também:
✔ Bomba a vácuo;
✔ Papel de filtro (diâmetro de poro de 0,45 μm);
✔ Sistema de filtração;
✔ Kitassato;
✔ Pinça.
1.2.2 Procedimento experimental
Observe na Figura 01 abaixo o display do equipamento e o significado de cada tecla
Figura 1 Colorímetro
Ligue o Colorímetro AquaColor Cor na tecla Aparecerá no display a Versão do aparelho,

DataLog, Data e Hora.
49
1.2.2.1 Calibrando o Branco
a) Insira o padrão de Branco no porta cubetas, alinhando ao traço vertical da cubeta

com a seta do porta cubetas e pressione a tecla LIGA/LEITURA para fazer a leitura.
b) Mantenha pressionada a tecla LIGA/LEITURA por 3 segundos para gravar o
Branco. Indicara no display: “Grav. Branco” e em seguida “0,0 uC APHA”.
1.2.2.2 Leitura de Amostra em Concentração uC / APHA
OBS.: Caso a amostra ultrapasse o valor máximo da curva de calibração (500 uC), será
necessário fazer a diluição da amostra antes da leitura no colorímetro.
1.3 COR VERDADEIRA (Real) - Método - 2120E
A cor verdadeira (real) é aquela sem interferência da turbidez, para isso é preciso filtrar
a amostra em membrana com diâmetro de poro de 0,45 μm, antes da realização da
leitura, caso a amostra ultrapasse o valor máximo da curva de calibração (500 uC), será
necessário fazer a diluição da amostra antes da leitura no colorímetro.

Filtrar a amostra utilizando o papel de filtro (diâmetro de poro de 0,45 μm) e o sistema
de filtração. Proceder a leitura conforme item 1.2.2.1 e 1.2.2.2.
50
1.4 INTERFERENTES
Material em suspensão, vidraria suja, bolhas de ar.
1.5 RESULTADO
Cor (mgPtCo/L ) = valor lido no aparelho (Se necessário, considerar o fator de diluição)
Outras unidades: 1 Unidade de Cor (uC) = 1 unidade Hazen (uH) = 1 mg
1.6 PRESERVAÇÃO DA AMOSTRA
Frasco: polietileno, vidro neutro ou borossilicato (pirex) Amostra: 200 mL

Preservação: refrigerar a 4 °C, evitar a exposição da amostra à luminosidade Prazo: 24
horas.
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION,

WATER ENVIROMENTAL FEDERATION. Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater. 22 edição, Washington, APHA/AWWA/WEF, 2012.
Manual do Fabricante
https://temporario-policontrol.lojaintegrada.com.br/marca/policontrol.html
51
2.0 DETERMINAÇÃO DA TURBIDEZ (2130 B Método Nefelométrico)
2.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO
Este método é baseado na comparação da intensidade da luz desviada pela amostra,em

ângulo de 90° tomando como referencia a direção da luz incidente. A leitura é
relacionada com a intensidade de luz desviada por uma suspensão padrão de referência
(formazina).Quanto maior a intensidade da luz dispersa, maior será a turbidez.
2.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E MATERIAIS
 Turbidímetro;
 Cubetas para Turbidímetro;
 Papel absorvente e
 Água destilada.
2.3 REAGENTES
 Suspensão de formazina (0,1;10;100 e 800 NTU)
2.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
a) Preparação do equipamento: Turbidímetro TB- 1000P

Nota: Caso utilize outro equipamento, consulte no manual do mesmo como utilizá-lo.
Observe na Figura 02 abaixo o equipamento e o significado de cada tecla
Figura 2 - Turbidímetro portátil

52
Verifique se as cubetas do conjunto de padrões (Figura 03) e as cubetas de amostra

estão limpas;
Figura 3 - Maleta do Turbidímetro
1. Conecte o cabo de alimentação e ligue o Turbidímetro na rede elétrica ele começa a

carregar a bateria automaticamente exibindo a tela de carga de bateria;
2. Chame o professor ou o técnico responsável para realizar a calibração do
equipamento, após a calibração, ligue o equipamento pressionando a tecla Ligar por
3 segundos;
3. Agitar a amostra suavemente e esperar até que as bolhas de ar desapareçam;
4. Encher uma cubeta com a amostra até a linha de indicação, tendo o cuidado de
evitar impressão digital na parede do vidro. Tampe a cubeta;
5. Limpe a cubeta com um papel macio, para eliminar as manchas de água e as
impressões digitais;
6. Insira a cubeta no compartimento, de forma que o traço de orientação fique
alinhado com a marca indicadora saliente à frente do compartimento;
7. Feche a tampa do turbidímetro;
8. Pressione a tecla Medir (B);
9. O equipamento ira ler a turbidez da amostra e ao final irá mostrar o resultado e
perguntar se deseja salvar esta leitura;
10. Pressione “B” para não salvar e ele retorna para o menu medição;
11. Repita a medição 05(cinco vezes) e calcule a média
12. Se necessário, faça a diluição da amostra.
53
2.5 RESULTADO
Turbidez (NTU) = valor indicado no aparelho x diluição (se houver)

Unidades: 1 NTU = 1 Unidade Nefelométrica de Turbidez = 1 uT (unidade de turbidez).
2.6 INTERFERENTES
A presença de partículas grosseiras que sedimentam rapidamente, vidraria suja, bolhas

de ar e os efeitos de vibrações contribuirão para a obtenção de resultados falsos.
Frasco: polietileno, vidro neutro ou borossilicato (pirex) Amostra: 200 mL

Preservação: refrigerar a 4 °C, evitar a exposição da amostra à luminosidade Prazo: 24
horas.

Manual do Fabricante.
http://www.saaesorocaba.com.br/downloads/concurso2010/POP%20TURBIDEZ%2
0CF Q%20002.pdf.
54
3.0 RESÍDUOS OU SÓLIDOS (2540 SÓLIDOS)

3.1 INTRODUÇÃO
Resíduos ou Sólidos são todas as matérias suspensas ou dissolvidas na água ou águas

residuais. Os sólidos podem afetar a qualidade da água ou do efluente de várias
maneiras. Águas com sólidos dissolvidos geralmente são de potabilidade inferior e
podem induzir uma reação fisiológica desfavorável no consumidor momentaneamente.
Por estas razões, um limite de 1000 mg de Sólidos Dissolvidos Totais/L é o desejável na
água potável. As águas altamente mineralizadas também são inadequadas para muitas
aplicações industriais. Águas com alto teor de sólidos suspensos podem ser
esteticamente insatisfatória para o banho. Análises de sólidos são importantes no
controle biológico e físico nos processos de tratamento de águas residuais e para avaliar
a conformidade com os limites da resolução CONAMA 357/05. Os sólidos de uma água
podem ser classificados de acordo com o diagrama abaixo:
“Sólidos Totais” é o termo aplicado ao resíduo que permanece em uma cápsula após a
evaporação de uma amostra e sua subsequente secagem em uma estufa por um tempo
fixado a uma temperatura definida.
“Sólidos suspensos totais” é a porção de sólidos totais retidos por um papel de filtro.
"Sólidos dissolvidos totais"é a porção que passa por um papel de filtro.
De acordo com o tratamento térmico efetuado na amostra, pode-se, ainda, fragmentar os
sólidos em termos de “fixos” e “voláteis”.
“Sólidos fixos” é o termo aplicado ao resíduo do total, suspensos ou dissolvidos após
aquecimento até à secura durante tempo especificado a uma temperatura especificada. A
perda de peso em ignição (na Mufla) é chamada de "sólidos voláteis"
55
3.2 SÓLIDOS TOTAIS à 103–105 °C 2540 B
3.2.1 Princípio do método
Uma amostra bem misturada é evaporada em uma cápsula e seca até peso constante em
uma estufa a 103 a 105 ° C°. O aumento de peso em relação a cápsula vazia representa os
sólidos totais (ST).
 Cápsula de porcelana de 90 mm de diâmetro (capacidade de 100 mL);

 Mufla para operação a 550 ° C;
 Dessecador, contendo sílica de cor azul;
 Estufa, para funcionamento de 103 - 105 ° C;
 Balança analítica, capaz de pesar até 0,1 mg;
 Banho-Maria;
 Agitador magnético com barra de agitação TFE;
 Proveta graduada;
 Béquer;
 Pinça metálica e;
 Luvas Térmicas.
a)Preparação da cápsula:
1) Ligue a Mufla e ajuste a temperatura da mesma em~550°C;
2) Lave as cápsulas e leve-as para calcinar na Mufla a temperatura de 550°C, por um
período de 1h;
3) Ao termino desse período, desligue a Mufla, aguarde o resfriamento de segurança
(± 15 min ou 150°C) e coloque as cápsulas no dessecador até atingir a temperatura
ambiente para que possam ser pesadas em balança analítica e anote esses valores,
não esquecendo de observar a identificação individual das cápsulas. Esses são os
56
pesos (B);
Obs.: Após a lavagem das cápsulas, as mesmas não deverão ser manuseadas sem um
auxílio de uma pinça metálica. Usar luvas térmicas e pinça metálica sempre que for
colocar ou retirar cápsulas da Estufa/Mufla.
b) Preparação da amostra:
1) Agitar o frasco contendo a amostra de maneira que todos os sólidos contidos sejam
ressuspensos e coloque um volume da amostra que renderá um resíduo entre 2,5 e
200 mg em um béquer contendo uma barra magnética e leve a amostra para o
agitador;
2) Retirar 100 mL de uma porção homogênea da amostra e despejar esse conteúdo na
cápsula preparada;
3) Levar a cápsula ao banho-maria até que a amostra seque;
4) Colocar a amostra seca evaporada por pelo menos 1 h em uma estufa a 103 a 105
°C;
5) Esfriar a cápsula mais resíduo, no dessecador e pesar o conjunto em balança
analítica. Esses são os pesos (A). Calcular os Sólidos Totais.
c) Cálculo:
𝐴 − 𝐵 𝑥1000
𝐶𝑜𝑛𝑐(𝑚𝑔𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙/𝐿) =
𝑉𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎(𝑚𝐿)
Onde:
Conc = Concentração de Sólidos Totais (mg/L)
A = peso do resíduo seco + peso da cápsula após a estufa, mg
B = peso da cápsula, mg
V = Volume da amostra (mL) = 100 mL
57
3.3 SÓLIDOS FIXOS E VOLÁTEIS à 550 ° C 2540 E
3.3.1 Princípio do método
O resíduo do Método 2540 B (Sólidos Totais) é calcinado à 550 °C. Os demais sólidos
representam os sólidos fixos totais, enquanto o peso perdido na ignição são os sólidos
voláteis. Essa determinação é útil no controle da operação da estação de tratamento de
águas residuais, de efluentes líquidos, lodo ativado e resíduos industriais, pois oferece
uma melhor aproximação da quantidade de matéria orgânica presente na fração sólida.
 Cápsula de porcelana de 90 mm de diâmetro (capacidade de 100 mL) utilizada no

Método 2540 B ;
 Mufla para operação a 550 ° C;
 Dessecador, contendo sílica de cor azul;
 Balança analítica, capaz de pesar até 0,1 mg;
 Pinça metálica e;
 Luvas Térmicas.
1) Os resíduos de ignição produzido pelo Método 2540B, após a pesagem da cápsula

(peso A), coloca-los na mufla à 550 ± 50ºC, durante1 hora.
2) Ao termino desse período, desligue a Mufla, aguarde o resfriamento de segurança
(± 15 min ou 150°C) e coloque as cápsulas no dessecador até atingir a temperatura
ambiente para que possam ser pesadas em balança analítica e anote esses valores,
não esquecendo de observar a identificação individual das cápsulas. Esses são os
pesos (C);
3) Calcular os Sólidos Totais Fixos e Voláteis;
4)
a) Cálculos Sólidos Fixos:
𝐶 − 𝐵 𝑥1000
𝐶𝑜𝑛𝑐(𝑚𝑔𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝐹𝑖𝑥𝑜𝑠/𝐿) =
58
Onde:
Conc. = Concentração de Sólidos Fixos (mg/L)
C = peso do resíduo + cápsula após a ignição, mg
B= peso da cápsula (Método 2540 B), mg
V = Volume da amostra (mL)
b) Cálculo para Determinação de Sólidos Totais Voláteis
É a porção de resíduo (matéria orgânica) que se perde na ignição da amostra à 550 ±

50ºC.
𝐴 − 𝐶 𝑥1000
𝐶𝑜𝑛𝑐(𝑚𝑔𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑉𝑜𝑙á𝑡𝑒𝑖𝑠/𝐿) =
Onde:
Conc. = Concentração de Sólidos Voláteis (mg/L)
A = peso do resíduo + cápsula antes da ignição (Método 2540 B), mg
C = peso do resíduo + cápsula após a ignição, mg
V = Volume da amostra (mL)
Obs.: Observe a unidade que você está pesando a cápsula, porque na equação o peso é em
mg.
3.4 PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS
Use garrafas de vidro resistente ou de plástico, desde que o material em suspensão não
fique aderido às paredes do recipiente. Refrigerar a amostra a 4 °C até o momento da
análise para minimizar a decomposição microbiológica de sólidos. Preferencialmente
analise as amostras até 24 h, caso não seja possível proceda a análise em até 7 dias.
Antes de realizar a análise deixe as amostras na temperatura ambiente .
O método 2540 B é adequado para a determinação de sólidos em águas potáveis,
superficiais e salinas, bem como águas residuais industriais no intervalo até 20.000
mg/L
59

WATER ENVIROMENTAL FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater. 22 edição, Washington, APHA/AWWA/WEF, 2012.
60
4.0 DETERMINAÇÃO DE RESÍDUO SEDIMENTÁVEL EM ÁGUAS, MÉTODO DO CONE

IMHOFF
Sedimentação das partículas em suspensão pela ação da gravidade, a partir de 1 L de

amostra em repouso, por 1 h em cone Imhoff
1) Após a coleta homogeneizar a amostra;

2) Despejar 1000 mL desta amostra em um cone de Imhoff e deixar sedimentar
durante 45 min;
3) Passar vagarosamente um bastão de vidro junto à parede interna do cone, para que
os sólidos a ela aderidos sedimentem;
4) Alternativamente, girar, cuidadosamente, com as mãos, o cone em torno do eixo
vertical, de forma a deslocar os sólidos aderidos à parede;
5) Deixar decantar por mais 15 min;
6) Efetuar a leitura da quantidade de sólidos sedimentáveis em mililitros por litro
(mL/L).
Obs.: Se os sólidos contêm volumes de líquido, entre grandes partículas sedimentadas,

estimar esses volumes e subtrair do volume de sólidos sedimentados.
Fluxograma das operações para determinação de sólidos sedimentáveis

61
4.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Expressão dos resultados

Conc. (mL/L) = L
onde: L = Leitura feita no cone Imhof
Observe abaixo o critério de arredondamento do resultado

62
ABNT NBR – 10561/1998
63
5.0 DETERMINAÇÃO DO pH MÉTODO ELETROMÉTRICO
5.1 INTRODUÇÃO
O pH mede a atividade do íon-hidrogénio, ou seja, a acidez do meio. Pode-se,

genericamente, definir pH como a relação numérica que expressa o equilíbrio entre os
íons H+ e os OH– . A escala de pH vai de 0 a 14. pH = 7,0 indica neutralidade. pH > 7,0
indica alcalinidade. pH < 7,0 indica acidez.
A determinação do pH é feita eletronicamente com a utilização de um potenciômetro e

eletrodos (Figuras 04 e 05). O princípio da medição eletrométrica do pH é a
determinação da atividade iônica do hidrogênio, utilizando o eletrodo padrão de
hidrogênio, que consiste de uma haste de platina sobre a qual o gás hidrogênio flui a
uma pressão de 101 kPa.
Figura 4 – Exemplo de Medidores de pH Digital

64
Figura 5 - Eletrodo de vidro combinado para pHmetro de bancada
É um eletrodo compacto no qual o eletrodo de vidro acha-se envolvido pelo eletrodo

de referência de prata/cloreto de prata (Ag / AgCl). É um eletrodo adequado para a
maioria das aplicações de laboratório sendo mais fácil de manusear que o par de
eletrodos separados. Os eletrodos combinados mais recentes têm também um sensor
de temperatura integrado útil na compensação automática de leituras de
temperatura de diferentes amostras.
65
5.3 EQUIPAMENTOS VIDRARIAS E MATERIAIS
 Béqueres de 150 mL
 Peagâmetro com escala para leitura de diferença de potencial ou pH de 0 a 14.
 Papel absorvente macio
 Pisseta com água destilada
5.4 REAGENTES
 Solução tampão pH = 4,0;

 Solução tampão pH = 7,0.
5.5 PROCEDIMENTO E XPERIMENTAL
a) Ligue o peagâmetro e espere, aproximadamente, 30 minutos para estabilizá-lo;

b) Em seguida, proceda a sua calibração (conforme manual do equipamento);
c) Recomenda-se calibrar o eletrodo de pH diariamente ou quando em uso.
d) Repita os procedimentos pelo menos duas vezes.
e) Ao final do processo de calibração lave o eletrodo com água destilada e deixe-o
imerso no frasco protetor com a solução de KCl 3M;
5.6 LEITURA DA AMOSTRA
f) Retire a amostra da refrigeração e aguardar alcançar a temperatura ambiente

g) Homogeneize a amostra;
h) Coloque aproximadamente 50 mL da amostra em um béquer de 150 mL;
i) Retire o eletrodo com cuidado do protetor, lave em água destilada e seque-o em
papel absorvente macio. Em seguida introduza-o no béquer contendo a amostra.
Espere alguns minutos até que o mostrador digital não apresente mais variações e
então anote o valor do pH da amostra;
j) Lave o eletrodo com água destilada, imergir o eletrodo na próxima amostra e assim
sucessivamente
66
k) Depois de fazer as medições, por favor, lave o eletrodo em água destilada e coloque
o frasco protetor com a solução de KCl 3M até a próxima medida de pH.
 Frasco: polietileno, vidro neutro ou borossilicato (pirex)

 Amostra: 200 mL
 Preservação: refrigerar a 4ºC
 Prazo: 24 horas
Manual do fabricante.
http://www.biologica.eng.uminho.pt/TAEL/downloads/analises/cor%20turbidez%
20ph%20t%20alcalinidade%20e%20dureza.pdf
67
6.0 DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO – DBO
A medição da Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) é feita através do método

manométrico (modelo BOD-OxiDirect) que é um método isento de mercúrio e
composto por 6 garrafas de 500 ml, tipo âmbar, para 6 amostras ou provas com
dispositivos superiores respirométricos e plataforma de agitação magnética indutiva, a
qual permite centralização automática da barra magnética . Sua leitura é feita através de
display digital frontal com 4 dígitos e LED com 7 segmentos, com memória programada
para leitura de 1 a 28 dias, que pode ser ajustável pelo usuário. Este display permite
leituras diárias e diretas sem a necessidade de aplicação de fator de conversão dos
seguintes parâmetros: BOD mg/L O2, volume da amostra, duração, tempo de medição
(seleção/controle através de painel frontal). A faixa de medição da Demanda
Bioquímica de Oxigênio varia de 0 a 4.000 mg/l (0-40, 0-80, 0-200, 0-400, 0-800, 0-
2000 e 0-4000). O reconhecimento eletrônico da temperatura se dá através dos sensores,
que só iniciam a medição após a temperatura estabilizar em 20°C (utilização de câmara
DBO recomendada).
6.2 EQUIPAMENTOS VIDRARIAS E MATERIAIS
 01 Balão de medição de 157 mL

 01 Balão de medição de 428 mL
 01 Sistema de agitação
 06 Barras magnéticas
 06 Dispositivos superiores respirométricos
 06 Garrafas âmbares de 500 ml
 Provetas de 100 e 400 mL
6.3 REAGENTES
 Inibidor de Nitrificação (ATH)

 Solução de Hidróxido de Potássio (KCl 45%)
68
6.4.1 Volume da Amostra
O Volume da amostra está relacionado com o valor esperado de DBO da sua amostra. O
BOD-OxiDirect é concebido para operar com as seguintes faixas e volume da amostra
(Tabela 01), permitindo a medição de 0- 4000 mg/L de DBO, sem qualquer diluição.
Tabela 1 – Volume da amostra necessária para a análise de DBO5
6.4.2 Preparação da Amostra de água
a) Verifique o pH da amostra do efluente. Um ótimo valor de pH para oxidação

bioquímica é entre 6,5 a 7,5. Se o valor de pH da amostra for maior ou menor, é
necessário ajustar para a faixa 6,5 a 7,5. Qualquer desvio significativo resultará num
valor mais baixo de DBO. Faça esse ajuste com soluções de ácido clorídrico 1 mol/L,
ácido sulfúrico 1 mol/L ou solução de hidróxido de sódio 1 mol/L;
b) Misture bem a amostra e deixe repousar por um curto período. Também pode ser
aconselhável filtrar a amostra;
c) Meça o volume com precisão usando o balão de medição apropriado e despeje a
amostra no frasco âmbar. Assegure que a amostra no frasco contenha uma parte
representativa de quaisquer sólidos em suspensão. Recomenda-se que cada amostra
deve ser testada duas vezes ou três vezes;
d) Para inibir a nitrificação, é recomendada a adição do inibidor de nitrificação B
(ATH – Alyl Thiourea). Isto é particularmente importante para pequenas faixas 0-40
69
mg/L (por exemplo, quando verificar descargas de efluentes a partir da estação de

tratamento). A quantidade certa do inibidor de nitrificação B está relacionada com a
faixa de medição (Tabela 01);
e) Coloque uma barra magnética limpa em cada frasco e adicione de 3-4 gotas da
solução de hidróxido de potássio a 45%na junta de vedação, com cuidado para não
deixar cair gotas na amostras (isto irá absorver o dióxido de carbono). Para então
inserir a junta de vedação no gargalo da garrafa;
f) Antes do início da medição, a amostra deve ser colocada na temperatura (20°C).
Isso pode ser conseguido colocando a amostra na incubadora de DBO, agitando
continuamente a amostra com o sistema de agitação indutivo;
g) Colocar os sensores de DBO nas garrafas com as amostra e aperte-o com cuidado,
observando a posição do sensor e parafuso no gargalo da garrafa. Isto é
extremamente importante. O sistema deve ser completamente hermético. Então
coloque a garrafa de DBO com o sensor em posição dentro do gargalo da garrafa.
Isso pode ser feito na câmara termostaticamente controlada;
h) Iniciar o processo de medição;
i) Incubar a amostra de acordo com as orientações (por exemplo, DBO5 por 5 dias a
20 °C).
Obs: Uma nova medição irá apagar todos os dados armazenados na memória.
Colocar a garrafa em uma posição vaga na galeria. Ligue o aparelho e pressione a tecla
correspondente para ativar a posição. Pressione a tecla Start para iniciar a medição para
esta garrafa. Quando o botão de ignição é pressionado a unidade muda para o modo
Start e irá mostrar o último intervalo selecionado usado para este conector, com o
volume de amostra necessária, o display piscará. Por exemplo:
70
Varias ações são agora possíveis:
● The + and - o volume da amostra e da faixa de medição podem ser alterados.

● Pressione a tecla Enter para selecionar no display o volume da amostra
requerida e dar continuidade ao processo de medição.
O aparelho verifica se o modo automático está ativado “Autoduration”. Se assim for, o
aparelho irá selecionar automaticamente o período de medição especificado e ativará a
medição. O período de medição não é exibido no display.
Se o modo automático não estiver ativo, o aparelho irá exibir a última medição que foi
usada (o display pisca). Por exemplo:
Varias ações são agora possíveis:
● The + and - o período de medição pode ser alterado em dias

● Pressione a tecla Enter para selecionar no display o período que será utilizado
e o aparelho irá começar a medição.
Enquanto o aparelho tenta iniciar a medição, o display mostrará “0.0.0” and
“0.0.0.0” (piscando). O tempo pode variar. Quando a medição no aparelho for
iniciada com êxito, no display será mostrado 000 e donE.
6.5 INTERPRETANDO OS RESULTADOS
a) O valor da DBO em qualquer dia deve ser maior do que a do dia anterior;
b) Valores da DBO não aumentam de forma linear. O aumento é sempre menor do que
a do dia anterior;
71
c) Se os resultados da DBO aumentarem de uma forma linear, a amostra tem um valor

maior de DBO do que o esperado;
d) Se os resultados da DBO aumentam subitamente durante a medição, isto pode ser
decorrência do processo de nitrificação e;
e) Se os resultados da DBO diminuírem subitamente durante a medição, isto pode
indicar vazamento no sistema.
Manual do fabricante http://www.hellige.com.br/oxidirect- dbo

72
7.0 DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO –DQO (5220 - Refluxo Fechado, Método

Colorimétrico)
A Demanda Química de Oxigênio (DQO) é definida como a quantidade de oxigênio

necessária para oxidar quimicamente, a matéria orgânica e inorgânica oxidável contida
na água.
Quando uma amostra é digerida, o íon dicromato oxida a matéria orgânica na amostra.
Isso resulta na mudança de cromo do estado hexavalente (Cr+6) ao estado trivalente
(Cr+3) em meio fortemente ácido (H2SO4), oxidando a matéria orgânica, convertendo-a
em dióxido de carbono (CO2) e água (H2O), conforme a equação química:
A DQO é frequentemente usada como uma medida de poluentes em águas residuais e

águas naturais. Outros valores analíticos relacionados são demanda bioquímica de
oxigênio (DBO), carbono orgânico total (COT) e demanda de oxigênio (OD). Em muitos
casos, é possível correlacionar dois ou mais desses valores para uma determinada
amostra. DBO é uma medida de oxigênio consumido por microorganismos sob condições
específicas; COT é uma medida de carbono orgânico em uma amostra; OD é uma medida
da quantidade de oxigênio consumida por todos os elementos em uma amostra quando a
oxidação completa (total) é alcançada.
 Bloco Digestor
 Espectrofotômetro
 Tubos de ensaio com tampa de 16 x 100 mm
 Pipetas graduada 5,0 mL
 Balança Analítica
 Balões volumétricos de 25 mL e 500 mL
 Pipeta automática de 1,0 mL; 2,0 mL e 5,0mL
 Béquer de 50 mL e 400 mL
73
7.3 REAGENTES
Estas operações deverão ser preparadas com muito cuidado, usando a capela e os
EPI´s necessários (jaleco, óculos e luvas de nitrila).
a) Solução de digestão (K2Cr2O7+ H2SO4+ HgSO4)
Adicionar a cerca de 500 mL de água destilada em 10,216 g K2Cr2O7, grau padrão
primário, previamente seco a 150 ° C durante 2 h, 167 mL de H2SO4 concentrado e 33,3 g
de HgSO4. Dissolver, esfriar até a temperatura ambiente e diluir para 1000 mL.
Transferir a solução para o frasco distribuidor (dispenser) destinado para essa solução,
através de funil.
ATENÇÃO: Quando essa solução for refeita, nova curva analítica deverá ser traçada.
b) Reagente de ácido sulfúrico (H2SO4 +Ag2SO4)
Adicionar 10,15g Ag2SO4 em 1000 mL de H2SO4. Deixe repousar 1 a 2 dias no escuro para
completa dissolução.
Transferir a solução para o frasco distribuidor (dispenser) destinado para essa solução,
através de funil.
c) Padrão de hidrogeno ftalato de potássio (KHP)
HOOCC6H4COOK: Triturar levemente e depois secar KHP até peso constante (± 3h) a
110° C. Dissolver 0,425g em aproximadamente 50 mL de água destilada e então
completar o volume para 500 mL. Esta solução tem uma DQO teórica de 1000 mgO2/L.
Este a solução é estável quando refrigerada, mas não indefinidamente. Esteja atento
para o desenvolvimento do crescimento biológico visível. Se for prático, prepare e
transfira a solução sob condições estéreis. A preparação semanal normalmente é
satisfatória.
7.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - (Realizar na capela de exaustão)
1) Preparação da Amostra (analisar as amostras em duplicata)

a) Adicionar 1,5 mL da solução de digestão ao tubo de digestão, com o auxílio do
frasco distribuidor (dispenser);
b) Adicionar 3,5 mL do reagente de ácido sulfúrico, também com o auxílio do frasco
distribuidor (dispenser);
c) Adicionar 2,5 mL da amostra pura, com uma pipeta, ou então promover a diluição
74
necessária;
d) Preparar o branco com 2,5 mL de água destilada;
e) Fechar perfeitamente os tubos de digestão e agitar o conteúdo no agitador tipo
vortex;
f) Caso a amostra não possa ser digerida imediatamente, guardá-la sob a proteção da
luz.
2) Preparação do Bloco Digestor
a) Ligar previamente o Bloco digestor, observando cuidadosamente a tomada
correspondente à voltagem do equipamento (220 V).
b) Colocar o equipamento na temperatura desejada (150o C). Quando apagar a luz
vermelha a temperatura desejada (150 oC) foi atingida;
c) Estando a temperatura do Bloco digestor em 150 oC, introduza no mesmo os tubos
de digestão contendo as amostras e o branco;
d) Com o auxilio de um cronômetro marque o tempo (120 minutos). Aguardar o
período de digestão.
e) Terminado o período de digestão (2 horas), resfriar as amostras em local escuro
para posterior leitura no espectrofotômetro.
3) Leitura Espectrofotométrica da DQO

Procedimento geral de uso do Espectrofotômetro - 3000 W da marca Marte
a) Verificar a voltagem do equipamento (110 ou 220 v), ligar na tomada e esperar o
espectrofotômetro fazer automaticamente a checagem (CPU, onda, carrossel, filtro e
lâmpadas);
b) Procurar na tela principal ABS/%T e clicar nessa função, em seguida aparecerá a
tela Modo de Análise (Analysis Mode), e no item configuração (config), será digitado
a quantidade de cubetas (Cell Type/multi Cell) e o comprimento de onda
(Wavelength) 600 nm e clicar em Aplicar;
c) Colocar as amostras nas cubetas iniciando pela posição do branco conforme a
Figura 06 abaixo:
75
Figura 6 - Posição das amostras
d) Retornar para a tela Modo de Análise (Analysis Mode), zerar o equipamento (Auto
Zero) e depois realizar as leituras Medição (Measure) e, anotar os valores.
e) Calcule os valores encontrados Absorbância (%) x DQO (mg/L)
7.5 DICAS DE CUIDADOS BÁSICOS
 As amostras lidas devem ser descartadas em um recipiente apropriado;

 Os tubos de digestão manipulados devem ser lavados sempre após o uso, com água
de torneira e agitação vigorosa, colocados de molho em água destilada com ácido
para lavagem de vidraria, depois postos para escorrer e secar, mantendo em um
local apropriado;
 As cubetas usadas devem ser lavadas sempre depois do uso, com água de torneira,
colocadas de molho em água destilada e após, para escorrer e secar, guardar no
local apropriado.
7.6 CÁLCULO
𝐷𝑄𝑂(𝑚𝑔𝑂2/𝐿) = 𝑌 𝑥 𝑑𝑖𝑙
Sendo: 𝑌 = 𝑎𝑋 + 𝑏
Onde:
DQO (mgO2/L) = Concentração de DQO (mgO2/L)
Y = Valor calculado na equação da curva a partir da absorbância lida no
espectrofotômetro
X = Abs = valor da absorbância lido no espectrofotômetro
dil = diluição da amostra
76
De preferência, coletar amostras em garrafas de vidro. Analise as amostras no dia da

coleta. Se o atraso antes da análise for inevitável, conservar a amostra por acidificação a
pH ≤ 2 usando H2SO4 concentrado. Misture (homogenize) todas as amostras contendo
sólidos suspensos antes da análise. Se a DQO estiver relacionada a DBO, COT, etc.,
Assegure-se de que todos os testes recebam um pré-tratamento idêntico. Fazer diluições
preliminares para resíduos contendo alta concentração de DQO para reduzir o erro
inerente na medição de pequenos volumes de amostra.
7.8 PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO
A Calibração consiste em obter os fatores de resposta relativa da DQO, em várias faixas de

concentração, e expressá-los na forma de uma curva analítica. Os padrões de calibração
são obtidos conforme o procedimento a seguir (semelhante ao preparo de uma amostra).
Adicionar em balões volumétricos de 25mL as quantidades que seguem, na tabela 2, da
solução mãe (DQO = 1000 mg/L) para cada ponto da curva. Completar o volume com
água destilada.
Tabela 2: Preparo dos padrões para Calibração
Nível Volume da Solução Mãe (mL) Concentração (mg.L-1)
1 1,0 40
2 2,0 80
3 3,0 120
4 4,0 160
5 5,0 200
6 7,5 300
7 10,0 400
8 12,5 500
9 15,0 600
10 17,5 700
11 20,0 800
77
Nota: Essas soluções devem ser feitas em duplicata. Determinar a DQO dessas amostras
também em duplicata.
Efetuar o procedimento de preparação e análise da amostra descrito no item 7.4
Com as leituras obtidas, tirar a média das absorbâncias e traçar a curva analítica de
Absorbância (%) x DQO (mg/L) para obtenção da equação de correlação e avaliação de
representatividade e confiabilidade do método.

Water and Wastewater. 22 edição, Washington, APHA/AWWA/WEF, 2012
78
8.0 CLORETOS
O cloreto presente em amostras de águas de abastecimento, águas residuárias

domésticas e efluentes de ETE (Estações de Tratamento de Esgotos), pode ser
determinado por titulação com uma solução padrão de nitrato de prata, após pré-
tratamento das amostras. Durante a titulação, os íons cloretos são precipitados na forma
de cloreto de prata, de acordo com a equação:
Ag++Cl- ↔ AgCl
O cromato de potássio é comumente utilizado como indicador do ponto final da reação.
O indicador forma com o excesso de nitrato de prata, o precipitado vermelho de cromato
de prata conforme a equação (SILVA; OLIVEIRA, 2001):
2 Ag+ + CrO ↔ Ag2CrO
8.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E MATERIAIS.
 Agitador magnético
 Barra magnética
 Béquer de 50 mL e 250 mL
 Bureta automática
 Erlenmeyer de 250 mL
 Papel absorvente
 Peagâmetro
 Pipeta volumétrica de 1mL
 Pipetador
 Proveta de 100 mL
8.3 REAGENTES
 Solução padrão de Nitrato de Prata 0,0141N;
 Solução indicadora de Cromato de Potássio 5%
 Solução padrão de NaCl 0,0141N
79
 Solução de Hidróxido de sódio (para ajuste do pH)

 Solução de Ácido Sulfúrico (para ajuste do pH)
8.3.1 Preparo das soluções

j) Preparo da solução indicadora de Cromato de Potássio 5%
Pesar cerca de 5,0g de K2CrO4 para um béquer de volume apropriado, adicionar 80mL de
água destilada e agitar até dissolução. Adicionar AgNO3 0,0141N até aparecer um
precipitado vermelho. Repousar a solução por 12h e após este tempo, filtrar. Transferir
quantitativamente para um balão volumétrico de 100mL e completar a volume com água
destilada.
k) Preparo de solução de AgNO3 0,0141N

Secar cerca de 4,0g de AgNO3 a 120 ºC por 2 horas e dessecar por 30 minutos;
Pesar 2,395g de AgNO3 para um béquer de volume apropriado, contendo 100mL de água
destilada e agitar até dissolução;
Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 1000mL e completar a
volume com água destilada.
l) Preparo da solução NaCl 0,0141N

Pesar em béquer de 250mL cerca de 824 mg (0,824g) de cloreto de sódio seco a 140ºC
por 2 horas e dessecado por 40 minutos;
Adicionar 100mL de água destilada e homogeneizar até a completa dissolução;
Transferir quantitativamente o conteúdo para o balão volumétrico de 1000mL,
avolumar com água destilada e homogeneizar a solução;
Transferir para o frasco e identificá-lo corretamente.
m) Padronização da solução AgNO3 contra solução de NaCl 0,0141mol/L

Transferir uma alíquota de 25,00mL da solução de NaCl 0,0141mol/L para 03
erlenmeyers de 250mL
Adicionar 1,00mL do indicador K2CrO4 a 5 %;
Titular com solução de nitrato de prata 0,0141mol/L até mudança de cor da solução de
amarelo-canário para castanho-avermelhada fraca;
80
Agitar com maior intensidade e verificar se a cor castanho-avermelhada persiste. Em

caso positivo finalizar a titulação. Em caso negativo, adicionar solução padrão de AgNO3
0,0141mol/L gota a gota até atingir o ponto final;
Registrar o volume de solução padrão gasto para titulação.
8.3.2 Cálculos da concentração das soluções
n) Concentração real da solução de NaCl

mNaCl
CNaCl 
eqNaCl  V( s ) ( L )
Onde:
CNaCl = concentração real da solução de NaCl;
mNaCl = massa de NaCl pesada;
eqNaCl = equivalente-grama do NaCl (58,44 g/gmol);
V( s ) ( L ) = volume da solução em litros (L).
o) Concentração real da solução de AgNO3
CNaCl  VNaCl
C AgNO3 
VAgNO3
Onde:
CNaCl = Concentração da solução de NaCl;
VNaCl = Volume da alíquota tomada de NaCl;
C AgNO 3 = Concentração da solução de AgNO3;
V AgNO 3 = Volume gasto da solução de AgNO3.
a) Ligue o peagâmetro e em seguida, proceda a sua calibração. Ao final do processo de

calibração lave o eletrodo com água destilada e deixe-o imerso em água destilada;
b) Meça em uma proveta 100 mL a amostra a ser analisada e em seguida despeje-a em
um Erlenmeyer de 250 mL (recomendado fazer sempre as amostras em duplicatas);
c) Retire o eletrodo da água destilada, seque-o em papel absorvente e introduza-o no
Erlenmeyer contendo a amostra. Caso o pH da amostra não esteja entre 7 e 10,
ajuste o pH da mesma para essa faixa, adicionando lentamente uma solução de ácido
sulfúrico (para baixar o pH) ou hidróxido de sódio (para elevar o pH);
81
d) Ajustado o pH da amostra, adicione à mesma 1 mL da solução indicadora de

cromato de potássio;
e) Coloque o Erlenmeyer de 250 mL contendo a amostra com o indicador em um
agitador com uma barra magnética, ligue o botão da agitação com cuidado,
aumentado aos poucos à velocidade de agitação;
f) Titule a amostra com a solução padrão de nitrato de prata até o aparecimento de
uma coloração levemente avermelhada. Anote o volume gasto da solução padrão
de nitrato de prata 0,0141N, que está na bureta automática;
g) Zere a bureta para realizar uma nova titulação;
h) Faça uma prova em branco. Neste caso, adicione 100 mL de água destilada e 1mL
da solução indicadora de cromato de potássio ao Erlenmeyer de 250 mL, e titule
com a solução padrão de nitrato de prata. Anote o volume gasto da solução padrão
de nitrato de prata 0,0141N, que está na bureta automática;
i) Realize os cálculos de acordo com a equação do item 8.5
8.5 CÁLCULOS
𝑉𝐴 − 𝑉𝐵 𝑥𝑁𝐴𝑔𝑁𝑜3𝑥35500
𝐶(𝑚𝑔/𝐿) =
Onde:
C = Concentração Cloreto, mg/L
VA = Volume da solução padrão de Nitrato de Prata gasto na titulação da amostra, mL;
VB = Volume da solução padrão de Nitrato de Prata gasto na titulação da água destilada
(branco), mL;
NAgNO3 = Normalidade da solução de Nitrato de Prata usada;
35500 = fator correção do peso molecular do Cl2 (35,5) x correção do volume mililitros
para litro (1000)
Vamostra = Volume da amostra (mL)
SILVA, S. A.; OLIVEIRA, R. O. (2001) Manual de Análises Físico-Químicas de Águas de

Abastecimento e Residuárias. Campina Grande, Paraíba: O Autor, 2001. 265p.
82
9.0 NITROGÊNIO AMONIACAL - NH3 (4500 3- B - Destilação Preliminar e 4500 NH3 -

C - Método Titulométrico)
A amostra é tamponada num pH de 9,5 com tampão de borato para diminuir a hidrólise
de cianatos e compostos nitrogenados orgânicos, em seguida é destilada, e o conteúdo
destilado é coletado em uma solução absorvente de ácido bórico. Esse destilado coletado
no ácido bórico é titulado com ácido sulfúrico e um indicador misto. Esse método é
indicado para concentrações de NH3-N superiores a 5 mg/L.
✔ Destilador de Nitrogênio;
✔ Medidor de pH;
✔ Agitador Magnético;
✔ Barra Magnética;
✔ Bureta automática;
✔ Erlenmeyers de 500mL;
✔ Papel absorvente;
✔ Pisseta com água destilada isenta de amoníaco;
✔ Provetas com tampa de 100mL;
✔ Balão volumétrico e;
✔ Beckeres;
9.4 REAGENTES
a) Água isenta de amônia:

Elimine traços de amônia em água destilada adicionando 0,1 mL de H2SO4 concentrado a
1000 mL de água destilada e redestilando.
Use água destilada isenta de amônia para preparar todos os reagentes, lavagem e
diluição da amostra.
83
b) Solução tampão de borato - Na2B4O7 10 H2O

Pesar 9,5g Na2B4O7 10 H2O (tetraborato de sódio) e transferir para um becker de 500mL,
dissolver o tetraborato de sódio em água destilada isenta de amônia. Após a dissolução
adicionar 88 mL de solução de NaOH 0,1N e transferir essa solução para um balão
volumétrico de 1000 mL e completar o volume até a marca de aferição do balão.
c) Solução de Hidróxido de sódio -NaOH 0,1 N

Pesar rapidamente 4,0 g de NaOH e transferir para um becker de 500mL, dissolver o
NaOH em água destilada. Transferir essa solução para um balão volumétrico de 1000 mL,
aguardar esfriar e completar o volume até a marca de aferição do balão.
d) Solução de Hidróxido de sódio - NaOH 6 N

Pesar rapidamente 240g de NaOH e transferir para um becker de 1000 mL, dissolver o
NaOH em 800mL de água destilada. Transferir essa solução para um balão volumétrico
de 1L, aguardar esfriar e completar o volume até a marca de aferição do balão.
e) Solução indicadora mista

Pesar 0,2 g do indicador vermelho de metila e dissolver em 100 mL de álcool etílico a
95% ou isopropílico. Pesar 0,1g de azul de metileno e dissolver em 50 mL de álcool
etílico ou isopropílico a 95%. Misturar as duas soluções e guardar. Prepare-se
mensalmente.
f) Solução absorvente de Ácido Bórico - H3BO3

Pesar 20 g de H3BO3 e transferir para um becker de 1L, dissolver o ácido bórico em
aproximadamente 800 mL de água destilada isenta de amônia. Após a dissolução,
adicione 10 mL da solução indicadora mista e transfira essa solução para um balão
volumétrico de 1000 mL. Completar o volume até a marca de aferição do balão.
Prepare-se mensalmente.
g) Solução titulante padrão de ácido sulfúrico - H2SO4 0,02N

Pipetar 0,54 mL do ácido sulfúrico concentrado (98% d = 1,84 g/cm3) e transferir
lentamente para um balão volumétrico de 1000 mL, contendo cerca de 500 mL de água
84
destilada. Completar o volume, até a marca de aferição do balão, com água destilada e
agitar. Essa solução é aproximadamente 0,02N.
Obs.: Caso se utilize um ácido sulfúrico com a concentração inicial diferente de 98% e
que esteja na unidade de Normalidade, realizar o cálculo para obtenção do volume
inicial necessário para o preparo da solução 0,02N utilizando a fórmula Ci x Vi = Cf x Vf
h) Indicador Vermelho de Metila 0,1%

Pesar 0,100g de vermelho de metila e dissolver em 100 mL de água destilada.
i) Padronização da Solução de Ácido Sulfúrico - H2SO4 0,02N contra padrão

primário Tetraborato de Sódio - Na2B4O7 10 H2O
Secar em estufa de 1,5g de Na2B4O7 10 H2O, por quatro horas a 100° C. Esfriar em
dessecador.
Pesar em triplicata 0,1335g de Na2B4O7 10 H2O e transferir para três erlemeyers de
250mL contendo uma barra magnética cada.
Adicionar 100 mL de água destilada a cada erlemeyer e agitar em baixa velocidade até
completa dissolução. Colocar 4 gotas do indicador vermelho de metila 0,1%.
Titular com o H2SO4 0,02 N até o ponto de viragem do indicador que passará de
vermelho para amarelo. Realizar a padronização em triplicata e anotar o volume do
ácido gasto. Calcular a normalidade do ácido sulfúrico pela seguinte fórmula:
𝑚𝑁𝑎2𝐵4𝑂7
190,68
𝑁(𝐻2𝑆𝑂4) =
𝑉𝐻2𝑆𝑂4
Onde:
NH2SO4 = Normalidade do H2SO4 desejada;
VH2SO4 = Volume do ácido gasto na titulação em L;
mNa2B4O7 = Massa pesada do Tetraborato de sódio
190,68 = Equivalente grama do Tetraborato de sódio
85

a) Preparação do equipamento:
Em um becker de 50 mL, adicione 25 mL de água destilada isenta de amônia e 1mL da
solução tampão de borato, ajustar o pH a 9,5 com solução de NaOH 6N.
Após esse ajuste, colocar essa mistura no tubo de ensaio do destilador de nitrogênio.
Usar a mistura para vaporizar o aparelho de destilação até o destilado não mostra traços
de amônia.
b) Preparação da amostra:
1) Homogeneizar a amostra;
2) Retirar uma alíquota representativa em relação a quantidade de nitrogênio
amoniacal presente na amostra, tal qual sugere a Tabela 03 abaixo, e transferir para
um becker:
Tabela 3 - Volume da amostra para a Digestão

Nitrogênio Amoniacal na amostra Volume para a amostra
(mg/L) (mL)
5- 10 250
10-20 100
20-50 50
50-100 25
Obs: Quando a concentração de NH3-N é inferior a 100 µg / L, use um volume de
amostra de 1000 mL.
3) Adicionar 25mL de Solução Tampão de Borato;

4) Ajustar o pH para 9,5 com a solução de NaOH 6 N, usando um medidor de pH;
5) Reservar.
c) Destilação das amostras:
6) Adicionar 50mL de Solução Absorvente de Ácido Bórico em um Erlenmeyer de 500
mL com a ponta do tubo da saída da amostra, abaixo da superfície da solução
receptora de ácido;
7) Transferir a amostra preparada e reservada para um frasco Kjeldahl e conectar o
frasco ao destilador;
8) Destilar a uma taxa de 6 a 10 mL/min (10 minutos destilando a amostra);
86
9) Colete pelo menos 200 mL de destilado;

d) Titulação da amostra
10) Após recolher aproximadamente 200 mL de destilado em cada caso, titule os
mesmos com a solução padrão de H2SO4 0,02N padronizado até o indicador virar
para a cor lavanda clara;
11) Faça o branco em todas as etapas do procedimento e aplique a correção necessária
aos resultados;
12) Anote os valores dos volumes da solução de ácido gasto em cada caso, que está na
bureta automática e calcule de acordo com a equação abaixo:
9.6 CÁLCULOS
(VA  VB ) xf
C (mgNH 3  N / L) 
Vamostra
Onde:
C = Concentração Nitrogênio Amoniacal, mgNH3-N/L
VA = Volume do Ácido Sulfúrico gasto na titulação da amostra;
VB = Volume do Ácido Sulfúrico gasto na titulação do branco.
f = Fator correção: MM do Nitrogênio (14) x 1000 (mg/L) x NH2SO4
Vamostra = Volume da amostra (mL)

Os resultados mais confiáveis são obtidos em amostras frescas. As amostras devem ser
analisadas dentro de 24 h após a coleta, refrigerar sem acidificação a ±4°C. Para
conservação até 28 dias, congelar a -20 °C não acidificando, ou preservar as amostras
acidificando para pH<2 e armazenar a ±4°C. Se a preservação ácida for usada, neutralize
as amostras com NaOH ou KOH imediatamente antes de fazer a determinação.
CUIDADO: Embora a acidificação seja adequada para certos tipos de amostras, produz
interferências quando o amônio permutável está presente em sólidos não filtrados.
87
10 FÓSFORO TOTAL (4500-P E. - Método do Ácido Ascórbico)
Em meio ácido o molibidato de amônio e o tartarato de potássio e antimônio reagem

com o íon ortofosfato (PO4-3) e forma o ácido fosfomolíbdico (complexo amarelo). Este
complexo é reduzido pelo ácido ascórbico a um pigmento intensamente colorido de azul
de molibdênio, que é absorvido a 880 nm.
 Autoclave
 Balança analítica
 Balões volumétricos de 50; 100; 200; 500 e 1000 mL;
 Béquer de 250 mL
 Conta-gotas
 Erlenmeyers de 125 mL
 Espátula
 Espectrofotômetro
 Fita adesiva
 Papel alumínio
 Pipeta volumétrica de 5 mL
 Pipetador
 Pipetas graduadas de 1,5,10 e 20 mL
 Provetas de 50 mL
10.3 REAGENTES
 Persulfato de potássio K2S2O8

 Tartarato de antimônio e potássio
 Ácido sulfúrico H2SO4
 Molibdato de amônio
88
 Ácido ascórbico
 Fosfato de Potássio monobásico KH2PO4
 Fenolftaleína
 Hidróxido de sódio (NaOH)
a) Ácido sulfúrico H2SO4 5N:

Diluir 70 mL de H2SO4 concentrado em um balão de 500 mL contendo aproximadamente
250 mL de água destilada, promover a dissolução e completar o volume até a marca de
aferição do balão. Transferir essa solução para um recipiente contendo uma
identificação.
b) Solução de tartarato de antimônio e potássio:

Dissolver 1,3715g K(SbO) C4H4O6 1⁄2H2O em 400 mL de água destilada em um balão
volumétrico de 500 mL e completar o volume até a marca de aferição. Guarde em uma
garrafa de vidro com rolha de vidro,contendo uma identificação.
c) Solução de molibdato de amônio:

Dissolver 20 g (NH4) 6Mo7O24 4H2O em 500 mL de água destilada. Armazenar em um
garrafa de vidro com rolha de vidro,contendo uma identificação.
d) Ácido ascórbico 0,1 M:

Dissolver 1,76 g de ácido ascórbico em 100 mL de água destilada. A solução é estável
durante cerca de 1 semana a ±4 ° C.
e) Reagente combinado:
Misture os reagentes acima nas proporções seguintes para 100 mL do reagente
combinado: 50 mL 5N H2SO4, 5 mL de solução de tartarato de antimónio e potássio, 15
mL de solução de molibdato de amônio e 30 mL de ácido ascórbico solução. Misture após
a adição de cada reagente. Deixe todos os reagentes atingir a temperatura ambiente
antes de serem misturados e misturar ordem dada. Se se formar turbidez no reagente
combinado, agitar e deixe repousar por alguns minutos até que a turbidez desapareça
antes de proceder. O reagente é estável por 4 horas.
89
f) Solução estoque de Fosfato a 50,0 µg PO43 -P/mL (para a curva de calibração):

Dissolver em água destilada 219,5 mg de KH2PO4 anidro e diluir a 1000 mL.
g) Solução padrão de Fosfato a 5,0 mg PO43 -P/L (para a curva de calibração):

Diluir 20mL da solução de fosfato em estoque em balão volumétrico para 200 mL com
água destilada obtendo-se uma solução de trabalho de 5mg/L.
h) Solução indicadora de Fenolftaleína

Pesar 1g de Fenolftaleína e transferir para um Béquer de 250 mL contendo 100 mL de
álcool etílico 95% e com a ajuda de um bastão, promover a total dissolução da
Fenolftaleína, em seguida adicionar 100 mL de água destilada e homogeneizar a solução
Transferir essa solução para um recipiente (conta-gotas) de vidro, contendo uma
identificação.
i) Solução de Hidróxido de Sódio 1M:

Pesar 40 g de hidróxido de sódio (NaOH) e transferir para um Béquer de 250 mL
contendo, aproximadamente, 100 mL de água destilada. Deixar resfriar até a
temperatura ambiente e, em seguida transferir para um balão volumétrico de 1000 mL e
promover uma agitação para dissolução completa e em seguida completar o volume do
balão até sua marca de aferição com água destilada. Transferir essa solução para um
recipiente de polipropileno, contendo uma identificação.
j) Solução de ácido sulfúrico (para a digestão):

Adicionar cuidadosamente 300 mL de H2SO4 para aproximadamente 600 mL de água
destilada e diluir a 1000 m L em balão volumétrico até a marca da aferição. Transferir
essa solução para um recipiente contendo uma identificação.
k) Digestão das amostras e do branco com Persulfato de Potássio:

1) Pesar 0,5 g de Persulfato de potássio (K2S2O8) em um erlenmeyer de 125 mL. (Obs.:
identificar cada erlenmeyer com o nome da amostra, incluindo o Branco. Fazer todas as
amostras em duplicata);
90
2) Pipetar 50mL de cada amostra, não filtrada, e transferir para os Erlenmeyers de

125 mL já identificados e contendo o Persulfato de Potássio e, 50 mL de água destilada
no erlenmeyer do Branco. Em seguida, adicionar 1 gota de solução indicadora de
fenolftaleína a cada erlenmeyer;
3) Se aparecer a coloração rósea característica do indicador em meio básico,
adicionar a cada um dos Erlenmeyers, gota a gota, a solução de digestão de H2SO4 ácido
sulfúrico, até o desaparecimento da cor e, em seguida, adicionar mais 1mL dessa solução;
4) Agitar os Erlenmeyers, cobrir com papel alumínio e levar todas as amostras e o
Branco à autoclave. Quando o autoclave atingir uma temperatura 130°C manter as
amostras nessa temperatura por 30 min.
l) Preparação da amostra para a leitura no Espectrofotômetro

1) Passado os 30 min., desligar o autoclave, retirar os Erlenmeyers e deixá-los
resfriar até a temperatura ambiente. Posteriormente, transferir o conteúdo dos mesmos
para balões volumétricos de 100 mL (identificados de acordo com as amostras),
adicionar a cada um deles uma gota do indicador de fenolftaleína e neutralizar todos eles
com a solução de hidróxido de sódio (1M), ou seja, gotejar a solução de hidróxido de
sódio até o aparecimento da cor rósea fraca . Em seguida, completar o volume dos balões
com água destilada até a marca de aferição de 100 mL;
2) Medir 50 mL da amostra do item anterior e retornar para os Erlenmeyers de 125
mL (identificados de acordo com as amostras);
3) Preparar o reagente combinado de acordo com a metodologia descrita (Reagentes
item e) e adicionar aos Erlenmeyers de 125 mL, contendo as amostras digeridas
inclusive o branco, 8 mL do reagente combinado.
4) Fazer a leitura no espectrofotômetro em um período compreendido entre 10 e 30
min;
5) Utilizar o branco para zerar o espectrofotômetro a 880 nm;
6) Ler a absorbância de todas as amostras no espectrofotômetro a 880 nm e anotar
esses valores.
c) Correção da interferência da turbidez ou cor :

A cor natural da água geralmente não interfere no alto comprimento de onda usado.
Para águas altamente coloridas ou turvas, prepare uma prova em branco adicionando
91
reagentes, com exceção do ácido ascórbico e do Tartarato de potássio antimônio na

amostra. Subtrair a absorvância em branco da absorvância de cada amostra,
adicionando reagentes, com exceção do ácido ascórbico e do Tartarato de potássio
antimônio na amostra. Subtrair a absorvância em branco da absorvância de cada
amostra.
10.5 CÁLCULO
Fósforo Total(mg P−PO43−/L) = 𝑌 𝑥 𝑑𝑖𝑙
Sendo: 𝑌 = 𝑎𝑋 + 𝑏
Onde:
Fósforo Total (mg P-PO43-/L) = Concentração de Fósforo Total (mg P-PO43-/L)
Y = Valor calculado na equação da curva a partir da absorbância lida no
espectrofotômetro
X = Abs = valor da absorbância lido no espectrofotômetro
dil = diluição da amostra
Preserve congelando a amostra ou abaixo de 10 °C. Em alguns casos, 40 mg de HgCl2/L

podem ser adicionados as amostras, especialmente quando devem ser armazenadas por
períodos antes da análise.
CUIDADO: O HgCl2 é uma substância perigosa; tomar as devidas precauções no descarte;
uso de HgCl2 não é muito indicado. Não adicione ácido ou CHCl3 como conservante
quando as formas de fósforo devem ser determinadas. Se for necessário determinar o
fósforo total, adicionar H2SO4 ou HCl a pH< 2 e esfriar a 4 ° C, ou congelar sem quaisquer
adições.
Não armazene amostras contendo baixas concentrações de fósforo em garrafas plásticas,
a menos que sejam mantidas congeladas, fosfatos podem ser adsorvidos nas paredes de
garrafas plásticas.
Lave todos os recipientes de vidro com HCl diluído (10%) e enxague várias vezes em
água destilada. Nunca use detergentes comerciais contendo fosfato para limpeza de
material de vidro usado em análise fosfato. Técnicas de limpeza mais extenuantes
podem ser usadas.
92
10.7 PREPARO DA CURVA PADRÃO

A Calibração consiste em obter os fatores de resposta relativa de Fósforo Total, em várias
faixas de concentração, e expressá-los na forma de uma curva analítica. Os padrões de
calibração são obtidos conforme o procedimento a seguir (semelhante ao preparo de uma
amostra).
Adicionar em balões volumétricos de 50mL as quantidades que seguem, na tabela 4, da
solução padrão de Fosfato (5,0 mg PO43 -P/L) para cada ponto da curva. Completar o
volume com água destilada. Preparar também um branco utilizando água destilada.
Tabela 4: Preparo dos padrões para Calibração

Nível Volume da Solução Padrão (mL) Concentração (mg.L-1)
1 2,0 0,2
2 4,0 0,4
3 6,0 0,6
4 8,0 0,8
5 10,0 1,0
6 12,0 1,2
7 14,0 1,4
8 16,0 1,6
Nota: Essas soluções devem ser feitas em duplicata. Determinar o Fósforo dessas amostras também em duplicata.
Efetuar o procedimento de preparação e análise da amostra descrito no item 10.4

Com as leituras obtidas, tirar a média das absorbâncias e traçar a curva analítica de
Absorbância (%) x Fósforo Total (mg/L) para obtenção da equação de correlação e
avaliação de representatividade e confiabilidade do método.
93
11. MEDIDOR MULTIPARÂMETROS AK 88

O Medidor Multiparâmetro AK88 (Figura 7) é um instrumento resistente a água (com
todas as sondas conectadas) que realiza medições de vários parâmetros da água como
pH, condutividade, salinidade, oxigênio dissolvido e temperatura. Ele mostra em uma
única imersão, os resultados de todas as medições simultaneamente em seu visor.
Figura 7- Medidor AK 88
O medidor em uso no laboratório de saneamento é da marca AKSO, modelo AK 88, que

verifica a qualidade da água em tempo real de 05 parâmetros (Tabela 5).
Tabela 5 - Especificações do medidor multiparâmetros AK88

94
Vista frontal do AK 88
95
Visor AK88
11.2 INSTRUÇÕES DE OPERAÇÃO
Antes de utilizar o aparelho observe os seguintes passos :

96
1º Passo
2º e 3º Passos
IMPORTANTE
97
11.3 OPERAÇÃO DO AK 88
LIGAR/DESLIGAR
Para ligar o aparelho pressione o botão Liga-Desliga/SET
11.3.1 pH (ajuste/Calibração)
1. Realize o ajuste/Calibração do aparelho ao menos uma vez por semana;

2. O aparelho pode ser ajustado em 1, 2 ou 3 pontos de pH, respeitando as seguintes
combinações: pH 7,0; pH 7,0 e 4,0 ou pH 7,0 e 10; pH 7,0, 4,0 e 10;
3. Conecte a sonda de pH e temperatura observando o seu encaixe de maneira correta;
4. Remova o frasco de solução KCl 3M da ponta da sonda de pH;
5. Ligue o aparelho pressionando o botão Liga-Desliga/SET;
6. Selecione o sensor de temperatura a ser utilizado pressionando o botão ENTER até
as indicações TEMP e pH piscarem simultaneamente no visor;
7. Lave a sonda de pH e TEMP em água destilada ou deionizada e seque a sonda com
um papel absorvente macio;
8. Mergulhe a sonda na solução tampão de pH 7,0 agitando suavemente para a
completa homogeneização;
98
9. Mantenha pressionado o botão CAL, até a indicação CAL aparecer no visor;

10. Aguarde o aparelho reconhecer a solução tampão utilizada, exibindo seu valor no
visor> Caso o valor reconhecido seja diferente do valor nominal da solução em uso,
utilize os botões ∆ ou ∇ para ajustar a leitura ao valor da solução;
11. Aguarde 30 s ou pressione o botão ENTER para salvar o ajuste no aparelho;
12. Repita os procedimentos de 7 a 11 para ajustar em um novo valor de pH e;
13. Ao final dos reajustes lave a sonda com água destilada/deionizada e recoloque-a no
frasco de armazenamento da ponta da sonda, contendo a solução de KCl 3M.
11.3.2 pH Medição
1. Conecte a sonda de pH e temperatura observando o seu encaixe de maneira correta;

2. Remova o frasco de solução KCl 3M da ponta da sonda de pH;
as indicações TEMP e pH piscarem simultaneamente no visor;
5. Lave a sonda de pH e TEMP em água destilada ou deionizada e seque a sonda com
6. Mergulhe a sonda na amostra em análise, agitando-a suavemente para a completa
homogeneização;
7. Após a leitura estabilizar observe no visor os valores de pH e TEMP medidos;
8. Anote os valores;
9. Após cada medição, lavar a sonda com água destilada ou deionizada, secando-a com
um papel absorvente macio e;
10. Ao fim das medições, lave a sonda com água destilada/deionizada e recoloque-a no
frasco de proteção da ponta da sonda, contendo a solução de KCl 3M.
11.3.3 Registro das Medições no AK 88 -MEM
1. Para salvar os valores das medições na memória do aparelho, pressione o botão

MEM. Piscará 02 vezes no visor a indicação MEMO e o número de identificação do
registro no campo da temperatura;
99
2. Caso a memória esteja totalmente utilizada aparecerá no visor a mensagem FUL.
11.3.4 Visualização dos Registros na Memória -RECALL

1. Para visualizar os registros armazenados na memória do AK 88, mantenha
pressionado o botão RECALL até a indicação MEMO começar a piscar no visor;
2. Aparecerá no visor os registros das medições de pH, condutividade/salinidade, OD e
TEMP;
3. Para alternar entre os registros. Pressione o ∆ ou ∇. Piscará 2 vezes no visor, no
campo da temperatura o número de registro selecionado com seus respectivos
valores registrados;
4. Para retornar o modo de medição, pressione o botão ESC. A indicação MEMO se
apagará do visor.
11.3.5 Condutividade/Salinidade -Medição
1. Conecte a sonda de Condutividade/Salinidade e temperatura observando o seu

encaixe de maneira correta;
as indicações TEMP e COND ( ou SALT) piscarem simultaneamente no visor;
4. Selecione o modo de medição condutividade ou salinidade, pressionando o botão
EC-SALT. Aparecerá no visor a indicação do modo selecionado. (COND →
condutividade ou SALT → salinidade) ;
5. Remova o frasco de proteção da ponta da sonda;
6. Lave a sonda de condutividade/salinidade e temperatura em água destilada ou
deionizada e seque a sonda com um papel absorvente macio;
homogeneização;
8. Após a leitura estabilizar observe no visor os valores de condutividade/salinidade e
temperatura medidos;
100

frasco de proteção da ponta da sonda, contendo água destilada.
11.3.6 Oxigênio Dissolvido (OD) - Ajuste (Calibração)
1. Conecte a sonda de OD e temperatura observando o seu encaixe de maneira correta;

as indicações TEMP e OD piscarem simultaneamente no visor;
4. Hidrate a sonda mergulhando-a por alguns segundos em água destilada ou
deionizada;
5. Suspenda a sonda no ar e aguarde a estabilização da leitura (± 2 minutos);
6. Mantenha pressionado o botão CAL, até aparecer no visor a mensagem CAL,
alternando com a temperatura medida;
7. Aguarde 30 s ou pressione o botão ENTER para salvar o ajuste no aparelho. A
medição de OD se ajustará automaticamente ao valor 100% de OD.
11.3.7 Oxigênio Dissolvido (OD) - Medição
1. Conecte a sonda de OD e temperatura observando o seu encaixe de maneira correta;

as indicações TEMP e OD piscarem simultaneamente no visor;
4. Remova o frasco de proteção da ponta da sonda;
5. Lave a sonda de OD e temperatura em água destilada ou deionizada e seque a sonda
com um papel absorvente macio;
homogeneização;
7. Após a leitura estabilizar observe no visor os valores de OD e temperatura medidos;
9. Em caso de instabilidade na medição direta, recolha a amostra em recipiente grande
101
(maior que 0,5 L) e efetue a medição no recipiente;

um papel absorvente macio e;
frasco de proteção da ponta da sonda.
11.3.8 Mensagens de erro Causa x Solução
Disponível em: https://www.akso.com.br/produto/ph-do-
solo/medidor_multiparametro_ph_cond_od_temp_ak88-238
102
12.0 SONDA MULTIPARÂMETROS
O uso de equipamentos para monitorar e analisar a qualidade da água em tempo real

vem sendo muito difundido. São instrumentos práticos, sem a necessidade de análises
laboratoriais e medem simultaneamente vários parâmetros. Um exemplo deste tipo de
instrumento para monitoramento são as sondas multiparamétricas (Figura 8), utilizadas
na medição em valas de drenagem ou canais, áreas de pântanos, poços ou reservatórios
e águas superficiais.
Figura 8 -HORIBA, modelo U-52G
A sonda utilizada no laboratório de saneamento é da marca japonesa HORIBA, modelo

U- 52G, que verifica a qualidade da água em tempo real de 13 parâmetros, conforme
demonstrado no Quadro 1.
Quadro 1 -Parâmetros medidos no Horiba U-52G
Parâmetros
pH Sólidos Totais Dissolvidos Gravidade específica da água
do mar
OD Profundidade ORP (potencial de redução de
oxidação)
OD % Temperatura GPS
Condutividade Turbidez
Salinidade Gravidade específica

103
12.2 PARTES NOMES E FUNÇÕES (Figura 9)
Figura 9 - Nomes e Funções do Horiba
A sonda possui uma unidade de controle integrado que coleta e armazena um conjunto
de dez mil dados (10.000), que pode ser transferido para o computador por um cabo
USB (Figura 10).
Figura 10 - Conexão da Sonda com o Computadora

104
12.2.1 Sensores (Figura 11)
Figura 11 - Sensores do Horiba
12.2.2 Display
Possui display (LCD)com visor luminoso (Figura 12), um cabo de 30 m.
Figura 12 - visor luminoso

105
12.2.3 Chaves de Operação (Figura 13)
Figura 13 - Descrição das chaves de Operações
12.2.4Conectando a unidade de controle e a sonda do sensor (Figura 14)
Figura 14 - Conexão do cabo a unidade controle

106
12.3 CALIBRAÇÃO
A calibração é realizada quando for utilizar o aparelho pela primeira vez ou o mesmo
não foi utilizado por mais de 3 meses.
O copo de calibração transparente possui linhas de medições com TURB e sem TURB.
Calibração Automática
Use cerca de 200 mL de solução padrão pH 4 até a linha indicadora (sem TURB) no copo
de calibração transparente. Insira a sonda no copo de calibração, observando a posição
do eletrodo de OD (Figura 15). Verifique se não há bolhas de ar.
Não segure a sonda ao executar a calibragem automática. A temperatura corporal pode
elevar o sensor de temperatura interna, dando erro de calibração. Com a sonda no copo
de calibração transparente, coloque o copo de calibragem imerso no copo de
calibração preto (Figura 16).
Figura 15 Figura 16
Copo de calibração transparente Copo de calibração preto
107
Os seguintes parâmetros são calibrados (a

25 ° C):
 pH: 4,05 (calibração de ponto zero);
 COND: 0, 449 s / m (4.49 mS / cm, a
calibragem span);
 TURB: 0 NTU (calibração de ponto
zero);
 DO: 8,92 mg / L (calibração span);
 DEP: 0 m (calibração de ponto zero).
Após os procedimento descrito nas Figuras acima, pressione a tecla CAL (Figura 17) da
unidade de controle para definir o modo de calibração ( auto calibração).
Figura 17 - Modo de Calibração
Quando todos os valores do sensor estiverem estabilizados , pressione a tecla ENTER

para iniciar a calibração; Não remova a sonda do sensor até finalizar a calibração.
 A calibração termina quando a mensagem “Cal completa. MEAS para medir
aparece”.
 Se ocorrer um erro de calibração, só iniciar a calibração após resolver
primeiro o problema de acordo com as instruções em “4.6 Solução de
problemas do manual”.
12.4 MEDIÇÃO
É possível efetuar a medição por qualquer um dos métodos abaixo. Selecione o método
de medição que atenda às suas necessidades. (Figura 18)
108
Figura 18 - Configuração Medição
Medição única – armazena os dados na memória manualmente com intervalo de 5

segundos entre as medições (Figura 19)
Medição de intervalo – armazena na memória dados automaticamente e
continuamente com intervalo mínimo de memória de 10 segundos.
Figura - 19 Intervalo de Medição
12.5 OPERAÇÃO DE DADOS
Use os procedimentos a seguir para recuperar dados armazenados na memória, apagar

todos os dados, como também verificar a capacidade restante da memória de dados e o
registro de calibração. No menu Configuração, selecione o item criar nova localização
(ENTER), para criar uma localização (Figura 20). Se desejar selecionar uma localização
existente pressione selecionar localização ou para excluir uma localização pressione
apagar localização.
109
Figura 20- Criando uma Localização
Quando selecionar o item criar nova localização, aparecerá no display a tela conforme a
Figura 21, onde você digitará o nome desejado para a sua localização e depois pressiona
arquivar.
Figura 21 -Escrevendo o nome da localização
Depois de selecionada a localização e o intervalo de medição, você está apto para

realizar a análise com a sonda, mas observe se as unidades dos parâmetros estão de
acordo com a legislação utilizada. No menu Configuração, selecione o item Unidade
para relatório, após selecionado você terá a tela no display, de acordo com a Figura 22.
Figura 22 -Unidade para o relatório

110
Agora você pode retirar os copos: transparente e escuro e adicionar a solução de

calibração pH 4 no frasco indicado para sua reutilização e colocar a sonda no copo
indicado para iniciar as medições, conforme o modelo abaixo:
12.6 REALIZANDO ANÁLISE
Depois de calibrar a sonda, escolher o intervalo de medição, criar ou selecionar uma

localização e observar se as unidades estão de acordo com a legislação utilizada, a
medição deve ser realizada. Utilizando as setas retorne ao menu conforme a Figura 23.
Figura 23 -MENU inicial
Submergir o sensor da sonda na amostra, agitando a amostra para remover quaisquer

bolhas de ar dos sensores. Se a amostra for de água corrente, mova o cabo lentamente
para cima e para baixo aproximadamente por 20 a 30 segundos, para garantir que a
amostra chegue ao sensor de OD. Quando os valores de medição estiverem estáveis,
111
pressione a tecla MEAS e aguarde em média 5 segundos até para de piscar, depois
pressione a tecla ENTER para gravar a leitura.
12.7 VERIFICANDO OS DADOS
Para verificar se os dados foram gravados, navegue até o item Operação de Dados
(Figura 24) e selecione a opção verificar dados
Figura 24 - Operação de Dados
Após selecionar, Verificar dados aparecerá no display à tela segundo a Figura 25, onde
será selecionado o item Todos para verificar se os dados foram armazenados.
Figura 25-Operação de Dados
12.8 TRABALHANDO OS DADOS
Utilize o programa U50 Data Collection Software para trabalhar os dados armazenados
que é enviado ao computador através do cabo USB (Figura 26), onde esses dados podem
também ser trabalhados no programa Excel.
112
Figura 26 - Cabo de Comunicação
Manual do Fabricante www.horiba.com
113
13.0 COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES (E. coli)
13.1 INTRODUÇÃO
O grupo coliforme, pertencente à família Enterobacteriaceae, é composto por vários

gêneros de bactérias que compartilham semelhanças metabólicas. Mais especificamente,
pela definição da Organização Mundial da Saúde, coliformes são bactérias Gram
negativas capazes de fermentar lactose a 37°C com produção de ácido, gás e aldeído em
até 48h, não formadoras de esporos e que apresentem atividade da enzima β-
galactosidase (uma das enzimas responsáveis pela fermentação da lactose) (WHO,
2011).
Dentre os diversos gêneros que compõe o grupo coliforme, Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter e Klebisiella se destacam por estarem presentes em grandes quantidades nas
fezes de animais, e, por esta razão, essas bactérias têm sido extensivamente utilizadas
como indicadores de contaminação fecal. Além da origem fecal, várias bactérias do
grupo dos coliformes totais são exclusivamente ambientais e podem multiplicar-se na
água e em biofilmes. Por esse motivo, elas não são atualmente utilizadas como
indicadoras de contaminação fecal, mas sim para avaliação da eficiência do tratamento,
da limpeza e integridade dos sistemas de distribuição e da presença potencial de
biofilmes (WORLD HEALTH ORGANIZATION 2004, STANDING COMMITTEE OF
ANALYSTS 2002).
De forma mais rigorosa, um subgrupo do grupo coliforme denominado coliformes fecais
ou coliformes termotolerantes têm sido descrito como indicadores de contaminação
fecal mais específicos, devido a sua correlação positiva com fezes de animais de sangue
quente (GRABOW, 1996; BORREGO; FIGUERAS, 1997). A Escherichia coli e os coliformes
termotolerantes são um subgrupo dos coliformes totais que podem fermentar a lactose
em temperaturas mais elevadas (WORLD HEALTH ORGANIZATION 2004, STANDING
COMMITTEE OF ANALYSTS 2002). Metabolicamente, os coliformes termotolerantes são
capazes de fermentar lactose a 44,5°C na presença de sais biliares (GRABOW, 1996).
A pesquisa de coliformes termotolerantes é aplicada na investigação da contaminação
fecal de corpos d'água, mananciais, águas recreacionais e despejos domésticos e
industriais. Em concordância com esses conceitos, a legislação brasileira sobre
qualidade de águas destinadas ao consumo humano, águas minerais e águas naturais
114
determina que sejam analisados os coliformes termotolerantes ou, preferencialmente, a

E. coli, que devem estar ausentes nessas águas. Quanto aos coliformes totais, é exigida
ausência na água tratada, na saída do sistema, sendo aceitas determinadas porcentagens
na rede de distribuição, enquanto que para águas minerais e águas naturais, é
estabelecido um limite máximo para essas bactérias.
13.2 COLIFORMES TOTAIS E E. COLI PELO MÉTODO COLILERT
13.2.1. Princípio do método
Este método é aprovado pelas organizações norte-americanas EPA, AOAC, IBWA, EBWA,
por outras organizações internacionais e aceito pelos Métodos Padrão para Exames de
Água e Esgoto (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater). Detecta
Coliformes Totais e E. coli, simultaneamente, em 24 horas.
O Colilert utiliza tecnologia de substrato definido [Defined Substrate
Technology®(DST®)] para detecção de coliformes totais e E. coli em água. À medida que
os coliformes se reproduzem no Colilert, eles utilizam ß-galactosidase para metabolizar
o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. O E. coli utiliza ß-
glucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. Já que a maioria dos não
coliformes não conta com estas enzimas, eles não podem se reproduzir e interferir. Os
poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz
especificamente formulada do Colilert. Esta abordagem diminui a incidência de falso-
positivos e falso-negativos.
13.2.2. Equipamentos, vidrarias e reagentes
✔ Incubadora
✔ Autoclave
✔ Seladora
✔ Câmara UV
✔ Álcool 70%
✔ Cartela Quanti-Tray e meio de cultura
✔ Água de diluição
115
✔ Frascos estéreis
13.2.3. Reagentes
● Água de diluição
Solução-estoque A - 1,25mL
Solução-estoque B - 5,00mL
Água purificada - 1000mL
Preparo:
a) Preparar a solução-estoque A com a seguinte composição:
Diidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) - 34,0g
Dissolver o dihidrogenofosfato de potássio em 500mL de água purificada, ajustar o pH
para 7,2 ± 0,5 com solução de hidróxido de sódio 1N e completar o volume para 1000mL.
Distribuir volumes adequados à necessidade de uso do laboratório em frascos com
tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos. Armazenar sob
refrigeração, durante no máximo dois meses;
Nota: Antes da utilização da solução-Estoque A, deve-se verificar se não há quaisquer evidências da
contaminação microbiana (turbidez ou presença de material em suspensão). Em caso afirmativo, essa
solução deve ser descartada.
b) Preparar a solução-estoque B com a seguinte composição:
Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) - 81,1g
Dissolver o cloreto de magnésio em 500mL de água purificada e completar o volume
para 1000mL. Distribuir volumes adequados à necessidade de uso do laboratório em
frascos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos.
Armazenar sob refrigeração, durante no máximo dois meses;
c) Adicionar 1,25mL da solução-estoque A e 5mL da solução-estoque B a um litro de
água purificada;
d) Distribuir, em frascos de diluição, quantidades adequadas para que o volume final,
após esterilização, seja de 90 ± 2mL; e
e) Tamponar e esterilizar em autoclave a 121°C, durante 15 minutos.
116
Nota: A água de diluição a ser utilizada no enxágüe de porta-filtros, após a filtração de cada amostra, pode
ser distribuída em balões ou frascos em volumes adequados às necessidades de uso do laboratório,
devendo ser observado o tempo requerido para a esterilização em autoclave do volume utilizado (30
minutos para volumes de 500 e 1000mL).
Armazenamento A solução preparada poderá ser estocada ao abrigo da luz e à temperatura ambiente
(menor que 30°C), durante, no máximo, duas semanas.
13.2.4. Procedimento experimental
Passe álcool 70% na bancada antes de iniciar a análise, utilize luvas e máscaras para
realizar o procedimento.
Adicione o reagente (ou meio de cultura) à amostra conforme a Figura 27. Tampe o
frasco e misture bem;
Figura 27 - Meio de cultura
Despeje o conteúdo do frasco na cartela Quanti-Tray®/2000 (Figura 28). Lacre a cartela

Quanti-Tray na seladora e coloque na incubadora por 24 horas na temperatura de 35°C.
Figura 28 - Cartela e seladora
13.2.5. Resultados
Leia os resultados do Quanti-Tray/2000 da seguinte maneira:

Cavidades amarelas = coliformes totais (Figura 29)
117
Cavidades amarelas/fluorescentes = E. coli (Figura 30)

Após a contagem das cavidades, consulte a tabela NMP para obter o resultado final.
Caso o resultado ultrapasse o limite detectável na tabela NMP procede-se à diluição da
amostra original. Para realizar as diluições devem ser preparados frascos com 90mL de
água de diluição estéril e em seguida proceder a diluição da seguinte forma: para a
diluição 10-1 retirar 10 mL da amostra original e inocular no 1º frasco contendo a água
de diluição estéril, para a diluição 10-2 retirar 10 mL da diluição 10-1 e inocular no 2º
frasco contendo água de diluição e assim por diante para realizar as diluições 10-3, 10-4,
etc. Para o resultado após as diluições multiplicar o valor do NMP encontrado na tabela
pelo fator de diluição.
Figura 29 - Coliformes Totais
Figura 30 - E . coli
Para o descarte do material contaminado colocá-los em sacos plásticos apropriados para

autoclave e autoclavá-los em 121ºC por 30 minutos.
IDEXX BRASIL. Colilert IDEXX BRASIL. Disponível em:

https://www.idexx.com.br/files/colilert-procedure-en.pdf. Acesso em: 11/02/2020.
118
13.3. COLIFORMES TERMOTOLERANTES PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO DE

MEMBRANA
13.3.1. Princípio do método
A técnica de membrana filtrante para quantificação de coliformes termotolerantes

baseia-se na filtração de volumes adequados de água, mediante pressão negativa
(vácuo), através de membrana filtrante, com porosidade de 0,45µm. Essas bactérias,
apresentando dimensões maiores que os poros da membrana, ficarão retidas em sua
superfície, a qual será então transferida para uma placa de Petri, contendo o meio de
cultura seletivo e diferencial ágar m-FC. Por capilaridade, o meio se difundirá para a
membrana, entrando em contato com as bactérias e, após um período determinado de
incubação (24 ± 2h a 44,5± 0,2°C) desenvolvem-se colônias com características típicas
(coloração azul) que poderão ser observadas com auxilio de um microscópio
estereoscópico. A partir da contagem dessas colônias calcula-se a densidade de
coliformes termotolerantes presentes na amostra.
Nota: Neste método o intervalo numérico aceitável para a realização da contagem de colônias é de 20 a 60
colônias típicas. Este intervalo é mais restritivo do que o proposto para a técnica de membrana filtrante
para coliformes totais (20 a 80 colônias típicas), e isso deve-se ao fato das colônias de coliformes
termotolerantes apresentarem maior tamanho no meio m-FC.
13.3.2. Equipamentos, vidrarias e reagentes
✔ Incubadora;
✔ Autoclave;
✔ Microscópio esteroscópico (lupa);
✔ Bomba de vácuo;
✔ Lamparina ou bico de Bunsen;
✔ Placas de Petri ;
✔ Frascos reagentes;
✔ Proveta;
✔ Tubos de ensaio;
✔ Tubo de Durhan;
119
✔ Pipetas de 1 mL e 10 mL;
✔ Pinça;
✔ Meios de cultura: m-FC agar, caldo lauril triptose, caldo EC;
✔ Água de diluição (KH2PO4, MgCL2.6H2O);
✔ Ácido rosólico;
✔ Hidróxido de sódio;
✔ Membranas filtrantes de acetato de celulose ou nitrato de celulose estéreis, com
47mm de diâmetro e porosidade de 0,45µm, brancas e quadriculadas.
13.3.3. Amostragem
A) Identificar a amostra a ser analisada e definir os volumes a serem filtrados, em função

de sua procedência, segundo especificações a seguir:
A.1) para amostras que se supõe menos contaminadas a soma dos volumes filtrados
deve ser no mínimo 100 mL e;
A.2) para águas mais contaminadas pode ser requerida a filtração de volumes decimais
da amostra.
B) Antes de iniciar o exame, desinfetar a bancada de trabalho, usando como desinfetante
álcool etílico 70%;
C) Dispor sobre a mesma o seguinte material:
C.1) porta-filtro(s) previamente esterilizado(s), adaptado(s) ao suporte de filtração, o
qual é conectado a um frasco Kitasato e esse à fonte de vácuo ou a um garrafão reforçado
para vácuo em polipropileno apresentando tampa com sistema de enchimento;
C.2) placas de Petri, de 49 x 13mm, contendo o meio m-FC, identificadas com os
números das amostras e o volume a ser filtrado;
C.3) pinça com as extremidades mergulhadas em álcool etílico contido em um béquer;
C.4) bicos de Bunsen, para manter o ambiente asséptico e efetuar a flambagem das
pinças utilizadas;
C.5) provetas graduadas estéreis, com a abertura recoberta com papel alumínio,
identificadas com o número da amostra. Podem ser utilizados porta-filtros graduados
com marcação externa, desde que os mesmos apresentem erro volumétrico inferior a
2,5%;
120
C.6) água de diluição estéril, contida em frascos de diluição (volume de 90 ± 2mL) e em

balões ou frascos de 1000mL e;
C.7) membranas filtrantes de acetato de celulose ou de acetato de celulose e nitrato de
celulose estéreis, com 47mm de diâmetro e porosidade de 0,45µm, brancas e
quadriculadas.
13.3.4 Preparação do porta-filtro
a) Retirar a parte superior do porta-filtro e, com as extremidades de uma pinça

previamente flambadas e resfriadas, colocar uma membrana filtrante estéril sobre a
parte inferior do porta-filtro;
b) acoplar a parte superior do porta-filtro à parte inferior, tomando cuidado para não
danificar a membrana;
c) para o controle de contaminação de cada porta-filtro usado, efetuar a filtração de um
volume de 100mL de água de diluição estéril no início de cada série de filtração e após a
filtração de 10 amostras.
13.3.5 Preparação dos meios de cultura e soluções
● Meio m-FC: Pesar o meio desidratado nas quantidades determinadas pelo

fabricante e acrescentar 1000mL de água purificada fria contendo 10mL de solução
de ácido rosólico 1%. Deixar em repouso durante aproximadamente 15 minutos.
Aquecer em banho-maria, agitando frequentemente até a completa dissolução dos
ingredientes, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição.
Estabilizar o meio de cultura a 45-50°C e, com os cuidados de assepsia, distribuir
volumes de aproximadamente 4mL em placas de Petri de 49mm x 13mm,
previamente esterilizadas. Esperar a solidificação do meio para posterior
armazenamento.
Nota: Este meio não pode ser esterilizado em autoclave, pois ocorreria decomposição do ácido rosólico.
● Solução de ácido rosólico 1%
Ácido rosólico - 1,0g
Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,2N - 100mL
121
Preparo: Pesar 1g de ácido rosólico e adicionar 100mL de solução de hidróxido de

sódio 0,2N. Agitar até a completa dissolução. A solução não deve ser autoclavada.
Armazenamento A solução preparada deverá ser estocada ao abrigo da luz e deve
ser mantida sob refrigeração por um período máximo de duas semanas. Caso a
solução apresente alteração de sua cor de vermelho escura para marrom, deverá ser
descartada.
● Solução de hidróxido de sódio 0,2N
Hidróxido de sódio (NaOH) - 8g
Preparo: Pesar 8g de hidróxido de sódio e dissolver em 1000mL de água purificada.
Armazenamento: Em frasco âmbar ou protegido da luz, com tampa de rosca, à
temperatura ambiente, durante no máximo seis meses.
● Meio EC: Pesar o meio desidratado nas quantidades determinadas pelo fabricante e
acrescentar 1000mL de água purificada fria. Aquecer, agitando frequentemente, até
completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a
temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio de 12mm x 120mm, contendo em seu
interior tubo de Durham invertido, distribuir volumes adequados para que o volume
final, após a esterilização seja de 5mL. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121°C,
durante 15 minutos.
Armazenamento: O meio preparado poderá ser estocado ao abrigo da luz e à
temperatura ambiente (menor que 30°C), durante no máximo, 15 dias.
● Caldo Lauril Triptose: Pesar o meio desidratado nas quantidades determinadas
pelo fabricante e acrescentar 1000mL de água purificada. Aquecer, agitando
frequentemente, até a completa dissolução do meio, evitando que se atinja a
temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio de 16mm x 150mm, contendo em seu
interior tubo de Duhram invertido, distribuir volumes adequados para que o volume
final após a esterilização seja de 10mL. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121°
C, durante 15 minutos.
Armazenamento: O meio preparado poderá ser estocado ao abrigo da luz e à
temperatura ambiente (menor que 30°C), durante no máximo, duas semanas.
Para o preparo da água de diluição verificar item 13.2.3.
122
13.3.6 Preparação da amostra para filtração
Para volumes iguais ou superiores a 10mL:

a) homogeneizar a amostra, no mínimo 25 vezes, inclinando o frasco, formando um
ângulo de aproximadamente 45° entre o braço e o antebraço e;
b) distribuir os volumes requeridos da amostra em provetas graduadas estéreis,
previamente identificadas, ou então em porta-filtro com graduação, e proceder à
filtração;
Para volumes inferiores a 10mL:
a) homogeneizar a amostra e, com o auxílio de uma pipeta estéril retirar o volume
desejado e adicionar a um frasco contendo 90mL de água de diluição estéril (este
volume servirá apenas de suporte para que as possíveis bactérias existentes na amostra
se distribuam uniformemente na superfície da membrana, ao ser efetuada a filtração) e;
b) homogeneizar e proceder à filtração;
Para volumes decimais (diluição da amostra), efetuar as diluições decimais da amostra
da seguinte forma:
a) proceder à identificação de cada frasco de água de diluição estéril, anotando o número
da amostra e a diluição que deverá conter;
b) homogeneizar a amostra e, com uma pipeta estéril de 10mL, obedecendo aos
cuidados de assepsia, transferir 10mL da amostra para um frasco previamente
identificado, contendo 90 ± 2mL de água de diluição estéril. Estará preparada a primeira
diluição (10-1), sendo que 1ml da mesma corresponde ao volume de 0,1mL da amostra;
c) repetir a operação segundo o item anterior, com o frasco contendo a diluição feita
anteriormente (10-1) e desta, com uma nova pipeta estéril de 10mL, transferir 10mL
para um novo frasco, previamente identificado, contendo 90 ± 2mL de água de diluição
decimal (10-2), sendo que 1mL da mesma corresponde ao volume de 0,01 mL de amostra;
d) preparar as diluições seguintes da mesma forma, até a maior diluição definida em
função do nível de contaminação da amostra.
123
Tabela 6 - Volume da amostra sugerido para Teste de E. coli ou coliformes

termotolerantes pelo método de filtração de membrana
Fonte da amostra Volume (X) a ser filtrado em mL
100 50 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001
Água potável x
Lagos, reservatórios x x
Poço x x
Sistema de abastecimento de água x x x
Água de banho natural x x x
Estação de tratamento de esgoto x x x
Lagoas agrícolas, rios x x x
Escoamento de águas pluviais x x x
Esgoto municipal bruto x x x
Águas de confinamento x x x
Lamas de depuração x x x
Fonte: APHA (2012)
13.3.7 Filtração da amostra e incubação
A) Verter cuidadosamente no porta-filtro o volume da amostra a ser examinado,

evitando que a água respingue sobre as suas bordas superiores;
B) Ligar o sistema ou a bomba de vácuo e proceder à filtração;
C) Após a filtração, enxaguar o porta-filtro três vezes, com porções de 20-30mL de água
de diluição estéril, para evitar a retenção de alguma bactéria nas paredes internas do
mesmo;
D) Desligar a válvula de controle de vácuo do porta-filtro, ao finalizar a operação. Evitar
a secagem excessiva da membrana filtrante, desligando o vácuo imediatamente após o
término do processo de filtração;
E) Separar a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça, cujas extremidades foram
flambadas e resfriadas, retirar com cuidado a membrana. Acoplar novamente a parte
superior do porta-filtro à inferior;
F) Obedecendo aos cuidados de assepsia, colocar cuidadosamente a membrana, com a
superfície quadriculada voltada para cima, na superfície do meio de cultura contido na
placa de Petri, devidamente identificada com o número da amostra e o volume filtrado;
124
Nota: Ao transferir a membrana para a superfície do meio de cultura, observar que toda a área da
membrana deve ficar completamente aderida ao meio. Para isso, segurando a membrana pelas bordas
(fora da área de filtração) com as extremidades da pinça previamente flambadas e resfriadas, colocá-la
sobre o meio de cultura e efetuar com ela um movimento giratório para permitir uma boa adesão. Se
persistir a formação de bolhas entre a membrana e o meio de cultura, sempre com a extremidade da pinça
flambada e resfriada, levantar a borda da membrana mais próxima da bolha para eliminá-la, pois as bolhas
impedem o contato das bactérias com o meio de cultura, dificultando, ou mesmo impedindo, o seu
crescimento (Figura 31).
Figura 31- Colocação da membrana filtrante na superfície do meio de cultura
G) Tampar a placa de Petri;

H) Lavar novamente o porta-filtro com água de diluição estéril e proceder à filtração da
próxima amostra;
Nota: Os porta-filtros devem estar estéreis no inicio de cada série de filtração e, se houver um intervalo de
30 minutos entre uma filtração e outra, devem ser esterilizados novamente ou substituídos por outros
estéreis, para evitar uma contaminação acidental.
I) Após as filtrações, colocar as placas de Petri contendo o meio de cultura e a membrana,
em posição invertida e proceder à incubação a 44,5 ± 0,2°C, durante 24 ± 2 horas. Se for
utilizado um banho-maria, acondicionar as placas em sacos plásticos bem vedados e
deixar as mesmas totalmente submersas na água, durante o período de incubação.
13.3.8 Leitura
A) Após o período de incubação e com auxílio de um microscópio estereoscópico, com

iluminação fluorescente, efetuar a contagem das colônias típicas de coliformes
termotolerantes. No meio m-FC, as colônias típicas apresentam coloração azulada,
enquanto colônias atípicas apresentam, coloração branca, cinza ou amarelada;
125
B) Os limites aceitáveis para a contagem de colônias típicas de coliformes

termotolerantes em ágar m-FC situam-se entre 20 e 60 colônias. Para efetuar a
contagem, observar as Figuras 32 e 33.
Figura 32 – Modelo para contagem das colônias
Nota: O circulo interno indica a área de filtração e as linhas pontilhadas indicam a seqüência a ser seguida
na contagem.
Figura 33 - Porção da membrana filtrante quadriculada, em aumento
OBS: AS COLÔNIAS SÃO CONTADAS NOS QUADRADOS INDICADOS PELAS SETAS.

C) No caso de terem sido filtrados vários volumes, selecionar para leitura apenas
aquele(s) que tiver(em) fornecido contagem de colônias dentro dos limites aceitáveis;
D) Quando os volumes filtrados (soma dos volumes maior ou igual a 100mL) não
apresentarem crescimento bacteriano, isto é, contagens iguais a zero, expressar o
resultado segundo item 13.3.9.C;
E) Se a contagem em todos os volumes filtrados for inferior a 20 colônias típicas, e a
soma dos volumes correspondentes for 100mL, efetuar a leitura em todas essas placas e
utilizar a soma das contagens para o cálculo;
F) Se a contagem em todos os volumes filtrados for inferior a 20 colônias típicas e a
soma desses volumes não for 100mL, selecionar para leitura o volume cuja contagem for
126
mais próxima do intervalo ideal para a contagem e expressar o resultado como

densidade estimada;
G) Se dois diferentes volumes filtrados fornecerem placas com a contagem na faixa ideal,
utilizar essas duas contagens e volumes para o cálculo;
H) Nos casos em que todos os volumes filtrados forneceram contagens superiores a 80,
mas for possível contar as colônias no menor desses volumes, efetuar cuidadosamente a
contagem dessas colônias e expressar o resultado como densidade estimada;
I) Quando a estimativa visual do total de colônias (típicas e atípicas) for superior a 200,
ou quando houver crescimento em toda a área de filtração da membrana, sem colônias
bem definidas (crescimento confluente), a contagem de colônias não é efetuada. Nesses
casos deve ser avaliada a necessidade de recoleta da amostra para a seleção de volumes
mais adequados para a filtração de forma que sejam obtidas contagens de colônias
dentro dos limites aceitáveis.
Nota: no método de determinação de coliformes termotolerantes pela técnica de membrana filtrante com
o meio m-fc não é necessária a realização de ensaios confirmativos posteriores. é considerado coliforme
termotolerante qualquer colônia de coloração azul capaz de se desenvolver no meio m-fc a 44,5 ± 0,2°c em
até 24 ± 2h.
13.3.9 Resultado
Cálculos
A) Selecionar a placa, com o número de colônias típicas (coloração azul), dentro dos
limites aceitáveis (20 a 60) e calcular a densidade de coliformes termotolerantes por
100mL através da aplicação da seguinte fórmula:
B) Se as contagens forem efetuadas em placas correspondentes a mais de um volume

filtrado, calcular a densidade em 100mL através da seguinte fórmula:
127
C) Nos casos em que todos os volumes filtrados forneceram contagens iguais a zero, se
esses volumes não totalizaram 100mL, considerar como sendo 1 a contagem no maior
volume filtrado e utilizar a fórmula geral apresentada no item A para o cálculo da
densidade de coliformes termotolerantes em 100mL e item 13.3.10.C para a expressão
dos resultados.
13.3.10 Expressão dos resultados
A) A densidade de coliformes termotolerantes determinada através da técnica de

membrana filtrante é expressa como:
Unidades formadoras de colônias de coliformes termotolerantes por 100mL ou
UFC de coliformes termotolerantes/100mL
B) No caso especificado em 13.3.7.C, em que todos os volumes filtrados forneceram
contagens iguais a zero e os mesmos não totalizam 100mL, após o cálculo expressar o
resultado obtido precedido do sinal <(menor que):
Unidades formadoras de colônias de coliformes termotolerantes / 100mL: < valor
obtido
C) Nos casos em que todos os volumes filtrados forneceram contagens iguais a zero, mas
os mesmos totalizaram 100mL, expressar o resultado como:
Unidades formadoras de colônias de coliformes termotolerantes / 100mL: < 1
(Ausente)
D) Quando a contagem não for efetuada devido ao grande número de colônias típicas e /
ou atípicas que se desenvolveram na membrana (> 200) ou a ocorrência de crescimento
confluente, considerar os seguintes casos para expressão dos resultados :
E) Para águas de consumo humano ou águas minerais ou naturais envasadas
Presença de coliformes termotolerantes - contagem prejudicada devido a
crescimento confluente
F) Para águas brutas ou efluentes, calcular o resultado conforme: Unidades formadoras
de colônias de coliformes termotolerantes: > valor obtido/100mL
128
13.3.11 Procedimento de verificação de colônias
A verificação para coliformes termotolerantes das colônias típicas (coloração azul) é

recomendada como controle de qualidade e para fornecimento de dados para uma
avaliação do desempenho do método em relação às amostras analisadas, devendo ser
realizada periodicamente, com o intuito de descartar os falsos positivos.
A) A partir das placas de uma determinada amostra, selecionar ao menos 10 colônias
típicas (coloração azul) bem isoladas, para serem submetidas ao procedimento de
verificação. As colônias devem ser aleatoriamente selecionadas e inoculadas, em caldo
lauril-triptose (meio presuntivo para coliformes totais) e posteriormente em meio EC
(meio confirmativo para coliformes termotolerantes). A contagem final deve ser
ajustada ao percentual encontrado no procedimento de verificação.
Para determinar a porcentagem de falsos negativos, inocular uma quantidade
representativa de colônias atípicas provenientes do m-FC em caldo lauril-triptose.
B) A partir do número de colônias típicas de coliformes termotolerantes determinado
para a verificação, identificar tubos contendo caldo lauril-triptose,de tal modo que cada
colônia corresponda a um tubo.
C) Com o auxílio da alça de inoculação devidamente flambada e esfriada, transferir cada
colônia selecionada para o tubo correspondente.
D) Incubar os tubos de caldo lauril-triptose a 35 ± 0,5°C durante 24 ± 2h.
E) Após o período de incubação efetuar a 1ª leitura. Considera-se como resultado
positivo os tubos que apresentarem turvação e formação de gás no tubo de Duhram. Os
tubos com resultado negativo devem ser incubados novamente a 35 ± 0,5°C durante 24
± 2h.
F) Efetuar a 2ª leitura (48 ± 3h).
G) Após as 1ª e 2ª leituras, todos os tubos de caldo lauril-triptose que apresentarem
resultado positivo devem ser submetidos, imediatamente, ao teste confirmativo para
coliformes termotolerantes. Para isso, tubos contendo o meio EC são marcados com os
números correspondentes a cada tubo de caldo lauril-triptose com resultado positivo;
H) Utilizando um palito estéril ou alça de inoculação, devidamente flambada e resfriada,
as culturas positivas provenientes do caldo lauril-triptose são transferidas para os tubos
de meio EC.
129
I) Incubar os tubos de meio EC em banho-maria ou incubadora a 44,5 ± 0,2°C durante 24

± 2h. Garantir que o tempo entre o inóculo e a incubação não exceda 30 minutos e que,
em caso de utilização de banho-maria, os tubos fiquem imersos até o nível superior do
meio de cultura neles contido.
J) Proceder à leitura. Considera-se como resultado positivo os tubos que apresentarem
turvação e formação de gás no tubo de Duhram.
K) A partir do número de colônias confirmadas como coliforme termotolerantes,
calcular a densidade dessas bactérias ajustando a contagem inicial de colônias típicas no
m-FC à porcentagem encontrada de colônias confirmadas no procedimento de
verificação.
13.3.12 Descarte do material
Para o correto descarte do material acondicioná-los em sacos para autoclave e colocá-los

na autoclave por 30 minutos à 121°C. Posteriormente, deixar a vidraria de molho em
hipoclorito de sódio por 30 minutos e lavar com água e sabão neutro e depois enxaguar
com água de torneira e por último água destilada.
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION - APHA. Standard Methods for the

Examination of Water and Waste Water. 22. ed. Washington DC, 2012. 1220 p.
CETESB. Norma técnica L5.221. Coliformes termotolerantes: determinação pela

técnica de membrana filtrante. 2ª edição. Junho de 2012. 18 páginas.
FUNASA. Manual prático de análise de água. 4ª edição. Brasília: FUNASA, 2013, 150 p.
130
14.0 MÉTODO DE DETECÇÃO PARA SALMONELLA (PRESENÇA/AUSÊNCIA)
Poluição da água por contaminação fecal pode introduzir uma variedade de

microrganismos patogênicos de origem intestinal. Dentre estes a Salmonella constitui
um importante problema de saúde pública, pois a doença também pode ser propagada
por alimentos crus contaminados. O gênero Salmonella causa infecções graves levando a
toxicoinfecções alimentares e quadro de gastroenterite aguda.
Vários autores têm proposto o uso de Salmonella como indicador de poluição, pois
enfatizam que a Salmonella pode, em certas circunstâncias, sobreviver durante mais
tempo do que os coliformes. A extrema resistência de bactérias do gênero Salmonella
aos fatores ambientais justifica também a utilização deste parâmetro em estudos que
visam avaliar a eficácia dos processos de tratamento de águas residuárias e de lodos de
esgoto, bem como do controle de qualidade de águas utilizadas em aquicultura.
O gênero Salmonella compreende atualmente mais de 2 mil sorotipos caracterizados por
reações bioquímicas, antígenos somáticos e flagelares. São bacilos gram-negativos,
anaeróbios facultativos, não esporulados, com 0,7 a 1,5 um de diâmetro por 2 a 5 um de
comprimento. Reduzem nitratos a nitritos e a maioria é móvel por meio de flagelos
peritríquios. Fermentam a glicose e o manitol, usualmente com produção de gás. Não
liquefazem a gelatina e não crescem em KCN. Em geral, produzem sulfeto de hidrogênio,
utilizam o citrato como única fonte de carbono e não fermentam a lactose, a sacarose, a
salicina e o inositol. Não possuem urease nem desaminases porém são lisina e ornitina
descarboxilase positivos.
O método baseia-se na concentração de volumes representativos de amostras de água
tratada, superficial e subterrânea através de membrana filtrante ou mecha de gaze ou na
inoculação direta das amostras de esgoto, de solo, de sedimento e de resíduo sólido. As
amostras são posteriormente incubadas em meios de enriquecimento (Rappaport
tetrationato e/ou selenito novobiocina) próprios para inibir outras bactérias e favorecer
o crescimento de Salmonella, ou pré-enriquecimento (água peptonada tamponada). As
colônias típicas isoladas em placa contendo o meio ágar seletivo e diferencial (XLD e BG)
são submetidas a testes bioquímicos e sorológicos para confirmação.
131
14.2 EQUIPAMENTOS, VIDRARIAS E REAGENTES
✔ Incubadora;
✔ Autoclave;
✔ Bomba de vácuo;
✔ Lamparina ou bico de Bunsen;
✔ Erlenmeyer;
✔ Tubos de ensaio;
✔ Placas de Petri;
✔ Pipetas de 1 mL e 10 mL;
✔ Frascos reagentes;
✔ Água de diluição;
✔ Pinça;
✔ Meios de cultura: caldo selenito com novobiocina, meio de Rugai e lisina motilidade
(IAL), XLD;
✔ Membranas filtrantes de acetato de celulose ou nitrato de celulose estéreis, com
47mm de diâmetro e porosidade de 0,45µm, brancas e quadriculadas.
14.3 REAGENTES
● Caldo selenito cistina com novobiocina

Suspender 23,0 g de pó do Caldo Selenito Cistina em 1 litro de água destilada ou
deionizada. Aquecer até ferver para dissolver completamente. NÃO AUTACLAVAR. O
superaquecimento destruirá as propriedades seletivas. Após resfriamento adicionar o
antibiótico novobiocina na proporção de 0,4% e em seguida distribuir em tubos ou
erlenmeyers.
Proceder conforme o item 13.2.3.
132
14.4 PROCEDIMENTO PARA ESGOTO
a) preparar o material necessário para a realização de cada amostra e dispor na bancada

em ordem:
- 6 erlenmeyers de 300 mL contendo 100 mL de selenito com novobiocina, sendo três
volumes de 100 mL e três para volumes de 10 mL de amostra;
- 6 tubos de 16 x 150 mm contendo 10 mL de selenito com novobiocina, sendo três para
volumes de 1 mL e três volumes de 0,1 mL da amostra
b) proceder à marcação dos erlenmeyers anotando o número da amostra, o volume
selecionado da amostra a ser inoculado, a data e as posições que cada um dos
erlenmeyers ocupar na série de três, com as letras A, B e C
c) para a série de 100 mL: homogeneizar a amostra, medir um volume de 100 mL e
proceder à filtração no porta-filtro de 47 mm e membrana de 0,45 um de porosidade
como segue:
- retirar a parte superior do porta-filtro e, com uma pinça flambada e esfriada, colocar na
base do suporte do filtro uma membrana estéril de 0,45 um de porosidade
- recolocar a parte superior do porta-filtro, tendo cuidado para não danificar a
membrana, ajustar e rosquear
- verter cuidadosamente no porta-filtro 100 mL da amostra, evitando que a água
respingue
- ligar a bomba de vácuo e proceder à filtração
- após a filtração da amostra, enxaguar o porta-filtro três vezes com porções de 20-30
mL de água de diluição estéril
- desligar a bomba de vácuo ao finalizar a operação; evitar secagem excessiva da
membrana filtrante
- retirar a parte superior do porta-filtro e, com o auxílio de uma pinça flambada e
esfriada, retirar a membrana e colocá-la no erlenmeyer contendo selenito com
novobiocina cortando em tirar pequenas
- recolocar a parte superior do porta-filtro e lavar com 20 a 30 mL de água de diluição
estéril e proceder à filtração de mais dois volumes de 100 mL, para completar a série de
três.
d) para a série de 10 mL: homogeneizar a amostra e trasnferir 10 mL para cada um dos
três erlenmeyers contendo selenito com novobiocina;
133
e) para a série de 1 mL: homogeneizar a amostra e transferir 1 mL para cada um dos três
tubos contendo selenito com novobiocina;
f) para a série de 0,1 mL: homogeneizar a amostra e transferir 1 mL para um frasco com
90 mL de água de diluição tamponada. Homogeneizar e transferir 1 mL da diluição para
cada um dos três tubos contendo selenito com novobiocina;
g) após a inoculação de todos os volumes da amostra incubar os erlenmeyers contendo
selenito com novobiocina a 42,5°C durante 24, 48 e 120 horas;
h) após 24 horas de incubação retirar as amostras da incubadora e aquelas que
apresentarem turvação coletar o material com mergulhando a alça de inoculação e
proceder a semeadura do inóculo em placas de Petri contendo o meio seletivo e
diferencial XLD ou BG, incubar em posição invertida durante 24 horas a 35 ± 0,5°C;
i) após a retirada dos inóculos para a semeadura em placas incubar os meios de
enriquecimento por mais 24 horas até completar 5 dias de incubação;
j) após o período determinado de incubação das placas efetuar a leitura separando
aquelas que apresentarem colônias típicas de Salmonella (colônias de coloração rosa no
meios de BG e colônias vermelhas com centro escuro ou vermelhas no meio de XLD);
k) do meio seletivo e diferencial selecionar de oito a dez colônias típicas de Salmonella e,
com o auxílio da alça de inoculação transferir as colônias típicas para o meio de Rugai e
lisina motilidade (IAL) previamente identificado. A inoculação é feita através de picada
em profundidade e de estrias em superfície. Após a transferência incubar os tubos de
IAL a 35 ± 0,5°C durante 24 horas.
Caso a análise seja realizada para água salina ou água doce favor consultar a referência
Norma CETESB L5.218 (1993).
14.5 LEITURA DAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE SALMONELLA SP. NO MEIO DE

IAL (CONFERIR TABELA 8):
a) fase inferior:
- motilidade positiva: crescimento difuso a partir da picada (exceções: S. gallinarum e S.
pullorum, que apresentam motilidade negativa e, portanto, não turvam o meio)
- lisina-descarboxilase positiva: cor violeta (exceções: S. paratyphi A e algumas culturas
de S. typhimurium que não descarboxilam a lisina)
b) fase superior:
134
- triptofano desaminase negativa: não se verifica coloração verde-acastanhada na

superfície inclinada
- sacarose negativa: coloração azul na superfície da fase superior
- glicose positiva: evidenciada pela coloração amarela na profundidade da fase superior
- sulfeto de hidrogênio (H2S) positivo: evidenciada pela coloração negra na profundidade
da fase superior (exceções: S. paratyphi A e S. choleraesuis não produzem sulfeto de
hidrogênio sendo que a S. typhi só produz H2S após 48 horas)
- urease negativa: não se verifica a coloração azul na profundidade da fase superior
- gás positivo: presença de bolhas na profundidade da fase superior, efeito não
observado para S. typhi, uma vez que esta bactéria não produz gás
c) tampão de algodão com reativo:
indol negativo: ausência de coloração vermelha ou rosa (algumas culturas de S.
typhimurium podem apresentar a produção de indol, constituindo no entanto raras
exceções).
Para a realização dos testes sorológicos o procedimento é o seguinte:

a) introduzir, em cada tudo de IAL com a cultura em teste uma pequena quantidade de
algodão hidrófilo, a seguir utilizando uma pipeta Pasteur, adicionar ao tubo cerca de
cinco gotas de solução fisiológica (0,85% NaCl);
b) com a ponta da pipeta Pasteur, passar delicadamente o algodão na superfície do meio
de cultura deslocando o crescimento bacteriano e obtendo uma suspensão densa da
cultura em solução fisiológica;
c) ainda com a pipeta Pasteur, colher um inóculo da suspensão da cultura e distribuir
uma gota em cada um de três quadrados de uma placa de vidro;
d) adicionar a uma das gotas de suspensão da cultura uma gota de soro anti-Salmonella
polivalente flagelar; à outra, uma gota do soro anti-Salmonella polivalente somático; à
última, uma gota de solução salina 2%;
e) em cada quadrado, efetuar a homogeneização dos soros e da solução salina a 2% com
a suspensão bacteriana, usando pequenos bastões de vidro e fazendo movimentos
circulares durante dois a três minutos. Utilizar um bastão para cada homogeneização;
f) proceder à leitura verificando a ocorrência ou não de aglutinação. Se a bactéria em
teste for Salmonella ocorrerá reação antígeno-anticorpo com os soros somáticos e/ou
flagelar, evidenciada pela aglutinação da cultura e nenhuma alteração na suspensão à
135
qual se adicionou a solução salina a 2% (controle negativo). Se a colônia for rugosa,

haverá aglutinação com os soros e com a solução salina 2%. Neste caso, a cultura deverá
ser enviada a um laboratório de referência para exame específico.
14.6 RESULTADOS
O resultado final é emitido com base nas provas bioquímicas e sorológicas. Se o exame
limitar-se à pesquisa de bactérias do gênero Salmonella utilizando-se apenas os soros
polivalentes, relatar o resultado como ausência ou presença de Salmonella sp.
Quando for empregada a técnica dos tubos múltiplos, a densidade de Salmonella deve
ser expressa como o NMP de Salmonella por 100 mL, obtido através de tabela específica,
em que são dados os limites de confiança de 95% para cada valor do NMP determinado.
A Tabela 7 apresenta o NMP para várias combinações de resultados positivos e
negativos quando são inoculadas três porções de 10 mL, três porções de 1 mL e três
porções de 0,1 mL da amostra. Entretanto, essa tabela também pode ser utilizada
quando volumes maiores ou menores da amostra são inoculados. Neste caso, procura-se
o código formado pelo número de erlenmeyers e tubos com resultado positivo para
Salmonella sp. obtido nas três séries consecutivas inoculadas, verificando-se o valor de
NMP correspondente a ele. O NMP/100 mL será dado através da seguinte fórmula:
10
𝑁𝑀𝑃𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑑𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑜 𝑐ó𝑑𝑖𝑔𝑜𝑥
𝑚𝑎𝑖𝑜𝑟 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
136
Figura 34 - Esquema de procedimento para água de esgoto
Tabela 7 - Índice de NMP e limites de confiança de 95% para várias combinações de

resultados positivos e negativos quando são utilizados três porções de 10 mL, três
porções de 1 mL e três porções de 0,1 mL
Número de tubos com reação positiva de Índice de 95% de confiança
3 de 10mL 3 de 1 mL 3 de 0,1 mL NMP/ 100 mL Mínimo Máximo
0 0 0 <3 - -
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13
1 0 0 4 <0,5 20
1 0 1 7 1 21
137
Cont. Tabela 7 - Índice de NMP e limites de confiança de 95% para várias combinações de
resultados positivos e negativos quando são utilizados três porções de 10 mL, três
porções de 1 mL e três porções de 0,1 mL
Número de tubos com reação positiva de Índice de 95% de confiança
3 de 10mL 3 de 1 mL 3 de 0,1 mL NMP/ 100 mL Mínimo Máximo
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 1 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 >2400 - -
Considerando-se o exemplo:
Volumes Série NMP
decimais Código correspondente Cálculo do NMP NMP/100 mL
A B C
inoculados ao código
1000 mL + + + 3
100 mL + - + 2 93 x 10 0,93
93
10 mL - - - 0 1000
138
Tabela 8 - Leitura do meio IAL

Desamin
Reações L-lisina Fermenta Fermenta ação do
Motilida Produçã Produção Hidrólise Produção
bioquímicas/ descarb ção da ção da L-
de o de gás de H2S da uréia de indol
gêneros oxilase glicose sacarose triptofan
o
Escherichia
v v v + v - - - +
coli
Shigella - - - (1) + - - - - v
Edwardsiella + + + + - + - - +
Salmonella (4) + (7) + (2) + (3) + - (4) + (5) - - - (7)
Citrobacter - + + + v + (6) - - - (6)
Enterobacter v + ++ + v - - - -
Klebsiella v - ++ + v - - - -
Proteus P v P P P v + + P
Providencia v v v + v - - + v
Vibrio * + + - + + - - - +
Aeromonas * - + v + v - - - v
Pleisomonas * + - - + - - - - +
Pseudomonas aeruginosa * Meio inalterado – induto bacteriano escuro
* São todas oxidade (+)

v = variável
P = prejudicado
- = negativos
+ = positivos
+ + = intensamente positivo
(1) Shigella flexneri, 6: gás positivo e indol negativo
(2) Salmonella gallinarum e S. pullorum: imóvel
(3) Salmonella typhi: gás negativo
(4) Salmonella paratyphi A: lisina negativa e H2S negativo
(5) Salmonella choleraesuis: H2S negativo
(6) Citrobacter intermedium: H2S negativo e indol positivo
(7) Salmonella typhimurium: algumas culturas podem apresentar indol negativo e/ou lisina negativa
CETESB. Norma técnica L5.218. Salmonella – isolamento e identificação: método de
ensaio. Novembro de 1993. 42 páginas.
139
15.0 ENUMERAÇÃO DE OVOS DE HELMINTOS
15.1 PRINCIPIO DO MÉTODO
As helmintoses mais freqüentes no mundo são a ascariose, a ancilostomose, a tricuríase

e a enterobiose. Essas helmintoses afetam o homem, tanto em países desenvolvidos
quanto em países em desenvolvimento, contudo, a maior prevalência da doença e maior
intensidade da infecção são usualmente encontradas em países em desenvolvimento. O
conhecimento das vias de infecção e do ciclo biológico dos agentes patogênicos também
contribuem para o entendimento da transmissão das doenças relacionadas com a
ausência de serviços de saneamento, passando a constituir um instrumento de
planejamento das intervenções, com vista à otimização de seu impacto sobre a saúde.
Para o processamento e preparação das amostras, bem como a enumeração de ovos de
helmintos será utilizado o método de Bailenger (1979), modificado por Ayres e Mara
(1996). Esse método é simples e de baixo custo, além de propiciar a recuperação de
ampla faixa de helmintos geralmente encontrados em águas residuárias.
As amostras a serem processadas passam pelas seguintes etapas: sedimentação,
centrifugação e flutuação. Após sucessivas centrifugações da amostra, com descarte do
sobrenadante, o sedimento foi tratado com solução tampão aceto-acética (pH 4,5) e éter
(ou acetato de etila) para a separação do material gorduroso. Posteriormente, com a
adição de uma solução de sulfato de zinco de alta densidade (ZnSO4 densidade 1,18), os
ovos flutuam. Os ovos que possuem densidade relativa menor que este valor são
separados do sedimento e, portanto flutuam. A contagem é realizada utilizando-se uma
câmara de McMaster com observação no microscópio em objetivas de 10X e 40X.
O tamanho, a densidade relativa e a velocidade de sedimentação de alguns ovos são
mostrados na tabela 9. Pode-se observar que, com exceção dos ovos de S. mansoni, os
demais são ligeiramente menores que os ovos de Ascaris suum e suas densidades
relativas são similares, exceto para os ovos de Taenia saginata que apresentam
densidade bem mais elevada (1,30).
140
Tabela 9 - Tamanho, densidade e velocidade de sedimentação de algumas espécies

de ovos de helmintos
Velocidade de
Espécies Tamanho (um) Densidade sedimentação
(m/h)
Ascaris suum 65 x 45 1,13 0,95
Ascaris lumbricoides 55 x 40 1,11 0,43
Schistossoma mansoni 50 x 150 1,18 5,23
Trichuris trichiura 22 x 50 1,15 0,48
Taenia saginata 40 x 35 1,30 0,83
Ancilostomídeos 60 x 40 1,055 0,26
Fonte: Zerbini & Chernicharo (2001)
15.2 PREPARO DE SOLUÇÕES
● Solução de sulfato de zinco: pesar 33 g de ZnSO4 e diluir em 100 mL de água

destilada;
● Solução tampão aceto-acética (pH 4,5): pesar 5 g de acetato de sódio cristalino,
misturar em 3,6 mL de ácido acético glacial e completar o volume com água
destilada até 1000 mL. Corrigir o pH da solução para 4,5 com os próprios reagentes;
● Solução detergente Triton X-100 ou Tween 80: pipetar 1 mL da solução e adicionar
em 1 L de água de torneira
De acordo com o método de Bailenger modificado, são adotados os seguintes

procedimentos para preparação das amostras e enumeração de ovos de helmintos
(Ayres e Mara, 1996):
a) Coletar uma amostra de esgoto de volume conhecido em litros – geralmente 1 litro
para esgoto bruto ou parcialmente tratado e 10 litros para esgoto tratado;
b) Deixar a amostra sedimentar em um béquer (esgoto bruto) ou em um balde (esgoto
tratado). Geralmente tem sido adotados tempos de sedimentação de cerca de 1 hora
para o esgoto bruto e de 2 horas para o esgoto tratado;
141
c) Remover aproximadamente 90% do sobrenadante usando uma bomba de sucção ou

um sifão, garantindo que fique no recipiente um volume de aproximadamente 100 mL
para o esgoto bruto e de 1 L para o esgoto tratado. Inclinar o recipiente, caso necessário,
tendo o cuidado para não ressuspender o sedimento;
d) Transferir cuidadosamente o sedimento para os tubos de centrífuga, enxaguando o
béquer e/ou balde com solução Triton (ou Tween). Para qualquer transferência do
sedimento de um recipiente para o outro, ou de um tubo para outro tubo, enxaguar com
solução Triton (ou Tween);
e) Pesar todos os tubos ajustando-os simetricamente na centrífuga e proceder a
centrifugação a 1000 g por 15 minutos;
f) Após a primeira centrifugação, descartar o sobrenadante, transferir todos os
sedimentos para um único tubo e centrifugar novamente a 1000 g por 15 minutos;
g) Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento contido no tubo utilizando um
volume equivalente de solução tampão aceto-acética (pH 4,5), ou seja, para um volume
de sedimento igual a 2 mL, adicionar 2 mL da solução tampão. Caso o volume do
sedimento seja inferior a 2 mL, adicionar solução tampão até completar um volume de 4
mL. Este volume mínimo de 4 mL visa facilitar o descarte do sobrenadante obtido
durante a etapa (i), sem provocar a ressuspensão do sedimento contendo os ovos;
h) Complementar o preenchimento do tudo com a adição de um volume de éter (ou
acetato de etila) correspondente a duas vezes o volume do sedimento e homogeneizar a
amostra com equipamento tipo Vortex. Ex.: se o volume do sedimento for 2 mL,
adicionar 4 mL de éter ou acetato de etila;
i) Centrifugar a 1000 g por 15 minutos. Após a centrifugação a amostra apresentará três
fases distintas: i) no fundo do tudo se concentrará todo o material não gorduroso e
fragmentos pesados, incluindo os ovos de helmintos, larvas e oocistos de protozoários; ii)
uma fase intermediária contendo a solução tampão, que deverá ser clara (transparente)
e iii) uma fase superior contendo a gordura e outros materiais, que juntamente com o
éter (ou acetato de etila) formam uma camada tampão espessa e de cor escura;
j) Descartar todo o sobrenadante com um único movimento firme e rápido, deixando no
tudo apenas o sedimento (anotar o volume do sedimento). Caso seja necessário,
desprender a camada tampão de cor escura com uma agulha fina, visando facilitar o
descarte do sobrenadante;
142
k) Adicionar um volume de solução de sulfato de zinco igual a 5 vezes o volume do

sedimento (ex.: se o volume do sedimento for igual a 1 mL, adicionar 5 mL da solução de
sulfato de zinco). Anotar o volume do produto final em mL, incluindo o sedimento e o
sulfato de zinco e homogenenizar a amostra com equipamento tipo vórtex;
l) Remover, rapidamente, uma alíquota da amostra final com o auxílio de uma pipeta de
Pasteur e transferir para a câmara de McMaster. Deixar a câmara de contagem em
repouso por 5 minutos para permitir que os ovos flutuem e atinjam a superfície do
retículo de contagem;
m) Examinar ao microscópio em objetivas de 10X ou 40X e contar todos os ovos que
estão dentro do retículo. Para uma melhor precisão na enumeração dos ovos dos
helmintos, deve-se fazer a leitura de mais de uma câmara, preferencialmente três e
calcular a média aritmética das contagens obtidas.
Notas:
(1) O método é muito eficiente quando utilizado para esgotos brutos, os quais
usualmente apresentam uma elevada concentração de ovos de helmintos. Para esgotos
tratados, no entanto, o número de ovos tende a ser muito baixo; nestes casos, o volume
da amostra deve ser aumentado pelo menos para 10 litros, objetivando uma melhor
recuperação dos ovos. Caso o número de ovos de helmintos no esgoto bruto também
seja baixo, deve-se aumentar o volume da amostra de 1 para 5 litros;
(2) Dependendo da altura do recipiente utilizado, o período de sedimentação dos ovos
deve ser aumentado. A lei de Stokes’ pode ser utilizada para se estimar as taxas de
sedimentação dos ovos de nematoda em águas residuárias, conforme a seguir: (taxas
usualmente adotadas, para uma temperatura de 200° C):
Ascaris lumbricoides: 20 mm/min
Trichuris trichiura: 16 mm/min
Ancilostomídeos: 6 mm/min
Para garantir uma maior recuperação dos ovos, é recomendado que o tempo de
sedimentação adotado seja pelo menos o dobro do tempo de sedimentação teórico
(calculado de acordo com a lei de Stokes'). A experiência dessa pesquisa indicou que
tempos de sedimentação ainda maiores favorecem uma maior recuperação dos ovos.
(3) a expressão que relaciona “g” com “rpm” é como a seguir:
143
, onde: “k” = 89.456 e “r” é o raio da centrífuga (distância entre o eixo da centrífuga e o
centro do recipiente), em cm ;
(4) se a quantidade de ovos de helmintos contidos dentro do retículo for zero, deve-se
contar os eventuais ovos de helmintos que poderão estar fora do retículo.
15.4 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
O número final de ovos da amostra de esgotos deve ser calculado por meio da equação:
onde:
N = número de ovos (ovos/litro);
A = número médio de ovos contados nas câmaras de McMaster (no. de ovos);
X = volume do produto final (mL);
P = volume da câmara de McMaster (para câmara de dois retículos P = 0,30 mL; para
câmara de um retícula P = 0,15 mL);
V = volume original da amostra.
15.4.1 Considerações preliminares para diferenciação dos ovos de helmintos
As águas residuárias podem conter uma variedade de ovos de helmintos provenientes

das fezes humanas. No entanto, as águas residuárias também podem apresentar, com
frequência, ovos de parasitos de animais como de porcos, ratos, cachorros e pássaros,
juntamente com os ovos de parasitos intestinais humanos. Nesse sentido, a correta
identificação dos ovos de helmintos deve ser realizada baseando-se principalmente nas
suas características morfológicas e de tamanho. Para tal, torna-se indispensável
proceder à medição exata dos ovos utilizando-se um microscópio calibrado, de forma a
se conseguir a correta identificação e diferenciação dos ovos de helmintos presentes na
amostra. Isso porque o tamanho dos ovos é um dos principais critérios que diferencia a
classificação das espécies de parasitos.
144
15.4.2 Critérios para diferenciação de ovos de helmintos
A identificação dos ovos de helmintos é baseada principalmente no tamanho e na

identificação de características morfológicas específicas dos ovos, tais como: forma;
conteúdo do ovo; espessura da membrana externa (casca) etc. São os seguintes os
principais critérios para identificação dos ovos (STOTT, 1998):
● tamanho: os ovos de helmintos variam em comprimento de pequenos (18 µm) a
grandes (150 µm ou maiores) e possuem diâmetros tão pequenos como 12 a 14 µm
(como é o caso de alguns ovos de trematódeos) a 90 µm ou mais (caso dos maiores
ovos de trematódeos);
● forma: os ovos de helmintos podem ser de forma esférica ou oval, embora alguns
poucos possam ser assimétricos;
● membrana externa: os ovos de helmintos usualmente apresentam parede externa
lisa, variando na espessura, dependendo da espécie;
● conteúdo interno: os ovos recentemente excretados apresentam estágios de
desenvolvimento que são característicos para cada espécie. Em sua maioria, os ovos
de nematóides não se apresentam embrionados quando liberados com as fezes;
● várias modificações da estrutura dos ovos também se constituem ferramentas
importantes de identificação, a exemplo de: protuberâncias, espinhos, rolhas polares
e opérculos.
Um resumo das principais características que auxiliam na diferenciação dos ovos de
helmintos é apresentado na Tabela 10.
Tabela 10 - Principais características de alguns ovos de helmintos

Ovo Tamanho Principais características
Forma: esférica ou oval
cor: castanho-amarelada
Ascaris lumbricoides
55 a 75 µm x 35 a 50 µm possui membrana mamilonada (alguns ovos podem
(fértil)
apresentar-se sem essa membrana – ovo descorticado)
casca espessa
Ascaris lumbricoides Forma: alongada
85 a 95 µm x 45 a 47 µm
(infértil) membrana mamilionada delgada
145
Cont. Tabela 10 - Principais características de alguns ovos de helmintos

Ovo Tamanho Principais características
Forma: aspecto típico de um pequeno barril
cor: castanho
Trichuris trichiura 50 a 55 µm x 22 a 24 µm
possui duas rolhas polares
possui duas membranas
Forma: ovóide ou elíptica
Ancylostoma duodenale:sem segmentação ou clivagem
em torno de 60 µm entre a casca e a célula-ovo há sempre um espaço claro
Ancilostomídeo
Necator americanus: em que diminui à medida que avança a segmentação
torno de 70 µm membrana fina e transparente envolvida por uma linha
preta
Membrana dupla, lisa e transparente
Enterobius
50 a 60 µm x 20 a 32 µm ligeiramente achatados de um lado
vermicularis
possui no seu interior uma larva já formada
Forma: aproximadamente esférica
apresentam dupla casca
Hymenolepsis não possuem filamentos dispostos no espaço que separa
70 a 80 µm de diâmetro
diminuta a casca interna da externa
oncosfera típica, com seus três pares de acúleos, estando
envolvida por duas membranas
Forma: ovóide ou arredondada
cor: transparente
Hymenolepis nana 30 a 47 µm de diâmetro oncosfera típica, com seus três pares de acúleos, estando
envolvida por duas membranas
possuem filamentos polares
Forma: esférica
possui uma casca protetora denominada embrióforo
Taenia sp. 30 µm de diâmetro dentro do embrióforo se encontra a oncosfera ou
embrião hexacanto com dupla membrana e três pares de
acúleos
146
Figura 35 – Ovos de Helmintos

147

BRUTAS
Técnica da concentração por centrifugação: Esta técnica é aplicada a águas residuárias

brutas que contenham sólidos suspensos ou turbidez, com possíveis ocorrências de
grandes quantidades de ovos de helmintos. A técnica também é aplicada a análises de
sedimentos.
Fundamento: A técnica consiste em centrifugações sucessivas da amostra com solução
salina isotônica, permitindo assim o clareamento do sobrenadante. Após o descarte do
sobrenadante, os ovos que se encontram no sedimento são recuperados por flutuação
com solução de sulfato de zinco a 33,1% e o sobrenadante é filtrado em membrana de 25
mm e 8 µm de porosidade. A contagem é realizada por observação microscópica da
lâmina contendo a membrana corada com o corante biológico.
15.5.1 Equipamentos, materiais e reagentes
• Centrífuga para operar a 1000 g ;

• Equipamento de filtração para membrana de 25 mm de diâmetro (Millipore ou
equivalente) ;
• Microscópio com objetivas de 10x, 40x e 100x, com bom poder de resolução ;
• Equipamento tipo Vortex ;
• Membranas de éster de celulose de 25 mm de diâmetro e porosidade de 8 µm
(Millipore ou equivalente) ;
• Frascos para centrífuga de 250 mL de capacidade ;
• Tubos para centrífuga de 50 mL de capacidade ;
• Garrafões de plástico com tampa de rosca e capacidade de 5 litros;
• Lâminas e lamínulas ;
• Solução salina isotônica (NaCl a 0,85% em água destilada) Solução aquosa de 0,1%
(p/v) de um dos seguintes corantes biológicos: Azul de Tripan, Safranina O, Eosina Y ;
• Solução aquosa de sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) a 33,1% (p/v) ;
• Glicerol .
148
15.5.2 Preparo de soluções
Os principais procedimentos para a preparação das soluções necessárias ao

desenvolvimento das análises de viabilidade em esgotos brutos:
• Solução salina isotônica (NaCl a 0,85%): pesar 0,85 g de NaCl e diluir em água destilada
até completar o volume de 100 mL de solução ;
• Solução aquosa de 0,1% (p/v) de Safranina O: pesar 0,1 g do corante Safranina e
dissolver em água destilada até completar o volume de 100 mL de solução ;
• Solução aquosa de sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) a 33,1% (p/v): pesar 33,1 g de
ZnSO4. 7H2O e dissolver em água destilada até completar o volume de 100 mL de
solução .
15.5.3 Coleta de amostras
● Coletar 5 litros da amostra no ponto em que se encontra mais homogênea

(representativa). Caso o líquido amostrado esteja parado ou com pouco movimento,
coletar também o sedimento e processá-lo pelo mesmo método.
● Tampar os recipientes e transportá-los ao laboratório, se possível preservados com
gelo. As amostras deverão ser analisadas preferencialmente logo após a coleta ou,
eventualmente, em um prazo máximo de 48 horas. Caso não seja possível a análise
neste período (48 horas), as amostras deverão ficar armazenadas sob refrigeração
por um período máximo de 15 dias.
Para amostras contendo grandes quantidades de detritos/sólidos grosseiros,

homogeneizar a mesma com um bastão de vidro e filtrar através de uma gaze. Lavar
perfeitamente os sólidos que ficarem aderidos à gaze e processar 1 litro da amostra de
acordo com os seguintes passos:
a) Distribuir a amostra em frascos de centrífuga e proceder a centrifugação a 1000 g
durante 5 minutos; descartar o sobrenadante, ressuspender os sedimentos em solução
salina isotônica e agitar com o equipamento tipo Vortex. Transferir o sedimento para um
ou dois tubos de centrífuga. Centrifugar novamente a 1000 g durante 5 minutos e
149
descartar o sobrenadante; repetir o procedimento até obter um sobrenadante claro

(geralmente são necessárias de duas a três centrifugações);
b) Após descartar o sobrenadante da última etapa de centrifugação, transferir todo o
sedimento restante para um tubo de centrífuga de 50 mL de capacidade. Utilizar solução
de sulfato de zinco para auxiliar na lavagem do tubo e transferência do sedimento;
c) Adicionar mais solução de sulfato de zinco até completar o volume de 25 mL e agitar
com Vortex. Completar novamente com sulfato de zinco até obter o volume final de 50
mL e agitar novamente com Vortex. Centrifugar a 1000 g durante três minutos;
d) Transferir o sobrenadante para o recipiente de filtração a vácuo e proceder a filtração
em membrana de 25 mm e porosidade de 8 µm;
Nota: Tendo em vista a eventual dificuldade de filtração, devido à porosidade, ao tamanho da membrana e
ao teor de sólidos presentes na amostra, pode-se tornar necessária a filtração de alíquotas menores,
utilizando-se várias membranas.
e) Ao término da filtração, adicionar 5 mL do corante selecionado e filtrar lentamente.
Retirar a membrana colocá-la sobre um papel filtro para perder o excesso de umidade
(no máximo por dois minutos);
f) Colocar uma gota de glicerol na lâmina e espalhar sobre uma área correspondente ao
tamanho da membrana (aprox. 25 mm de diâmetro). Colocar a membrana com cuidado,
sobre o glicerol, para que não apareçam bolhas de ar; adicionar outra gota de glicerol,
sobre a membrana, e espalhar com cuidado; colocar a lamínula e esperar até que a
membrana fique transparente, para permitir uma boa visualização dos ovos. Caso se
deseje acelerar este processo, deve-se colocar a lâmina na incubadora a 37ºC;
g) Observar ao microscópio usando objetivas de 10x e 40x de aumento. Se desejar um
maior aumento, observar com objetiva de 100x, aplicando uma gota de óleo de imersão.
Para cada lâmina, contar o número de ovos corados (ovos não-viáveis) e não corados
(ovos viáveis) e expressar o percentual de ovos viáveis, por litro de amostra.
150
Notas: a) O número de lâminas pode ser bastante variável, dependendo das

características de filtrabilidade do esgoto. b) Os resultados obtidos por meio da técnica
de coloração devem ser usados apenas para expressar a fração de ovos viáveis e não-
viáveis. c) Para a enumeração/quantificação de ovos de helmintos, deve-se utilizar o
método de BAILENGER, modificado por AYRES& MARA (1996), conforme descrito no
item 15.4. d) Para saber o número de ovos viáveis na amostra processada, deve-se
aplicar o percentual de ovos viáveis (obtido pela técnica da coloração) sobre o número
total de ovos da amostra (obtido pelo método de BAILENGER, modificado por AYRES &
MARA (1996).

TRATADAS
Técnica de concentração por filtração: Esta técnica foi desenvolvida e validada

originalmente para ser aplicada em águas naturais e de abastecimento, entretanto foi
comprovado que pode ser aplicada também para águas residuárias tratadas, que
contenham pouca turbidez e sólidos suspensos, e baixas concentrações de ovos de
helmintos.
Fundamento: A técnica é baseada na concentração da amostra por filtração a vácuo,
através de uma membrana de éster de celulose de 47 mm, com porosidade de 8 µm. Os
ovos aderidos à membrana são recuperados por flutuação com solução de sulfato de
zinco a 33,1%; a contagem é realizada por observação microscópica direta da membrana
tingida com o corante biológico.
151
15.6.1 Equipamentos, materiais e reagentes
• Equipamento de filtração para membrana de 47 mm de diâmetro;

• Equipamento de filtração para membrana de 25 mm de diâmetro;
• Sistema de vácuo (para operar até 40 cm Hg) ;
• Centrífuga para operar a 1000 g;
• Microscópio com objetivas de 10x, 40x e 100x, com um bom poder de resolução;
• Membranas de éster de celulose de 47 mm de diâmetro e 8 µm de porosidade
(Millipore ou equivalente) ;
• Membranas de éster de celulose de 25 mm de diâmetro e 8 µm de porosidade
(Millipore ou equivalente);
• Tubos para centrífuga de 50 mL de capacidade;
• Garrafões de plástico com tampa de rosca e capacidade de 5 e 10 litros;
• Lâminas e lamínulas;
• Solução salina isotônica (NaCl a 0,85% em água destilada) Solução aquosa a 0,1% (p/v)
de um dos seguintes corantes biológicos: Azul de Tripan, Safranina O, Eosina Y ;
• Solução aquosa de sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) a 33,1% (p/v);
• Glicerol.
15.6.2 Preparo de soluções
• Solução salina isotônica (NaCl a 0,85%): pesar 0,85 g de NaCl e diluir em água destilada
até completar o volume de 100 mL de solução;
• Solução aquosa de 0,1% (p/v) de Safranina O: pesar 0,1 g do corante Safranina e
dissolver em água destilada até completar o volume de 100 mL de solução;
• Solução aquosa de sulfato de zinco (ZnSO4. 7H2O) a 33,1% (p/v): pesar 33,1 g de
ZnSO4. 7H2O e dissolver em água destilada até completar o volume de 100 mL de
solução.
152
15.6.3 Coleta de amostras
Para fontes de abastecimento público, poços, mananciais e águas com baixos teores de
turbidez e sólidos suspensos, coletar uma amostra com volume de 10 litros. Para águas
residuárias tratadas, coletar uma amostra com volume de 5 litros.
Tampar os recipientes e transportá-los ao laboratório, se possível preservados com gelo.
As amostras deverão ser analisadas preferencialmente logo após a coleta ou,
eventualmente, em um prazo máximo de 48 horas. Caso não seja possível a análise neste
período (48 horas), as amostras deverão ficar armazenadas sob refrigeração por um
período máximo de 15 dias.
Para amostras contendo grandes quantidades de detritos/sólidos grosseiros, misturar a

mesma com um bastão de vidro e filtrar através de uma gaze. Lavar perfeitamente os
sólidos que ficarem aderidos à gaze e processar 1 litro da amostra de acordo com os
seguintes passos: Nota: Para os casos de amostras que contenham muitos sólidos, pode
se tornar necessário centrifugar as mesmas algumas vezes, com solução salina e com
descartes sucessivos do sobrenadante. Nesses casos, deve-se eliminar os procedimentos
(a) e (b) e iniciar pelo (c).
a) Homogeneizar a amostra e filtrar 1 litro em membrana de 47 mm de diâmetro e
porosidade de 8 µm, aplicando um vácuo máximo de 40 cm de Hg. Ao término da
filtração, lavar as paredes dos recipientes de filtração com solução salina isotônica e
filtrar essa água de lavagem na mesma membrana. b) Após a filtração, retirar a
membrana e colocá-la sobre a parede interna de um tubo de centrífuga e raspar com
uma espátula; lavar a membrana e a espátula com solução de sulfato de zinco. c)
Adicionar sulfato de zinco gradativamente (agitando perfeitamente em cada adição) até
completar o volume de 50 mL. Centrifugar a 1000 g durante três minutos. d) Transferir
o sobrenadante para o recipiente de filtração com uma membrana de 25 mm de
diâmetro e 8 µm de porosidade. Filtrar aplicando pouca pressão;
e) Ao término da filtração, adicionar 5 mL do corante selecionado e filtrar lentamente.
Retirar a membrana colocá-la sobre um papel filtro para perder o excesso de umidade
(no máximo por dois minutos). f) Espalhar uma gota de glicerol na lâmina; colocar a
153
membrana e adicionar outra gota de glicerol e cobrir com uma lamínula e esperar até
que a membrana fique transparente, permitindo assim uma melhor visualização dos
ovos (se desejar acelerar o processo deve-se colocar a lâmina na incubadora a 37ºC). g)
Observar no microscópio com objetiva de 10x e 40x.
Para cada lâmina, contar o número de ovos corados (ovos não-viáveis) e não corados
(ovos viáveis) e expressar o percentual de ovos viáveis, por litro de amostra.
Notas: a) O número de lâminas pode ser bastante variável, dependendo das

características de filtrabilidade do esgoto. b) Os resultados obtidos por meio da técnica
de coloração devem ser usados apenas para expressar a fração de ovos viáveis e não-
viáveis. c) Para a enumeração/quantificação de ovos de helmintos, deve-se utilizar o
método de BAILENGER ,modificado por AYRES & MARA (1996), conforme descrito no
item 15.4. d) Para se saber o número de ovos viáveis na amostra processada, deve-se
aplicar o percentual de ovos viáveis (obtido pela técnica da coloração) sobre o número
total de ovos da amostra (obtido pelo método de BAILENGER, modificado por AYRES &
MARA (1996).
Os ovos de helmintos também podem ser corados com outros tipos de corantes. Na
tabela abaixo estão os resultados da incorporação de quatro tipos de corantes em
Ascaris, Toxocara, Trichuris e Hymenolepsis (Tabela 11).
154
Tabela 11 - Incorporação e exclusão de corantes em diferentes espécies de ovos de

helmintos
Ascaris Toxocara Trichuris Hymenolepsis
Corante
Morto vivo Morto vivo Morto vivo Morto vivo
Sulfato nilo
+ - - + - - - -
azul
Cristal violeta + - + - + + + +
Safranina O + + + + + - + -
Vermelho
+ + + + + - + -
neutro
Ilustração fotográfica de ovos de helmintos pela técnica de coloração
Figura 36. a) Ovo viável de Trichuris trichiura corado com azul de Tripan; b) ovo não viável de
Trichuris trichiura corado com azul de Tripan
Figura 37. a) ovo viável de Ascaris lumbricoides corado com azul de Tripan; b) ovo não viável
de Ascaris lumbricoides corado com eosina Y
Ayres, R.; Mara, D. Analysis of Wastewater for Use in Agriculture: Laboratory Manual
of Parasitological and Bacteriological Techniques. Geneva: WHO, 1996, 31 p.
155
16.0 RESUMO DAS PRESERVAÇÕES DAS AMOSTRAS
Resultados mais confiáveis são obtidos em amostras frescas. Contudo, caso estas não
possam ser analisadas imediatamente ao retornar ao laboratório, deve-se observar as
recomendações de preservação e armazenamento estabelecidos para cada analito a fim
de se garantir a confiabilidade dos resultados.
16.1 REAGENTES E MATERIAIS
p)Solução de Tiossulfato de Sódio 10%
q)Solução de EDTA 15%
r) Ácido Sulfúrico P.A.
s) Pipeta graduada de 1mL
16.2 PROCEDIMENTO
16.2.1 Condições de preservação e armazenamento de amostras antes do ensaio
Preservar as amostras, quando necessária. Os recipientes para coleta de amostras antes

de serem utilizados devem ser preservados, conforme a tabela de preservação e
validade das amostras (ANEXO I - Tabela 13) contida neste documento.
Caso haja a necessidade de preservação após a coleta, levar o reagente a ser utilizado
para preservação em campo.
16.2.2 Armazenamento de amostras após o ensaio
Armazenar as amostras em geladeira nomeada (local e data), caso necessitem de

refrigeração, ou em prateleiras, quando estão preservadas quimicamente (conforme o
Anexo I - Tabela 13) até a validade do ensaio.
Amostra para ensaios microbiológicos: Armazenar por no máximo 10 dias após o inicio
do procedimento analítico.
156
Tabela 12: Aplicabilidade de preservantes na conservação de amostras

líquidas
Preservantes Ação
Ácidos sulfúrico e/ou Inibidor bacteriano

clorídrico/Nítrico Formação de sais com bases orgânicas
Tiossulfato de sódio Eliminação de cloro livre
EDTA Agente complexante
Inibidor bacteriano
Refrigeração
Redutor de volatilidade
DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA
WATER ENVIROMENTAL FEDERATION. Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater. 22 edição, Washington,
APHA/AWWA/WEF, 2012
AGÊNCIA NACIONAL DE ÁGUAS – ANA. Guia Nacional de coleta e preservação de
amostras: água, Sedimento, Comunidades Aquáticas e Efluentes Líquidos.
Brasília-DF 2011.
157
ANEXO I
Tabela 13 - Tabela de preservação e validade das amostras
Parâmetro Tipo do recipiente Volume mínimo Preservação Preservação Validade da Obs
de amostra (mL) química física amostra
Refrigeração
O ensaio pode ser realizado em amostra
Cloretos 16.3.1 Plástico ou Vidro 200 -- ≤6ºC 28 dias
refrigerada.
0,1 mL tiossulfato de Validade dos recipientes de vidro preparados

Vidro, boca larga, Refrigeração
Coliformes sódio 10% + 0,3 mL no laboratório: 60 dias
esterilizado ou 100 <8ºC 24 h
termotolerantes 16.3.1 EDTA 15% (somente Refrigeração entre 2 ºC e 8ºC e proteger da luz.
Plástico esterilizado
para Águas cloradas) Não congelar

Vidro, boca larga,
16.3.1 sódio 10% + 0,1 mL Refrigeração no laboratório: 60 dias
Coliformes totais esterilizado ou 100 24 h
EDTA 15% (somente <8ºC Refrigeração entre 2 ºC e 8ºC e proteger da luz.
Para o ensaio de condutividade, se a amostra for

Refrigeração estabilizada por resfriamento, ela deverá ser
Condutividade 16.3.1 Plástico ou Vidro 500 -- 28 dias
≤6ºC ambientada até 25 ºC para leitura, ou os
resultados devem ser corrigidos para 25 ºC.
Cor aparente/Real Refrigeração

16.3.1 Plástico ou Vidro 500 -- 48 h
≤6ºC
Cromo Refrigeração
Plástico ou Vidro 250 -- 28 dias
Hexavalente16.3.2 ≤6ºC
16.3.1 Refrigeração Realizar a análise de imediato mas se não for
DBO Plástico ou Vidro 1000 - 24 h
≤6ºC possível vê o prazo estabelecido.
158
Cont. Tabela 13 - Tabela de preservação e validade das amostras

Refrigeração Pode ser analisado sem preservação desde que

DQO 16.3.1 Plástico ou Vidro 20 pH < 2 H2SO4 7 dias
≤6ºC imediatamente.

Vidro, boca larga,
16.3.1 sódio 10% + 0,3 mL Refrigeração no laboratório: 60 dias
Escherichia coli esterilizado ou 100 24 h
EDTA 15% (somente <8ºC Refrigeração entre 2 ºC e 8ºC e proteger da luz.
Congele a amostra sem nenhuma adição a uma

Refrigeração
Fósforo Total 16.3.1 Plástico ou Vidro 100 pH < 2 H2SO4 28 dias temperatura inferior a 10 ºC
≤6ºC
Refrigeração 1mL de ácido clorídrico se for realizar a coleta

Metais16.3.2 Vidro 100 pH < 2 HNO3 6 meses
≤6ºC para Nitrito/Nitrato
Refrigeração
Nirito/Nitrato16.3.1 Plástico ou Vidro 200 pH < 2 H2SO4 2 dias
≤6ºC
Pode ser analisado sem preservação desde que

imediatamente ou pode ser preservado por até
Nitrogênio amoniacal Refrigeração
16.3.1 Plástico ou Vidro 500 pH < 2 H2SO4 7 dias 28 d, congelado a 20 º C não acidificando a
≤6ºC
amostra
Oxigênio dissolvido O método eletrométrico é executado em campo

16.3.2 vidro 300 -- -- --
e não necessita de preservantes.
Refrigeração Refrigeração entre 2 ºC e 8ºC e proteger da luz.

Ovos de helmintos Plástico ou vidro 1000 -- 24 h
≤6ºC Não congelar
159
Cont. Tabela 13 - Tabela de preservação e validade das amostras

Leitura de pH em campo tem que ser realizada

pH -- -- -- -- --
com um prazo máximo de 15 minutos.
Refrigeração 6 meses (Frasco

Salinidade 15.3.2 Vidro 240 -- Analise de imediato ou vede a amostra.
≤6ºC vedado)
0,1 mL tiossulfato de
Vidro, boca larga, Validade dos recipientes de vidro preparados
15.3.1 sódio 10% + 0,3 mL Refrigeração
Salmonella sp esterilizado ou 100 24 h no laboratório: 60 dias
EDTA 15%(somente <8ºC
Plástico esterilizado Não congelar
para Águas cloradas)
Sólidos dissolvidos Refrigeração Deixar as amostras à temperatura ambiente

15.3.1 Plástico ou Vidro 200 -- 7 dias
≤6ºC antes da análise
Sólidos em suspensão Refrigeração Deixar as amostras à temperatura ambiente

15.3.1 Plástico ou Vidro 200 -- 7 dias
Sólidos sedimentáveis Refrigeração 7 dias Deixar as amostras à temperatura ambiente

15.3.1 Plástico ou Vidro 1000 --
Sólidos suspensos Refrigeração Deixar as amostras à temperatura ambiente
Plástico ou Vidro 200 -- 7 dias
voláteis 15.3.1 ≤6ºC antes da análise
15.3.1 Refrigeração Deixar as amostras à temperatura ambiente
Sólidos totais Plástico ou Vidro 200 -- 7 dias
Deix as amostras à temperatura ambiente antes
Sólidos Totais fixos e Refrigeração da análise
Plástico ou Vidro 200 - 7 dias
voláteis 15.3.1 ≤6ºC
Plástico ou Vidro Refrigeração Analise no mesmo dia, ou armazene em frasco

Turbidez 15.3.1 100 - 24 h
âmbar ≤6ºC escuro até 24 h

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COORDENAÇÃO DE SANEAMENTO AMBIENTAL - CSA

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Determinação de Parâmetros Físico-Químicos e

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1.0 SEGURANÇA EM LABORATÓRIO

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1.1. BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO

As Boas Práticas de Laboratório (BPL) é um conjunto de ações com o objetivo de

separadamente das outras roupas do cotidiano);

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1.2 EPI – EQUIPAMENTO DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL E EPC – EQUIPAMENTO

Esse EPI deve ser utilizado no momento em que se

Óculos de proteção ou de segurança tem a função de

Um dos equipamentos mais importantes, pois protege

Máscaras e respiradores são equipamentos de proteção

Ele é utilizado quando ocorre um acidente em que o

Bota de segurança ou sapato fechado é o calçado que

os sinais de deterioração, pequenos orifícios, descoloração e ressecamento;

onde são manipulados produtos químicos.

✔ Permeação: velocidade com que uma substância permeia através da luva;

✔ Tempo de Resistência: tempo decorrido entre o contato inicial com o lado

externo da luva e a ocorrência do produto químico no seu interior.

Quadro 1 - Material da luva e indicações

Material Recomendado para: Material Recomendado para:

Solventes aromáticos, Oxidantes, ácidos,

Utilizado em todos os Formaldeído,

Ácidos,álcalis diluídos, Todos acima, mais

Ácidos,álcalis diluídos, Aromático, alifático,

Altas temperaturas. Soluções aquosas,

1.3 HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS

A higienização das mãos apresenta as seguintes finalidades:

✔ Remoção de sujidade, suor, oleosidade, pêlos, células descamativas e da

microbiota da pele, interrompendo a transmissão de infecções veiculadas ao

Figura 2 -Higienização das Mãos

2.0 MANUSEIO DE PRODUTOS QUÍMICOS

2.1 DIAGRAMA DE HOMMEL

Também conhecido como Diamante de Risco ou diamante do perigo mundialmente

Figura 3 - DIAGRAMA DE HOMMEL

Pictogramas são símbolos gráficos que identificam determinadas características das

Símbolo Exemplo de pictograma Alguns exemplos de pictogramas

Não refereciados na legislação de

2.3 SISTEMA SAF-T-DATA™

Risco a saúde Inflamabilidade Reatividade Contato

Figura 4 - SISTEMA SAF-T-DATA™

Inflamável com franja: indica o Reativo

2.4 DESCARTE DE MATERIAL

Materiais que estiveram em contacto com amostras potencialmente infectantes

2.4.1 Resíduos Que Podem Ser Descartados Diretamente Na Pia Ou No Lixo

Figura 5- Saco autoclavável

3.0CONCEITOS BÁSICOS DE MEDIÇÃO

O resultado de uma análise química é função direta do cuidado, da manipulação e da

Figura 6 – Ajuste do menisco

d) Pipetas volumétricas e graduadas: deve-se utilizar uma pera para sucção,

4.0 AS VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIO

4.1 TIPOS DE VIDRARIAS E SUAS FUNÇÕES

Geralmente a vidraria de laboratório apresenta graduações e marcas volumétricas em

Em alguns casos, a vidraria não apresenta marcação.

As vidrarias também podem apresentar cores e materiais diferenciados:

4.1.1 Vidraria e Equipamentos Básicos do Laboratório de Saneamento

Tubos de ensaio: um dos utensílios mais úteis em laboratório,

Estante para tubos de ensaio: suporte de tubos de ensaio;

Vidro de relógio: Peça de Vidro de forma côncava, é usada em

Espátula: usada para transferência de substâncias sólidas;