000753447

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
METODOLOGIA ANALÍTICA APLICADA AO CONTROLE DE

QUALIDADE DO ANTIFÚNGICO CLORIDRATO DE
BUTENAFINA NA FORMA DE CREME E À AVALIAÇÃO DA
SUA PENETRAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO
ALINE BERGESCH BARTH
Porto Alegre, 2010.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
METODOLOGIA ANALÍTICA APLICADA AO CONTROLE DE

QUALIDADE DO ANTIFÚNGICO CLORIDRATO DE
BUTENAFINA NA FORMA DE CREME E À AVALIAÇÃO DA
SUA PENETRAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO
Dissertação apresentada por ALINE

BERGESCH BARTH para obtenção do
GRAU DE MESTRE em Ciências
Farmacêuticas
Orientadora: Profa. Dr. Nadia Maria Volpato

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas em nível de Mestrado – Produção e Controle de Qualidade de
Produtos Farmacêuticos – da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul e aprovada em 21.05.2010, pela Banca Examinadora constituída
por:
Profa. Dr. Cássia Virginia Garcia

Universidade Federal do Pampa (Unipampa)
Prof. Dr. Helder Ferreira Teixeira

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
Prof. Dr. Martin Steppe

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
B284m Barth, Aline Bergesch

Metodologia analítica aplicada ao controle de qualidade do antifúngico
cloridrato de butenafina na forma de creme e à avaliação da sua
penetração cutânea in vitro / Aline Bergesch Barth – Porto Alegre :
UFRGS, 2010. – xx, 117 p. : il., tab.
Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa

de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Cloridrato de butenafina. 2. Antifúngicos. 3. Controle de qualidade

de medicamentos. 4. Cromatografia líquida de alta eficiência. 5.
Validação: métodos de análise de fármacos. 6. Estabilidade. 7.
Eletroforese capilar. 8. Penetração cutânea. I. Volpato, Nadia Maria. II.
Título.
CDU: 615.2.07
Bibliotecárias responsáveis:
Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira, CRB 10/480
Heloísa do Canto Canabarro, CRB 10/1036
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Ensino e Pesquisa em Controle de Qualidade
(LEPCQ) de Medicamentos da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul com bolsa de estudos financiada
pelo CNPq.
AGRADECIMENTOS
À Prof. Nadia Maria Volpato pela orientação e pela imensa dedicação oferecidas
durante o desenvolvimento deste trabalho.
À Prof. Elfrides E. S. Schapoval pelo exemplo de vida e profissionalismo, essenciais

para minha formação profissional.
Aos professores Tércio Oppe e Célia Chaves pela disponibilidade e auxílios

prestados, em especial ao Prof. Martin Steppe pela amizade e pelo incentivo.
Aos colegas do LEPCQ: Amanda, Bárbara, Cássia, Fernanda, Franciele, Gabriela,

Heloísa, Jamila, Jéferson, Marcelo, Mariana, Nathalie, Patrícia e Vanessa.
Aos funcionários do Laboratório de Controle de Qualidade Farmacêutico: Alianise,

Leila, Lorena, Rose e Viviane.
Ao Clésio Paim pela amizade, convívio e auxilio ao longo deste trabalho.
À amiga Rúbia Pereira pelo carinho e pelos momentos de descontração entre

estudos, aulas e experimentos.
Às colegas Alini e Letícia pela amizade e, principalmente, pelo incentivo.
Ao Vítor, Maximiliano e Diogo pela amizade e pela colaboração nos experimentos de

eletroforese capilar.
À amiga Bethânia Vargas pela colaboração nos experimentos de

permeação/penetração cutânea.
À Cooperativa dos Suinocultores do Caí Superior pela doação das orelhas para os
estudos de penetração/permeação cutânea.
Ao Programa de Pós-Graduação, à Faculdade de Farmácia da UFRGS e a todos os
professores e funcionários dessa instituição.
À família Andres pela carinhosa acolhida e em especial ao Natan pelo amor,

amizade, compreensão e paciência no decorrer desta caminhada.
Aos meus pais, Pedro e Lélia, e ao meu irmão Mateus, pela compreensão e
principalmente pelo apoio incondicional na busca de meus sonhos.
vi
RESUMO
Objetivos: os objetivos gerais deste trabalho foram desenvolver, validar e comparar
métodos indicativos de estabilidade para a análise do cloridrato de butenafina (BTF),
matéria-prima e forma farmacêutica, bem como determinar a cinética de degradação
do fármaco em condição de estresse. Adicionalmente, o trabalho visou à validação
de método para avaliar e comparar a penetração/permeação cutânea da BTF de
diferentes formulações. Métodos: Um método indicativo de estabilidade para análise
da BTF por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido e
validado, conforme normas do ICH. A cinética de degradação do fármaco (matéria-
prima e creme) frente à luz UVC foi determinada. Testes para o desenvolvimento de
método quantitativo por eletroforese capilar para a análise do fármaco isoladamente
e presente na formulação foram realizados. O método analítico cromatográfico
previamente desenvolvido para a formulação semi-sólida foi validado para a
quantificação de BTF na pele suína. Em seguida, as penetrações/permeações
cutâneas do fármaco utilizando células de Franz foram analisadas visando à
comparação de duas formulações comerciais (uma delas brasileira e a outra
americana). Resultados e Conclusões: O método de CLAE indicativo de
estabilidade desenvolvido demonstrou ser adequado para a determinação da
substância ativa na formulação mesmo na presença de produtos de degradação,
bem como para a quantificação do fármaco na pele suína e no fluído receptor. Os
principais fatores extrínsecos que promovem a degradação do fármaco foram
estabelecidos: luz, oxidação e meio básico (este último somente na presença de
excipientes). A determinação da cinética de fotodegradação como sendo de primeira
ordem demonstra que o processo é dependente da concentração do fármaco,
reforçando a necessidade de proteção frente à luz. Já o método por eletroforese
capilar mostrou-se não específico frente à formulação placebo simulado,
inviabilizando seu uso para o creme. Na avaliação da permeação cutânea das
formulações brasileira e americana não foi detectada presença considerável do
fármaco no fluído receptor para ambos os produtos. Já na verificação da penetração,
não houve diferença significativa na retenção do fármaco na epiderme, entretanto,
na derme a diferença foi estatisticamente significativa, com maior concentração
retida na análise da formulação americana (α = 0,05).
Unitermos: cloridrato de butenafina, cromatografia líquida de alta eficiência,
validação, estabilidade, eletroforese capilar, pele suína e célula de Franz.
ABSTRACT
Analytical Methodology Applied to the Quality Control of the Antifungal

Butenafine Hydrochloride in Cream Formulation and to the Analysis of its
Penetration In Vitro.
Objectives: The aim of the present work was to develop, validate and compare
stability indicating methods to quantify butenafine hydrochloride (BTF), raw material
and commercial cream, as well as to establish the degradation kinetics of the drug in
a stress condition. Also, the study had the goal of validating a method to assess and
compare the cutaneous permeation/penetration of two different formulations.
Methods: A stability-indicating method for the analysis of BTF by high performance
liquid chromatography (HPLC) was developed and validated according to the ICH
guidelines. The degradation kinetics of the drug (raw material and cream) under the
UVC light was determined. Analyzes to develop and validate an analytical method by
capillary electrophoresis, to quantify the drug by itself and in the cream, were
performed. The chromatographic method previously developed for the semi-solid
product was validated to quantify the drug in porcine skin. Then, the cutaneous
permeation/penetration of BTF, through the Franz-type cell, was analyzed to
compare two different commercial formulations (one of them is Brazilian and the
other is American). Results and Conclusions: The developed stability-indicating
method was adequate to determine the active substance in the formulation even in
the presence of the degradation products, as well as to quantify the drug in porcine
skin and in the receptor fluid. The main extrinsic factors that promote the drug
degradation were established: light, oxidative and basic media (the last in the
presence of the excipient ingredients). The photodegradation kinetics was
determined as first order showing that the process is dependent on the drug
concentration, reaffirming the necessity of protection against light. The method by
capillary electrophoresis was not specific considering the placebo formulation,
hindering its use to the cream. During the cutaneous permeation analysis, no drug
was found in the receptor media of both the Brazilian and the American formulations.
No difference was verified to the epidermis, although to the dermis there was a
statistical distinction as the concentration of retained drug from the American
formulation was higher (α = 0,05).
Keywords: butenafine hydrochloride, high performance liquid chromatography,
validation, stability, capillary electrophoresis, porcine skin and Franz cell.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA:
Figura 1. Via de síntese do ergosterol e pontos de atuação de agentes antifúngicos..

...................................................................................................................................13
Figura 2. Estrutura química do cloridrato de butenafina. ...........................................16
Figura 3. A pele com suas três camadas: epiderme, derme e hipoderme. ................22
Figura 4. Representação esquemática da pele mostrando as diferentes rotas de
penetração. ................................................................................................................24
Figura 5. Célula de difusão de Franz.. .......................................................................25
Capítulo I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de método

analítico por CLAE para análise do cloridrato de butenafina em forma farmacêutica
semi-sólida e estudo de estabilidade
Figura 1.1. Curva de aquecimento obtida por DSC para a BTF SQR........................39
Figura 1.2. Espectro no IV da BTF SQR em pastilhas de KBr ...................................40
Figura 1.3. Estrutura química da butenafina e de terbinafina. ...................................41
Figura 1.4. Cromatograma e valores de Rf obtidos por CCD na análise de BTF SQR,
BTF extraída do creme dermatológico e terbinafina ..................................................42
Artigo submetido: Stability-indicating LC assay for butenafine hydrochloride in creams

using an experimental design for robustness evaluation and photodegradation
kinetics study
Figure 1. Chemical structure of BTF. .........................................................................51

Figure 2. Representative chromatograms obtained for BTF reference standard for the
placebo after forced degradation studies with the BTF standard and with the
commercial cream .....................................................................................................62
Figure 3. Chromatogram from the BTF reference standard exposed to UV light for 2
h. and overlapping of the UV spectra from the indicated peaks. ................................63
Figure 4. Half-normal probability plot for the effects of Table 5 with identification of the
critical effects ME and SME. ......................................................................................66
Figure 5. First-order reaction plots of remaining BTF from the standard and from the
cream versus time, after photodegradation with UV-C light. .......................................... 68
Capítulo II. Estudos para o desenvolvimento de metodologia por eletroforese
capilar para a análise de cloridrato de butenafina presente na formulação semi-
sólida
Figura 2.1. Diagrama esquemático do sistema de EC...............................................76

Figura 2.2. Formação e sentido do fluxo eletrosmótico. ............................................76
Figura 2.3. Eletroferograma de BTF SQR. Condições eletroforéticas: tampão fosfato
50 mM, pH 5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo de injeção de
5 segundos. ...............................................................................................................80
Figura 2.4. Eletroferograma de BTF SQR. Condições eletroforéticas: tampão fosfato
50mM, pH 5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo de injeção de 5
segundos. ..................................................................................................................80
Figura 2.5. Eletroferograma de BTF SQR. Condições eletroforéticas: TRIS 50mM,
SDS 20 mM, pH 10,5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo de
injeção de 5 segundos. ..............................................................................................82
Figura 2.6. Eletroferograma de BTF SQR exposta à luz UVC por uma hora.
Condições eletroforéticas: TRIS 50mM, SDS 20 mM em pH 10,5, tensão de 25 Kv,
temperatura de análise 25 ºC e tempo de injeção de 5 segundos.............................83
Figura 2.7. Eletroferograma de: Rosiglitazona e BTF SQR. Condições eletroforéticas:
TRIS 50mM, SDS 20 mM em pH 10,5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25
ºC e tempo de injeção de 5 segundos. ......................................................................84
Figura 2.8. Eletroferograma de BTF obtida do creme, com alargamento de sua base
e eletroferograma do placebo simulado com sinal no mesmo tempo de migração do
fármaco......................................................................................................................84
Capítulo III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato de

butenafina em segmento de pele e estudo comparativo de retenção cutânea de
duas formulações presentes no mercado.
Artigo a ser submetido: A simple and rapid method to assess butenafine

hydrochloride in skin samples and a comparative cutaneous retention study of two
marketed formulations.
Figure 1. Chemical structure of BTF. .........................................................................94
xii
Figure 2. Chromatograms from: extraction solution from epidermis in contact with
formulation T and with excipients from formulations T and L ..................................104
Figure 3. Chromatograms from: extraction solution from dermis in contact with
formulation L and with excipients from formulations T and L ..................................104
Figure 4. Plots of the mean concentration of formulations L and T in the epidermis
with the respective standard deviations. ..................................................................106
Figure 5. Plots of the mean concentration of formulations L and T in the dermis with
the respective standard deviations. .........................................................................106
xiii
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DE LITERATURA:
Tabela 1. Ensaios necessários para a validação de método analítico. .....................20
Capítulo I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de método

analítico por CLAE para análise do cloridrato de butenafina em forma farmacêutica
semi-sólida e estudo de estabilidade
Tabela 1.1. Determinação da solubilidade da BTF SQR . .........................................38

Tabela 1.2. Atribuição das principais bandas do espectro da BTF na região do IV. ..40
Tabela 1.3. Determinação quantitativa da BTF SQR por titulação potenciométrica em
meio não aquoso. ......................................................................................................44
Artigo submetido: Stability-indicating LC assay for butenafine hydrochloride in creams

using an experimental design for robustness evaluation and photodegradation
kinetics study
Table 1. Factors and levels applied to the robustness test by LC method .................57
Table 2. BTF Precision study by LC method. ............................................................61
Table 3. BTF accuracy study by LC method. .............................................................61
Table 4. Plackett-Burman design factors and the obtained response to each
experiment. ................................................................................................................65
Table 5. Effects from the seven-factor Plackett-Burman design for two wavelengths
...................................................................................................................................66
Table 6. Determination coefficients from the photodegradation kinetics of BTF . ......68
Capítulo III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato de

duas formulações presentes no mercado.
Artigo a ser submetido: A simple and rapid method to assess butenafine

hydrochloride in skin samples and a comparative cutaneous retention study of two
marketed formulations.
Table 1. Precision and Accuracy from the analytical method: BTF extracted from
Epidermis and Dermis. ............................................................................................103
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 7
1. Micoses superficiais..............................................................................................9
2. Fármacos Antifúngicos .......................................................................................12
2.1. Cloridrato de Butenafina ..................................................................................16
3. Validação de métodos analíticos .......................................................................18
4. Estabilidade de fármacos e medicamentos ......................................................21
5. Quantificação de fármacos na pele - testes in vitro .........................................22
6. Referências ..........................................................................................................25
CAPÍTULO I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de

método analítico por CLAE para análise do cloridrato de butenafina em forma
farmacêutica semi-sólida e estudo de estabilidade ............................................ 33
1. Introdução ............................................................................................................35
2. Produtos Farmacêuticos e Material de Referência ...........................................36
Produtos Farmacêuticos..............................................................................36
Material de Referência ................................................................................37
2.1 Caracterização do cloridrato de butenafina - substância química de
referência (SQR): .....................................................................................................37
2.1.1 Análise Qualitativa ..........................................................................................37
Solubilidade .................................................................................................37
Calorimetria Exploratória Diferencial ...........................................................38
Espectrofotometria na Região do Infravermelho .........................................39
Cromatografia em Camada Delgada ...........................................................41
2.1.2 Análise Quantitativa .......................................................................................43
Titulação Potenciométrica em meio não-aquoso.........................................43
3. Conclusão ............................................................................................................44
4. Referências ..........................................................................................................45
Manuscrito submetido ao Journal of Chromatographic Science ........................47
Abstract ....................................................................................................................50
Introduction ..............................................................................................................51
Materials and Methods ............................................................................................52
Materials ......................................................................................................52
Chromatographic system.............................................................................53
Sample preparation for LC analysis ............................................................53
Validation procedure ...................................................................................54
BTF photodegradation kinetics ....................................................................58
Results and Discussion ..........................................................................................59
Selection and optimization of the chromatographic conditions ....................59
Validation of LC methods ............................................................................60
BTF Photodegradation kinetics ...................................................................67
Conclusion ...............................................................................................................68
References ...............................................................................................................70
CAPÍTULO II. Estudos para o desenvolvimento de metodologia por eletroforese

capilar para a análise de cloridrato de butenafina presente na formulação semi-
sólida ....................................................................................................................... 73
1. Introdução ............................................................................................................75
2. Metodologia..........................................................................................................78
2.1. Solventes e reagentes ......................................................................................78
2.2. Sistema de Eletroforese Capilar ......................................................................78
2.3. Desenvolvimento de Método Analítico ...........................................................78
Utilização de tampão fosfato .......................................................................79
Utilização de tampão citrato ........................................................................81
Utilização de tampão acetato ......................................................................81
Utilização de tampão TRIS com SDS ..........................................................81
Seleção do padrão interno ..........................................................................83
Utilização de tampões Borato e Tetraborato com SDS ...............................85
3. Conclusões ..........................................................................................................86
4. Referências ..........................................................................................................86
CAPÍTULO III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato de

duas formulações presentes no mercado. ........................................................... 89
Manuscrito a ser submetido ao Biomedical Chromatography ............................92

Abstract ....................................................................................................................93
Introduction ..............................................................................................................94
Materials and Methods ............................................................................................96
Materials ......................................................................................................96
Chromatographic system.............................................................................97
Calibration Standards ..................................................................................97
Skin Preparation ..........................................................................................98
Butenafine Hydrochloride Extraction Procedure ..........................................98
Method Validation ........................................................................................99
xviii
Application of the Method to in vitro Skin Penetration Studies ..................100
Results and Discussion ........................................................................................101
Butenafine Hydrochloride Extraction Procedure ........................................101
Method Validation ......................................................................................102
Method Application in a comparative cutaneous retention study ...............105
Conclusion .............................................................................................................107
References .............................................................................................................109
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES GERAIS .............................................................. 113
xix
INTRODUÇÃO
Introdução
Infecções fúngicas superficiais estão entre as doenças infecciosas mais

comuns. As dermatofitoses que geralmente causam somente infecções superficiais
da pele são classificadas em três gêneros: Microsporum, Trichophyton e
Epidermophyton. A ocorrência de dermatofitoses nos pés é certamente a mais
comum infecção fúngica, sendo que Trichophyton rubrum é o usual agente
causador. Tinea cruris é a segunda infecção mais comum, sendo causada por T.
rubrum, T. mentagrophytes ou Epidermophyton floccosum. Essas infecções tendem
a ser crônicas e geralmente ocorrem recidivas após o tratamento (ODOM, 1997).
O cloridrato de butenafina (BTF) é um fármaco derivado da benzilamina, com
estrutura e modo de ação similar às alilaminas. O fármaco possui ação fungicida,
inibindo a epoxidação do esqualeno, sem interferir em enzimas dependentes do
citocromo P450. A ação do fármaco é de amplo espectro, com altas taxas de cura
micológica e clínica (ODOM, 1997; SINGAL, 2008). De acordo com Singal (2008), a
BTF apresenta excelente penetração na epiderme e um tempo de retenção
prolongado na mesma, conferindo atividade terapêutica residual após o final do
tratamento.
Comercialmente, o fármaco é encontrado no mercado brasileiro desde 2007
na forma de creme a 1% (p/p), com o nome comercial de Tefin, marca da Mantecorp.
No mercado americano existem dois produtos disponíveis: Mentax® da Bertek
Pharmaceuticals e Lotrimin Ultra® da Schering-Plough, ambos na mesma
concentração da formulação brasileira.
Apesar de sua utilização, não existe descrição de um método analítico
indicativo de estabilidade para matéria-prima e forma farmacêutica, objetivando
quantificar o fármaco em presença de seus produtos de degradação e estudar
características relativas à estabilidade da substância ativa isolada e na presença de
componentes da formulação semi-sólida.
Para uma completa avaliação de formulações de liberação tópica é importante
conhecer o perfil de penetração do fármaco no tecido cutâneo, incluindo a
quantidade de substância ativa presente nas diferentes camadas da pele e o fluxo
através dela para a circulação sistêmica. Para formulações de uso tópico, é desejado
o acúmulo na pele com mínima permeação e para a ação sistêmica, o
comportamento oposto é desejado (TOUITOU et al, 1998). No caso das infecções
3
Introdução
por dermatófitos espera-se que o fármaco se concentre na camada mais externa, já

que a infecção é de caráter superficial (ODOM, 1997; SINGAL, 2008).
Entre os poucos estudos que quantificam o fármaco na pele, dois deles são
estudos em animais (ARIKA et al, 1990; ARIKA et al, 1993) e um em humanos
(TANUMA et al, 2001), e somente um quantifica o fármaco em diferentes camadas
da pele (ARIKA et al, 1993). Os estudos desenvolvidos não geraram modelos
aplicáveis na análise da liberação de fármacos em diferentes camadas para a rotina
de pesquisa e controle de qualidade de formulações, já que os modelos disponíveis
na literatura são complexos, caros, longos e necessitam do uso de
animais/humanos. Considerando o caráter superficial das infecções por dermatófitos
e o uso estritamente tópico da BTF, associado à carência de literatura quanto à sua
toxicidade sistêmica, é de alta relevância o desenvolvimento de um método para
análise da retenção e da permeação do fármaco. Atualmente, o uso de pele suína
para estas análises vem sendo amplamente difundido em virtude de sua similaridade
com a pele humana (TOUITOU et al, 1998; MOSER et al, 2001; SCHMOOK et al,
2001; SCCP, 2006, JACOBI et al, 2007; MEYER et al, 2007; BARBERO & FRASCH,
2009) e o modelo célula de difusão (Célula de Franz) tem sido considerado padrão
para os estudos de quantificação in vitro.
Considerando o exposto, os objetivos gerais desta dissertação foram:
 Desenvolver e validar métodos quantitativos para análise do cloridrato de

butenafina na forma farmacêutica semi-sólida;
 Avaliar a aplicabilidade da metodologia desenvolvida em estudos de

estabilidade do fármaco e estudar a cinética de degradação do cloridrato de
butenafina em condições forçadas ou de estresse;
 Desenvolver e validar método para avaliar a penetração e eventual

permeação cutânea do fármaco em pele suína in vitro, bem como aplicar a
metodologia para comparar duas formulações.
4
Introdução
Como objetivos específicos foram estipulados:
 Desenvolver e validar método por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) para análise quantitativa do cloridrato de butenafina na forma
farmacêutica semi-sólida;
 Desenvolver e validar método por eletroforese capilar (EC) para análise

quantitativa do cloridrato de butenafina matéria-prima e forma farmacêutica
semi-sólida;
 Avaliar a especificidade e sensibilidade da metodologia desenvolvida na

determinação do fármaco quando submetido a condições forçadas de
degradação, como meio fortemente ácido, fortemente básico, com agente
oxidante e sob luz ultravioleta;
 Identificar os principais fatores extrínsecos que promovem decomposição do

cloridrato de butenafina, de modo a fornecer subsídios científicos para o
desenvolvimento de produtos com garantia de eficácia e segurança;
 Avaliar a aplicabilidade de CLAE como metodologia analítica para

determinação do cloridrato de butenafina na epiderme e na derme suína,
visando à aplicação em estudos de penetração cutânea, bem como
desenvolver método de extração de fármaco dos tecidos cutâneos;
 Determinar e comparar a penetração cutânea do cloridrato de butenafina

presente em duas formulações diferentes, na epiderme e na derme, após a
aplicação do produto sobre a pele suína in vitro, bem como a eventual
permeação do fármaco através da mesma.
5
REVISÃO DE LITERATURA
Revisão de Literatura
1. Micoses superficiais
Micoses são infecções causadas por microfungos parasitas e ocupam lugar

de destaque na patologia tropical. Muitos fungos apresentam potencial patogênico
para os humanos. De acordo com os tecidos e órgãos afetados, as micoses são
classificadas em micoses superficiais - da pele, unhas e pêlos; micoses subcutâneas
e micoses sistêmicas ou profundas.
A pele seca na camada mais externa desencoraja a colonização por

microrganismos e a perda de células da epiderme mantém os mesmos afastados.
Entretanto, os mecanismos de defesa da pele podem falhar devido a uma série de
fatores, tais como trauma, irritação ou maceração. Além disso, a oclusão da pele
com materiais não porosos pode interferir em sua função de barreira pelo aumento
da temperatura local e pela hidratação. Com a inibição ou falha dos mecanismos de
proteção da pele, infecções cutâneas podem ocorrer (HAINER, 2003).
Micoses superficiais são doenças produzidas por fungos que se localizam

preferencialmente na epiderme e/ou seus anexos, podendo, em raríssimos casos,
invadir a derme e, até mesmo, órgãos internos. O contágio inter-humano (agentes
antropofílicos) é freqüente, mas pode ocorrer também a partir de animais (agentes
zoofílicos) e do solo (agentes geofílicos) (AZULAY & AZULAY, 1999; HAINER, 2003;
VERMOUT et al, 2008).
As infecções fúngicas superficiais podem ser divididas em dermatofitoses e

candidíase. Na candidíase superficial, a levedura infecta as mucosas da boca
(infecção conhecida popularmente como sapinho) ou da vagina ou da pele (RANG et
al, 2001). As dermatofitoses são micoses superficiais causadas por fungos que, em
regime parasitário, alimentam-se da queratina da pele, unhas e pêlos. Os
microrganismos secretam proteases chamadas queratinases que quebram a rede de
queratina em oligopeptídeos ou aminoácidos, facilmente assimiláveis. Existe relação
direta entre queratinases e patogenicidade. Pouca informação encontra-se
disponível sobre outras hidrolases como lipases e ceramidases, também secretadas
por estes fungos (VERMOUT et al, 2008). As infecções por dermatófitos induzem
uma resposta imune específica, com componentes humorais e celulares. Uma
resposta eficiente e protetora contra os dermatófitos é mediada por células de
9
Revisão da Literatura
hipersensibilidade tardia, caracterizadas pela ação de macrófagos como células

efetoras e por algumas citosinas chaves como interferon γ. Entretanto, o grau de
resposta imune desenvolvida, especialmente o nível de inflamação varia de acordo
com a espécie de dermatófito e de hospedeiro, bem como do estado patofisiológico
do hospedeiro (GUPTA et al, 1998; VERMOUT et al, 2008).
Agrupam-se sob essa denominação fungos do gênero Trichophyton,
Microsporum e Epidermophyton, cujas características morfológicas, fisiológicas e
antigênicas relacionam-se entre si. As dermatofitoses representam a infecção
fúngica mais comum no homem, mas, por requererem queratina, não atingem as
mucosas. Dermatofitoses são também designadas como infecções por “Tinea” e
nomeadas de acordo com o local do corpo atingido: Tinea capitis, Tinea corporis,
Tinea pedis,Ttinea unguium (GUPTA et al, 1998; AZULAY & AZULAY, 1999;
WEINSTEIN & BERMAN, 2002, HAINER, 2003; NEWTON & POPOVICH, 2004;
HAY, 2005).
A resposta inflamatória é caracterizada por um grau elevado de vermelhidão e
escamação na borda da região afetada ou por formação de bolhas. Uma região clara
central pode estar presente e diferencia as dermatofitoses de outras doenças
(HAINER, 2003). O risco de adquirir dermatofitoses durante a vida está estimado
entre 10 e 20 % (WEINSTEIN & BERMAN, 2002).
Tinea pedis, conhecida popularmente como pé de atleta, é uma das formas
mais comuns de dermatofitoses e pode manifestar-se de três formas: interdigital,
mocassim e vesicular (GUPTA, 2005; GUPTA & TU, 2006). A forma interdigital é a
mais comum, caracterizada por fissuras, escamação e maceração das áreas
interdigitais, particularmente entre o quarto e o quinto dedo. Trichophyton rubrum e
T. mentagrophytes são os microrganismos geralmente responsáveis pelas infecções.
Devido à perda da função barreira da pele pela ação dos dermatófitos a ocorrência
de infecções bacterianas secundárias é comum, podendo resultar em inflamação e
maceração na região (GUPTA, 2005). A infecção tipo mocassim é caracterizada por
coloração rósea subjacente à pele vermelha, afetando a sola, o calcanhar e os lados
dos pés, sendo causada principalmente pelo T. rubrum. É caracterizada por pele
seca, hiperqueratolítica, sendo de característica suave, porém esteticamente
desinteressante. Formas moderadas a grave apresentam pele rachada a inflamada,
com eritema e odor, podendo incluir infecções nas unhas (GUPTA, 2005). A forma
10
de Tinea pedis vesicular é a forma menos comum e ao mesmo tempo mais severa,
sendo caracterizada pela presença de bolhas ou vesículas inflamadas. T.
mentagrophytes é o microrganismo predominantemente causador da doença. A
forma mais branda da doença inclui a presença de vesículas com líquido claro de
tamanho pequeno e isoladas que podem se romper, ocorrendo cura espontânea.
Formas mais severas são caracterizadas por coalescência das vesículas em uma
grande bolha erosiva caracterizada por prurido, ulceração e por seu espalhamento
(GUPTA, 2005).
A Tinea corporis é caracterizada por infecções cutâneas do corpo, geralmente
envolvendo o tronco, ombros ou membros e, ocasionalmente, o rosto (excluindo a
área da barba em homens) e pode ser causada por qualquer dermatófito. A infecção
pode manifestar-se de forma suave a severa, caracterizando-se por lesão única ou
múltipla, anular e escamosa com o centro claro e borda elevada e avermelhada com
marginação fina (abrupta transição de pele anormal a normal). A borda das lesões
pode conter pústulas ou pápulas foliculares (WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995;
HAINER, 2003). Cada lesão pode ter um ou mais anéis concêntricos com pápulas
vermelhas ou placas centrais. Com a progressão da lesão, o centro se torna limpo
com uma hiperpigmentação ou hipopigmentação pós-inflamatória (WEINSTEIN &
BERMAN, 2002).
A Tinea cruris é uma infecção da região da virilha, perianal e perineal, bem
como ocasionalmente na parte superior das coxas, sendo mais comum em homens
do que mulheres. T. rubrum e T. floccosum são os agentes etiológicos mais comuns.
As lesões são eritematosas podendo desenvolver tom amarelo tostado a marrom
(WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995). A lesão é geralmente bilateral e assimétrica
na parte interna da coxa exibindo uma borda elevada e finamente marginada,
podendo ser vermelha e com textura escamosa, sendo frequentemente preenchida
com pequenas vesículas (WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995; HAINER, 2003).
Muitas pessoas infectadas com Tinea cruris também são infectadas por Tinea pedis
e tem sido postulado que a Tinea cruris é disseminada pela mão a partir da Tinea
pedis (WEINSTEIN & BERMAN, 2002; HAINER, 2003).
A manifestação clínica é a evidência mais importante para diagnóstico e
tratamento corretos (WEINSTEIN & BERMAN, 2002). Os métodos de diagnóstico
para infecções por dermatófitos incluem: exame microscópico direto (material colhido
11
é tratado com hidróxido de potássio, que atua como clarificante) que possibilita a
visualização de hifas; exame com lâmpada ultravioleta (lâmpada de Woods) que tem
uso limitado já que muitos dermatófitos não fluorescem; cultura de fungos e biopsia
de pele (HAINER, 2003).
2. Fármacos Antifúngicos
Antifúngicos de uso sistêmico são geralmente administrados para o

tratamento de onicomicosis, cândida superficial ou sistêmica e para a prevenção e
tratamento de infecções fúngicas invasivas. Anfotericina B, flucitosina, itraconazol e
cetoconazol têm sido os principais agentes antifúngicos por muitos anos, entretanto
sua toxicidade, a emergência de cepas resistentes e a baixa eficácia tem
restringindo seu uso. Nos últimos 20 anos alguns agentes antifúngicos vêm
demonstrando boa absorção e eficácia com significante potencial terapêutico.
Voriconazol, micafungina, caspofungina e formulações lipídicas de anfotericina B
estão sendo utilizadas no tratamento de infecções fúngicas sistêmicas (ZHANG et al,
2007).
As principais classes de antifúngicos tópicos incluem os polienos, azóis e as

alilaminas/benzilaminas. Outros agentes tópicos antifúngicos incluem o ciclopirox, a
hidroxipiridona, o tiocarbonato, a haloprogina e o sulfeto de selênio (GUPTA et al,
1998; ZHANG et al, 2007). Geralmente o agente antifúngico encontra-se disponível
na forma de creme, algumas vezes para o uso intravaginal. Muitos destes agentes
possuem amplo espectro de atividade contra dermatófitos, leveduras e Malassezia
furfur. Para o tratamento de Tinea corporis e Tinea cruris é necessária aplicação
uma a duas vezes por dia num período de duas a quatro semanas. Para o
tratamento de Tinea pedis a duração do tratamento varia entre 4 a 6 semanas
(GUPTA et al, 1998).
Os agentes antifúngicos da classe dos polienos possuem alta afinidade pelo

ergosterol da membrana fúngica, ligando-se irreversivelmente a ela e alterando sua
permeabilidade, tendo como conseqüência a criação de poro e o extravasamento de
12
componentes intracelulares, destruindo assim a célula fúngica. A nistatina e a

anfotericina B são os principais antimicrobianos da classe, porém são inefetivos
contra dermatófitos (GIMENO-CARPIO, 2006; ZHANG et al, 2007). Na Figura 1 pode
ser visualizada a rota de síntese do ergosterol da membrana fúngica e os principais
alvos para a ação de fármacos.
Figura 1. Via de síntese do ergosterol e pontos de atuação de agentes antifúngicos.

Adaptado de GIMENO-CARPIO, 2006.
Os antimicrobianos azóis são compostos de triazóis e imidazóis. São

fungistáticos e não fungicidas, exceto em concentrações muito altas. Esses agentes
inibem a síntese do ergosterol pela interação com a enzima 14-α lanosterol
desmetilase, uma enzima dependente do citocromo P450 (catalisa a reação), que
converte o lanosterol a 14 desmetil-lanosterol, interrompendo a síntese do
ergosterol, inibindo assim, o crescimento fúngico e a replicação. Fluconazol,
cetoconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol são utilizados para
13
tratamentos sistêmicos (ZHANG et al, 2007). O cetoconazol foi o primeiro azol a ser
administrado por via oral no tratamento das infecções fúngicas sistêmicas. O
fármaco possui alta afinidade pela queratina e é transportado ao estrato córneo
através do suor. Seu principal risco é hepatotoxicidade, que é rara, mas pode se
tornar fatal. Outras reações adversas estão relacionadas com distúrbios
gastrintestinais. O cetoconazol também está disponível para terapia tópica na forma
de creme 2% (RANG et al., 2001).
O ciclopirox é uma hidroxipiridona sintética derivada que possui propriedades

antifúngicas, antibacterianas e antinflamatórias e tem sido amplamente utilizado
como tratamento tópico de infecções superficiais fúngicas. Seu mecanismo de ação
relaciona-se com sua alta afinidade por Fe3+ e Al3+ . Pela formação de um grande
cátion polivalente através de quelação, o fármaco inibe enzimas essenciais,
incluindo citocromos e interferindo no transporte de elétrons mitocondrial e na
produção de energia. Em altas concentrações o ciclopirox também inibe a
recaptação celular de compostos essenciais e desequilibra a integridade da célula
fúngica. O fármaco também desequilibra o processo de respiração celular. Sua
propriedade antiinflamatória é majoritariamente devido à inibição da 5-lipoxigenase
e cicloxigenase e inibição de prostaglandinas e leucotrienos (ZHANG et al, 2007).
A griseofulvina é um dos agentes antifúngicos clássicos que tem sido usado

no tratamento de dermatofitoses nos últimos 40 anos. Seu mecanismo de ação é
incerto, porém estima-se que o fármaco iniba a mitose celular e a síntese de ácido
nucléico e que também tem interferência na função de eixo e nos microtúbulos
citoplasmáticos pela ligação às tubulinas alfa e beta (ZHANG et al, 2007). A
griseofulvina é administrada por via oral. Pode ser utilizada para o tratamento das
infecções da pele ou unhas, porém devido à sua baixa afinidade por queratina, o
tratamento precisa ser muito prolongado (RANG et al., 2001).
As alilaminas exibem um amplo espectro de atividade antifúngica contra

dermatófitos como Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, T. tonsurcanis e
Epidermophyton floccosum. A classe também tem ação fungistática contra Candida
spp. Os fármacos agem pela inibição da esqualeno epoxidase que é uma enzima
essencial na síntese do ergosterol. As alilaminas são seletivas, tendo pequeno efeito
no colesterol humano. Os principais fármacos representantes do grupo são a
14
naftifina e a terbinafina (ZHANG et al, 2007). A categoria apresenta ação fungicida

contra dermatófitos, sem registro de desencadeamento de resistência fúngica, e é
bem tolerada, sendo relatados efeitos adversos do tipo vermelhidão e sensação de
queimadura em 2 a 3% dos pacientes (ODOM, 1997). As benzilaminas são outra
classe de antifúngicos, estruturalmente similares às alilaminas (ZHANG et al, 2007).
O representante desta classe é o cloridrato de butenafina, cujas informações
detalhadas estão no item 2.1.
As equinocandinas são uma nova classe de antifúngicos para o tratamento
de infecções fúngicas invasivas. São efetivos contra várias espécies de Candida spp
e de Aspergillus spp. Sua ação ocorre através da inibição não competitiva da síntese
de 1,3-β-glicanos, um componente essencial na parede celular fúngica. Alguns
componentes deste grupo são a caspofungina e a micafungina (ZHANG et al, 2007).
Os agentes antifúngicos tópicos em geral se acumulam na pele, que em alguns
casos, bloqueia a transferência desses para a circulação sanguínea quase
completamente. Portanto, a aplicação tópica é considerada um excelente método de
administração de agentes antifúngicos, do ponto de vista de segurança, sendo que
sua eficácia terapêutica irá depender de sua concentração no sítio infectado. O
tratamento antifúngico tópico é geralmente preferível em relação à terapia sistêmica
devido à menor incidência de reações adversas (RANG et al., 2001).
Um agente tópico ideal para infecções fúngicas superficiais deve ter um amplo
espectro de atividade, ser eficaz em baixas concentrações, possibilitar esquemas de
dosagens convenientes, possuir mais atividade fungicida do que fungistática, ter alta
afinidade pelo estrato córneo, ser bem tolerado, não ser sensibilizante, apresentar
baixa incidência de recidivas, evitar o desenvolvimento de resistência fúngica e ter
baixo custo (ODOM, 1997).
Para a maioria das infecções por Tinea algumas medidas podem ser tomadas
para evitar reinfecção. A reinfecção por Tinea cruris pode ser reduzida pelo uso de
roupas íntimas largas de algodão. Redução de peso, limpeza e secagem da área
afetada e uso de pó absorvente podem ajudar na redução da probabilidade de
reinfecção. Nas infecções por Tinea pedis, os pés devem ser limpos regularmente e
completamente secos antes do uso de meias e sapatos. As unhas devem ser
mantidas curtas e limpas (GUPTA et al, 1998).
15
2.1. Cloridrato de Butenafina
O cloridrato de butenafina exibe atividade antifúngica de amplo espectro,

particularmente contra dermatófitos, aspergilus, fungos dimórficos e fungos
dematiáceos. O fármaco foi introduzido na terapêutica no Japão nos anos 90 para o
tratamento de Tinea pedis, Tinea cruris, Tinea corporis e Tinea vesicolor, bem como
para infecções cutâneas por cândida. Testes clínicos conduzidos no Japão, em mais
de 300 pacientes, demonstraram a alta eficácia associada à baixa incidência de
efeitos adversos. O fármaco foi aprovado para o uso no mercado americano em
1997. O uso de BTF tópica a 1% tem sido eficaz para Tinea pedis, Tinea corporis e
Tinea cruris em testes clínicos randomizados, quando administrada por curta
duração. Sua eficácia contra Pityriasis vesicolor, dermatite seborréica e como agente
anti-cândida ainda não foi completamente estabelecida (SINGAL, 2008).
O cloridrato de butenafina é quimicamente designado como N-4-terc-butilbenzil-
N-metil-1-naftalenemetilamina cloridrato. Sua estrutura química é semelhante à da
classe das alilaminas, porém um grupamento butilbenzil substitui o grupamento
alilamina. Essa modificação reduz a tensão superficial na molécula e contribui para
uma melhor atividade antimicótica em relação à naftifina e à terbinafina (SINGAL,
2008). O composto possui fórmula molecular C23H27N.HCl, com peso molecular de
353,93 g/mol e estrutura química apresentada na Figura 2. Apresenta-se sob forma
de pó cristalino branco e inodoro. É livremente solúvel em metanol, etanol e
clorofórmio e esparsamente solúvel em água (BUDAVARI, 1996; DRUG LABEL
SECTIONS, 2007). Na DCB atual possui registro como base sob n. 2241.01-3 (DCB,
2006).
HCl
Figura 2. Estrutura química do cloridrato de butenafina.
O cloridrato de butenafina é um derivado benzilamina e seu modo de ação é

semelhante ao dos demais fármacos antifúngicos pertencentes à classe das
alilaminas. A molécula atua inibindo a epoxidação do esqualeno, de modo a
bloquear a biosíntese do ergosterol, composto essencial para a membrana celular
16
fúngica, conforme Figura 1 (BRENNAN & LEYDEN, 1997). Constatou-se

posteriormente que o fármaco possui, além da ação antifúngica, atividade anti-
inflamatória in vivo, promovendo redução do eritema induzido por radiação UVB
(NAHM et al., 1999).
O cloridrato de butenafina foi introduzido no Brasil, no ano de 2007, pela
empresa Brainfarma associada à Mantecorp, na forma de creme dermatológico, sob
nome comercial de Tefin (BRASIL, 2006b, 2007). Anteriormente, a empresa Allergan
Prod. Farm. Ltda. possuía registro para o medicamento, mas o mesmo caducou sem
que o produto fosse lançado no mercado nacional (BRASIL, 2006a). No mercado
americano, o fármaco pode ser encontrado sob forma de creme dermatológico
(Mentax® da Bertek Pharmaceuticals e Lotrimin Ultra® da Schering-Plough),
contendo 1% do fármaco, sendo apenas para uso externo (NEWTON & POPOVICH,
2004).
No que se refere à análise qualitativa e quantitativa do cloridrato de butenafina,
não há praticamente literatura disponível em idioma ocidental. KOSHIKAWA e
colaboradores (1992) publicaram trabalho em japonês apresentando algumas
propriedades físico-químicas e estabilidade do cloridrato de butenafina. Do resumo,
apreende-se que o fármaco, no estado sólido, possui boa estabilidade frente ao
calor, umidade, luz ambiente, luz solar e UV, mas que a molécula em solução não é
estável sob luz UV. LING e colaboradores (2000) publicaram, em chinês, estudo
sobre determinação de butenafina na forma farmacêutica creme empregando CLAE
e WU e colaboradores (2006) desenvolveram formulação e determinaram, também
pelo método de CLAE, o conteúdo de cloridrato de butenafina em creme a 2%
contendo 20% de uréia. Este artigo também se encontra disponível somente em
chinês. Já TANUMA e colaboradores (2001) relatam, sucintamente, um método de
análise, também por CLAE, para determinação do fármaco no estrato córneo, após
aplicação tópica do medicamento.
No resumo do artigo de KOSHIKAWA e colaboradores (1992) há um breve
relato sobre duas substâncias relacionadas: 1-naftalenometanol e 1-(clorometil)-
naftaleno; bem como sobre um possível produto de degradação, N-metil-N-(1-
naftalenilmetil)-1-naftalenemetanamina, sob forma de cloridrato. Em 2006, LING e
colaboradores publicam, também em chinês, um artigo sobre a determinação do
fármaco e de substâncias relacionadas na forma farmacêutica creme por CLAE.
17
No artigo de ARIKA e colaboradores (1993) está descrita determinação da

presença de butenafina14C após aplicação de solução tópica, sob oclusão, em
diferentes camadas da pele de cobaio. Os resultados demonstraram que a
butenafina é acumulada em altas concentrações na epiderme (incluindo o estrato
córneo) e apresenta um prolongado tempo de retenção, conferindo atividade
terapêutica residual após o término do tratamento (SINGAL, 2008). Baixas
concentrações de radioatividade foram localizadas a nível de glândulas sebáceas e
de folículos capilares, sugerindo que a BTF penetra em menor quantidade na derme
através destas vias. De acordo com Lesher (1997), o fármaco apresenta baixa
absorção sistêmica após aplicação tópica.
Nenhuma farmacopéia internacional apresenta, até o momento, monografia
para o cloridrato de butenafina.
3. Validação de métodos analíticos
A necessidade de se demonstrar a qualidade de medições químicas, por meio

de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, é cada vez mais
reconhecida e exigida pelas agências reguladoras. Dados analíticos não-confiáveis
podem conduzir a decisões equivocadas, resultando em prejuízos financeiros para
as companhias e sanitários para a população. Para garantir que um novo método
analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, deve-se
submetê-lo a uma avaliação denominada validação (RIBANI et al., 2004).
A validação é um processo pelo qual se estabelece, por meio de estudos
experimentais, que um método é apropriado para as aplicações analíticas
pretendidas, assegurando a confiabilidade dos resultados (BRASIL, 2003).
Para o registro de novos produtos, as agências reguladoras do Brasil e de
outros países exigem a validação de métodos analíticos e, para isso, a maioria delas
tem estabelecido guias e resoluções com diretrizes a serem adotadas no processo.
No Brasil, o assunto é regulamentado por uma resolução (BRASIL, 2003) com poder
de lei. As guias, em contrapartida, são documentos que sugerem uma linha a ser
seguida, e são, portanto, abertos para interpretação (RIBANI et al., 2004).
É importante destacar que não há um modelo único para executar a validação
de métodos analíticos aplicados a fármacos e medicamentos. A grande variedade de
substâncias, formas farmacêuticas e técnicas tornam impossível estabelecer um
18
sistema de validação universal. As guias são recomendações e, portanto,

intencionalmente flexíveis para permitir aos analistas adaptá-las de acordo com a
situação. Por conseguinte, no desenvolvimento de um método, é importante um bom
planejamento onde sejam avaliados os requerimentos legais, a técnica escolhida e a
finalidade do método (RIBANI et al., 2004).
Diferentes grupos têm definido os parâmetros analíticos para validação. Na
tentativa de harmonizar as divergências encontradas entre as definições,
representantes das indústrias e agências reguladoras dos Estados Unidos, Europa e
Japão, por meio da ICH (International Conference on Harmonisation), definiram os
parâmetros e requerimentos para a validação de métodos analíticos para produtos
farmacêuticos (ICH, 1994, 1996, 2005). As diretrizes contidas nas guias publicadas
pela ICH são quase integralmente adotadas na Farmacopéia Americana (USP,
2008) e no texto da Resolução Específica no 899/2003 (BRASIL, 2003).
Os parâmetros analíticos, ou características de desempenho, tipicamente
avaliados durante o processo de validação são: especificidade, linearidade e faixa de
trabalho, exatidão, precisão, limite de detecção, limite de quantificação da substância
em análise e robustez (BRASIL, 2003).
Os procedimentos descritos em monografias farmacopeicas podem variar de
determinações analíticas de alta exatidão a avaliações subjetivas de características
físicas. Considerando esta variedade de ensaios, diferentes esquemas de validação
podem ser requeridos para diferentes métodos, sendo estes classificados em
categorias, de acordo com sua aplicação (BRASIL, 2003; USP, 2008):
 Categoria I: métodos analíticos para determinação da substância ativa em
matérias-primas ou medicamentos;
 Categoria II: métodos analíticos para determinação de impurezas e produtos
de degradação em matérias-primas ou medicamentos;
 Categoria III: métodos analíticos para determinação de características de
desempenho do medicamento (dissolução, por exemplo);
 Categoria IV: testes de identificação.
A avaliação de diferentes parâmetros é requerida para cada categoria,
conforme indicado na Tabela 1 (BRASIL, 2003; USP, 2008).
19
Tabela 1 Ensaios necessários para a validação de método analítico, segundo sua

finalidade (Fonte: BRASIL, 2003).
Parâmetro Categoria I Categoria II Categoria III Categoria IV
Quantitativo Ensaio
limite
Especificidade Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Precisão Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não
Intermediária ** ** Não ** Não
Limite de detecção Não Não Sim * Não
Limite de quantificação Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.
** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da precisão

intermediária.
A validação de métodos bioanalíticos é um processo utilizado para

estabelecer que o método quantitativo analítico seja adequado para a aplicação
biomédica em questão (CAUSSON, 1997). Para isso é necessária uma avaliação
consistente de parâmetros analíticos chave, tais como exatidão, precisão,
especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e estabilidade (CDER/FDA, 2001). A
determinação de analitos em matrizes biológicas é sujeita a tantas variáveis que o
método analítico não está realmente validado até que seja aplicado com sucesso em
pelo menos um estudo (CAUSSON, 1997).
20
4. Estabilidade de fármacos e medicamentos
Os estudos de estabilidade são justificados por razões sanitárias, econômicas

e legais. Quanto à razão sanitária, o fato de um fármaco ser inócuo não significa
necessariamente que seu produto de degradação também o será. Tendo em vista o
motivo legal, este exige que todos os medicamentos cumpram com as condições de
identidade, efetividade, potência, pureza e inocuidade durante o período em que se
encontram no mercado e até o momento de seu uso. Já os motivos econômicos são
embasados no fato de que um medicamento que não possui a dose indicada, pode
não gerar os efeitos desejados ou no caso das características organolépticas não
apropriadas, o próprio paciente evita o uso do produto (NUDELMAN, 1975).
A previsão da estabilidade de um produto farmacêutico é realizada através de

testes de longa duração e estabilidade acelerada, conforme regulamentado, no
Brasil, pela atual RE no 1 de 29 de julho de 2005 da ANVISA (BRASIL, 2005), a qual
é uma adaptação, para nossa zona climática, do guia elaborado pela ICH (ICH,
2003). Os estudos de estabilidade acelerada são destinados a aumentar a
velocidade de degradação química e modificação física de uma substância e/ou
alterações de características da forma farmacêutica, empregando condições de
estresse de armazenamento (luz, calor, umidade), com o propósito de monitorar o
decaimento do analito, as reações de degradação e prever o prazo de validade nas
condições normais de armazenamento, através das leis de cinética química
(REYNOLDS et al., 2002; KLICK et al., 2005). Entretanto, estes estudos não
dispensam a realização de estudo de estabilidade de longa duração.
No Brasil, a maioria das empresas farmacêuticas multinacionais e nacionais

importa o fármaco sintetizado em outros países e procede a sua inserção numa
forma farmacêutica, na grande maioria das vezes, sem o suficiente conhecimento
dos possíveis produtos de degradação. Além disso, o Brasil está inserido numa zona
climática denominada IV, quente e úmida, diferente da zona onde estão inseridos
Estados Unidos, Japão e Europa. Considerando-se que os ensaios de estabilidade
são pertinentes à temperatura do país, todos os ensaios devem ser realizados sob
os nossos aspectos climáticos, onde ocorre acentuada variação de temperatura e
umidade, entre as regiões durante todo o ano. Além dos fatores extrínsecos à
formulação, como umidade, incidência de luz e temperatura, é necessário também
21
avaliar a influência dos excipientes na estabilidade do produto, bem como conhecer

os produtos de degradação que eventualmente podem se formar durante o prazo de
utilização do medicamento.
O acompanhamento da estabilidade de fármacos e medicamentos requer o
emprego de métodos de análise específicos, que não sofram interferência dos
produtos de degradação, e que estejam validados para tal utilização.
5. Quantificação de fármacos na pele - testes in vitro
A pele cobre uma área de aproximadamente 2 m2 e atua como barreira

protetora contra ataques físicos, químicos, microbiológicos e de raios ultravioleta,
mantém a temperatura corporal, impede a perda de água, além de possuir funções
sensoriais (calor, frio, pressão, dor e tato) (HADGRAFT, 2001). A pele é composta
principalmente por duas partes: externamente a epiderme, seguida da derme,
conforme Figura 3. A derme contém capilares, glândulas sebáceas e sudoríparas,
folículos capilares e nervos. A epiderme possui estrutura multilamelar, que
representa os diferentes estágios de diferenciação celular. A partir da camada
proliferativa basal até a camada mais externa, as células sofrem mudanças, de
metabolicamente ativas e em divisão para células queratinizadas, funcionalmente
mortas e densas, sendo que estas últimas estão cercadas por bicamadas lipídicas
multilamelares e constituem a parte mais externa da pele chamada de estrato
córneo, principal responsável pela função barreira do órgão (MOSER et al, 2001).
Figura 3. A pele com suas três camadas: epiderme, derme e hipoderme. Fonte:
http://www.saudetotal.com.br/prevencao/topicos/images/pele3d.jpg
22
Medicamentos aplicados via tópica sobre a pele podem ser divididos em duas
categorias: de ação local e de ação sistêmica. A ação local pode ocorrer na pele ou
sobre a superfície da mesma (estrato córneo) e também na epiderme e/ou derme.
Formulações de ação local incluem cremes, géis, pomadas, pastas, suspensões,
loções, espumas, sprays, aerossóis e soluções. Já os produtos aplicados na pele
visando à ação sistêmica são, principalmente, os adesivos transdérmicos ou
sistemas de liberação transdérmica de fármacos (USP, 2009a; USP, 2009b). A
liberação de fármacos por via transdérmica possui uma série de vantagens para
alguns fármacos em relação a outras vias de administração: evita o efeito de
primeira passagem no intestino e a metabolização no fígado, possui menor risco de
efeitos colaterais com reduzido risco de toxicidade e é uma via de fácil administração
(DE PAULA, 2008).
Permeação cutânea é a passagem de uma substância pela pele, chegando
até suas camadas mais profundas, inclusive circulação sanguínea. Testes para
determinação da permeação cutânea de formulações transdérmicas são importantes
para determinação de sua eficácia. Já para produtos dermatológicos, a
determinação da quantidade de fármaco capaz de chegar à circulação não tem
influência direta no efeito terapêutico. No entanto, a extensão da possível absorção
sistêmica é um dado importante quanto à segurança e possíveis efeitos colaterais de
formulações tópicas (BEMVINDO, 2006).
Como os produtos dermatológicos tratam doenças nas diferentes camadas da
pele ou em apêndices cutâneos, sua eficácia depende da concentração do fármaco
nesses locais (PERSHING et al, 1994; ALBERTI et al, 2001a; ALBERTI et al, 2001b).
A presença do fármaco na pele depende da liberação do mesmo da formulação
(ALBERTI et al, 2001a), sendo fatores críticos o veículo utilizado e o modo de
preparo do mesmo. Após a liberação da formulação, a penetração através do estrato
córneo irá determinar a disponibilidade local do fármaco (BEMVINDO, 2006).
Existem deferentes rotas pelas quais os fármacos cruzam o estrato córneo:
intercelular, transcelular e por meio de apêndices (podendo ser através das
glândulas sudoríparas ou folículos pilosos). Em condições normais a penetração
pela rota dos apêndices não é muito significante, em parte, devido à baixa superfície
ocupada pelos mesmos. As duas demais rotas de permeação através do estrato
córneo são intercelular (passagem do fármaco entre as células pela matriz lipídica
23
intercelular) e transcelular (a passagem do fármaco ocorre também através das

células) (HADGRAFT, 2001; MOSER et al, 2001), sendo que a principal via de
penetração cutânea é a intercelular (HADGRAFT, 2001; MOSER et al, 2001;
HADGRAFT, 2004). Uma representação esquemática das vias de penetração
cutânea pode ser visualizada na Figura 4.
Figura 4. Representação esquemática da pele (estrato córneo) mostrando as

diferentes rotas de penetração. Adaptado de HADGRAFT, 2001.
Uma série de fatores biológicos pode alterar a permeabilidade da pele, como

o estado da pele (presença de alguma patologia), a idade da pele, o fluxo sangüíneo
e o metabolismo. Fatores físico-químicos também apresentam grande influência no
processo de passagem de uma substância através da pele. A hidratação do estrato
córneo é um dos mais importantes fatores para aumentar a velocidade de
penetração da maioria das substâncias. A hidratação pode resultar da água
difundindo das camadas epidérmicas adjacentes ou da transpiração que se acumula
após aplicação de um veículo oclusivo. Entre as características do fármaco que
afetam a taxa de penetração estão o coeficiente de partição, o coeficiente de
difusão, o tamanho e a forma molecular (AULTON, 2005).
Nesse contexto, o uso de experimentos de penetração cutânea in vitro se
tornou um dos estudos mais relevantes na área dermatológica (DE PAULA, 2008).
Idealmente, testes para avaliação da penetração e permeação de produtos de
aplicação tópica devem ser feitos in vivo. No entanto, isso é freqüentemente
impossível, principalmente nos primeiros estágios de desenvolvimento, quando a
toxicidade dos ativos e excipientes ainda não foi bem documentada. Experimentos in
vitro ou ex-vivo têm sido empregados, devido ao considerável número de exigências
associadas aos protocolos in vivo (BEMVINDO, 2006). Atualmente o modelo mais
aceito é o emprego da pele suína em substituição à pele humana, devido à maior
24
semelhança histológica quando comparado a outros modelos (TOUTOI et al., 1998;

MOSER et al., 2001; SCHMOOK et al., 2001). Os estudos sobre a penetração
cutânea de fármacos são extremamente importantes na otimização e
desenvolvimento de formas farmacêuticas de liberação, dérmicas e transdérmicas
(LEVEQUE et al., 2004) e também para comparar produtos genéricos com inovador.
A célula de difusão de Franz é o dispositivo padrão para a avaliação da permeação
através da pele, sendo constituída de um compartimento doador e um receptor,
separados por uma amostra de pele, conforme Figura 5 (OECD, 2004; DE PAULA et
al, 2008; USP, 2009a). A formulação é colocada sobre a pele, no compartimento
doador, e o compartimento receptor é preenchido com meio onde o fármaco tenha
condição sink garantida, sem degradar o tecido cutâneo. A homogeneidade deste
meio é garantida por agitação magnética e as amostras são retiradas em tempos
pré-determinados pela injeção de solução receptora (SR) no braço de reposição e
coleta de meio no braço de amostragem. A temperatura da célula é mantida pela
camisa dupla.
Figura 5. Célula de difusão de Franz. Adaptado de: HANSON RESEARCH, 2004;

BENVINDO, 2006.
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31
CAPÍTULO I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de
método analítico por CLAE para análise do cloridrato de butenafina em forma
farmacêutica semi-sólida e estudo de estabilidade
Capítulo 1: CLAE e estabilidade
1. Introdução
Na cromatografia líquida a separação física é conduzida com uma fase

líquida. Os componentes que constituem a amostra são separados pela sua
distribuição entre a fase móvel (fluído em movimento) e a fase estacionária
(partículas sólidas empacotadas em uma coluna) (SKOOG et al, 2004; DONG,
2006). São interações físicas e químicas dos componentes da amostra com as duas
fases que são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna
cromatográfica. A diferença na intensidade dessas forças determina a resolução e,
portanto, a separação dos solutos individuais.
Os principais mecanismos de separação utilizados na CLAE incluem:

cromatografia em fase normal (ou cromatografia de adsorção) que é baseada na
adsorção/dessorção do analito na fase estacionária polar; cromatografia em fase
reversa, cuja separação é baseada no coeficiente de partição entre uma fase móvel
polar e uma fase estacionária apolar; cromatografia por troca iônica que é baseada
na presença de grupamentos iônicos na fase estacionária, sendo que estes podem
ser trocadores de cátions ou de ânions e cromatografia por exclusão, cuja separação
é baseada no tamanho das moléculas dos componentes da amostra (DONG, 2006).
Entre as vantagens da CLAE estão: análise quantitativa rápida e precisa,

operação automatizada, sensibilidade de detecção, recuperação quantitativa da
amostra e a aplicabilidade da técnica a diversas amostras. Entre as limitações da
metodologia incluem-se ausência de detector universal, menor eficiência de
separação que a cromatografia gasosa capilar e necessidade de treinamento do
analista, já que a metodologia possui muitos parâmetros de análise (DONG, 2006).
Desde o primeiro método por CLAE descrito em uma farmacopéia

(Farmacopéia Americana) em 1980, a velocidade de propagação desta metodologia
não possui precedente na história das análises farmacêuticas (GÖRÖG, 2008). Este
é o principal método (juntamente com método de cromatografia em camada delgada)
para a análise de impurezas orgânicas relacionadas e para análise indicativa de
estabilidade aplicada a fármacos presentes em formulações, contribuindo para uma
maior segurança no uso de medicamentos (RAHMAN et al, 2006; GÖRÖG, 2008). O
uso amplo da metodologia em estudos de estabilidade é devido a sua sensibilidade,
35
especificidade e alta capacidade de resolução (BAKSI & SINGH, 2002). A CLAE é

uma técnica bem estabelecida como ferramenta efetiva no controle de processo e na
análise de matéria-prima e produto acabado (RAO & NAGARAJU, 2003).
Neste contexto, o objetivo do presente capítulo foi o desenvolvimento e a

validação de metodologia analítica indicativa de estabilidade por CLAE para a
quantificação de cloridrato de butenafina em formulação semi-sólida, bem como
aplicação da metodologia em um estudo de cinética de degradação do fármaco
frente à luz. Previamente a realização destes estudos, foram desenvolvidos métodos
qualitativos e quantitativos para a análise do cloridrato de butenafina utilizado como
substância química de referência, visando a sua caracterização e verificação da
adequação do mesmo para os estudos propostos.
2. Produtos Farmacêuticos e Material de Referência
Produtos Farmacêuticos
O creme dermatológico Tefin foi adquirido em estabelecimento local, já que

encontra-se disponível no Brasil desde 2007. Sua produção é realizada pela
empresa Mantecorp Ind. Quim. Farm. Ltda (Rio de Janeiro, Brasil). O medicamento é
composto de 1 % (p/p) de cloridrato de butenafina e dos seguintes excipientes:
álcool benzílico, álcool etílico, álcool cetílico, benzoato de sódio, cera
autoemulsionante, edetado dissódico, estearato peg-40, petrolato líquido,
polissorbato 60, propilenoglicol, simeticona, petrolato branco, hidróxido de sódio e
água. Para a parte inicial deste trabalho (desenvolvimento de método por CLAE,
estudo de estabilidade e eletroforese capilar) foi utilizado o lote: 705. Já para a parte
final deste trabalho (validação de método por CLAE para a quantificação de fármaco
na pele e estudo comparativo entre duas formulações) foi utilizado o lote 901.
Para o estudo comparativo de permeação cutânea entre duas formulações foi

utilizado o creme dermatológico Lotrimin Ultra® adquirido no mercado americano. O
medicamento é produzido pela Schering-Plough HealthCare Products Inc. (Estados
Unidos) e encontra-se disponível na composição de 1 % (p/p) de cloridrato de
butenafina e dos excipientes: álcool benzílico, álcool cetílico, dietanolamina,
glicerina, monoestearato de glicerila SE, polioxietileno (23) de éter cetílico,
36
propilenoglicol dicaprilato, água purificada, benzoato de sódio, ácido esteárico e

petrolato branco. O lote utilizado foi o 9MO2DA.
Material de Referência:
O cloridrato de butenafina, caracterizado macroscopicamente como um pó

cristalino branco e inodoro, foi doado pela empresa Mantecorp Ind. Quim. Farm. Ltda
(Rio de Janeiro, Brasil).
2.1 Caracterização do cloridrato de butenafina - substância química de

referência (SQR):
A pureza das substâncias utilizadas como referência é de extrema

importância para o desenvolvimento e validação de métodos analíticos. Assim
sendo, devem ser utilizados materiais de referência com pureza documentada e bem
caracterizados para o estudo de validação (ICH, 2005; MATHKAR et al, 2009). Neste
contexto, a parte inicial deste capítulo enfoca a análise qualitativa e quantitativa da
BTF SQR, sendo que a primeira inclui: caracterização da BTF SQR através da
determinação da solubilidade, análise por calorimetria exploratória diferencial (DSC),
da espectrofotometria na região do infravermelho (IV), bem como o desenvolvimento
de método por cromatografia em camada delgada (CCD) para identificação do
cloridrato de butenafina no produto dermatológico Tefin. A parte quantitativa inclui a
análise do teor da BTF SQR através de titulação potenciométrica.
2.1.1 Análise Qualitativa:
Solubilidade
A determinação da solubilidade da BTF SQR foi realizada para verificar quais

solventes poderiam ser utilizados como diluentes nos métodos a serem
desenvolvidos. Esta avaliação foi realizada conforme F. Bras. IV, 1988, porém
ao invés da pesagem de 1g de fármaco, foram utilizados 100 mg. Os solventes
utilizados para a verificação da solubilidade foram: etanol, metanol, água pH neutro,
37
acetonitrila, acetona, diclorometano, hexano, ácido acético, ácido clorídrico 0.1 M e

n-propanol, mantidos à temperatura ambiente. Os solventes orgânicos utilizados
foram de grau analítico. O solvente utilizado e a solubilidade observada podem ser
verificados na Tabela 1.1.
Tabela 1.1. Determinação da solubilidade da BTF SQR, conforme F. Bras. IV, 1988.
Solvente Solubilidade
Etanol Solúvel
Metanol Facilmente solúvel
Água pH neutro Muito pouco solúvel
Acetonitrila Pouco solúvel
Acetona Muito pouco solúvel
Diclorometano Ligeiramente solúvel
Hexano Muito pouco ou insolúvel
Ácido Acético Facilmente solúvel
Ácido cloródrico 0,1 M Muito pouco ou insolúvel
n-propanol Ligeiramente solúvel
Calorimetria Exploratória Diferencial
As análises foram realizadas em um calorímetro diferencial exploratório por

fluxo de calor, Shimatzu DSC-60, dotado de controlador de fluxo para gás de purga
(N2) FC-60-A, integrador TA-60WS e software de controle e análise TA-60 versão
2.0.
Foram pesados aproximadamente 2 mg de BTF em porta amostra de alumínio

com capacidade para 4 l, o qual foi selado e inserido no equipamento de DSC. A
análise foi efetuada sob atmosfera inerte de nitrogênio mantida sob fluxo de 50
ml/min e velocidade de aquecimento de 10°C/min até 220°C. Esta técnica compara e
avalia diferenças no fluxo de calor entre uma referência (porta-amostra selado vazio)
e a substância em análise enquanto ambas são submetidas ao programa de
temperatura controlada.
38
O termograma indicou a faixa de fusão compreendida entre 212,4°C e

221,3°C, com pico em 217,5°C, conforme Figura 1.1. A BTF SQR apresentou
transição endotérmica, ou seja, a amostra absorve calor (91,83 J/g) para fundir.
Figura 1.1. Curva de aquecimento obtida por DSC para a BTF SQR.
Espectrofotometria na Região do Infravermelho
O espectro na região do infravermelho da BTF SQR foi obtido através da preparação

de uma pastilha contendo 150 mg de KBr e 1,5 mg do fármaco previamente
dessecado a 105 ºC por duas horas. A análise foi realizada em espectrofotômetro
FTIR, marca Shimadzu, modelo 8001. O espectro no infravermelho da BTF pode ser
verificado na Figura 1.2. e na Tabela 1.2. estão descritas as atribuições para as
principais bandas referentes aos grupos funcionais característicos da molécula.
39
Figura 1.2. Espectro no IV da BTF SQR em pastilhas de KBr
Tabela 1.2. Atribuição das principais bandas do espectro da BTF na região do IV.
Freqüência (cm-1) Atribuição

800 Banda forte de anel dissubstituído 1,4
1363 e 1411 Bandas de deformação axial grupamento t-butila
1514 Banda referente à ligação C=C aromática
2536 Banda forte do sal da amina
2963 Deformação da ligação C-H alifática
Em torno de 3400 Banda larga referente à deformação N-H do sal
A interpretação do espectro de IV da BTF foi baseada na análise realizada por

Cardoso (2000) para o espectro de IV da terbinafina, tendo em vista a similaridade
de ambas as moléculas. A banda em 800 cm-1, característica de anel dissubstituído
1,4 foi analisada conforme Silverstein (1994), já que o grupamento não se encontra
presente na terbinafina, conforme pode ser visualizado na Figura 1.3.
40
A análise por espectrofotometria no infravermelho é um indicativo positivo de

que a amostra trata-se de cloridrato de butenafina.
Figura 1.3. Estrutura química da butenafina (esquerda) e de terbinafina (direita).
Cromatografia em Camada Delgada
Para o desenvolvimento de cromatografia em camada delgada foi utilizada a BTF

SQR, o creme dermatológico contendo o fármaco, bem como de terbinafina, análogo
estrutural da butenafina. A migração cromatográfica foi realizada em cromatoplacas
de gel-sílica 60 F254 (MERCK) com 10 cm de comprimento, 6 cm de largura e 0,25
mm de espessura da camada absorvente. Foi empregada lâmpada ultravioleta (UV)
a 254 nm como revelador.
As soluções de BTF SQR e de terbinafina foram preparadas em metanol na

concentração de 1 mg/mL. Já a solução amostra foi preparada de acordo com o
seguinte procedimento: pesagem de 1 g de creme (equivalente a 10 mg de BTF) em
balão volumétrico de 50 mL, ao qual foi adicionado 15 mL de n-butanol, seguido de 5
minutos em ultrassom. Após, foram acrescentados 15 mL de metanol e o balão foi
mantido por mais 5 minutos em ultrassom e o volume foi complado com metanol
(concentração final de BTF 200 μg/mL), seguido de filtração com papel filtro. Os
solventes orgânicos utilizados foram de grau analítico.
Os sistemas eluentes testados englobaram os seguintes componentes em

diferentes combinações e proporções: tolueno, acetato de etila, hexano, clorofórmio,
N-N-dimetilformamida, diclorometano, NaOH 0,1 M, metanol, acetona, trietilamina e
acetato de amônio. O sistema eluente selecionado foi constituído de: metanol:
acetato de etila: acetato de amônio (7:1,5:1). A aplicação das soluções contendo os
fármacos foi realizada nas placas com o auxílio de tubos capilares a uma distância
de 1,5 cm da borda inferior das mesmas, que foram posicionadas nas cubas
41
previamente saturadas com o sistema eluente. Após a migração da fase móvel, as

placas foram retiradas das cubas e mantidas à temperatura ambiente para a
secagem. A visualização das manchas foi realizada através da exposição da placa à
luz UV 254 nm.
É possível verificar a semelhança entre os fármacos analisados na Figura 1.3.,

sendo diferenciados pela presença de anel aromático ligado à t-butila (BTF) ou, na
mesma posição, uma ligação tripla, seguida de ligação dupla em ressonância (TER),
o que garante polaridades aproximadas.
O cromatograma da BTF SQR, solução amostra do creme dermatológico e da

terbinafina, bem como seus respectivos valores de fatores de retenção (Rf) podem
ser visualizados na Figura 1.4. O Rx obtido pela razão entre o Rf da BTF e o Rf da
terbinafina foi de 0,95. Apesar dos valores de Rf entre a BTF e a terbinafina obtidos
serem próximos, o resultado é satisfatório, tendo em vista a similaridade estrutural
entre as moléculas (Figura 1.3.) que garante uma polaridade semelhante, resultando
em perfis de migração aproximados. A identificação da BTF foi efetuada através da
comparação dos valores de Rf obtidos pela amostra da formulação semi-sólida e
pela substância referência, sendo igual a 0,74 para ambas.
Rf TER:0,78
Rf BTFSQR:0,74
Rf BTFcreme:0,74
Rx: 0,95
BTFCREME BTFSQR TER
Figura 1.4.Cromatograma e valores de Rf obtidos por CCD na análise de BTF SQR,

BTF extraída do creme dermatológico e terbinafina, com revelação por luz UV 254
nm.
42
2.1.2 Análise Quantitativa
Titulação Potenciométrica em meio não-aquoso
A titulação foi realizada conforme preconizado pela F. Bras. IV, 1988 que descreve
as condições para a volumetria de bases fracas em meio não-aquoso. Inicialmente
foi procedida a padronização do ácido perclórico 0,05 M em ácido acético. Para
tanto, 8,5 mL de ácido perclórico foram dissolvidos sob agitação em 250 mL de ácido
acético glacial. Foram acrescentados 20 mL de anidrido acético, seguido de diluição
com acido acético glacial a 1 litro e repouso por 24 horas. Foram pesados
exatamente, cerca de 180 mg de biftalato de potássio, previamente dessecado a 120
ºC por 2 horas, e dissolvidos em 50 mL de ácido acético glacial em frascos
erlenmeyer de 250 mL de capacidade e foi realizada a titulação com a solução de
ácido perclórico (n=3). Paralelamente foi realizada a titulação do branco. Para
verificar a variação do potencial em milivolt (mV) e determinação do ponto final foi
utilizado aparelho medidor de pH Digimed DM-20 equipado com eletrodo de
membrana de vidro.
Foram pesados, exatamente, cerca de 120 mg de BTF SQR, dissolvidos em

ácido acético glacial e foi realizada a titulação potenciométrica com solução acética
de ácido perclórico 0,05 M (n=6), utilizando os mesmos equipamentos descritos para
a padronização do ácido perclórico. Acetato de mercúrio II 6% foi adicionado para
neutralizar a interferência do íon cloreto, devido à forma cloridrato do fármaco. Foi
realizada correção do volume do titulante em relação à diferença de temperatura no
dia de sua padronização e no dia da análise do fármaco. Paralelamente foi realizada
a titulação do branco. Os resultados obtidos através de titulação potenciométrica da
BTF SQR por meio não-aquoso podem ser verificados na Tabela 1.3. Durante os
trabalhos seguintes descritos nesta dissertação, foi realizada correção em relação à
pureza do padrão para as determinações quantitativas.
43
Tabela 1.3. Determinação quantitativa da BTF SQR por titulação potenciométrica em

meio não aquoso.
Amostra Teor (%) Média (%) DPR

1 99,29
2 99,55
3 100,50
99,64 0,61
4 99,15
5 99,07
6 100,29
A titulação em meio não-aquoso com detecção potenciométrica demonstrou

ser uma técnica rápida e precisa (DPR=0,61) para a quantificação de BTF SQR.
3. Conclusão
A determinação da solubilidade da BTF SQR permitiu verificar a adequação

dos solventes para os estudos envolvendo o fármaco.
A análise por DSC indicou a faixa de fusão compreendida entre 212,4°C e

221,3°C, com pico em 217,5°C, com perfil afilado, sendo este fator indicativo de
pureza do cloridrato de butenafina SQR.
A análise das bandas por espectrofotometria no infravermelho foi um

indicativo de que a amostra trata-se de cloridrato de butenafina, já que as bandas
referentes aos grupos funcionais do fármaco foram detectadas.
O método de CCD proposto para a detecção do fármaco foi considerado

adequado uma vez que os perfis de migração do padrão e da amostra foram iguais e
a diferenciação da terbinafina, semelhante estruturalmente, foi possível. A
metodologia desenvolvida possui as vantagens de ser extremamente fácil, rápida e
de custo reduzido.
Quanto à análise quantitativa, a volumetria em meio não-aquoso demonstrou

a alta pureza da BTF SQR e representa um método rápido e preciso para a
quantificação do fármaco, não necessitando de padrão para a análise.
44
O conjunto de análises realizadas demonstrou a adequação da BTF SQR

para o os estudos descritos neste trabalho e revelam o ponto de fusão do fármaco
que não está indicado na literatura, bem como o espectro no IV característico do
mesmo.
4. Referências
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– critical review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.28, p.1011-
1040, 2002.
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RAHMAN, N.; AZMI, S.N.H.; WU, H.-F. The importance of impurity analysis in
pharmaceutical products: an integrated approach. Accreditation and Quality
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HPLC methods for determination of impurities in drugs. Journal of Pharmaceutical
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espectrométrica de compostos orgânicos. 5ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
1994.
46
Manuscrito submetido ao Journal of Chromatographic Science
47
48
Stability-indicating LC assay for butenafine hydrochloride in creams using an experimental
design for robustness evaluation and photodegradation kinetics study
Aline Bergesch Barth*, Gabriela Bolfe de Oliveira, Marcelo Donadel Malesuik, Clésio
Soldatelli Paim, Nadia Maria Volpato.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Ipiranga 2752, Porto Alegre-RS,
Brazil.
* Corresponding author: Tel: +55 51 33085214; Fax: +55 51 33085378
E-mail address: alinebbarth@hotmail.com (Aline Bergesch Barth)
49
Abstract
A stability-indicating LC method for the determination of the antifungal agent butenafine
hydrochloride (BTF) in a cream was developed and validated using the Plackett-Burman
experimental design for robustness evaluation. Also, the drug photodegradation kinetics was
determined. The analytical column was operated with acetonitrile, methanol and a solution of
triethylamine 0.3% adjusted to pH 4.0 (6:3:1) at a flow rate of 1 mL/min and detection at 283
nm. BTF extraction from the cream was done with n-butyl alcohol and methanol in ultrasonic
bath. The performed degradation conditions were: acid and basic media with HCl 1M and
NaOH 1M, respectively, oxidation with H2O2 10% and the exposure to UV-C light. No
interference in the BTF elution was verified. Linearity was assessed (r2 = 0.9999) and
ANOVA showed non-significative linearity deviation (p > 0.05). Adequate results were
obtained for repeatability, intra-day precision and accuracy. Critical factors were selected to
examine the method robustness with the two-level Plackett-Burman experimental design and
no significant factors were detected (p > 0.05). The BTF photodegradation kinetics was
determined for the standard and for the cream, both in methanolic solution, under UV light at
254 nm. The degradation process can be described by first-order kinetics in both cases.
Keywords: Experimental design, method validation, stability-indicating method,
butenafine hydrochloride, photodegradation kinetics.
50
Introduction
Butenafine hydrochloride (BTF) is a benzylamine derivative antifungal agent. It has a
structure that resembles the allylamines; however, a butylbenzyl group replaces the allylamine
group (Figure 1) (1). This antifungal agent has activity against dermatophytes such as
Thrichophyton mentagrophytes, Microsporum canis and Thrichophyton rubrum which cause
tinea infections (2, 3). The drug inhibits the fungal enzyme squalene epoxidase, blocking the
biosynthesis of ergosterol, which is an essential component of fungal cell membranes (1-3).
Also, the benzylamine antifungal agent demonstrates inherent anti-inflammatory properties in
vivo, as demonstrated by reduced cutaneous erythema response after UVB irradiation (4).
BTF was introduced in the Brazilian market in 2007.
Figure 1. Chemical structure of BTF.
There is no study describing suitable analytical conditions of a method that is stability
indicative for both BTF raw material and commercial cream, objectifying to quantify the drug
in presence of its degradation products (DP) and to elucidate inherit stability characteristics of
the standard and the active substance in the semisolid formulation. Due to these reasons, a LC
method was developed and validated by specificity, enclosing placebo and stress conditions as
acid, basic, oxidation and UV light, linearity, accuracy, repeatability, intermediate precision,
robustness, limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD).
51
A two-level experimental design approach was applied for the robustness test in order
to examine potential sources of variability by screening a large number of factors in relatively
small number of experiments (5, 6). Therefore, the reliability of the analysis with respect to
deliberate variations in method parameters can be evaluated, as recommended by ICH
Guideline (7).
According to ICH (8), stress testing of the drug substance can help identify the likely
degradation products, which can cooperate to establish the degradation pathways and the
intrinsic stability of the molecule. In agreement with this guide, the light testing should be an
integral part of the stress testing. Consequently, a study of the BTF photodegradation kinetics
was performed in order to provide evidence on how the quality of the drug varies with the
time under the influence of light. To realize this study, the developed stability-indicating
method was applied.
The objective of the present study was to develop and validate a stability-indicating
LC method in compliance with the ICH Guideline (7) and the USP (9) for the determination
of BTF in creams using the Plackett-Burman experimental design for robustness evaluation as
well as to determine the photodegradation kinetics of the drug in methanolic solution.
Materials and Methods
Materials
The reference standard was kindly supplied by Brainfarma (Rio de Janeiro, Brazil) and
the commercial cream Tefin® was obtained in the local market. Creams are claimed to contain
1% (w/w) of BTF and the following inactive ingredients: benzyl alcohol, ethyl alcohol, cetyl
alcohol, sodium benzoate, emulsifying wax, edetate disodium, polyethylene glycol 40
52
stearate, liquid petrolatum, polysorbate 60, propylene glycol, simethicone, white petrolatum,
sodium hydroxide and water. All reagents were analytical or HPLC grade. Acetonitrile and
methanol were purchased from Tedia (Fairfield, USA), the phosphoric acid from Merck
(Darmstadt, Germany) and the n-butyl alcohol from Synth (Diadema, Brazil). Purified water
was obtained by a Millipore® Direct-Q 3UV with pump (Molsheim, France).
Chromatographic system
The HPLC system (Agilent 1200 series, Santa Clara, USA) consisted of a G1311A
quaternary pump, G1322A vacuum degasser, G1316A thermostat column compartment,
G1329A standard auto sampler and G1315B diode array detector set at 283nm. The analytical
column, a Shim-pack CLC – C8 (M) (250 mm x 4.6 mm i.d., 5 µm particle size) (Shimadzu
Corporation, Tokyo, Japan), and the guard column, a Shim-pack CLC G-C8 (4) (4.0 mm i.d.,
10 mm long) (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan), were operated in ambient temperature
(25 ºC). The final selected mobile phase was acetonitrile, methanol and a solution of
triethylamine 0.3% adjusted to pH 4.0 with phosphoric acid 10% (6:3:1; v/v/v) in isocratic
mode at a flow rate of 1 mL/min and the sample injection volume was 20µL. The
triethylamine solution was prepared freshly or kept in refrigerator (5 ºC ± 3 ºC) for a
maximum time of 24 hours.
Sample preparation for LC analysis
The stock solution of BTF reference standard was prepared in methanol. The working
standard solution (20 μg/mL) was obtained by the dilution of the stock solution in a mixture
of acetonitrile, methanol and water (6:3:1, v/v/v). The use of water instead of a solution of
53
triethylamine and phosphoric acid in the diluent mixture was verified and no modification in
the chromatographic profile or in the measured areas was observed.
For the commercial cream, a quantity equivalent of 10 mg BTF was transferred to a 50
mL volumetric flask, and then it was added 15 mL of co-solvent n-butyl alcohol (that was
selected after the testing of several solvents), followed by 5 minutes in ultrasonic bath. After
that, 15 mL of methanol were added to the volumetric flask, followed by more 5 minutes in
ultrasonic bath. Methanol was added until the concentration of 200 μg/mL of BTF. This
solution was filtered and one aliquot of the filtrated fluid was diluted with a mixture of
acetonitrile, methanol and water (6:3:1; v/v/v) until the final concentration of 20 μg/mL. Also,
here the use of water instead of a solution of triethylamine and phosphoric acid in the diluent
mixture was verified and no modification in the chromatographic profile or in the measured
areas was observed. Both sample and standard solutions were then filtered through a 0.45μm
membrane filter (Millipore) prior to the injection.
Validation procedure
The objective of validation of an analytical procedure is to demonstrate that it is
suitable for its intended purpose (7). The method was validated for linearity, detection limit,
quantification limit, precision (repeatability and intermediate precision), accuracy, specificity,
robustness and system suitability.
To test linearity, standard plots were constructed with six concentrations in the range
of 10-40 μg/mL of the drug prepared in triplicates. The linearity was evaluated by linear
regression analysis that was calculated by the least square regression and by ANOVA for
compliance of the linear model.
54
The quantification and detection limits were obtained based on signal-to-noise
approach. The background noise was obtained after injection of the blank, observed over a
distance equal to 20 times the width at half-height of the peak in a chromatogram obtained by
the injection of 20 μg/mL of the reference standard (10, 11). The signal-to-noise ratio applied
was 10:1 for the LOQ and 3:1 for the LOD. The results were verified experimentally.
The repeatability was verified from six independent sample preparations in the same
day, obtained as described in Sample preparation for LC analysis. The intermediate precision
was tested by assaying freshly prepared sample solutions at the same concentration in two
other days. Precision was reported as %R.S.D.
The accuracy was determined by the recovery of known amounts of BTF reference
standard added to the samples in the beginning of the preparative process. The added levels
were 20, 40 and 60% of the nominal drug concentration. The results were expressed as the
percentage of BTF reference standard recovered from the sample.
Two types of specificity experiments were performed. In the first one, it was assessed
by comparing the chromatograms obtained from the pharmaceutical preparation and the
standard solution with those obtained from excipients which take part in the commercial
cream and verifying the absence of interferences. In the second type, forced degradation
protocols were performed in order to provide suitable analytical conditions for stability study
of BTF. The accelerated degradation conditions applied were: light, acid, basic and oxidant
media. Samples were analyzed against a freshly prepared control sample (with no degradation
treatment) and under light protection. The peak purity was determined using the tools of the
Agilent Chemstation software. Excipient solutions were submitted to the same degradation
conditions in order to demonstrate no interference. Specific details of the experiments
conditions are described below:
55
- Effect of UV light: 1 mL of a solution containing 0.1 mg/mL of BTF reference standard in
methanol was placed in a closed 1cm quartz cell. The cells were exposed to a UV chamber
(100 x 18 x 17cm) with internal mirrors and UV fluorescent lamp CSR F30W T8 emitting
radiation at 254nm for 15, 30, 60, 120 and 180 minutes. The same procedure was realized for
sample solution from the commercial cream, after the BTF extraction as described in Sample
preparation for LC analysis. Protected samples, wrapped in aluminum foil (in order to protect
from light) were submitted simultaneously to identical conditions and used as control. After
the degradation treatment, the samples were diluted to 20 μg/mL with a mixture of
acetonitrile: methanol: water (6:3:1; v/v/v) and immediately analyzed.
- Effect of oxidation: BTF reference standard was dissolved in methanol (1 mg/mL) and 5 mL
of this solution were transferred to a volumetric flask, where hydrogen peroxide solution
(30%) was added until the final concentration of 10% and the volume was completed with
methanol. After 20 hours the solution was diluted until the final concentration of 20 μg/mL,
filtered and analyzed. Similar procedure was realized for the commercial cream, when 25 mL
of the initial solution 200 μg/ml of BTF, obtained as described in Sample preparation for LC
analysis, were transferred to a volumetric flask and submitted to degradation. A control
solution containing the excipients was prepared under the same circumstances of the
commercial cream solution.
- Effect of acid and alkaline hydrolysis: 5 mL of the BTF reference standard solution were
transferred to a volumetric flask and HCl (acid degradation) or NaOH (alkaline degradation)
was added until the final concentration of 1M in both cases. After 5 hours (basic degradation)
and 1 and 6 days (acid degradation), one aliquot of the solution was neutralized HCl 1M
(alkaline degradation) or with NaOH 1M (acid degradation) and diluted with acetonitrile,
methanol and water (6:3:1, v/v/v) until the final concentration of 20 μg/mL for LC analysis.
Similar procedure was realized with the commercial cream, when 25 mL of the initial solution
56
200 μg/mL of BTF (obtained as described in Sample preparation for LC analysis) were
transferred to a volumetric flask and submitted to the degradation. A control solution
containing the excipients was prepared under the same circumstances of the commercial
cream.
During the stability assays the peak purity tool was applied to confirm the absence of
other substances co-eluting in the same retention time.
The robustness of the analytical method was investigated with the factors summarized
in Table 1. The six factors selected were examined in a Plackett-Burman design (8
experiments) (5, 6). The BTF standard and the sample were analyzed under identical
experimental conditions and for this reason no additional experiments were necessary. The
estimation of the error from the distribution of effects was done according to the Dong
algorithm that is a suitable tool to identify significant effects in small designs (6).
Table 1. Factors and levels applied to the robustness test by LC method
Factor Units Level (-1) Level (+1) Nominal
pH of the triethylamine
- 3.9 4.1 4
solution
Concentration of the
% 88* 92* 90
organic phase
◦
Column temperature C 20 30 25
Wavelength of the detector nm 281/282 284/285 283
Column manufacturer - Shimadzu Merck Shimadzu
Triethylamine concentration % 0.27 0.33 0.3
* The modification on the organic phase composition was done proportionally to the nominal composition
(30% methanol and 60% acetonitrile).
57
The system suitability was verified through the evaluation of the obtained parameters
for the standard elution, such as theoretical plates, peak asymmetry and retention factor,
verified in different days of the method validation. The resolution was calculated according to
USP (9) using the chromatogram obtained from the worst case of accelerated degradation
conditions, which is the chromatogram that presented the nearest degradation product peak
(DP) to the BTF peak. The injection precision was calculated according to USP (9) and also
from the difference of duplicate injections of five sample solutions, as described by Ermer and
Ploss (12).
BTF photodegradation kinetics
The study was carried out with quartz cells containing 0.5 mL of BTF standard in methanolic
solution 400 g/ml exposed to UVC radiation (254 nm). The experiment conditions for the
drug irradiation were the same described for the specificity analysis under UV light as
described in Validation procedure at pre-established times (40, 60, 80, 100, 120 and 140
minutes), the total volume contained in the quartz cell was transferred to a volumetric flask (n
= 3) and diluted with acetonitrile, methanol and water (6:3:1, v/v/v) to achieve the final
theoretical concentration of 20 μg/mL. These solutions were protected from light and
analyzed by LC, employing the validated method.
The photodegradation kinetics of BTF in the presence of the cream excipients was
evaluated through the same experimental conditions described for the BTF standard. The
cream solution, prepared as described in Sample preparation for LC analysis, was diluted in
methanol. Aliquots of 1 mL of this solution (100 μg/mL) were transferred to quartz cells and
exposed to UVC light (254 nm). Also, a solution containing the excipient ingredients was
submitted to this stress condition to evaluate a possible interference of its degradation in the
58
BTF elution. At pre-established times (30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 and 240 minutes), the
total volume contained in the quartz cell was transferred to a volumetric flask (n = 3) and
diluted with acetonitrile, methanol and water (6:3:1, v/v/v) to achieve the final theoretical
concentration of 20 μg/mL. As described for the standard, these solutions were protected from
light and analyzed by LC, employing the validated stability-indicating method.
In order to evaluate a possible contribution of thermally induced degradation,
protected samples prepared from the standard and the commercial cream were wrapped in
aluminum foil and exposed to the same conditions described above. They were kept in the
chamber until the withdrawn of the last samples and analyzed. In addition, the temperature
inside the chamber was controlled during the experiment in both cases.
The BTF photodegradation kinetic rate was determined by plotting the drug
concentration (zero-order process), the log (first-order process) and the reciprocal (second-
order process) concentration versus time. The determination coefficients (R2) were obtained
and the best observed fit indicated the reaction order. The kinetic parameters constant (k) and
t0.5 were calculated.
Results and Discussion
Selection and optimization of the chromatographic conditions
The effect of the composition of the column and mobile phase on the retention time of
BTF and on its chromatographic parameters was initially investigated. At the first stage, C18
column chemistry (15 cm) and a solution 0.3% triethylamine in water were used with
acetonitrile as the organic solvent. Modifications in the organic phase percentage did not
result in adequate retention time or peak symmetry.
59
Subsequently C8 column chemistry (25cm) was also evaluated. Adequate analytical
parameters were obtained. Due to the high quantity of acetonitrile required, methanol was
tested, as a part of the organic phase, to reduce the analysis costs. The composition of the
mobile phase varied from: 45 to 80% (acetonitrile), 10 to 45% (methanol), 10% (triethylamine
solution 0.3%) and both 3 and 4 pH values were evaluated (as BTF is a basic compound with
pKa value 7.87 ± 0.5, calculated with the ACD/ChemSketch software). A composition of
acetonitrile, methanol and triethylamine solution (6:3:1; v/v/v) with pH value of 4.0 was
finally chosen.
Validation of LC methods
Before the beginning of the validation procedure, a stability test was performed with
two solutions: one of them containing reference standard and the other containing the
commercial cream, both in a mixture of acetonitrile, methanol and water (6:3:1, v/v/v) and
prepared according to section 2.3. After 20 h of analysis there was no significant alteration in
the measured areas (the variation was smaller than 2%).
Linearity, LOD and LOQ: over the concentration range of 10 – 40 μg/mL, the slope
and the intercept obtained from the three standard curves analyzed together were 22.415 and
6.524, respectively, and the determination coefficient was 0.9999. The analysis of variance
revealed that the obtained results correspond to a linear regression (p<0.05) with adequate
fitting (p>0.05). Regarding the intercept, it was significantly different from the theoretical
zero value (p< 0.05), although it was less than 2% of the area obtained for 20μg/mL of BTF
reference standard (100% of analyte level), therefore, there is no interference on the validation
(10).
60
LOQ and LOD were 0.0542 and 0.0166 μg/mL, respectively.
Precision: repeatability and intermediate precision results are expressed as relative
standard deviations (%R.S.D.). The %R.S.D. values presented in Table 2 were low for both
the repeatability and the intermediate precision (%R.S.D. maximum 1.64%), demonstrating
the good precision of the developed method for the semisolid dosage form.
Table 2. BTF Precision study by LC method.
Intra-day precision (n=6)

Label claim (%) R.S.D. (%)
Day 1 101.13* 0.76
Day 2 99.09 1.62
Day 3 98.26 0.88
Inter - day precision (n=17)

Label claim (%) R.S.D. (%)
99.4 1.64
* One sample was identified as an outlier, according to Dixon’s Q Test (α = 0,05) (13) and excluded.
Accuracy: the data for accuracy were expressed in terms of percentage recoveries of
BTF from the real samples. These results are summarized in Table 3. The mean recovery data
were within the range of 100.48 to 103.21% and the mean %R.S.D. was 0.86%, satisfying the
acceptance criteria for the study.
Table 3. BTF accuracy study by LC method.
Added levels (%) Added concentration Mean recovery (%) ±

(n=9) (μg/mL) R.S.D. (%)
20 4 103.21 ± 0.90
40 8 101.28 ± 1.32
60 12 100.48 ± 0.38
Specificity: placebo injections were performed to demonstrate the absence of
interference of the excipients components with the BTF elution. The results demonstrate that
61
there was no interference of other materials from the cream formulation, as shown in Figure 2
(a).
Figure 2. (a) Representative chromatograms obtained for 1) BTF reference standard 20 μg/mL
and for the 2) placebo. (b) Photodegradation of BTF 20 μg/mL from the commercial cream in
methanolic solution exposed to 254 nm UV light. 1) 30 minutes of exposure and 2) 17.5 hours
of exposure.(c) Chromatograms obtained from 1) reference standard 20 μg/mL and from the
2) commercial cream solution 20 μg/mL of BTF, both in 1M hydrochloridric acid for 6 days.
(d) Chromatograms from the 1) BTF reference standard 20 μg/mL and from the 2)
commercial cream solution 20 μg/mL of BTF, both in 1M sodium hydroxide for 5 hours. (e)
1) BTF and 2) its DP in a chromatogram from the commercial cream solution 20 μg/mL of
BTF in hydrogen peroxide 10% for 19 hours. 3) H2O2 stabilizing. Chromatographic
conditions: see Chromatographic system.
62
BTF solutions were submitted to different stress conditions to induce degradation.
Under UV radiation (254nm), total degradation was observed after 17.5h for the standard and
for the commercial cream solutions. After 30 minutes the BTF content in both analytes
exhibited some decrease and additional peaks were detected quicker than in other stress
conditions (Figure 2(b)). The results obtained in this preliminary stability study indicate that
BTF is very susceptible to the photodegradation. However, UV spectra’s from BTF peak and
from other two peaks of DP were overlaid (Figure 3). Two of them presented similarity to the
BTF peak, suggesting that these DP molecules have few differences from the BTF molecule
or that the structures just present the same absorptive properties. These findings indicate that
the developed LC method is capable of providing separation among similar molecules and/or
molecules with similar absorption profiles from the analyte.
Figure 3. (a) Chromatogram from the BTF reference standard exposed to UV light for 2 h. 1)
BTF, 2) DP, 3) majority DP.(b) The overlapping of the UV spectra from peaks indicated in
chromatogram (a), indicating similarity between the molecules 1, 2 and 3 or same absorptive
properties. Chromatographic conditions: see Chromatographic system.
When acid degradation was performed, no degradation peaks were detected and the
concentration of butenafine hydrochloride remained constant during the exposure time to the
degradation condition, according to Validation procedure (Figure 2(c)). Under basic
conditions the standard remained stable, although the drug from the commercial cream
solution did not (Figure 2(d)). The possible reason can be due to the action of one or more
excipient ingredients that facilitate the degradation reaction.
63
The oxidation by H2O2 caused the degradation of standard and commercial cream and
just one DP peak could be observed. However, the extent of oxidation was not the same for
the sample solutions. After 20 hours it remained 96.23% of BTF on the standard solution and
only 62.42% of the drug lasted on the commercial cream solution (Figure 2 (e)). Also, this
higher degradation in sample solution can be due to the action of one or more excipient
ingredients that favor the product formation.
Robustness: the Plackett-Burman design selected factors and the obtained response to
each experiment are summarized in Table 4 for both wavelength variations of 1nm and 2nm.
The responses are the percentages of BTF in the commercial cream (relative to its label
claimed concentration) obtained in relation to the standard solution in each experiment.
After the calculation of the effects for each parameter, the statistical interpretation,
through the t-test, allowed to define what is significant and what is not. No significant factors
were detected for all the experiments in the tested wavelengths (Table 4), as t-calculated
values were minor than the t-critical value (α = 0.05).
Another way to evaluate the results is creating a half normal-plot, to rank the effects
according to the increasing absolute effect size. The effects are plotted against a scale defined
by portioning the right half of the normal distribution in equal parts and by taking the median
of each slice. These values are called rankits (6). The effect of each factor was calculated and
the results are summarized with the respective rankit in Table 5 (just for the wavelength
variation of two nm). In figure 4, these effect values were plotted with the critical effect
values of margin of error (ME) (0.44) and of simultaneous margin of error (SME) (0.89).
When one effect is positioned between ME and SME is called possibly significant and one
effect that is above SME is considered significant (6). None of the results exceeded the ME or
SME values, so the effects of each parameter were not significant, confirming the results
obtained from the t-test, for this wavelength variation.
64
Table 4. Plackett-Burman design factors and the obtained response to each experiment.
Experiment pH Column Dummy Wave- % Tempe- % TEA* Response Response
lenght Organic rature (± 1nm) (± 2nm)
Phase
1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 -1 99.41 99.46
2 -1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 99.67 99.91
3 -1 -1 +1 +1 +1 -1 +1 99.15 99.12
4 +1 -1 -1 +1 +1 +1 -1 99.11 99.08
5 -1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 99.57 99.5
6 +1 -1 +1 -1 -1 +1 +1 99.22 99.24
7 +1 +1 -1 +1 -1 -1 +1 99.35 99.35
8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 99.45 99.47
tcalculated (± 1nm) -1.333 1.902 -0.053 -0.658 -0.800 0.373 -0.622
tcalculated (± 2nm) -1.166 1.756 0.442 -0.281 -1.086 0.442 -0.952
tcritical 5.408
*TEA= triethylamine
65
Table 5. Effects from the seven-factor Plackett-Burman design for the wavelengths of 281 nm
and 285 nm
Factor (definition) |Effect| Rankit

Detection Wavelength (A) 0.0525 0.09
Temperature (B) 0.0825 0.27
Dummy (C) 0.0825 0.46
% TEA* (D) 0.1775 0.66
% Organic phase (E) 0.2025 0.90
pH of TEA* solution (F) 0.2175 1.21
Column (G) 0.3275 1.71
*TEA= triethylamine
Figure 4. Half-normal probability plot for the effects of Table 5 with identification of the
critical effects ME and SME.
Also, the performance parameters were analyzed. In all the performed experiments the
theoretical plates were higher than 5000 and the tailing factor was smaller than 1.4, in
agreement with the literature (14, 15). The retention factor observed in all analysis was higher
than 1 (16).
66
System suitability: the analysis of the BTF standard evaluated at each day presented
the approximate results: 16600 theoretical plates, 0.97 peak asymmetry and 2.09 for the
retention factor. The resolution of BTF and DP was obtained through the analysis of the
oxidative degradation chromatogram that has the nearest DP from the BTF peak and the
calculated value was 12.4. For injection repeatability, calculated according to two different
ways (as described in Validation procedure), a R.S.D. of 0.2% was determined for the
standard and sample solution. The obtained results establish that the LC system and procedure
are capable of providing data of acceptance quality (14, 15).
BTF Photodegradation kinetics
Through the evaluation of the determination coefficients obtained by plotting the drug
concentration (zero-order process), the log (first-order process) and the reciprocal (second-
order process) concentration versus time, the degradation of BTF in methanolic solutions
could be better described as first order kinetic for both the standard solution and the cream
solution, under the applied experimental conditions (Table 6). Therefore, the degradation
speed is proportional to one component (17), the BTF itself. The obtained degradation rate
constants (k) and t0.5 were: 0.284 h-1 and 2.44 h for the standard solution; 0.422 h-1 and 1.64 h
for the drug in the cream solution. The rate constants were quite different probably because of
the action of one or more excipient ingredients that influence the drug degradation in the
cream solution. The plots containing the logarithm of the remaining BTF in the standard and
in the commercial cream versus time are in Figure 5.
67
Table 6. Determination coefficients from the photodegradation kinetics of BTF .
Order Standard Cream
Zero 0.9789 0.9271

First 0.9891 0.9755
Second 0.9809 0.8853
Figure 5. First-order reaction plots of remaining BTF from the standard and from the cream
versus time, after photodegradation with UV-C light.
The temperature inside the chamber was always below 34◦C. There was no
considerable variation in the BTF concentration in the solutions containing BTF standard and
commercial cream, wrapped in aluminum foil and submitted to the photodegradation
conditions, as thermal controls. The peaks generated by the solution containing the excipient
ingredients and exposed to the same UV-C radiation had no interference in the BTF migration
time.
Conclusion
The reverse phase LC method proposed was found to be simple, fast, accurate, precise,
linear, robust and specific and it is a powerful tool to investigate chemical stability of BTF.
68
The robustness of the method was verified with small variations on pH, concentration of
triethylamine solution, concentration of organic phase, detector wavelength, column
manufacturer and analysis temperature, using the Plackett-Burman experimental design to
examine potential sources of variability. All the parameters meet the criteria of the ICH
guidelines for method validation. Its chromatographic retention time of 6.8 min allows the
analysis of a large number of samples in an adequate period of time. The method could
therefore be recommended for routine quality control analysis of raw material and of
commercial cream, as well as for protocols of BTF stability study.
The method applicability to stability studies was proved through the evaluation of the
main factors that affect the drug content in solution and through the BTF degradation kinetics
in methanolic solution exposed to UVC light. Both methanolic solutions of BTF, reference
standard and commercial cream, showed stability in relation to the applied acid condition and
instability when submitted to basic, oxidation and light conditions. The degradation kinetics
was defined as first order for the drug in both standard and cream methanolic solutions,
establishing that its speed is dependent on the drug concentration. The developed method and
the stability study are essential to future studies of isolation and identification of the
degradation products, objectifying the analysis of biological and toxicological aspects, aiming
the maintenance of efficacy and safety of the pharmaceutical product.
Acknowledgements
The authors wish to thank CAPES (Brazil) and CNPq (Brazil) for the financial
support and Brainfarma for the provision of BTF reference standard.
69
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71
72
CAPÍTULO II. Estudos para o desenvolvimento de metodologia por
eletroforese capilar para a análise de cloridrato de butenafina presente na
formulação semi-sólida
Capítulo 2: Eletroforese Capilar
1. Introdução
A eletroforese capilar (EC) é considerada um método alternativo atrativo para

a análise de fármacos, por causa da sua alta eficiência de separação, curto tempo
de análise, relativamente baixo custo de operação e de consumíveis, facilidade de
automação e uso de baixos volumes de analito, bem como reduzido consumo de
solventes quando comparada com técnicas como a CLAE (CREGO et al, 2001;
ALTRIA & ELDER, 2004; GOMES et al, 2004; SÜSLÜ et al, 2007; GAONA-GALDOS
et al, 2008; MAMANI et al, 2008). Apesar da EC ter se tornado técnica de rotina para
análises específicas em alguns países (ALTRIA, 1999; ALTRIA & ELDER, 2004), no
Brasil o uso da técnica permanece majoritariamente na pesquisa.
A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração diferenciada

de compostos iônicos ou ionizáveis em um campo elétrico (TAVARES, 1996;
SANTORO et al, 2000), sendo que a velocidade e o sentido da migração dependem
do tamanho e da magnitude de carga de cada íon (ALTRIA, 1996; SANTORO et al,
2000; GERVASIO et al, 2003), conforme Figura 2.1. Na EC a separação é conduzida
em tubos cujas dimensões são em torno de 15 a 100 μm de diâmetro interno e em
torno de 50 a 100 cm de comprimento, preenchidos com eletrólito condutor e
submetidos à ação de um campo elétrico. O uso de capilar oferece muitas vantagens
sobre os outros meios utilizados para eletroforese, pois devido a fatores geométricos
(a relação entre a área superficial interna e volume é apreciavelmente grande), um
capilar possibilita a dissipação eficiente de calor gerado pela passagem de corrente
elétrica (efeito Joule). Além disso, a alta resistência elétrica do capilar permite o
estabelecimento de campos elétricos elevados, resultando em separações de alta
eficiência, resolução inigualável e tempos de análise apreciavelmente curtos
(TAVARES, 1996; TAVARES, 1997). Entretanto a técnica apresenta algumas
desvantagens como baixa precisão de injeção e pouca sensibilidade, quando
comparada com CLAE (ALTRIA et al 1998; ALTRIA, 1999).
75
Figura 2.1. Diagrama esquemático do sistema de EC: R1 e R2 são os recipientes

contendo o eletrólito onde se encontram os eletrodos e1 e e2 e F é a fonte de
tensão. Os círculos brancos representam os íons com as cargas indicadas ou as
espécies sem carga N e as áreas representam as massas. Já v é uma lâmpada de
emissão com freqüência conhecida, D é o detector acoplado ao computador C.
Fonte: GERVASIO et al, 2003.
Outro mecanismo envolvido no transporte de analitos em direção ao detector

é o fluxo de solução gerado pela aplicação de voltagem no capilar preenchido com
eletrólito. Esse fluxo ocorre por causa da ionização dos grupamentos silanóis no
interior do capilar em pH > 3. Os grupos silanóis ionizados atraem cátions
provenientes do tampão que formam duas camadas, sendo que a mais distante da
parede do capilar é movimentada no sentido do cátodo, com a aplicação da tensão,
conforme Figura 2.2. O desequilíbrio de cargas origina deslocamento osmótico do
solvente água do ânodo para o cátodo, o que contribui para o deslocamento do
analito, mesmo desprovido de carga (neutro) ao longo do capilar, sendo que está
força de transporte é chamada de fluxo eletrosmótico (EOF) (ALTRIA 1996;
SANTORO et al, 2000).
Figura 2.2. Formação e sentido do fluxo eletrosmótico. Fonte: GRAEF, 2007.
76
A eletroforese capilar classifica-se em eletroforese capilar de zona (CZE),

cromatografia capilar eletrocinética micelar (MEKC), focalização isoelétrica capilar,
isotacoforese capilar, eletroforese capilar em gel e eletrocromatografia capilar. Na
CZE os compostos são separados pela combinação entre mobilidade eletroforética e
a magnitude do fluxo eletrosmótico. As moléculas são separadas de acordo com o
tamanho e o número de grupamentos ionizados (SANTORO et al, 2000). Na MECK
a solução tampão contem um tensoativo em concentração superior a concentração
micelar crítica, proporcionando um microsistema de duas fases. O eletrólito é a fase
primária, a qual é transportada eletroosmoticamente sob ação do campo elétrico,
enquanto que as micelas representam a fase secundária, pseudo-estacionária, que é
transportada por uma combinação de eletroforese e eletroosmose (TAVARES,
1997). Moléculas neutras podem ser separadas pelo método em função de sua
hidrofobicidade, já que os compostos hidrofílicos não são solubilizados na micela,
sendo separados de acordo com a mobilidade eletroforética (SANTORO et al, 2000).
A partição diferenciada de solutos neutros entre essas duas fases é responsável
pela seletividade de separação (TAVARES, 1997).
Um procedimento importante nas análises por eletroforese capilar consiste na
adição de concentração conhecida de padrão interno (PI). Determina-se a relação
entre as áreas fornecidas pela amostra e PI, eliminando desse modo, erros
decorrentes da variabilidade do volume de injeção, voltagem e EOF. O PI deve
possuir propriedades químicas similares ao composto sob análise, apresentar tempo
de retenção semelhante e não interferir na análise (DOSE & GUIOCHON, 1991).
O pH da solução tampão é um dos parâmetros que afeta fortemente a
separação em EC. Este parâmetro afeta tanto o EOF, quanto a mobilidade
eletroforética dos analitos (GERVASIO et al, 2003). Outros fatores incluem o tempo
de injeção da amostra, o tampão (concentração e força iônica), adição de
modificador orgânico ao tampão de corrida, temperatura de análise e tensão
aplicada (TOASAKSIRI et al, 2000; CREGO et al, 2001; NEMUTLU et al, 2005; LIU
et al, 2009).
Neste contexto, o objetivo do presente capítulo foi o desenvolvimento de

metodologia analítica por eletroforese capilar para a quantificação de cloridrato de
77
butenafina na formulação semi-sólida em estudo, investigando os diversos fatores

que influenciam o desempenho da análise.
2. Metodologia
2.1. Solventes e reagentes
O sal fosfato de potássio foi obtido da Merck (Darmstadt, Alemanha), o

acetato de amônio da marca Quimex (Cotia, Brasil) e o citrato de sódio foi adquirido
da Spectrum (New Brunswick, EUA). O tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) e o
dodecil sulfato de sódio (SDS) foram obtidos da Nuclear (Diadema, Brasil). Os
solventes e sais utilizados foram de grau analítico. Água purificada foi obtida pelo
equipamento Millipore® Direct-Q 3UV (Molsheim, França).
2.2. Sistema de Eletroforese Capilar
Os experimentos foram conduzidos em equipamento de eletroforese capilar

3D
da marca Agilent, modelo CE (Waldbronn, Alemanha) equipado com auto-
amostrador, detector de arranjo de fotodiodos, sistema de controle de temperatura e
fonte de fornecimento de tensão de até 30 kV. O software CE Chemstation foi
utilizado para o controle do equipamento, aquisição e análise de dados (inclusive a
verificação da pureza dos picos obtidos). Foi utilizado capilar de sílica fundida de
comprimento total de 48,5 cm, comprimento efetivo de 40 cm e diâmetro interno de
50 μm.
2.3. Desenvolvimento de Método Analítico
Considerando as características de base fraca da BTF, com valor de pKa de

7,87 ± 0,5, primeiramente optou-se pelo desenvolvimento de método analítico por
CZE em pH baixo, já que a molécula apresenta-se ionizada no mesmo. Foram
testados diferentes tampões, variando sua concentração e pH, bem como a adição
de modificador orgânico, temperatura de análise, tempo de injeção da amostra e
tensão aplicada. A seguir estão detalhadas as principais tentativas.
Nota: considerou-se a concentração da amostra 50 μg/mL, tensão de 25 Kv , tempo

de injeção de 5 segundos e temperatura de 25 ºC como condições padrão de análise
78
por serem usuais na literatura, portanto, quando não indicado no texto, estes foram
os valores utilizados.
Utilização de tampão fosfato: inicialmente foi avaliado o seu uso, já que os

valores de pKa do fosfato são 2,12 (pKa1), 7,21 (pKa2) e 12,32 (pKa3), atuando
como tampão nestas proximidades de pH (ALTRIA, 1996). Sendo assim,
considerando-se o valor de pKa do fármaco, foram testados os valores de pH de 3 e
5 , onde a BTF encontra-se totalmente ionizada. Foram analisadas as concentrações
25 e 50 mM, que se encontram dentro da faixa de concentração indicada na
literatura, já que concentrações superiores causam problemas de aquecimento
interno no capilar (ALTRIA, 1996). Também, a adição de 10% de metanol como
modificador orgânico foi averiguada, bem como os tempos de injeção de 3 e 5
segundos e a intensidade do sinal gerado em dois diferentes comprimentos de onda:
223 nm e 283 nm (pontos de absorção máxima). Todas as combinações,
considerando os fatores descritos, foram testadas.
Os resultados obtidos com o comprimento de onda de 223 nm resultaram

numa intensidade adequada de sinal. Já no comprimento de 283 nm a intensidade
do sinal foi consideravelmente baixa, sendo descartado o uso deste comprimento de
onda. Esse resultado é justificável pela reduzida absorção do fármaco em 283 nm e
pela menor sensibilidade do método em relação à CLAE, cujo método de
quantificação para BTF foi desenvolvido nesse comprimento de onda.
A variação no volume de injeção teve como efeito somente a redução na área

e intensidade do sinal, fato justificável devido à menor injeção de amostra. A adição
do modificador orgânico não trouxe nenhum benefício significativo para análise
eletroforética.
Entre a concentração de tampão e os valores de pH, o tampão fosfato 50 mM,

pH 5 resultou em parâmetros de análise adequados (tempo de migração de 4,5
minutos, simetria de 0,95 e pratos teóricos em torno de 63.000). Na Figura 2.3 pode
ser verificado o adequado perfil eletroforético da análise.
79
Figura 2.3. Eletroferograma de BTF SQR (50 μg/mL). Condições eletroforéticas:

tampão fosfato 50 mM, pH 5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo
de injeção de 5 segundos.
Entretanto, não foi obtida reprodutibilidade nos parâmetros de análise citados.

A Figura 2.4 exemplifica o perfil eletroforético obtido em análises subseqüentes nas
mesmas condições. Nos parâmetros de análise foi verificado um reduzido número de
pratos teóricos (em torno de 4440) e inadequada simetria (USP tailing: 0,628), que
pode ser visualizada no eletroferograma pela formação de “front” no pico do fármaco.

tampão fosfato 50mM, pH 5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo
de injeção de 5 segundos.
80
Devido à falta de reprodutibilidade nas análises, foram testados outros

tampões, conforme descrito a seguir.
Utilização de tampão citrato: a sua utilização também se justifica pela faixa de

ação tamponante ocorrer em valores de pH baixos, já que os valores de pKa do
citrato são 3,06 (pKa1) e 5,40 (pKa2) (ALTRIA, 1996). Sendo assim foram testados
os valores de pH 3 e 5 nas concentrações de 25 e 50 mM.
Os melhores resultados foram obtidos com a concentração de tampão de 25

mM e valor de pH 3. Entretanto, apesar da intensidade do sinal ser excelente (em
torno de 40 mAU), os parâmetros de análise obtidos não foram plenamente
satisfatórios.
Utilização de tampão acetato: foram produzidas soluções nas concentrações

de 25 e 50 mM e nos seguintes valores de pH: 3, 4 e 5. O pKa do acetato é 4,75
(ALTRIA, 1996). As melhores condições foram obtidas com o tampão na
concentração de 25 mM, pH 5. Porém, novamente a simetria não foi adequada (USP
tailing em torno de 2,1).
Já nas tentativas de desenvolvimento de metodologia analítica por MECK

foram realizadas em pH elevado, onde a molécula encontra-se sem carga, para que
a migração ocorra devido à interação com as micelas. Foram avaliados os fatores
citados para a CZE, bem como diferentes concentrações do tensoativo.
Utilização de tampão TRIS com SDS: inicialmente foi avaliado o uso do

tampão TRIS (pKa: 8,3) (ALTRIA, 1996) com a adição de SDS. O tampão foi testado
nas concentrações de 20 e 50 mM e o tensoativo na concentração de 20 mM e valor
de pH de 10,5, onde a BTF encontra-se totalmente não ionizada. Excelentes
parâmetros de análise foram obtidos: intensidade de aproximadamente 20 mAU,
simetria adequada (0,89), pratos teóricos em torno de 40.000 e tempo de migração
de 3,5 minutos, conforme Figura 2.5
81

TRIS 50mM, SDS 20 mM, pH 10,5, tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e
tempo de injeção de 5 segundos.
Como foi possível reproduzir o método, foi conduzido estudo para avaliar a
sua especificidade frente à luz como fator de degradação, já que o fármaco é
sensível a este agente de estresse. Na degradação forçada da BTF SQR frente à luz
UVC (254 nm), conduzida conforme indicado para a metodologia de CLAE,descrita
no capítulo 1, houve uma redução a 75,09% na área do fármaco após 1 hora de
exposição. Foi detectado pico do produto de degradação em 3,3 minutos, conforme
Figura 2.6 A análise da pureza pelo software indicou ausência de migração conjunta
de outra substância. Pelo conhecimento prévio da suscetibilidade ao meio oxidativo,
a BTF SQR também foi exposta a este meio (mesmas condições descritas para o
método de CLAE), sendo verificado decaimento na área do pico em análise
realizada após 24 horas de contato com o agente estressor. A análise da pureza
pelo software indicou novamente a ausência de migração conjunta de outra
substância.
82
Figura 2.6. Eletroferograma de BTF SQR (50 μg/mL) exposta à luz UVC (254 nm)
por uma hora. Condições eletroforéticas: TRIS 50mM, SDS 20 mM em pH 10,5,
tensão de 25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo de injeção de 5 segundos.
Seleção do padrão interno:
Foram realizados testes para selecionar uma substância passível de ser

utilizada como padrão interno nas condições de MECK desenvolvidas. As seguintes
substâncias foram testadas: nimesulida, terbinafina, epinastina, fexofenadina,
rabeprazol, rosiglitazona, duloxetina, mesilato de gemifloxacino, paracetamol, 1-
naftol, cimetidina, diclofenaco de sódio, tramadol cloridrato e hidroclorotiazida, Os
melhores perfis eletroforéticos foram obtidos com 1-naftol, cimetidina,
hidroclorotiazida e rosiglitazona. Para verificar a adequabilidade destes fármacos
como padrão interno foi realizado um estudo de proporcionalidade, onde a
concentração do PI foi mantida constante (50 μg/mL) e a concentração da BTF foi
analisada em três níveis (20, 50 e 100 μg/mL) (6 análises em cada nível). Foi
calculada a razão entre as áreas BTF/PI e verificado o DPR. Os menores valores de
DPR foram obtidos com o uso de rosiglitazona (Figura 2.7.) como padrão interno e a
análise da linearidade dos dados forneceu um r2 de 0,9989, sendo um indicativo
prévio de linearidade do método.
83
Figura 2.7. Eletroferograma de: a) Rosiglitazona (50 μg/mL) e b) BTF SQR (50
μg/mL). Condições eletroforéticas: TRIS 50mM, SDS 20 mM em pH 10,5, tensão de
25 Kv, temperatura de análise 25 ºC e tempo de injeção de 5 segundos.
Posteriormente procedeu-se a análise da BTF extraída do creme

dermatológico e observou-se um perfil alargado da base do pico, conforme
eletroferograma “a” na Figura 2.8.
Figura 2.8. Eletroferograma de BTF (50 μg/mL) obtida do creme (a), com
alargamento de sua base e eletroferograma do placebo simulado (b) com sinal no
mesmo tempo de migração do fármaco, sugerindo a migração concomitante dos
mesmos como fator de alargamento do eletroferograma “a”. Condições
eletroforéticas: TRIS 50mM, SDS 20 mM em pH 10,5, tensão de 25 Kv, temperatura
de análise 25 ºC e tempo de injeção de 5 segundos.
84
Para confirmar a causa deste alargamento, foi analisada uma solução placebo
e observou-se um pequeno sinal no tempo de migração da BTF, conforme
eletroferograma “b” da Figura 2.8. Uma solução padrão de BTF SQR foi adicionada
ao placebo e o perfil eletroforético obtido foi semelhante ao da solução amostra da
formulação semi-sólida, confirmando a suposição de interferência dos excipientes do
produto na migração da butenafina nas condições desenvolvidas.
Para resolver os excipientes do fármaco foram testados: capilar de maior

comprimento (51 cm), aumento na concentração de SDS (75 e 100 mM) e redução
do pH (para 7 e 8) (AGILENT TECHNOLOGIES, 2000), bem como a adição de
agentes para aumentar a viscosidade como etilenoglicol (5, 10, 15 e 25%) e
propanol (5, 10 e 15%). Todas as tentativas não resultaram em migração
diferenciada dos componentes do placebo e da BTF. Foi verificado o padrão de
migração dos componentes do creme isoladamente e vários apresentaram um
pequeno sinal no tempo de migração da BTF. São eles: EDTA, cera auto-
emulsificante, álcool benzílico, silicone, óleo mineral, vaselina sólida e
polietilenoglicol 40.
O foco dos testes passou a ser o método de extração do fármaco da

formulação, objetivando separar o mesmo dos excipientes. Foi testado o uso de
extração líquido-líquido, procedimento presente em algumas monografias de
pomadas e cremes nas Farmacopéias (F. Bras, 1988 e USP, 2008). Foram avaliadas
as seguintes combinações de solventes: n-butanol e éter; n-butanol e HCl 0,1 M; éter
e etanol; éter e HCl 0,1M; dimetilsulfóxido (DMSO) e éter e DMSO e HCl 0,1M,
entretanto, não foi eliminado o interferente. Posteriormente foi analisado o método
de extração descrito por Kaale (2002), que consiste no uso de metanol e hexano
com agitação vigorosa, seguida de centrifugação. Após a retirada de parte da fase
inferior aquosa, o procedimento foi realizado mais duas vezes, sem obtenção de
resultados adequados.
Utilização de tampões Borato e Tetraborato com SDS: foi verificada a

adequabilidade do uso dos tampões tetraborato e borato (pKa: 9,24) (ALTRIA, 1996)
com SDS. O tampão tetraborato foi testado nas concentrações de 20 e 40 mM com
SDS 25 e 50 mM e valores de pH 9 e 10. O tampão borato foi avaliado nas
concentrações de 25 e 50 mM, com SDS 25 e 50 mM no pH 10 somente. Foram
85
analisados padrão de BTF, o fármaco extraído do creme e o placebo simulado,

sendo que a interferência de parte dos excipientes foi novamente verificada.
3. Conclusões
O método desenvolvido por MECK mostrou-se não específico frente à

formulação de placebo simulado, inviabilizando seu uso para o creme. A
metodologia poderia ser aplicada para a análise de matéria-prima, porém mais
estudos são necessários para este uso, sendo esta uma perspectiva futura deste
trabalho. Apesar da ineficiência no desenvolvimento de método analítico para
quantificação da BTF na formulação semi-sólida, o trabalho reuniu diferentes
estratégias de desenvolvimento analítico por EC embasadas na literatura, partindo
do modelo simples da CZE empregando diferentes tampões até MECK com aditivos.
4. Referências
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88
CAPÍTULO III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato
de butenafina em segmento de pele e estudo comparativo de retenção
cutânea de duas formulações presentes no mercado.
Capítulo 3: Permeação/penetração cutânea
O objetivo deste capítulo foi a validação de um método previamente desenvolvido

de cromatografia líquida para avaliar a permeação e a penetração do cloridrato de
butenafina presente em formulação semi-sólida através da pele de orelha suína.
Para este estudo foram utilizadas células de Franz. Os parâmetros avaliados na
validação do método bioanalítico foram: linearidade, precisão, exatidão, limite de
quantificação, limite de detecção e os resultados obtidos estão de acordo com os
códigos oficiais. Posteriormente à validação da metodologia, foi realizado um estudo
comparativo entre duas formulações e não foi detectada diferença significativa na
concentração de fármaco na epiderme, já na derme a diferença foi significativa no
período de 8 horas. Não foi detectada presença significativa de fármaco no fluído
receptor durante o estudo para ambas as formulações.
91
Manuscrito a ser submetido ao Biomedical Chromatography
A simple and rapid method to assess butenafine hydrochloride in skin samples and a
comparative cutaneous retention study of two marketed formulations.
Aline Bergesch Barth*, Rúbia Lazzaretti Pereira, Bethânia Andrade de Vargas, Nadia Maria
Volpato.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Ipiranga 2752, Porto Alegre-RS,
Brazil.
* Corresponding author: Tel: +55 51 33085214; Fax: +55 51 33085378
E-mail address: alinebbarth@hotmail.com (Aline Bergesch Barth)
92
Abstract
An analytical chromatographic method previously developed for a butenafine
hydrochloride (BTF) formulation was validated for the analysis of the drug in the main skin
layers. To evaluate the specificity of the method, the influence of the components of the skin
was analyzed, as well as the skin in contact with the excipient ingredients and no signal was
detected on the elution of the drug. Linearity was assessed with 8 different solution
concentrations in the range of 0.1 a 10 g/mL (r2 = 0.9999) and ANOVA showed non-
significantly linearity deviation (p > 0.05). Adequate results were obtained for repeatability,
intra-day precision and accuracy, which were analyzed in the following concentrations: 0.5,
3.0 and 8.0 g/mL of BTF extracted from six layers spiked with the drug. The limit of
quantification and the limit of detection were determined using the signal to noise ratio and
the obtained values were: 68.4 ng/mL and 17.7 ng/mL, respectively. After the validation of
the analytical method, a comparative study of BTF cutaneous penetration through porcine skin
was performed applying two different formulations: Tefin, present in the Brazilian market,
and Lotrimin Ultra®, available in the American market, and no statistical difference was found
in the epidermis (p > 0.05) although in the dermis the difference was significant (p < 0.05).
During the experiment period (8 hours) no drug permeation from both formulations was
detected in the receptor fluid.
Keywords: method validation, Franz cell, porcine skin, butenafine hydrochloride.
93
Introduction
Butenafine (N-4-tert-butylbenzyl-N-methyl-1-naphtalenemethylamine hydrochloride) (Figure
1), a broad-spectrum topical antifungal agent (Mingeot-Leclercq et al, 2001; Singal, 2008),
shows excellent therapeutic efficacy in humans with dermatomycoses (Arika et al, 1993;
Gupta et al, 1998; Mcneely and Spencer, 1998; Mingeot-Leclercq et al, 2001). The drug
readily interacts with lipids and is incorporated into membrane phospholipids which may
explain the excellent antifungal efficacy and long duration of action when it is used as a
topical antifungal agent in humans (Mingeot-Leclercq et al, 2001). The drug mechanism of
action is based on the inhibition of the fungal enzyme squalene epoxidase, blocking the
biosynthesis of ergosterol, which is an essential component of fungal cell membranes (Gupta
et al, 1998; Mcneely and Spencer, 1998; Gupta, 2002). Butenafine hydrochloride (BTF) was
introduced in the Brazilian market in 2007 formulated as 1% (w/w) cream.
Figure 1. Chemical structure of BTF.
In order to design dermal delivery systems and/or superficial topical delivery it is
essential to understand the permeation and/or retention of drugs through/into the skin. Crucial
parameters include the amount of active agent accumulated in the different strata of the skin,
as well as the flux through the skin into the systemic circulation. For topical delivery systems,
accumulation in the skin with minimal permeation is desired, while for systemic delivery, the
94
opposite behavior is preferred (Touitou et al, 1998). In spite of the use of BTF in topical
formulations, there are only few studies that quantify the drug in the skin: two animal studies
(Arika et al, 1990; Arika et al, 1993) and a human study (Tanuma et al, 2001), but only one of
them quantifies the BTF in different layers of the skin (Arika et al, 1993), however it applies
an in vivo model. The applied method is complex, expensive, multi-step, time-consuming and
demand the use of animals. Consequently, it is not a convenient method for assessing the drug
delivery in different skin layers as usually necessary in skin penetration studies performed to
assess drug delivery to the skin during development of new topical formulations (Wagner et
al, 2000; Lopes et al, 2010; USP, 2009b), to allow the comparison of generic products with an
innovator (De Paula et al, 2008; USP, 2009b) and in post-approval drug product monitoring
(USP, 2009b). The use of excised human skin in an in vitro model is an alternative (Wagner et
al, 2000), however, its availability is limited and animal skin is therefore preferred (Moser et
al, 2001; SCCP, 2006). Studies have been demonstrating that porcine skin is the most relevant
animal model for human skin (Touitou et al, 1998; Moser et al, 2001; Schmook et al, 2001;
SCCP, 2006, Jacobi et al, 2007; Meyer et al, 2007; Barbero & Frasch, 2009). In this context,
the diffusion cell model is the standard for measuring drug permeation across the skin. This
model consists of donor and receptor compartments separated by the skin sample and the
permeation rate through the skin into the receptor compartment as well as the drug retention in
the skin are quantified with an analytical method as LC (Touitou et al, 1998; Moser et al,
2001; SCCP, 2006).
Considering that dermatophytosis are superficial fungal infections (Singal, 2008) with
treatment efficacy dependent on the drug localization in the skin and that BTF is strictly for
topic use with limited data about systemic toxicity (Lesher et al, 1997), the objective of the
present study was to validate the previously developed LC method in compliance with the
CDER/FDA Guideline (2001) for the in vitro determination of the permeation and penetration
95
of BTF from creams in porcine ear skin using the Franz cell diffusion model, as well as to
compare the penetration of BTF from two products: formulation T (Tefin), available in the
Brazilian market, and formulation L (Lotrimin Ultra®), present in the American market.
Materials and Methods
Materials
The reference standard was kindly supplied by Brainfarma (Rio de Janeiro, Brazil) and
both creams T and L were obtained in the local Brazilian and American market, respectively,
and are claimed to contain 1% (w/w) of BTF. The following inactive ingredients are present in
formulation T: benzyl alcohol, ethyl alcohol, cetyl alcohol, sodium benzoate, emulsifying
wax, edetate disodium, polyethylene glycol 40 stearate, liquid petrolatum, polysorbate 60,
propylene glycol, simethicone, white petrolatum, sodium hydroxide and water. The American
formulation L contains the following excipient ingredients: benzyl alcohol, cetyl alcohol,
sodium benzoate, stearic acid, diethanolamine, glycerin, glycerin monostearate SE,
polyoxyethylene (23) cetyl ether, propylene glycol dicaprylate, white petrolatum and purified
water
All reagents used in this work were analytical or HPLC grade. Acetonitrile and
methanol were purchased from Tedia (Fairfield, USA) and the phosphoric acid from Merck
(Darmstadt, Germany). Purified water was obtained by a Millipore® Direct-Q 3UV with pump
(Molsheim, France). The porcine ears were obtained from a local slaughterhouse (Harmonia,
Brazil).
96
Chromatographic system
The LC method was previously developed for the stability study of the semi-solid
formulation and its validation for this matrix was done according to the ICH Guideline (2005)
with the analysis of the specificity enclosing degradation conditions as: acid and basic media
with HCl 1M and NaOH 1M, respectively, oxidation with H2O2 10% and the exposure to UV
light (254nm). For the robustness evaluation, critical factors (pH and concentration of
trietilamine solution, concentration of organic phase, detector wavelength, column
manufacturer and analysis temperature) were selected to examine the method robustness with
the two-level Placket-Burman experimental design. The method consists on: LC system
(Agilent 1200 series, Santa Clara, USA) containing a G1311A quaternary pump, G1322A
vacuum degasser, G1316A thermostat column compartment, G1329A standard auto sampler
and G1315B diode array detector set at 283nm. The analytical column, a Shim-pack CLC –
C8 (M) (250 mm x 4.6 mm i.d., 5 µm particle size) (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan)
and the guard column, a Shim-pack CLC G-C8 (4) (4.0 mm i.d., 10 mm long) (Shimadzu
Corporation, Tokyo, Japan) were operated in ambient temperature (25 ºC). The mobile phase
was composed by acetonitrile, methanol and a solution of triethylamine 0.3% adjusted to pH
4.0 with phosphoric acid 10% (6:3:1; v/v/v) in isocratic mode at a flow rate of 1 mL/min and
the sample injection volume was 20µL.
Calibration Standards
The stock solution of BTF reference standard was prepared in methanol. The working
standard solutions (25, 150 e 400 μg/mL) were obtained by the dilution of the stock solution
97
in the same solvent. This series was applied to spike skin samples during the validation. To
execute the permeation studies, solutions of 0.5, 3.0 and 8.0 μg/mL were obtained from the
dilution from the working solution with methanol, spiked with porcine skin as described for
linearity in Method Validation, and applied as the external calibration curve.
Skin Preparation
During transport from the slaughterhouse the fresh porcine ears were kept at 4 ºC.
After cleaning with water, skin samples (central region from the outer side of the auricle)
were excised by the use of scissors and a scalpel. Then all the skin was cut in round pieces to
be placed in the Franz diffusion cells. These pieces had the thickness measured with a caliper
and the range of thickness between 1.0 and 1.2 mm was accepted to be used in the
experiments (OECD, 2004). After that, they were packed in PVC film and aluminum foil,
than stored at -20 ºC and used within a month. The ears were obtained from a local
slaughterhouse and the following criteria were applied: they had to be from the same porcine
race, age between 4 and 6 months, white and the excision procedure had to be done before the
usual scalding of the animals. No skin with wounds, warts or hematomas was accepted.
Butenafine Hydrochloride Extraction Procedure
Porcine ear skin sliced in round pieces with 1.5 cm diameter (same internal diameter
that is in contact with the receptor media, of the Franz cell) had the dermis and epidermis
separated. The skin was placed in a water bath at 60 ºC for 1 minute and the layers were
separated with a scalpel. Then, the skin pieces were cut in small pieces, placed in tubes and
100 μL of a solution containing 5 mg/mL of BTF was carefully added on the skin. A weak
98
hand agitation was performed and after the solvent had evaporated, 5 mL of methanol was
added (final concentration of 100 μg/mL). As BTF is highly soluble in methanol, this was the
first and unique tested solvent. Five different series combining ultrasonic bath and vortex–
stirring were tested: 2 min of vortex–stirring followed by 5 min in ultrasonic bath, the same
series 2 times, the same series 3 times, just 10 min in ultrasonic bath and just 20 min in
ultrasonic bath. After the selection of the extraction procedures, a second extraction was
performed to the same skin layers to verify a possible residual presence of the drug.
Method Validation
To test linearity, standard plots were constructed with eight concentrations in the range
of 0.1-10 μg/mL of the drug prepared in triplicates. The final dilution of each volumetric flask
was done with methanol spiked with porcine skin according to the proportion obtained during
the permeation studies (round skin of 1.5 cm diameter cut in small pieces to each 5 mL of
diluent). The linearity was evaluated by linear regression analysis that was calculated by the
least square regression and by ANOVA for compliance of the linear model.
The quantification and detection limits were obtained based on signal-to-noise
approach. The background noise was obtained after injection of the blank, observed over a
distance equal to 20 times the width at half-height of the peak in a chromatogram obtained by
the injection of 3 μg/mL (intermediate concentration from the accuracy curve) of the reference
standard. The signal-to-noise ratio applied was 10:1 for the LOQ and 3:1 for the LOD. The
results were verified experimentally and the diluent was composed by methanol spiked with
skin according the proportion described in the linearity test. Therefore, a possible interference
of the skin on the LOD and LOQ was considered.
99
The repeatability was verified from five independent sample preparations in the same
day. The intermediate precision was tested by assaying freshly prepared sample solutions at
different concentrations in other day. Each day, rounded skins with 1.5 cm of diameter had the
dermis separated from the epidermis and they both were cut in small pieces and placed in
tubes. These layers were spiked with 100 μL of working standard solutions (25, 150 or 400
μg/mL) and after the methanol evaporation, 5 mL of methanol were added to obtain the
theoretical concentrations of 0.5 (first day), 3.0 and 8 μg/mL (second day). Precision was
reported as %R.S.D.
The accuracy was determined by the recovery of known amounts of BTF reference
standard added to the skin to verify the agreement between the measured and nominal
concentrations of the analytes in the spiked drug-free matrix samples. The results were
obtained from the three levels also assayed for repeatability and expressed as the percentage
of BTF reference standard recovered from the sample.
The specificity was assessed by comparing the chromatograms obtained from the
extraction solution of the skin in contact with pharmaceutical preparation, with the extraction
solution of the skin only and also with the extraction solution of the skin in contact with the
excipient ingredients of the formulations. The absence of interferences was verified in all
cases.
Application of the Method to in vitro Skin Penetration Studies
Prior to the use, the skin specimens were defrosted at ambient temperature and then
placed in the Franz–type diffusion cell (Hanson Research, Chatsworth, USA), with the
epidermis facing the donor compartment and the dermis facing the receptor compartment. The
nominal diffusion area of the Franz cell was 1,77 cm2 and the receptor volume contained 7 mL
100
of degassed water adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid 10%. As in our previous study the
drug showed stability in strong acid conditions (HCl 1M) for 6 days at room temperature, the
drug was stated as stable in this media (Barth et al, 2010). Butenafine hydrochloride
solubility in the receptor phase was determined, achieving sink conditions to have a high
capacity to dissolve and carry away the drug (USP et al, 2009a). One infinite dose of the
Brazilian or the American formulation (200 mg) was placed on the skin surface in the donor
chamber. At given times intervals (1h, 2h, 4h, 6h and 8h) aliquots of 1 mL were collected to
be analyzed and the same volume of receptor fluid was replaced. The receptor medium was
maintained at 37 ºC, in order to keep the skin surface at 32 ºC (the ambient temperature was
21 ºC) and magnetically stirred at 500 rpm. Eight replicates of the formulation plus two of
excipients ingredients were done to each product.
After eight hours of experiment, the skin was removed from the Franz diffusion cell
and the excess of formulation was removed with the help of a spatula followed by the
separation of the dermis from the epidermis using a scalpel. The skin layers were weighted
and BTF was extracted according to Butenafine Hydrochloride Extraction Procedure,
previously described.
The results are reported as means ± R.S.D. (n = 8). Data were statistically analyzed
using the t – test, after assuring the normal distribution. The level of significance was set at α
= 0.05.
Results and Discussion
Butenafine Hydrochloride Extraction Procedure
101
The results for the five different tested series combining ultrasonic bath and vortex –
stirring ranged from 90.57 to 107.94 % for the dermis and 89.95 to 97.52 % for the epidermis.
Although all the obtained values could be acceptable, the easiest procedure was not chosen, as
the spiking of the skin with the drug solution does not truly represent the complete penetration
of a drug, then the sequence of 2 min of vortex – stirring followed by 5 min in ultrasonic bath
executed 2 times was selected for the study. After the extraction of a skin penetration study, a
second extraction was performed with the same skin samples (two dermis and two epidermis)
and no drug was detected in the methanolic solution. This result confirms the efficiency of the
first extractive procedure.
Method Validation
Linearity, LOD and LOQ: over the concentration range of 0.1 – 10 μg/mL, the slope
and the intercept obtained from the three standard curves analyzed together were 22.613 and
0.3686, respectively, and the determination coefficient was 0.9999. The analysis of variance
revealed that the obtained results correspond to a linear regression (p<0.05) with adequate
fitting (p>0.05). Regarding the intercept, it was not significantly different from the theoretical
zero value (p>0.05). LOQ and LOD were 0.0684 and 0.0177 μg/mL, respectively.
Precision: repeatability and intermediate precision results are expressed as relative
standard deviations (%R.S.D.). The %R.S.D. values presented in Table 1 were low for both
the repeatability and the intermediate precision (%R.S.D. maximum 5.16% for epidermis in
the inter-day precision), demonstrating the adequate precision of the developed method for
penetration studies.
Accuracy: the data for accuracy were expressed in terms of percentage recoveries of
BTF from the samples. These results are summarized in Table 1. The mean recovery data
102
were within the range of 100.50 to 111.04% for the epidermis and in the range of 99.11 to
101.10 % for the dermis, in accordance to the literature recommendations of overall recovery
in the range of 85-115 % for bioanalytical methods (Causon, 1997; CDER/FDA, 2001; SCCP,
2006).
Table 1. Precision and Accuracy of the analytical method: BTF extracted from Epidermis and
Dermis.
Accuracy Intra-day precision (n=5)

Mean recovery (%) R.S.D. (%)
Day 1 - 0,5 μg/mL*
Epidermis 111.04 2.69
Dermis 101.10 3.70
Day 2 - 3.0 μg/mL
Dermis 99.67 2.02
Day 2 - 8.0 μg/mL
Dermis 99.11 1.35
Inter-day precision (n=14)

R.S.D. (%)
Epidermis 5.16
Dermis 2.48
* n=4: one sample of each layer in this day was lost during manipulation
Specificity: the analyses of the chromatograms obtained from the skin itself and from
extraction solution from the skin with excipient ingredients demonstrated the absence of
interference from the matrix with the BTF elution, as shown in Figure 2 and 3.
103
Figure 2 Chromatograms from: a) extraction solution from epidermis in contact with

formulation T eight hours after the permeation study, b) extraction solution from epidermis in
contact with the excipient ingredients from formulation L eight hours after the permeation
study, c) extraction solution from epidermis in contact with the excipient ingredients from
formulation T eight hours after the permeation study, d) BTF peak in the concentration of 4.32
μg/mL. The scale from the Y axis corresponds to the scale from chromatogram c.
Figure 3. Chromatograms from: a) extraction solution from dermis in contact with formulation
L eight hours after the permeation study, b) extraction solution from dermis in contact with
the excipient ingredients from formulation L eight hours after the permeation study, c)
extraction solution from dermis in contact with the excipient ingredients from formulation T
eight hours after the permeation study, d) BTF peak in the concentration of 1.20 μg/mL. The
scale from the Y axis corresponds to the scale from chromatogram c.
104
Method Application in a comparative cutaneous retention study
The application of this analytical method was demonstrated by the quantification of
BTF in both porcine skin layers samples (dermis and epidermis) and samples of the receptor
fluid compartment of diffusion cells after in vitro cutaneous penetration study. To perform
this experiment the two different formulations T and L containing BTF were used as donor
phase. The penetration experiment was carried out over 8 hours. The amount of BTF retained
in the skin layers was: 308.60 and 8.45 ng/mg of skin (T) and 225.88 and 14.14 ng/mg of skin
(L), for the epidermis and dermis, respectively. Another approach for exposing the results
related to the total amount of drug and skin is: 3.12 μg and 4.14 of BTF in 331.42 mg of
dermis (mean weight) for formulation T and L, respectively. In the epidermis the amount of
BTF detected was: 15.14 μg (T) and 14.56 μg (L) in a mean epidermis weight of 55.86 mg.
Two epidermis samples from formulation L where detected as outliers, according to the
Dixon’s Q Test (Burgess, 2005), and excluded from the data analysis.
The statistical interpretation, through the t-test, allowed to define if the amount of drug
was significantly different in the skin layers for the different formulations. The penetration in
the epidermis was not statistically different (p > 0.05) for them. However, in the dermis there
was a statistically significant difference between the penetrations of BTF from the semi-solids
(p < 0.05) and the higher penetration was achieved with formulation L. The graphical
representation of the results can be seen in Figure 4 and 5. Dermatophytosis normally occur in
the outermost layer of the skin, the epidermis (Weitzman and Summerbell, 1995; Crawford
and Hollis, 2007). Therefore, the antifungal action is exerted in this layer and it is desired that
the drug remains in this localization and does not penetrate to deeper tissues or achieve the
circulation.
105
450
400
350
300
250
L
T
200
150
100
50
0
Epidermis
Figure 4. Plots of the mean concentration of formulations L and T in the epidermis with the
respective standard deviations.
20
18
16
14
12
L
10
T
0
Dermis
Figure 5 Plots of the mean concentration of formulations L and T in the dermis with the
respective standard deviations.
Finally, the presence of BTF in the receptor compartment was detected in just one cell
of the formulation T. The drug quantity was low: under the LOQ at 4 hours of experiment and
at 6 and 8 hours the concentration was slightly over the LOQ, which after the calculation of
the 8 cells mean was unexpressive.
106
Conclusion
The developed performance test for butenafine hydrochloride from creams enclosing
the use of Franz diffusion cell with quantification of the drug in the main layers of the skin
and in the receptor compartment has the necessary characteristics for a good bioanalytical
method: reproducibility, reliability, ability to measure drug release from the finished dosage
form and capacity of measuring changes in drug release characteristics from the finished
product. Those changes may be related to active or inactive/inert ingredients in the
formulation, physical or chemical attributes of the finished formulation, manufacturing
variables, shipping and storage effects, aging effects, and other formulation factors critical to
the quality characteristics of the finished drug product (USP, 2009b).
In this context, the reverse phase LC method proposed was found to be simple, fast,
accurate, precise, linear and specific and it is a powerful tool to investigate the presence of
BTF in skin samples and in the receptor compartment after in vitro permeation/retention
studies. All the parameters meet the criteria of the FDA guidelines for method validation. Its
chromatographic retention time of 6.8 min allows the analysis of a large number of samples in
an adequate period of time.
The method applicability to permeation studies was proved through the evaluation of
two formulations: T and L and there were no significantly differences between the BTF
penetration in the epidermis, but in the dermis the difference was significantly (α = 0.05) and
no expressive drug permeation of both formulations was detected through porcine skin in vitro
during 8 h.
The developed method is important to a complete analysis of topical formulations and
to learn about the penetration profile of the drug in the cutaneous tissue, including the quantity
107
of active substance in the different layers of the skin and the flow from it to the systemic
circulation, which could cause toxic effects as the systemic safety of this drug is not known.
Acknowledgements
The authors wish to thank CNPq (Brazil) for the financial support, Brainfarma for
the provision of BTF reference standard and the Laboratory of Technological
Development (UFRGS) for using its circulating water-bath with magnetic-stirring.
108
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112
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES GERAIS
Discussão e Conclusões Gerais
A carência de literatura científica analítica sobre o antifúngico cloridrato de

butenafina e a sua introdução no mercado nacional em 2007 como medicamento de
venda livre, requerem o desenvolvimento de métodos de análise de domínio público
nacional, para que possam ser utilizados no controle de qualidade do insumo e do
medicamento.
Neste contexto, a presente pesquisa foi desenhada com o intuito de
desenvolver e validar métodos quantitativos para a análise do cloridrato de
butenafina na sua forma farmacêutica, avaliar a aplicabilidade destes métodos para
estudos de estabilidade, incluindo a determinação da cinética de degradação do
fármaco frente a condição de estresse e de desenvolver e validar método para
avaliar a penetração e permeação cutânea da BTF in vitro, empregando pele animal,
bem como avaliar a aplicabilidade do método na análise comparativa de duas
formulações presentes no mercado.
Primeiramente foram realizados testes para caracterizar a BTF substância de
referência, visando ao seu uso como padrão. Esses testes incluíram: solubilidade, IV
e DSC para a caracterização qualitativa. Já para sua caracterização quantitativa foi
desenvolvido método de titulação potenciométrica, explorando a característica de
base fraca da molécula. Adicionalmente foi desenvolvido método por CCD para
identificação do fármaco no creme.
A validação de método por CLAE, com a utilização de condições normais de
coluna (C8) e detector (UV/DAD) permitiu a análise qualitativa e quantitativa do
fármaco de maneira rápida e eficiente. Além disso, a exposição do fármaco a fatores
de estresse possibilitou a elucidação de fatores aos quais a molécula é susceptível e
a influência dos excipientes. O fármaco demonstrou ser sensível à luz UVC, ao meio
oxidativo e, na análise da formulação em solução, ao meio básico. As degradações
por oxidação mostraram-se mais intensas na análise da solução obtida do produto
farmacêutico do que no fármaco isoladamente. A eluição diferenciada do fármaco e
seus produtos de degradação garante a característica de método indicador de
estabilidade, sendo essencial para estudos futuros de isolamento e identificação de
produtos de degradação do fármaco, com o objetivo da análise de aspectos
toxicológicos e biológicos visando à manutenção da eficácia e segurança do produto
farmacêutico.
115
A determinação da cinética de degradação em condições fotolíticas, definida

como de primeira ordem, permitiu avaliar o grau de transformação durante o período
de estudo. A alta velocidade de degradação da BTF permitiu detectar acentuada
labilidade em condições fotolíticas, informação de extrema importância para a
produção, controle de qualidade, armazenamento e embalagem de matéria-prima e
forma-farmacêutica.
As tentativas de desenvolvimento de método por eletroforese capilar
representaram um conjunto de estratégias empregando diferentes modelos, CZE e
MECK, e considerando as variáveis críticas de cada técnica. Apesar do método por
MECK desenvolvido não ser específico frente aos excipientes da formulação,
impedindo seu uso para a forma farmacêutica, o método poderia ser validado para a
análise de matéria-prima.
Para uma completa avaliação de formulações de liberação tópica é importante

conhecer o perfil de penetração do fármaco no tecido cutâneo, incluindo a
quantidade de substância ativa presente nas diferentes camadas da pele e o fluxo
através dela para a circulação sistêmica, principalmente quando se trata de
molécula não administrada por via oral/sistêmica, fato do qual pode se depreender
sua baixa segurança sistêmica. Neste sentido, a adequação do método analítico
descrito por CLAE para a análise da penetração do fármaco em diferentes camadas
de pele suína foi assegurada, permitindo a avaliação in vitro da penetração e da
permeação cutânea. Na análise da matriz biológica o método mostrou-se
reprodutível, confiável, capaz de medir o fármaco liberado da formulação para o
tecido cutâneo e consequentemente de fornecer informações relevantes.
Após a validação do método bioanalítico, foi realizado estudo comparativo de

penetração cutânea de BTF em pele suína utilizando a célula de difusão de Franz e
empregando-se duas formulações: Tefin, presente no mercado brasileiro, e Lotrimin
Ultra®, disponível no mercado americano, e não foi encontrada diferença significativa
na penetração da BTF na epiderme. Já na derme a diferença encontrada entre as
concentrações foi significativa. No período de estudo de 8 horas não houve
permeação considerável do fármaco de ambas as formulações, uma vez que não foi
detectada BTF no fluído receptor.
116
De modo geral, os resultados desse trabalho descrevem: (i) metodologia

analítica indicativa de estabilidade por CLAE para a análise de BTF, bem como os
principais agentes aos quais o fármaco em solução é susceptível, (ii) cinética de
fotodegradação do fármaco frente à luz seguindo primeira ordem, (iii) estratégias
para o desenvolvimento de metodologia por EC e método para a análise da matéria-
prima, (iv) método para análise de BTF na pele suína e (v) comparação na
permeação / penetração cutânea do fármaco de duas formulações diferentes, sendo
que não foi detectada diferença significativa na retenção do fármaco na epiderme,
porém na derme esta diferença foi significativa.
117

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

METODOLOGIA ANALÍTICA APLICADA AO CONTROLE DE

ALINE BERGESCH BARTH

Porto Alegre, 2010.

METODOLOGIA ANALÍTICA APLICADA AO CONTROLE DE

Dissertação apresentada por ALINE

Orientadora: Profa. Dr. Nadia Maria Volpato

Profa. Dr. Cássia Virginia Garcia

Prof. Dr. Helder Ferreira Teixeira

Prof. Dr. Martin Steppe

B284m Barth, Aline Bergesch

Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa

1. Cloridrato de butenafina. 2. Antifúngicos. 3. Controle de qualidade

À Prof. Elfrides E. S. Schapoval pelo exemplo de vida e profissionalismo, essenciais

Aos professores Tércio Oppe e Célia Chaves pela disponibilidade e auxílios

Aos colegas do LEPCQ: Amanda, Bárbara, Cássia, Fernanda, Franciele, Gabriela,

Aos funcionários do Laboratório de Controle de Qualidade Farmacêutico: Alianise,

Ao Clésio Paim pela amizade, convívio e auxilio ao longo deste trabalho.

À amiga Rúbia Pereira pelo carinho e pelos momentos de descontração entre

Às colegas Alini e Letícia pela amizade e, principalmente, pelo incentivo.

Ao Vítor, Maximiliano e Diogo pela amizade e pela colaboração nos experimentos de

À amiga Bethânia Vargas pela colaboração nos experimentos de

À família Andres pela carinhosa acolhida e em especial ao Natan pelo amor,

Analytical Methodology Applied to the Quality Control of the Antifungal

Figura 1. Via de síntese do ergosterol e pontos de atuação de agentes antifúngicos..

Capítulo I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de método

Artigo submetido: Stability-indicating LC assay for butenafine hydrochloride in creams

Figure 1. Chemical structure of BTF. .........................................................................51

Figura 2.1. Diagrama esquemático do sistema de EC...............................................76

Capítulo III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato de

Artigo a ser submetido: A simple and rapid method to assess butenafine

Figure 1. Chemical structure of BTF. .........................................................................94

Tabela 1. Ensaios necessários para a validação de método analítico. .....................20

Capítulo I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de método

Tabela 1.1. Determinação da solubilidade da BTF SQR . .........................................38

Artigo submetido: Stability-indicating LC assay for butenafine hydrochloride in creams

Capítulo III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato de

Artigo a ser submetido: A simple and rapid method to assess butenafine

REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 7

CAPÍTULO I. Caracterização do padrão, desenvolvimento e validação de

CAPÍTULO II. Estudos para o desenvolvimento de metodologia por eletroforese

CAPÍTULO III. Validação de metodologia para a quantificação do cloridrato de

Manuscrito a ser submetido ao Biomedical Chromatography ............................92

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES GERAIS .............................................................. 113

Infecções fúngicas superficiais estão entre as doenças infecciosas mais

por dermatófitos espera-se que o fármaco se concentre na camada mais externa, já

Considerando o exposto, os objetivos gerais desta dissertação foram:

 Desenvolver e validar métodos quantitativos para análise do cloridrato de

 Avaliar a aplicabilidade da metodologia desenvolvida em estudos de

 Desenvolver e validar método para avaliar a penetração e eventual

Como objetivos específicos foram estipulados:

 Desenvolver e validar método por cromatografia líquida de alta eficiência

 Desenvolver e validar método por eletroforese capilar (EC) para análise

 Avaliar a especificidade e sensibilidade da metodologia desenvolvida na

 Identificar os principais fatores extrínsecos que promovem decomposição do

 Avaliar a aplicabilidade de CLAE como metodologia analítica para

 Determinar e comparar a penetração cutânea do cloridrato de butenafina

Micoses são infecções causadas por microfungos parasitas e ocupam lugar

A pele seca na camada mais externa desencoraja a colonização por

Micoses superficiais são doenças produzidas por fungos que se localizam

As infecções fúngicas superficiais podem ser divididas em dermatofitoses e

hipersensibilidade tardia, caracterizadas pela ação de macrófagos como células

Antifúngicos de uso sistêmico são geralmente administrados para o

As principais classes de antifúngicos tópicos incluem os polienos, azóis e as

Intermediária Não ** Não