UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS ESCOLA DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Disciplina: Gentica Bsica Prof. Dr. Jorge Luis Ferreira Acadmicas: Camila Noronha Deyse Camargo rica Galon Juliana Rabelo Mrcia Fernanda Rassa Pettine

Araguana- TO

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Introduo

Ampla aplicao;
-Desenvolvimento de culturas microbianas - Insulina humana, hormnio de crescimento , vacinas, enzimas industriais. Como funciona esse processo?

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Funcionamento geral Organismo doador - extrair o DNA; Isolar o DNA doador e vetor (enzimas de restrio); Inseri-los em molculas de DNA bacteriano abertas (vetores); DNA recombinante = DNA doador + DNA vetor. Como o DNA doador foi cortado em vrios fragmentos diferentes, maioria das colnias ir levar um DNA recombinante diferente.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Funcionamento geral

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

CORTANDO O DNA

Enzimas de restrio, cortam o DNA. Corte feito em sequncias- alvo especficas.

Ex.: EcoRI 5-GAATTC- 3 3-CTTAAG -5 palndromo de DNA

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

CORTANDO O DNA

Pontas adesivas idnticas.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

JUNTANDO O DNA O DNA doador e o vetor so misturados , para permitir que as pontas adesivas se encontrem. As sequencias acar fosfato ainda no esto completas nas duas pontas de juno, ento, uma a enzima DNA ligase cola esses fragmentos criando ligaes fosfodister.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Amplificao do DNA recombinante

O DNA recombinante introduzido em uma bactria.

O plasmdio vetor capaz de se replicar, agora o DNA doador automaticamente replicado junto com o vetor. A colnia de bactrias resultante conter bilhes de cpias da nica insero de DNA do doador, que so os clones de DNA.

USO DO DNA CLONADO

Pode ser utilizado de vrios modos de acordo com a finalidade do experimento

SONDAS DE DNA
DNA de fita simples Oligonucleotdeos

Detectam possveis doenas genticas.

DOENA GENTICA RECESSIVA ANEMIA

FALCIFORME

TCNICAS DE BLOTTING PARA A DETECO DE FRAGMENTOS DE DNA ESPECFICOS E MRNAS COM SONDAS DE DNA

Mtodos sensveis para a deteco de sequncias de DNA ou RNA

TCNICA DE SOUTHERN BLOTTING

Detecta um nico fragmento de restrio especfico em uma mistura altamente complexa. Feito por meio do realce do resultado de uma eletroforese em gel de agarose.

APLICAES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

APLICAES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Com o clone podem criar diversas possibilidades experimentais ;

As mutaes espontneas so imprevisveis;

MUTAGNESE IN VITRO

Pode ser utilizada na reproduo de animais e plantas, na microbiologia experimental e na medicina; Pode ser direcionada, assim possibilita o estudo do funcionamento gnico;

MUTAGNESE IN VITRO
Mutagnese do stio-dirigido sequncia conhecida oligonucleotdeos o fago M13

base mal pareada

diferenciar tipo selvagem dos fagos mutantes

modificao do gene

MAPEAMENTO RFLP

O DNA dos cromossomos so homlogos; Determinado stio de restrio nem sempre e encontrado em todos os indivduos;

+ ou de um stio de restrio pode gerar Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrio (RFLP)

MAPEAMENTO RFLP

Mudanas em uma nica base no DNA

Repeties em tandem -GC-GC-GC-GC-GC- indivduo 1 -GC-GC-GCindivduo 2

MAPEAMENTO RFLP

Significado triplo Pode ser usado para mapear genes de interesse e agir como posies e a partir da esses genes podem ser clonados clonagem posicional;

Usado como ferramenta de diagnoseaconselhamento gentico;

usado para medir a divergncia gentica entre populaes diferentes ou espcies correlatas;

GENTICA REVERSA

TRANSCRIPTASE REVERSA

Primer

GENTICA REVERSA

EXPRESSO DE GENES EUCARITICOS EM

BACTRIAS

EXPRESSO DE GENES EUCARITICOS EM

BACTRIAS

Bactrias transgnicas; Protenas exgenas em E. coli RNA polimerase do fago T7 funcionando como um promotor de T7;

Promotor tardio1sistema RNA polimerase T7 transcrito no promotor lac , com a adio do IPTG o repressor e inativado;

EXPRESSO DE GENES EUCARITICOS EM

BACTRIAS 2sistema o gene de escolha e inserido adjacente a um promotor tardio de T7. A RNA polimerase ento transcreve esse gene em altos nveis, o que resulta em alta produo.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE EM

EUCARIONTES

As tcnicas de manipulao gnica, clonagem e expresso foram desenvolvidas inicialmente em bactrias, mas hoje so aplicadas de forma rotineira em uma variedade de eucariontesmodelos. Usa-se essa tecnologia para alterar gentipos e fentipos de organismos conhecida como engenharia gentica.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE EM

EUCARIONTES

Um vetor de expresso largamente usado para as protenas o baculovrus de inseto, no qual os genes so inseridos e expressos em altas taxas em clulas cultivadas de inseto.

EUCARIONTES TRANSGNICOS

Gene transferido chamado de transgene e o produto construdo e chamado de organismo transgnico. A possibilidade de modificao transgnica dos eucariontes, tais como plantas e animais, abre muitos enfoques novos a pesquisa pois os gentipos podem ser geneticamente alterados para que se adequem a algum experimento especfico.

EUCARIONTES TRANSGNICOS

As vezes difcil detectar a atividade de um determinado gene no tecido no qual ele normalmente funciona. Este problema pode ser evitado colocando-se o promotor do gene em questo na regio codificante de um gene conhecido como gene reprter.

ENGENHARIA GENTICA EM PLANTAS

ENGENHARIA GENTICA EM PLANTAS

Durante muito tempo os agricultores alteraram a combinao gentica das plantas por eles cultivadas. A seleo artificial tem como objetivo a obteno de caractersticas fenotpicas(sementes maiores, frutos mais doces). Porm reunir os melhores genes numa planta era longo e difcil .

ENGENHARIA GENTICA EM PLANTAS

As novas tcnicas de modificaes permite remoo de genes especficos e sua insero numa outra(transgene). Plasmido Ti: Os nicos vetores rotineiramente usados para produzir plantas transgnicas so derivados de uma bactria do solo chamada Agrobacterium tumefaciens.

ENGENHARIA GENTICA EM PLANTAS

O prprio T-DNA desempenha vrias funes , incluindo a produo do tumor e a sntese de compostos chamados de opinas. Duas opinas importantes so a nopalina e ocotpina.

EXPRESSO DE DNA CLONADO

O T-DNA clonado pode ser de qualquer DNA que o pesquisador queira inserir na planta. Um DNA exgeno particulamente marcante que foi inserido com uso de T-DNA o gene para a enzima luciferase que isolado do vaga-lume.

EXPRESSO DO DNA CLONADO

Esta enzima luciferase cataliza a reao de uma substncia qumica chamada de luciferina. Uma planta de tabaco transgnica que expresse o gene da luciferase tambm brilhara no escuro quando regada com soluo de luciferina.

EXPRESSO DE DNA CLONADO

O gene da luciferase til como reprter para monitorar o funcionamento de qualquer gene durante o desenvolvimento. Ele anunciar sua atividade brilhando proeminentemente em vrios momentos ou em vrios tecidos .

PLANTAES DE TRANSGNICOS

PLANTAES DE TRANSGNICOS

Em 1996 foi produzido o primeiro alimento transgnico, que foi a soja. Houve vrios protestos contra a utilizao de alimentos geneticamente modificados. A objeo dos que protestam contra tais plantas transgnicas era devido aos transgenes serem nocivos a sade humana.

PLANTAES TRANSGNICAS

Outro temor era que de que, como resultado da colheita resistente, os consumidores poderia ser expostos a nveis mais altos de pesticidas.

PLANTAES TRANSGNICAS

Em 1998 o milho transgnico e a soja foram plantados em uma rea 20 vezes maior que me 1996. Esta tecnologia tem um imenso potencial benfico atravs do mtodo de T-DNA .

ENGENHARIA GENTICA EM LEVEDURA DO

PO

ENGENHARIA GENTICA EM LEVEDURA DO PO

A levedura tornou-se o modelo eucaritico mais sofisticado para a tecnologia de DNA recombinante. Disponibilidade do plasmdio Plasmdio de 2 mcrons. Os vetores mais simples de leveduras so derivados de plasmdios bacterianos. Crossing duplo ou nico.

Engenharia gentica em levedura do po

Vetor bsico e outros segmentos de bactrias e leveduras; Vetores de transporte ( shuttle); Plasmdio de replicao autnoma; Centrmero adicionado ao plasmdio; Linearizao do plasmdio Cromossomo artificial de levedura (YAC); YAC usados como vetores de clonagem.

ENGENHARIA GENTICA EM LEVEDURA DO PO

ENGENHARIA GENTICA EM ANIMAIS

Animais usados como sistemas-modelos. - Caenorhabdilis elegans - Drosophila - Camundongos

ANIMAIS TRANGNICOS

Os animais transgnicos so aqueles que tiveram seu patrimnio gentico alterado com a introduo de genes de outras espcies que no a sua. Produo de Drosophilas. Fornecimento do gene lacZ.

PERTUBAES GNICAS E SUBSTITUIO

GNICA EM CAMUNDONGOS

Os camundongos so os modelos mais importantes Habilidades em perturbar um gene. - Gene nocaute; - Estudo dos fentipos alterados; - Estudos de mutantes similares aos encontrados em humanos; Substituio de um alelo pelo outro.

TERAPIA GNICA

TERAPIA GNICA

Tratamento e alvio de doenas genticas pela adio de genes para corrigir o funcionamento defeituoso das mutaes;

TERAPIA GNICA

Linhagens transgnicas de crescimento rpido do salmo do pacfico;

TERAPIA GNICA

- Eram em mdia 11 vezes mais pesados que os

controles no-transgnicos; - A prole herdava o transgene;

TERAPIA GNICA
dividida em dois tipos: De linhagem germinativa e linhagem somtica;

TERAPIA GNICA LINHAGEM GERMINATIVA

Tornam-se parte de muitos tecidos do corpo, em geral, incluindo a linhagem germinativa, que dar origem as gnadas;
Meta;

TERAPIA GNICA LINHAGEM GERMINATIVA

Desvantagens: Insero ectpica dos fragmentos transformantes ao longo do genoma;

- Possibilidade do alelo defeituoso se segregar;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Correo do fentipo da doena, tratando algumas clulas somticas no paciente afetado; O mtodo aborda doenas cujo fentipo causado por genes que so expressos predominantemente em um tecido; Se uma porcentagem das clulas for transgnica, pode haver melhora nos sintomas gerais da doena;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Mtodo:

- Remoo de clulas de um paciente com gentipo defeituoso; - Tornar estas clulas transgnicas pela introduo do gene selvagem; - Reintroduo das mesmas no corpo do paciente; - Funcionamento gnico normal.

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Existem atualmente dois modos de colocar o transgene nas clulas somticas defeituosas, ambos mtodos usam vrus;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Retrovrus: O transgene colocado em seu genoma, substituindo a maioria dos genes virais; O retrovrus recombinante levar o transgene junto com ele no cromossomo;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Desvantagens: Mutao;

Este tipo de vetor ataca apenas as clulas com proliferao;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Procedimento usado para a terapia gnica da Imunodeficincia Combinada;

Mutao no gene que codifica a enzima sangunea Adenosina Desaminase (ADA);

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

-Clulas sanguneas so removidas da medula ssea; - O transgene adicionado; - As clulas so introduzidas no sistema sanguneo;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Adenovrus:

Ataca o epitlio respiratrio, injetando seu genoma nas clulas epiteliais; O genoma viral no se integra em um cromossomo; persiste extracromossomicamente em todas as clulas;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

Vantagens: Eliminao do problema da mutagnese;

O Adenovrus ataca clulas que no se dividem, tornando a maioria das clulas suceptveis;

TERAPIA GNICA LINHAGEM SOMTICA

-Usado na terapia gnica da Fibrose Cstica;

USO DO DNA RECOMBINANTE PARA DETECTAR

DIRETAMENTE ALELOS DE DOENAS

Muitas das enzimas ou protenas que esto alteradas ou ausentes nas doenas genticas j so conhecidas;

Triagem das clulas derivadas do feto em estgio inicial;

Opo de abortar fetos afetados;

AMNIOCENTESE

CVS
Puno de vilosidades corinicas; Coleta de pequena amostra de clulas da placenta; Pode ser feita mais cedo na gestao; Amniocentese necessita de maior tempo gestao; A tecnologia do DNA recombinante melhora a triagem de doenas genticas;

PCR

Permite o enfoque em uma sequncia potencialmente defeituosa de DNA; Diagnstico de doenas nas quais um sitio mutacional especifico est em questo; O DNA amplificado pode ser isolado e sequenciado, ou comparado ao tipo selvagem.

CONCLUSO
A fascinante abrangncia do uso desta tecnologia tem mudado a histria da Cincia nos ltimos 50 anos. A realizao do projeto genoma e as tcnicas de mapeamento gentico so reflexos dessa grandiosidade. Com o progressivo desenvolvimento cientfico nesta rea h a esperana de que se resolvam muitos dos problemas enfrentados pela humanidade atualmente como a erradicao da fome no planeta, atravs de melhores e mais eficazes tcnicas de cultivos (transgnicos), e o tratamento de doenas que hoje so incurveis, com a terapia gnica.

OBRIGADA.