TCC FINAL - Amanda

INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CURSO SUPERIOR DE AGRONOMIA
AMANDA GONÇALVES ALVES
ATIVIDADE ACARICIDA DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS A BASE DE Metarhizium

anisopliae (HYPOCREALES: CLAVICIPITACEAE) SOBRE Tetranychus urticae
(KOCH, 1836) (ACARI: TETRANYCHIDAE)
Colatina
2023
AMANDA GONÇALVES ALVES
ATIVIDADE ACARICIDA DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS A BASE DE Metarhizium

anisopliae (HYPOCREALES: CLAVICIPITACEAE) SOBRE Tetranychus urticae
(KOCH, 1836) (ACARI: TETRANYCHIDAE)
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à

Coordenadoria de Agronomia do Instituto Federal
do Espírito Santo – Campus Itapina, como requisito
parcial para obtenção do título de Engenheira
Agrônoma.
Orientador(a): Anderson Mathias Holtz
Coorientador(a): Thiago Rodrigues Dutra
Colatina
2023
(Biblioteca do Campus Itapina)
A474a Alves, Amanda Gonçalves.
Atividade acaricida de extratos enzimáticos a base de Metarhizium anisopliae

(hypocreales: clavicipitaceae) sobre Tetranychus urticae (Koch, 1836) (acari:
tetranychidae) / Amanda Gonçalves Alves. - 2023.
50 f. : il..
Orientador: Anderson Mathias Holtz

Coorientador: Thiago Rodrigues Dutra
TCC (Graduação) Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Itapina,

Agronomia, 2023.
1. Ácaros rajados. 2. Fungos entomopatogênicos. 3. Acaricidas. I. Holtz, Anderson

Mathias. II. Dutra, Thiago Rodrigues. III.Título IV. Instituto Federal do Espírito Santo.
CDD: 632.422
Bibliotecário/a: Júlia Schettino Jacob dos Santos CRB-ES nº 999
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus que vem cuidando dos meus passos, me guiando,
sustentando e iluminando minha jornada.
Agradeço imensamente, meus amados pais, Cenira e Joaquim. Vocês são

verdadeiros exemplos de dedicação, amor e perseverança. Através do apoio
incondicional que sempre me proporcionaram, pude trilhar esse caminho com paixão
e comprometimento.
Ao meu irmão, André, que não mede esforços em me ajudar durante as

adversidades da vida.
Aos meus queridos avós, que por meio de suas histórias e valores moldaram minha
visão sobre a agricultura e a valorização do trabalho no campo.
Jamais esquecerei o legado de nossas famílias.
Aos meus orientadores, Anderson e Thiago, gratidão por me confiar a

responsabilidade de trabalhar em um tema tão inovador. Agradeço pelas lições
acadêmicas e de vida que foram fundamentais para o meu crescimento.
Aos amigos e colegas do Laboratório, que de alguma forma contribuíram com esse
trabalho, em especial Kirk e Matheus, que além da ajuda, trouxeram alegria e leveza
aos dias cansativos.
As minhas amigas, Ayssan e Danielly, que sempre estiveram presente, me

apoiando, incentivando e compartilhando as alegrias e as dificuldades da vida.
A minha dupla da faculdade e da vida, Ana Clara, sua amizade ao longo desses
cinco anos tornaram meus dias mais felizes. Gratidão pelas inúmeras vezes em que
choramos de tanto rir. Agradeço pela paciência, compreensão e companheirismo
nos momentos de alegrias e principalmente nos de aflito.
Ademais, meus sinceros agradecimentos, a todos que de alguma forma contribuíram

para que este sonho se realizasse.
EPÍGRAFE
Seja forte e corajoso. Não se apavore nem

desanime, pois o Senhor, o seu Deus, estará
com você por onde você andar.
(Josué 1:9)
RESUMO
Os fungos entomopatogênicos se destacam como agentes de biocontrole, sendo a

patogenicidade desses microrganismos relacionada à secreção de enzimas durante o
processo de infecção do hospedeiro. O objetivo desse trabalho foi produzir extratos
enzimáticos do fungo entomopatogênico, Metarhizium anisopliae e aplicá-lo em
bioensaios com ácaro rajado (Tetranychus urticae) para avaliação acaricida. O estudo
foi realizado no Laboratório de Entomologia e Acarologia e no Complexo de
Laboratórios do IFES - Campus Itapina. O formulado comercial Metarril® (cepa E9) foi
utilizado para obtenção de conídios de Metarhizium anisopliae. O fungo foi cultivado
em 3 meios sólidos: farelo de trigo puro, farelo de trigo misturado com pó de tenébrio
e farelo de trigo misturado com azeite de oliva, por 4, 8 e 14 dias (9 tratamentos). Após
o tempo de incubação o substrato sólido foi diluído em água destilada, coado e
centrifugado, resultando em um sobrenadante. Os sobrenadantes foram
armazenados em frízer a 4°C. A atividade de protease e proteína total dos extratos
foram avaliadas. Para o teste de toxicidade, a solução foi diluída em água destilada
na proporção 1:1 e aplicada sobre adultos do ácaro, sendo cada tratamento composto
por 7 placas de Petri, com 12 indivíduos do ácaro por placa. As unidades
experimentais foram constituídas de discos de folhas de feijão de porco (4cm de
diâmetro), com algodão umedecido ao redor para evitar a fuga dos ácaros. A solução
foi aplicada de forma direta com o auxílio do aerógrafo modelo Alfa 2, conectado a um
compressor calibrado com pressão constante de 1.3 bar, sendo 1 mL da solução em
cada arena. O efeito acaricida foi avaliado 24, 48 e 72 horas após a pulverização das
soluções. Os dados de mortalidade foram submetidos à análise de Tukey a 5% de
significância pelo programa Sisvar (v.5.6). Os meios de cultivo contendo farelo de trigo
e farelo de trigo misturado com pó de tenébrio se mostraram bons substratos para
produção enzimática de Metarhizium anisoplie. O extrato enzimático de Metarhizium
anisoplie cultivado em farelo de trigo puro e misturado com pó de tenébrio, com 8 dias,
apresentaram alta atividade de protease e toxidade a Tetranychus urticae. Os
resultados mostraram que o extrato enzimático de Metarhizium anisoplie possui
potencial bioacaricida, podendo ser utilizado no manejo da praga.
Palavras – chaves: Ácaro rajado. Fungos entomopatogênicos. Bioacaricida.

ABSTRACT
The entomopathogenic fungi stand out as biocontrol agents, the pathogenicity of these
microorganisms correlates to the secretion of enzymes during the infection process of
the host. Therefore, the objective of this work was the elaboration of an enzymatic
extract from the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae for the
management of the spider mite (Tetranychus urticae). The study was conducted in the
Entomology and Acarology Laboratory and in the Laboratory Complex of IFES - Itapina
Campus. The commercial formulation Metarril® (strain E9) was used to obtain
Metarhizium anisopliae conidia. The fungus was cultivated in 3 solid media: pure wheat
bran, wheat bran mixed with insect meal, and wheat bran mixed with olive oil, for 4, 8
and 14 days (9 treatments). After the incubation time the solid substrate was diluted in
distilled water, strained and centrifuged, resulting in a supernatant. The supernatants
were stored in a refrigerator at 4°C. Protease activity and total protein of the extracts
were evaluated. For the toxicity test, the solution was diluted in distilled water in a 1:1
ratio and applied on adults of the mite, with each treatment consisting of 7 Petri dishes,
with 12 individuals of the mite per dish. The experimental units consisted of discs of
pork bean leaves (4cm diameter), with moistened cotton around them to prevent the
mites from escaping. The solution was applied directly using an Alfa 2 airbrush,
connected to a calibrated compressor with a constant pressure of 1.3 bar, with 1 mL
of the solution in each arena. The acaricidal effect was evaluated 24, 48, and 72 hours
after spraying the solutions. The mortality data were submitted to Tukey's analysis at
5% significance using the Sisvar (v.5.6) program. The culture media containing wheat
bran and wheat bran mixed with insect meal proved to be good substrates for
Metarhizium anisoplie enzyme production. The enzymatic extract of Metarhizium
anisoplie cultivated in pure wheat bran and mixed with insect meal, at 8 days, showed
high protease activity and toxicity to Tetranychus urticae. The results showed that the
enzymatic extract of Metarhizium anisoplie has bioacaricidal potential and can be used
in pest management.
Key-words: Spotted Mite. Entomopathogenic Fungus. Bioacaricide.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Localização geográfica do IFES – Campus Itapina...................................22
Figura 2 – Placa de padronização de Tetranychus urticae em folha de Canavalia

ensiformis...................................................................................................................24
Figura 3 – Frasco Erlenmeyer com Metarhizium anisopliae cultivado por sete

dias.............................................................................................................................25
Figura 4 – Frascos Erlenmeyer contendo meio sólido fermentado com 4 dias (A),
Frascos Erlenmeyer contendo meio sólido fermentado com 8 dias (B) e Frascos
Erlenmeyer contendo meio sólido fermentado com 14 dias (C).................................26
Figura 5 – Pasta homogeneizada do meio solido (A), pasta espremida com pano de
nylon (B), extrato bruto antes da centrifugação (C), extrato já centrifugado sem
precipitado (D)...........................................................................................................27
Figura 6 – Arenas montadas e extratos enzimáticos diluídos (B), pulverização (A)...28
Figura 7 – Atividade de protease dos extratos enzimáticos de Metarhizium anisoplie

produzidos em diferentes condições de cultivo. ........................................................30
Figura 8 – Proteína total dos extratos enzimáticos de Metarhizium anisoplie produzidos

em diferentes condições de cultivo.............................................................................32
Figura 9 – Mortalidade de Tetranychus urticae obtida pelos extratos enzimáticos de

Metarhizium anisoplie cultivado em diferentes meios de cultivo. ................................34
Figura 10 – Tetranychus urticae 72 horas após tratamento com enzimas obtidas a

partir de extratos enzimáticos de Metarhizium
anisoplie.....................................................................................................................35

Metarhizium anisoplie cultivado em diferentes meios de cultivo e tempo....................36
LISTA DE SIGLAS
ABRASFRUTA - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DOS PRODUTORES

EXPORTADORES DE FRUTAS E DERIVADOS
BDA – AGAR BATATA DEXTROSE
B.O.D – DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO
FAO – FOOD END AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS
IBGE - INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA
INCA - INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 11
2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 13
2.1 GERAL............................................................................................................ 13
2.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................ 13
3 REFERENCIAIS TEÓRICOS ........................................................................... 14
3.1 FRUTICULTURA NO ESPÍRITO SANTO .......................................................... 14
3.2 IMPORTÂNCIA DO ÁCARO RAJADO PARA A FRUTICULTURA .................... 16
3.3 FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS NO CONTROLE DO ÁCARO RAJADO . 18
3.4 ENZIMAS NO CONTROLE DE PRAGAS ......................................................... 20
4 METODOLOGIA ............................................................................................... 22
4.1 CRIAÇÃO DE Tetranychus urticae ................................................................. 22
4.2 UNIDADES EXPERIMENTAIS ....................................................................... 23
4.3 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ............................................................................ 24
4.3.1 Suspensão de conídios e isolamento de Metarhizium anisopliae E9 ...... 24
4.3.2 Meios de cultivo ............................................................................................ 25
4.2.3 Fermentação em estado sólido e isolamento das enzimas ........................ 25
4.4 ATIVIDADE ENZIMÁTICA .............................................................................. 27
4.4.1 Determinação de Proteína Total .................................................................. 27
4.4.2 Protease......................................................................................................... 28
4.5 AÇÃO ENZIMÁTICA SOBRE Tetranychus urticae ......................................... 28
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................... 30
5.1 PROTEASE .................................................................................................... 30
5.2 PROTEÍNA TOTAL ......................................................................................... 32
5.3 EFEITO ACARICIDA SOBRE Tetranychus urticae ........................................ 33
6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS......................................................................................................... 39
11
1 INTRODUÇÃO
Dentre os artrópodes praga, o ácaro rajado, Tetranychus urticae Koch 1836 (Acari:
Tetranychidae), se destaca entre as espécies de maior resistência aos agrotóxicos,
provavelmente devido ao uso indiscriminado de acaricidas associado à alta taxa
reprodutiva, reprodução haplo-diplóide e ciclo de vida curto (PRAC, 2021; GARRIDO
& BOTTON, 2021).
O ácaro T. urticae é uma espécie fitófaga de ataque severo e altamente polífaga,

estando entre os três principais ácaros-praga do Brasil, sendo relatado causando
danos a várias hospedeiras de importância econômica. Destacando-se as frutíferas,
como mamão (Carica papaya L.), morango (Fragaria Ananassa Duch) e uva (Vitis
vinifera L.) (OLIVEIRA et al., 2016; MARTINS et al., 2017; WYBOUW et al., 2019;
MICHEREFF FILHO et al., 2020)
A fruticultura, assim como outras cadeias do agronegócio mundial, encontra-se em

constante expansão (BORNAL et al., 2021). Diante deste cenário, o Brasil se destaca
como 3° maior produtor mundial de frutas frescas (FAO, 2022), ultrapassando a
produtividade de 40 milhões de toneladas, movimentando quase 1 bilhão de dólares
em exportações em 2022 (ABRASFRUTAS, 2023), sendo o sudeste e nordeste as
principais regiões produtoras do Brasil (LIMA et al., 2021).
Na região sudeste, o estado do Espírito Santo lidera o ranking de maior produtor e

exportador de mamão do País, exportando no ano de 2022 mais de 40 mil toneladas
da fruta, correspondendo a 49% da exportação brasileira (BRASIL, 2022; IBGE, 2023).
Além disso, o cultivo de morango e uva no estado tem aumentado consideravelmente
nos últimos anos, possuindo grande contribuição para renda dos agricultores
familiares e para o agroturismo da região serrana do estado (MELLO et al., 2018;
ANTUNES et al., 2021).
Nesse contexto, o ácaro rajado torna-se um problema para a fruticultura capixaba,

pois o seu ataque reduz a capacidade fotossintética da planta levando a necrose e a
perfuração do limbo foliar, resultando na queda prematura das folhas, da
produtividade e perda da qualidade dos frutos (CASTILHO et al., 2022).
12
Dentre os métodos de controle utilizados no manejo de pragas, destaca-se os

químicos sintéticos (RODRIGUES et al., 2022). Todavia, a utilização indiscriminada
dos agrotóxicos contribui para o desenvolvimento de populações ainda mais
problemáticas (ZANARDI et al., 2018; GOMES, 2019). Nesse contexto, o ácaro rajado
é relatado sendo resistente a mais de 90 princípios ativos, o que o torna o seu controle
cada vez mais desafiador (ASSOUGUEM et al., 2022).
Diante disso, políticas de incentivo a agricultura sustentável visam a redução e a

substituição dos agrotóxicos (COLETO et al., 2021). Dentre as alternativas utilizadas
no manejo de pragas, o controle biológico se destaca, pois tem como princípio a
manipulação de inimigos naturais a fim de promover o equilíbrio populacional, visando
a sustentabilidade (PARRA, 2019).
Neste cenário, os fungos entomopatogênicos ganham destaque devido à sua alta

virulência, baixa ou nenhuma toxicidade para os seres humanos e o ambiente. Esses
fungos demonstram atividade inseticida e acaricida contra diversas pragas agrícolas
(BORGHI et al., 2018; MASCARIN et al., 2019; MORO et al., 2020; ALMEIDA et al.,
2021; ANDRADE & RANGEL, 2021).
O fungo Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae) está entre um dos

principais entomopatógenos utilizados, inclusive apresentando eficiência no manejo
de T. urticae (VENZON et al., 2021; CUA BASULTO et al., 2022). Apesar dos fungos
apresentarem alta taxa de infecção, sua eficiência depende de microclimas
específicos, incluindo alta umidade, temperatura e radiação solar baixa, restringindo
as possibilidades desse manejo (MORA, CASTILHO & FRAGA, 2016; RIBEIRO et al.,
2019).
A virulência dos fungos entomopatogênicos correlaciona-se à secreção de enzimas

que degradam estruturas dos hospedeiros durante o processo de penetração e
infecção (ALTINOK; ALTINOK & KOCA, 2019). Porém pesquisas relacionadas a
eficiência desses compostos usados isoladamente ainda são incipientes.
Portanto, propõe-se o desenvolvimento de bioacaricida enzimático a partir de

Metarhizium anisopliae para manejo de Tetranychus urticae em condições de
laboratório com temperatura e fotofase controladas.
13
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Produzir extrato enzimático a partir de fungo entomopatogênico com ação bioacaricida

contra Tetranychus urticae.
2.2 ESPECÍFICOS
● Produzir extrato enzimático a partir de fungo entomopatogênico Metarhizium

anisopliae;
● Determinar as atividades de protease e proteína total presentes nos extratos
enzimáticos produzidos pelo fungo Metarhizium anisopliae;
● Avaliar a mortalidade de adultos de Tetranychus urticae sob tratamento com

extratos enzimáticos de Metarhizium anisopliae;
14
3 REFERENCIAIS TEÓRICOS
3.1 FRUTICULTURA NO ESPÍRITO SANTO
A fruticultura tem se destacado nas atividades agrícolas capixabas, ampliando as

áreas de cultivo e apresentando grande potencial socioeconômico, tornando-se opção
de diversificação de renda e contribuindo para permanência da população rural no
campo, em especial a agricultura familiar (SOUZA; FORNAZIER & PONCIANO,
2020). No âmbito do agronegócio do Espírito Santo, a fruticultura apresenta uma
relevância significativa, consolidando-se como uma das principais atividades agrícolas
no estado (IBGE, 2023).
Dentre as frutíferas cultivadas no Espírito Santo, a cultura do mamão possui grande

importância socioeconômica, devido ao alto nível tecnológico usado na implantação
dos sistemas de cultivo, bem como a demanda por grande mão de obra e a alta
produtividade, correspondendo a quase 15% do valor bruto da produção agropecuária
do estado (GALEANO, VENTURA & MARTINS, 2021). Além disso, o Espírito Santo
se destaca não apenas como o maior produtor nacional de mamão, mas também
superando a produtividade média nacional, colhendo em média 60 toneladas por
hectare (IBGE, 2020; LANDAU & SILVA, 2020).
O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma frutífera tropical pertencente à família

Caricaceae, originária da América Central e do Sul de grande valor econômico e
nutricional, sendo cultivado em diversas regiões do mundo, principalmente em climas
quentes e úmidos, devido ao seu fruto comestível e rico em nutrientes (DA SILVA et
al., 2022). O mamoeiro apresenta caule único e herbáceo e as folhas são grandes,
lobadas e alternas, dispostas na parte superior do caule. O fruto, produto de principal
interesse econômico, é uma baga alongada, de coloração alaranjada, com polpa
macia e suculenta e numerosas sementes pretas envoltas por um arilo gelatinoso. O
mamoeiro possui diversas aplicações nutracêuticas e farmacológicas, devido alto teor
de vitamina C, vitamina A e betacaroteno, substâncias que apresentam atividade
antioxidante e anti-inflamatória (DA SILVA et al., 2022).
A produção de mamão no Espírito Santo se concentra na região norte do estado,

apesar de vários municípios apresentarem aptidão para o cultivo da espécie. O fruto
15
é cultivado principalmente nos municípios de Pinheiros, Pedro Canário, Linhares,

Montanha e São Mateus, localizados na região do Rio Doce e na região nordeste do
estado (GALEANO, VENTURA & MARTINS, 2021).
Já o morangueiro (Fragaria ananassa Duch.), pertencente à família Rosaceae, tem

um ciclo de vida curto em relação a outras frutas. Trata-se de uma planta perene e
rastejante, que se reproduz vegetativamente por estolões. O morango é um
pseudofruto carnoso e suculento formado pela hipertrofia do receptáculo floral
(NUNES & NOVELLO, 2021).
O cultivo do morangueiro vem se destacando nos últimos anos no Espírito Santo,

sendo produzido culturalmente na região serrana do estado, impulsionando o
agroturismo rural e a agroindústria, agregando renda as famílias capixabas
(GALEANO et al., 2022). O Espírito Santo está entre os cinco principais estados
produtores de morango, além disso a fruta está entre uma das mais apreciadas pelos
consumidores (ANTUNES & JUNIOR, 2019). Isso se dá devido à elevada capacidade
antioxidante e aos seus possíveis efeitos benéficos para a saúde, o morango é
classificado como um alimento funcional, pois possuem os flavonoides, ácidos
fenólicos e a vitamina C, que são os responsáveis pelas propriedades nutracêuticas
presente neste pseudofruto, que incluem ação anticancerígena e anti-inflamatória
(NUNES & NOVELLO, 2021).
Todavia, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa (2019) o

morango está entre as hortaliças com maiores índices de resíduos de agrotóxico no
Brasil. Além dos níveis de resíduos acima do limite permitido, a Anvisa também
constata a presença de resíduos de ingredientes ativos não liberados para cultura,
entre eles o acaricida com princípio ativo Metamidofós (organofosforado), acaricida
utilizado para controle de ácaro rajado na cultura de algodão e soja, mas banido desde
2012 devido ao alto risco a saúde humana e a segurança ambiental (INCA, 2023;
RIBEIRO et al., 2021).
A videira (Vitis spp. L) é uma planta trepadeira da família Vitaceae, sendo as espécies
Vitis vinifera L. e Vitis labrusca L. as de maior importância agronômica. A fruta é uma
baga oval, com ou sem semente, que pode ter diferentes cores e tamanhos,
16
dependendo da variedade, sendo as bagas sem sementes as mais aceitadas no

mercado in natura (DE SOUZA LEÃO, 2021). A uva, além de saborosa é rica em
compostos fenólicos e taninos, que apresentam atividade antioxidante, anti-
inflamatória e anticancerígena, fatores que aumentam o interesse dos consumidores
pela fruta (AIRES, MODESTO & SANTOS, 2021).
No Brasil a viticultura se destaca, com cerca de 75 mil hectares em produção,

totalizando mais de 1,7 milhões de toneladas em 2021, dos quais cerca de 76 mil
toneladas foram exportadas in natura e o restante atenderam o mercado interno de
frutas frescas e agroindústria de vinhos e sucos (IBGE, 2021; ABRASFRUTAS, 2023).
As principais regiões produtoras de uva se concentram na região Sul, sudeste e
nordeste do País.
Ainda que incipiente no Espírito Santo, a viticultura apresenta grande potencial

econômico para a agricultura familiar, principalmente para uvas de mesa, produção
de vinhos finos e sucos, fortalecendo o agroturismo da região serrana (MELLO &
MACHADO, 2022). Porém ainda é necessário a implantação de novas tecnologias
para impulsionar a produtividade dos vinhedos capixabas (SOUSA et al., 2021).
Ambas as frutíferas citadas, são conduzidas em sistema de monocultivo e apresentam

uma grande dependência de agrotóxicos para manejo fitossanitário das lavouras,
principalmente para o controle de T. urticae. Nesse contexto, o incremento de novas
tecnologias na fruticultura faz-se necessário (CASTILHO et al., 2022).
3.2 IMPORTÂNCIA DO ÁCARO RAJADO PARA A FRUTICULTURA
O ácaro rajado, Tetranychus urticae, é uma espécie fitófaga generalista de ataque

severo, sendo relatado causando danos a várias culturas de importância agrícola em
todo mundo. Ao alimentar-se do tecido das folhas reduz o potencial fotossintético da
planta podendo levar a morte de hospedeiros jovens, além de reduzir
significativamente a produtividade de plantas adultas (CASUSO; SMITH & LOPEZ,
2020).
17
A espécie Tetranychus urticae demonstra uma preferência pela face abaxial das
folhas do seu hospedeiro, onde realiza o ataque em ambas as faces. Esse ácaro
rajado é conhecido por causar amarelecimento do limbo foliar, seguido por necrose e
queda prematura das folhas. Além disso, essa espécie produz uma quantidade
significativa de teias que servem para proteger seus ovos e ninfas, atuando como uma
barreira física contra predadores e até mesmo contra acaricidas de contato (MARTINS
et al., 2016).
O ciclo da espécie é rápido, ocorrendo em cerca de 8 dias, podendo variar de acordo

com as condições edafoclimáticas, principalmente em altas temperaturas. A fase de
ovo dura em média 3 dias, larval cerca de 4 dias e pré-oviposição 1 dia. A fêmea vive
em média 30 dias e ovoposita cerca de 100 ovos durante seu ciclo (CASUSO, SMITH
& LOPEZ, 2020).
O pico da infestação ocorre nos períodos de baixa umidade e altas temperaturas,

porém quando as temperaturas são reduzidas a fêmea da espécie possui a
capacidade de realizar a diapausa, abandonando a planta hospedeira e se protegem
em rachaduras, no solo ou estruturas da estufa, quando as temperaturas voltam a
subir, o ácaro retorna as atividades (CABI, 2021).
Devido o rápido desenvolvimento da praga e a facilidade em se adaptar a vários

hospedeiros, o ácaro rajado se tornou ameaça a produtividade de inúmeras culturas
de importância agrícola. Na cultura do mamão, T. urticae é relatado como praga-chave
visto que reduz o potencial fotossintético da planta, podendo causar redução da
produtividade, além de promover a queda prematura das folhas, expondo os frutos a
insolação comprometendo a qualidade das bagas (OLIVEIRA & MEISSNER FILHO,
2021).
De acordo com Bernardi et al. (2015) infestações de T. urticae quando severas pode
reduzir em até 80% a produtividade do morangueiro. Há relatos que infestações da
mesma praga, geralmente nos períodos mais secos do ano, causa severa desfolha
em vinhedos, além do murchamento das bagas comprometendo a qualidade do
produto a ser comercializado (IGLESIAS, 2018).
18
Geralmente, para ambas as culturas citadas, o controle de T. urticae faz-se por meio
de acaricidas sintéticos (CACHAGO LLAMATUMBI, 2019), porém devido uso
indiscriminado de agrotóxicos nas lavouras e a rápida capacidade reprodutiva da
espécie, desde o século XX há registros de populações de ácaro rajado resistente a
diferentes princípios ativos presentes nos acaricidas utilizados nas lavouras
(BERNEDO, 2021), inclusive de produtos que não são recomendados as culturas,
colocando em risco a segurança alimentar e ambiental, além de expor os agricultores
a altos níveis de substâncias toxicas a saúde (PESSOA et al., 2022).
Portanto, o manejo integrado de pragas torna-se crucial para o controle de T. urticae,

visto que trabalha diversas técnicas que reduzem a população dos indivíduos nas
lavouras associando manejo cultural, químico e biológico.
3.3 FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS NO CONTROLE DO ÁCARO RAJADO
Dentre as alternativas utilizadas no manejo de T. urticae o controle biológico tem se

destacado. O controle biológico de pragas consiste na manipulação de inimigos
naturais, com intuito de manter a população da praga abaixo do nível de controle
(PARRA et al., 2018). Atualmente, há o crescente uso de tecnologias voltadas ao
biocontrole, visando minimizar o uso de agrotóxicos nas lavouras, assumindo papel
de importância em programas de manejo integrado de pragas (EMBRAPA, 2018).
O controle biológico aplicado inclui o uso de parasitoides, insetos/ácaros predadores

e microrganismos entomopatogênicos, como fungos, vírus e bactérias. Dentre eles os
fungos entomopatogênicos são os mais utilizados atualmente, visto que infectam os
artrópodes diretamente, por meio da penetração do exoesqueleto exercendo
diferentes mecanismos de ação, tornando impossível o desenvolvimento de
resistência pelo hospedeiro (OLIVEIRA et al., 2019).
Os fungos possuem ampla distribuição no meio ambiente, estando presentes no solo,

em simbiose com as plantas e na água (MORA, CASTILHO & FRAGA, 2016).
Atualmente, os fungos mais utilizados no controle biológico de pragas são Beauveria
spp e Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin, apresentando ampla gama de
hospedeiros (PINHEIRO et al., 2020).
19
Nesse contexto, várias pesquisas comprovam a efetividade de Beauveria bassiana

(Bals.) Vuill sobre diversos organismos pragas, como controle de mosca branca
(Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae)) na cultura da soja (OLIVEIRA
et al., 2018) e eficiência no manejo de Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleoptera:
Curculionidae) na cultura da banana, causando 80% de mortalidade dos indivíduos
(MORAN, 2021), entre outros.
O fungo M. anisopliae também demonstra uma eficiência notável no manejo de

pragas. Foi observado que ele é capaz de infectar espécies de Tetranychus
ogmophallos (Acari: Tetranychidae), resultando em uma taxa de mortalidade de 92%
(BARBOSA et al., 2018). Além disso, em estudos envolvendo o fungo associado a
Beauveria bassiana, observou-se sua eficácia no controle de Planococcus citri (Risso)
(Hemiptera: Pseudococcidae), mostrando-se efetivo em ambos os tratamentos (LIMA,
2021), além de outras espécies de pragas.
O efeito acaricida de M. anisopliae é relatado para várias espécies pragas, causando

mortalidade e redução da taxa de fecundidade de fêmeas de Tetranychus
ludeni (Zacher) (Acari: Tetranychidae) (PEREIRA et al., 2019) causando até 86% de
mortalidade em condições de laboratório (CUA BASULTO et al., 2022).
A patogenicidade do fungo está diretamente ligada a virulência, ou seja, a intensidade

do dano causado aos insetos, dependendo da interação entre a cepa, ambiente e
hospedeiro (SUJII et al., 2020). Os fungos podem infectar os artrópodes de forma
direta por meio dos espiráculos, ânus, sifão respiratório, tarso e membranas
intersegmentais do abdome e principalmente pelo exoesqueleto, por meio de
liberação de compostos durante a adesão e penetração (SUJII et al., 2020).
A cutícula é uma estrutura que compõem o exoesqueleto dos artrópodes e tem como
função a proteção da epiderme dos indivíduos. A cutícula é composta pela epicutícula
e pró-cuticula. A epicutícula é a estrutura mais externa, fina e composta por proteínas
e ceras que tem como função a impermeabilidade do tegumento dos indivíduos. Já a
pró-cuticula é mais espessa e dividida em duas camadas, uma mais rígida para
proteção contra dados físicos e outra mais interna, mole e elástica, ambas são
quimicamente semelhantes sendo compostas por proteínas e quitina, mas na
20
exocuticula a acréscimo de polifenóis responsáveis pela dureza do tegmento, porém

encontra-se ausente nas articulações e ao longo da linha de ecdiase
(FLERCHTMANN, 1975; SCHMID-HEMPEL, 2005).
Apesar da cutícula servir como barreira protetora para os indivíduos, desde o processo
de adesão, os fungos iniciam o processo de liberação de enzimas líticas, responsáveis
pela hidrólise de componentes presentes na cutícula. Apesar dos fungos
apresentarem uma taxa de infecção alta, a sobrevivência desses organismos depende
diretamente de microclimas específicos, incluindo alta umidade, temperatura e
radiação solar baixas, restringindo as possibilidades desse manejo (MORA,
CASTILHO & FRAGA, 2016; OLIVEIRA et al., 2016).
3.4 ENZIMAS NO CONTROLE DE PRAGAS
O sucesso dos fungos entomopatogênicos está associada a capacidade de secretar

toxinas e enzimas catalizadoras de quitina, lipídeos e proteínas presentes no
exoesqueleto dos hospedeiros (FREITAS, 2018). As enzimas envolvidas no processo
da catálise da degradação de componentes da cutícula protetora de insetos têm sido
identificadas como determinantes na infecção de insetos por fungos
entomopatogênicos (AGUIAR, 2020).
A lipase é o primeiro grupo de enzimas a ser produzido logo após a aderência do

esporo a cutícula. Essas enzimas hidrolisam os lipídeos e lipoproteínas presentes na
epicutícula, além de suportar a adesão dos esporos em germinação, aumentando as
interações hidrofóbicas entre fungo e superfície da cutícula. Quando as lipases
concluem a degradação da cutícula o fungo produz grande quantidade de proteases
(WIERMANN, 2022).
As proteases são enzimas líticas que degradam as proteínas presentes na cutícula do

hospedeiro levando a exposição das fibrilas de quitina (LITWIN, NOWAL &
RÓZALSKA, 2020). As proteases, cuja principal função é hidrolisar as proteínas da
cutícula, também estão relacionadas a inativação de proteínas antifúngicas
produzidas na epiderme dos insetos (WIERMANN, 2022).
21
Após a exposição das fibrilas de quitina, outra enzima importante, entra em ação, as
quitinases, elas vão variar de acordo com o local de ação na molécula de quitina,
sendo endoquitinases e exoquitinases. Além das enzimas citadas, alguns trabalhos
relatam a secreção de outros compostos importantes na patogênese dos fungos
(LITWIN, NOWAK & RÓZALSKA, 2020). A trealase, enzima que não atua sobre a
quitina do hospedeiro, é relatada atuando sobre a hemolinfa dos indivíduos, sendo
que inativação dessa enzima específica reduz a patogenicidade de alguns fungos,
como Metarhizium acridum (LI & XIA, 2022).
As toxinas são outro grupo de compostos secretados pelos fungos que apresentam
grande influência em sua toxicidade sobre o hospedeiro (PENG et al., 2022). Os
metabólitos secundários secretados pelos fungos após o processo de penetração vão
depender da cepa do microrganismo, como por exemplo as destruxinas secretadas
pelos fungos do gênero Metarhizium (YIN et al., 2021). As dextruxinas são conhecidas
pela alta toxicidade a pragas agrícolas, por meio da inibição da imunidade do
hospedeiro (WANG et al., 2023).
O número de pesquisas acerca da biotecnologia por trás das enzimas fúngicas vem
crescendo na atualidade (SHAHEEN, SALEM & FOUDA, 2021). Pesquisas com
diferentes meios de cultura para indução enzimática vem sendo testados,
apresentando grande potencial para produção de enzimas fúngicas (QUEIROZ &
SOUZA, 2020; VIVEKANANDHAN et al., 2022). Extratos enzimáticos produzidos a
partir de culturas sólidas causaram redução de peso e mortalidade em Diatraea
saccharalis (SANTOS, 2019). Visto isso, estudo das enzimas secretadas durante o
processo de infeção do hospedeiro faz-se necessário.
Portanto, formulações de enzimas e metabólitos secretados por fungos

entomopatogênicos são vantajosos por não dependerem da sobrevivência do fungo
no ambiente, atuando diretamente sobre o organismo alvo. Contudo, há poucos
estudos sobre a toxicidade dos extratos enzimáticos sobre insetos e ácaros-praga
sendo necessárias pesquisas sobre essa tecnologia.
22
4 METODOLOGIA
Os experimentos foram conduzidos simultaneamente no Laboratório de Entomologia

e Acarologia e no Complexo de Laboratórios do Instituto Federal do Espírito Santo,
IFES - Campus Itapina, situado no município de Colatina – ES (19° 32’ 22”S 40° 37’
50”W) (Figura 1).
Figura 1 – Localização geográfica do IFES – Campus Itapina.
Fonte: Marchiori, 2022
4.1 CRIAÇÃO DE Tetranychus urticae
A criação de T. urticae foi estabelecida a partir de colaboração de exemplares cedidos

pelo Laboratório de Entomologia da UFES – Campus Alegre.
Para a preparação das arenas, folha de “feijão de porco” (Canavalia ensiformis) foram
coletadas em plantas isentas de agrotóxicos, cultivadas em casa de vegetação do
IFES – Campus Itapina, higienizadas com solução pré-elaborada em água destilada
com hipoclorito de sódio a 5% e colocadas sobre placas de Petri (14,0 x 1,5 cm).
Algodão umedecido foi adicionado no fundo e ao redor da folha de “feijão de porco”
para manter a sua turgidez e evitar a fuga dos ácaros. As Placas de Petri foram
mantidas em câmeras climatizadas do tipo B.O.D. à 25±1ºC, UR de 70±10% e fotofase
de 12h. A manutenção da criação foi realizada semanalmente, sendo os adultos de T.
23
urticae transferidos para novas Placas de Petri a cada manutenção com auxílio de
pincel de ponta fina (Figura 01).
4.2 UNIDADES EXPERIMENTAIS
As unidades experimentais foram compostas por uma placa de Petri (10,0 x 1,2cm),
contendo algodão umedecido com água destilada sobreposta com discos de folha de
“feijão de porco” (Canavalia ensiformis) com cerca de 4 cm de diâmetro, delimitadas
por algodão umedecido para manter a turgescência da folha e evitar a fuga dos
ácaros, as arenas foram mantidas em câmaras climatizadas do tipo B.O.D., à
temperatura de 25 ± 1 ºC, umidade relativa 70 ± 10 % e fotofase de 12 horas.
Para a obtenção dos ácaros na fase adulta, foram transferidas 10 fêmeas adultas e 1
machos para placas de Petri (14,0 x 1,5 cm) contendo algodão umedecido com água
destilada sobreposta com folhas de “feijão de porco” previamente cortadas com
tamanho correspondente a placa de Petri, delimitadas por algodão umedecido para
manter a turgescência da folha e evitar a fuga dos ácaros. Os ácaros foram mantidos
por 24 horas, nas condições descritas anteriormente, para obtenção de ovos com
idade igual (Figura 2). Após esse período os adultos foram retirados e os ovos
mantidos em condições adequadas por aproximadamente 14 dias, tempo necessário
para conclusão da fase imatura da espécie (ovo – adulto), dessa forma foi obtido
indivíduos com idade e fase de desenvolvimento padronizada, com até 5 dias de fase
adulta. Após esse período 12 fêmeas adultas de T. urticae foram transferidos para
arena, montada conforme descrito anteriormente.
Figura 2 – Placa de padronização de Tetranychus urticae em folha de Canavalia

ensiformis
24
Fonte: Elaboração própria.
4.3 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA
4.3.1 Suspensão de conídios e isolamento de Metarhizium anisopliae E9
Conídios de Metarhizium anisopliae cepa E9 foram obtidos do produto comercial

Metarril®. Os conídios foram ressuspendidos em água destilada estéril para
preparação da suspensão de esporos. Utilizando-se 1 grama do formulado comercial
(1,39 x108 conídios viáveis) para 10 mL de água destilada esterilizada. 200 µL da
solução foi adicionada a placa de petri contendo PDA para isolamento da cepa de
Metarhizium anisopliae. O processo foi realizado em cabine de segurança biológica,
sob condições estéreis. As placas foram mantidas em B.O.D a 28 ± 1ºC, umidade
relativa de 70% ± 10 e 24 horas de escuro, por sete dias. Verificados esporulações
com outra coloração, diferente da verde, era feito novo isolamento a partir de pontos
em que a placa apresentava apenas esporulação verde, característica do fungo. Esse
processo foi realizado até não ser observado mais a presença de contaminantes,
Após o processo de isolamento da cepa, os esporos provenientes das placas de
cultivo foram replicadas em tubos de ensaio inclinados contendo o mesmo meio de
cultivo, e posteriormente replicado no arroz polido, visto que o mesmo apresenta maior
taxa de esporulação que as placas e o tubo (Figura 3).
7 mL de água foram adicionadas aos tubos de ensaio inclinado, realizou-se agitação

manual por 1 minuto, retirou-se a alíquota de 1,5 mL da suspensão de conídios
25
adicionando sobre frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 10 gramas de arroz e 5

mL de água. Os frascos foram mantidos em B.O.D a 28 ± 1ºC, umidade relativa de
70% ± 10 e 24 horas de escuro, por sete dias.
Figura 3 – Frasco Erlenmeyer com Metarhizium anisopliae cultivado por sete dias.
4.3.2 Meios de cultivo
Foram utilizados três meios sólidos para avaliar a produção enzimática de M.

anisopliae: farelo de trigo puro, farelo de trigo misturado com pó de tenébrio e farelo
de trigo misturado com azeite de oliva.
A cultura de tenébrio moída foi obtida pela moagem de adultos da criação de Tenebrio
molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) mantida no Laboratório de Entomologia e
Acarologia do IFES – Campus Itapina. Para obtenção do pó de tenébrio, adultos de T.
molitor que já se encontravam mortos na criação foram coletados e secos a 60°C em
estufa, até que toda a umidade fosse retirada, e posteriormente moídos. Ambos os
substratos foram moídos em moinho de facas com peneira de 10 mesh. O farelo de
trigo e o azeite de oliva foram comprados em supermercado, sem preferência por
marca específica.
4.2.3 Fermentação em estado sólido e isolamento das enzimas
O fungo Metarhizium anisopliae cepa E9 foi cultivado sob fermentação em estado

sólido para produção de extrato enzimático seguindo metodologias adaptadas de
Meyer & Wiebe (2003) (proteases) e Tikhonov et al., (2002) (quitinases) e Oliveira
26
(2013) (lipases). A fermentação foi realizada em frascos Erlenmeyer de 125 mL

contendo 10 gramas de substrato sólido (8 g de farelo de trigo + 2 g de pó de tenébrio
ou 10 gramas de farelo de trigo puro ou 10 gramas de farelo de trigo puro e 1 mL de
azeite), umedecidos com 6 mL de meio mínimo composto por (g L-1): glicose (1,0);
KH2PO4 (1,5); K2HPO4 (1,0); MgSO4 (0,2); CaCl2 (0.2); NaCl (0.2) e triptona (4,0).
Os frascos foram cobertos com algodão hidrofóbico e autoclavados a 121°C por 15
minutos. Após resfriar, cada frasco foi inoculado com 1,5 mL de suspensão de
conídios de M. anisoplie E9 obtidos conforme descrito anteriormente. Adicionada a
solução com esporos, os frascos foram novamente cobertos com algodão hidrofóbico
e mantidos em B.O.D a 28 ± 1ºC, umidade relativa de 70% ± 10 e 24 horas de escuro,
por 4, 8 e 14 dias. Os tratamentos foram confeccionados em duplicatas, totalizando
18 frascos (3 meios diferentes x 3 períodos de incubação diferentes x 2 repetições),
para eliminar chances de contaminante, comparando as duplicatas entre si e
verificando a característica do fungo em crescimento (Figura 4).
Figura 4 – Frascos Erlenmeyer contendo meio sólido fermentado com 4 dias (A),
Frascos Erlenmeyer contendo meio sólido fermentado com 8 dias (B) e Frascos
Erlenmeyer contendo meio sólido fermentado com 14 dias (C).
Para o isolamento das enzimas secretadas, aos frascos contendo a matéria

fermentada foi adicionado 50 mL de água destilada (1:5 p/v). Com auxílio de um
agitador magnético, realizou-se a mistura do meio por 30 minutos à temperatura
ambiente (25 °C). A pasta foi então espremida através de pano de nylon, seguido de
centrifugação de todo o conteúdo a 10.000 × g durante 10 min a 25 °C, para remover
27
os materiais insolúveis. O sobrenadante foi separado como o extrato enzimático

(Figura 5).
Figura 5 – Pasta homogeneizada do meio solido (A), pasta espremida com pano de
nylon (B), extrato bruto antes da centrifugação (C), extrato já centrifugado sem
precipitado (D).
4.4 ATIVIDADE ENZIMÁTICA

4.4.1 Determinação de Proteína Total
Para determinação da proteína total dos extratos utilizou-se o método

espectrofotométrico de Bradford. O reagente de Bradford foi preparado com 100 mg
de Cromasse Blue G-250 dissolvidos em 50 mL de etanol 95%, adicionados a 100 mL
de ácido fosfórico comercial concentrado e água destilada, até completar o volume
final de 200 mL.
A concentração de proteínas totais foi determinada pela adição 200 µL do reagente

de Bradford a 50 µL de extrato enzimático diluído 10x e 750 µL de água destilada para
diluição da amostra. A absorbância foi lida em espectrofotômetro em 595 nm. Para
quantificação das proteínas foi utilizada uma curva padrão com albumina de soro
bovino (BSA). Para todos os extratos enzimáticos foram preparados três tubos de
ensaio (triplicata).
28
4.4.2 Protease
A atividade de protease foi determinada pela adição de 50 µL de extrato bruto, 450 µL

de Tris-HCl a pH 7,0 e 100 mM, e 500 µL de solução de caseína 1%, pH 8,0. O meio
de reação foi incubado durante 15 minutos a 40 ºC e a reação interrompida pela adição
de 1 mL de ácido tricloroacético 10% (m/v). Após 10 minutos, o meio de reação foi
centrifugado a 10.000 x g durante 5 min. O sobrenadante foi recolhido e a absorbância
lida no espectrofotômetro a 280 nm. Para todos os extratos enzimáticos foram
preparados três tubos de ensaio (triplicata).
4.5 AÇÃO ENZIMÁTICA SOBRE Tetranychus urticae
Nos ensaios experimentais relativos à ação enzimática sobre T. urticae, extratos

enzimáticos de M. anisopliae foram diluídos em água na concentração de 1:1 v/v e
testados em indivíduos T. urticae, sendo cada tratamento composto por 7 repetições,
com 12 indivíduos por repetição. As unidades experimentais foram montadas como
descrito anteriormente (Figura 5A). A pulverização foi realizada utilizando um
aerógrafo modelo Alfa 2, conectado a um compressor calibrado com pressão
constante de 1.3 bar e 1mL de solução de cada formulado para cada repetição (Figura
5B). Para o tratamento controle, utilizou-se apenas água destilada. As unidades
experimentais foram mantidas em câmaras climatizadas à temperatura de 25 ± 1ºC,
umidade relativa 70% ± 10 e fotofase de 12h. O efeito bioacaricida do extrato foram
avaliados 24, 48 e 72 horas após as pulverizações (Figura 6).
Figura 6 – Arenas montadas e extratos enzimáticos diluídos (B), pulverização (A)

29
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram apurados e submetidos à análise de variância e ao teste de Tukey

para comparação das médias dos tratamentos (p < 0,05). Os dados referentes a
proteína total e atividade de lipase e protease foram utilizados em sua forma original
e avaliados em esquema fatorial 3x3 (3 composições de meio e 3 tempos de cultivo).
Todos os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado.
As análises foram realizadas com auxílio do Software Sisvar, versão 5.6.
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 PROTEASE
A produção enzimática de Metarhizium anisoplie variou de acordo com o meio de

cultura e o tempo de cultivo. O fungo produziu as maiores atividades de protease nos
cultivos contendo farelo de trigo puro, com quatro e quatorze dias de cultivo (402,5 e
563,9 U/mL, respectivamente), e combinado com pó de tenébrio, com oito dias de
cultivos (490,0 U/mL) (Figura 7).
Figura 7 – Atividade de protease dos extratos enzimáticos de Metarhizium anisoplie

produzidos em diferentes condições de cultivo.
Médias seguidas de mesma letra não se diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância.
Dados semelhantes a esses foram relatados em Aspergillus sp, com pico de proteases
em 4 dias de cultivo no mesmo substrato (SIMAS, 2023). Após oito dias de incubação
foi observado significativa queda na atividade de protease (100, 9 U/mL) seguido pelo
aumento na atividade no decimo quarto dia de incubação (563,9 U/mL). Resultados
semelhantes foram encontrados por Silva et al. (2018) com protease secretada por M.
anisoplie em meio sólido de fibras de algaroba.
31
A alta atividade enzimática nos primeiros dias de cultivo pode estar associada a maior
biodisponibilidade de substrato e a rápida resposta do entomopatógeno de iniciar o
processo de colonização. As proteases são relatadas como um dos primeiros grupos
de enzimas a ser liberado pelos fungos durante seu crescimento (SOUZA et al., 2015).
Todavia, a queda da atividade enzimática no oitavo dia pode estar associada a
redução da relação C/N do substrato (SIMAS, 2023).
Já o aumento da atividade enzimática no decimo quarto dia provavelmente está

associada a elevada taxa de renovação de proteínas durante o processo de
esporulação (MELO; MELO & ALVES, 2018). A síntese de proteases está intimamente
ligada ao processo de esporulação dos fungos, e fatores de stress afetam
profundamente a produção de enzimas hidrolÍticas (BERNAL, 2020). O mesmo
comportamento também foi observado em proteases subtilisina (Pr1) secretada pelo
mesmo fungo (ROSAS - GARCIAS et al., 2014).
Já para o cultivo contendo farelo de trigo misturado com pó de tenébrio, outro

comportamento foi observado. Havendo maiores atividades de proteases no oitavo
dia de cultivo (490,0, U/mL). O crescimento dos organismos e a produção de seus
metabolitos primários e secundários são muito influenciados pelas condições
ambientais, principalmente pelos nutrientes disponíveis (AMOBONYE et al., 2020). De
acordo com Menezes (2021), foi constatado que o crescimento do fungo Trichoderma
sp. é diretamente influenciado pelas condições do meio de cultivo e pelo período de
incubação.
A presença do pó de tenébrio pode ter sido, inicialmente, uma barreira para produção
de protease, devido a presença de cutícula rica em lipídeos (WIERMANN, 2023).
Durante o processo de infecção do fungo ao inseto, é necessário inicialmente a
produção de lipases que hidrolisam os lipídeos e lipoproteínas presentes na
epicutícula do inseto. Somente após a degradação da camada lipídica que o fungo
libera grande quantidade de proteases para degradação das proteínas presentes no
exoesqueleto do inseto (LITWIN et al., 2020).
O cultivo de farelo de trigo misturado com azeite foi o tratamento com menor atividade
de proteases, para ambos os dias de cultivo (93,3,74,7 e 93,6 U/mL). O fungo M.
32
anisoplie se apresentou menos eficiente na produção de lipases em cultivos contendo

azeite de oliva, quando comparado a outras fontes lipídicas (GEOFFRY & ACHUR,
2018). Provavelmente a presença de lipídeos no substrato foi uma barreira química
para a produção de proteases durante a fermentação, visto que as atividades de
proteases alcalinas tiveram atividade inibida pela presença de ácido linoleico,
composto presente no óleo de oliva (BORATYNSKI et al., 2018).
5.2 PROTEÍNA TOTAL
Extrato de M. anisoplie cultivado com farelo de trigo misturado com pó de tenébrio

apresentou maiores concentrações de proteínas totais que o extrato cultivado em
farelo de trigo puro e farelo de trigo misturado com azeite, indicando provável presença
de proteínas dos insetos moídos (355,6 e 435,7 g/mL). Extratos enzimáticos desse
fungo cultivado por oito e quatorze dias não diferiram estatisticamente quanto a
concentração de proteína, quando comparado com mesmo tipo de cultivo (Figura 8).
Figura 8 – Proteína total dos extratos enzimáticos de Metarhizium anisoplie produzidos

em diferentes condições de cultivo.
À medida que as enzimas são produzidas no processo fermentativo, a quantidade de

proteína total também aumenta, refletindo o crescimento e o metabolismo celular
33
(SILVA et al., 2018). Os mesmos autores identificaram o aumento de proteína total até
o decimo dia de cultivo de M. anisoplie.
Os resultados indicaram que os extratos obtidos a partir do cultivo com farelo de trigo
misturado com pó de tenébrio apresentaram concentrações mais elevadas de
proteínas totais em comparação com o extrato de farelo de trigo puro. Segundo
Bandeira et al. (2018) os meios de cultivo afetam diretamente os níveis de proteínas
do extrato, sugerindo que a presença de proteínas provenientes dos insetos moídos,
contribuíram para o aumento da concentração de proteínas.
Meios de cultura enriquecidos com cutícula de insetos já foram descritos como bons
indutores de protease. Segundo Gimenes et al. (2014) B. bassiana cultivado em
substratos contendo cutícula de cigarra e larvas de Aedes aegypti apresentaram
maiores atividades de protease e aminoácidos, além do maior crescimento da
biomassa fúngica, colaborando com os resultados obtidos neste trabalho.
5.3 EFEITO ACARICIDA SOBRE Tetranychus urticae
Os extratos enzimáticos de M. anisoplie obtidos do cultivo de farelo de trigo puro e

farelo de trigo misturado com pó de tenébrio, com oito dias de cultivo, causaram
maiores mortalidades de T. urticae (89,29% e 84,54%, respectivamente) não
apresentando diferença estatística entre si, enquanto extrato enzimático contendo
farelo de trigo misturado com azeite causou mortalidade de 51,17% da mortalidade
para o mesmo dia de cultivo. (Figura 9).
Figura 9 – Mortalidade de Tetranychus urticae obtida por diferentes extratos

enzimáticos de Metarhizium anisoplie cultivado por oito dias.
34
Apesar da menor produção de protease no extrato enzimático de farelo de trigo puro

cultivado por oito dias, o extrato ainda se destacou causando alta mortalidade.
Provavelmente esse resultado está relacionado a outros compostos presentes no
extrato, como as toxinas, entre elas as dextruxinas (BENSLAMA et al., 2022).
Trabalhos indicaram que mutações em cepas de M. anisoplie causaram aumento da
virulência do patógeno reduzindo em 50% o tempo de sobrevivência de insetos
tratados com a cepa mutante (LI et al., 2021). Além disso, estudos com essas mesmas
moléculas indicaram alta afinidade de ligação com a quitina presente no exoesqueleto
de Culex quinquefasciatus (Diptera), sendo correlacionada com a toxicidade da
molécula aos artrópodes (BENSLAMA et al., 2022).
O extrato enzimático de farelo de trigo misturado com pó de tenébrio cultivado por oito
dias apresentou atividade de protease alta, justificando a mortalidade de T. urticae. As
proteases são descritas como um dos principais fatores de patogenicidade e virulência
dos fungos entomopatogênicos (LITWIN et al., 2020). Os ácaros tratados com extrato
enzimático apresentaram sinais de extravasamento da hemolinfa e ressecamento,
35
após tratamento com os extratos enzimáticos, esse sintoma pode ter ocorrido devido
a degradação das estruturas celulares presentes em seu exoesqueleto (Figura 10).
Figura 10 – Fêmeas adultas de Tetranychus urticae 72 horas após tratamento com

enzimas obtidas a partir de extratos enzimáticos de Metarhizium anisoplie.
Também foi observado maiores mortalidades para farelo de trigo e farelo de trigo
misturado com pó de tenébrio cultivado por quatro dias (73,8% e 80,9%,
respectivamente) (Figura 11). Resultados obtidos no presente estudo corroboram com
os de Keppanan et al. (2017) que determinaram o efeito tóxico de proteases,
provenientes de cultivos com cinco dias de fermentação, de três isolados de M.
anisopliae sobre larvas de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) e relataram
atividade de degradação da cutícula dos insetos e ação inseticida, com mortalidades
próximas a 100%.
Mortalidades menores foram observadas nos tratamentos com azeite de oliva para
ambos os dias de cultivo (48,8%, 51,2% e 62,5%) (Figura 11). A presença da cutícula,
estrutura responsável pela proteção dos artrópodes contra danos físicos e contra
infecções por microrganismos é uma das maiores barreiras aos fungos
entomopatógenos, principalmente na ausência de enzimas hidrolíticas que degradam
essa estrutura, entre elas a protease (WIERMANN, 2020). A análise química indicou
baixa atividade dessa enzima, justificando a baixa mortalidade.
36

Metarhizium anisoplie cultivado em diferentes meios de cultivo e tempo.
Estudos com M. anisopliae indicaram baixa produção de lipase e proteases em meios

de cultura contendo azeite de oliva (SANTI et al., 2010). Os mesmos altores
esclareceram que meios de cultivo contendo resíduos de insetos ou estearato de
colesterol apresentaram maiores atividades de lipase que fontes lipídicas de origem
37
vegetal, indicando que substratos enriquecidos com lipídeos de origem animal, são
mais eficientes para produção de lipase para este fungo específico. Portanto a menor
mortalidade dos indivíduos tratados com extrato enzimático obtido a partir do meio de
cultivo enriquecido com azeite de oliva pode estar associada a baixa atividade
enzimática do extrato.
38
6 CONCLUSÃO
Os meios de cultivo contendo farelo de trigo e farelo de trigo misturado com pó de

tenébrio se mostraram bons substratos para produção enzimática de Metarhizium
anisoplie. O extrato enzimático de Metarhizium anisoplie cultivado em farelo de trigo
puro ou misturado com pó de tenébrio, cultivado por 8 dias, apresentou alta atividade
de protease e toxidade a Tetranychus urticae. Os resultados mostraram que o extrato
enzimático de Metarhizium anisoplie possui potencial bioacaricida, podendo ser
utilizado no manejo da praga. No entanto, demais estudos são necessários para
avaliar o comportamento dos extratos enzimático obtidos em condições de cultivo
variadas, a virulência das enzimas purificadas e seu comportamento em campo.
39
REFERÊNCIAS
ABRAFRUTAS. Dados de exportação de 2022. Abrafrutas, 2023. Disponível em:

<https://abrafrutas.org/2023/02/dados-de-exportacao-de-2022/>. Acesso em: 02 jun.
2023.
AGUIAR, J. P. S. A. Produção e caracterização de enzimas quitinolíticas

produzidas pelo fungo Trichoderma asperellum e sua aplicação no biocontrole
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3.2 IMPORTÂNCIA DO ÁCARO RAJADO PARA A FRUTICULTURA