Deteco e Identificao dos Fungos de Importncia Mdica

Mdulo VII

NDICE Introduo ......................................................................................................................1 Fungos e infeco hospitalar ................................................................................................. 1 2. Coleta e transporte de amostras ....................................................................................4 Procedimentos para coleta de amostras.................................................................................. 4 3. Processamento de amostras ..........................................................................................6 Exame microscpico de amostras .......................................................................................... 6 Cultura de amostras biolgicas para isolamento de fungos ........................................................ 8 4. Identificao de fungos.................................................................................................12 Identificao de leveduras .................................................................................................. 12 Identificao de fungos filamentosos.................................................................................... 16 Identificao de fungos dimrficos ....................................................................................... 18 5. Descrio das principais micoses ..................................................................................20 6. Referncias bibliogrficas .............................................................................................24 1.

GLOSSRIO Artrsporo ou artrocondio = esporo formado pela desarticulao da hifa de fungos filamentosos ou leveduras. Blastosporo ou blastocondio = esporos formados por brotamento ou gemulao. Bolor = fungo filamentoso, multicelular, constitudo de hifas. Brotamento ou gemulao = reproduo com diviso de citoplasma atravs de estrangulamento. Cenoctica = hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa contnua. Clamidsporo = estruturas de resistncia, constitudas de reserva nutritiva e membrana bastante espessa, permitindo resistir aos fatores externos, semelhante aos esporos. Condio = esporo assexuado externo. Dimrfico = que apresenta duas formas: leveduriforme e filamentosa. Esporngio = rgo de reproduo assexuada interna, geralmente em forma de vescula e contm inmeros esporos denominados de esporangiosporos. Hialino = que no tem cor, translcido, assumindo a cor do corante utilizado. Hifa = reunio de clulas justapostas, formando estrutura tubular, filamentosa, que compe o corpo vegetativo dos bolores e de alguns gneros de leveduras (por ex, Candida spp.). Demcio ou demaciceo = fungos negros que tm pigmento melanide (acastanhado), na parede celular. Levedura = fungo em regra, unicelular que se reproduz geralmente por brotamento. Tuberculado = com granulaes ou nodosidades.

1. INTRODUO
FUNGOS E INFECO HOSPITALAR
Fungos so seres dispersos no meio ambiente, em vegetais, ar atmosfrico, solo e gua e, embora sejam estimados em 250 mil espcies, menos de 150 foram descritos como patgenos aos seres humanos. Leveduras so fungos capazes de colonizar o homem e animais e, frente perda do equilbrio parasita-hospedeiro, podem causar diversos quadros infecciosos com formas clnicas localizadas ou disseminadas. De modo contrrio, fungos filamentosos, ou bolores, normalmente, no fazem parte da microbiota animal e portanto o homem no um reservatrio importante para esse grupo de fungos. As portas de entrada no hospedeiro so as vias areas superiores ou quebra na barreira epidrmica aps traumatismos com objetos perfuro-cortantes. Dentre as centenas de espcies descritas, leveduras do gnero Candida so os maiores agentes de infeco hospitalar e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenas graves e aqueles em perodo ps-operatrio. Hospitais norte-americanos com sistema de vigilncia operante, notificaram Candida como 6o patgeno nosocomial e a 4a causa mais comum de infeces de corrente sangunea, adquiridas em hospitais. A manifestao clnica mais comum nas candidases hospitalares febre. Candidemia pode ser definida como a ocorrncia de 2, ou mais,culturas positivas para a mesma espcie de Candida, provenientes de amostras diferentes, coletadas aps 72 h da admisso. Infeco invasiva por Candida pode ser tambm considerada quando h isolamento de Candida a partir de stio normalmente, estril associado a pelo menos, um outro sinal de infeco. A sensibilidade de hemocultura para Candida baixa; aproximadamente, 50% dos pacientes com infeco invasiva por Candida podem ter culturas negativas. Alm disso, se houver infeco bacteriana concomitante, pode diminuir a chance do isolamento de Candida. Os fatores reconhecidos de risco para infeco invasiva por Candida so: Permanncia > 4 dias em UTI Antibioticoterapia de largo espectro Cirurgia abdominal Cateterizao venosa central Nutrio parenteral total Imunodepresso ndice APACHE II > 10 Ventilao mecnica > 48h Neutropenia Quimioterapia citotxica Frente a estas condies recomenda-se monitorao com exames micolgicos sangue de amostras biolgicas dos pacientes, tais como, sangue, escarro, pontas de catteres intravasculares, lquido peritoneal e urina. Culturas positivas para leveduras podem significar apenas colonizao mas, podem conduzir doena invasiva subsequente. Estudo prospectivo, em pacientes cirrgicos de UTI, mostrou que 38% de 29 pacientes desenvolveram infeco aps colonizao. A colonizao pode ser demonstrada por anlise de 3 ou mais amostras, coletadas do mesmo local ou de stios diferentes, do mesmo paciente, em dias consecutivos. Diferentes espcies de Candida podem causar quadros de fungemia, a saber: Candida glabrata (Torulopsis glabrata), Candida tropicalis; Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida guilliemondii, Candida lusitaniae, Candida lipolytica, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida norvergensis e Candida catenulata. Um grupo europeu realizou na dcada de 90 um estudo multicntrico e, por anlise univariada, concluiram ser C. glabrata, a espcie associada maior taxa de mortalidade e que bito estava relacionado com maior idade e severidade da doena de base do paciente.

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O gnero Candida , sem dvida o mais importante mas, existem outras leveduras no ambiente hospitalar, tanto em vegetais, ar atmosfrico e gua, quanto na pele e no trato gastrointestinal dos pacientes e funcionrios, que podem causar quadros infecciosos. Os principais gneros so Pichia sp (Hansenula sp), Rhodotorula sp e Trichosporon sp. Fungos filamentosos presentes no meio ambiente hospitalar, tambm podem causar infeco em pacientes suscetveis. O gnero Aspergillus sp (Aspergillus terreus, A. fumigatus, A. flavus e A. niger) o mais citado na literatura como fungo oportunista, especialmente em pacientes transplantados de medula ssea e neutropnicos. A inalao de esporos a via mais comum de transmisso e os surtos de aspergilose so associados a reformas e construes, dentro e ao redor de hospitais. Doena pulmonar e, mais raramente, sinusite, so as manifestaes de aspergilose. Outros gneros, tais como Fusarium sp, Acremonium sp e Penicillium sp so capazes de causar formas localizadas ou disseminadas de infeco hospitalar. Estes gneros que so dispersos pelo ar atmosfrico, pertencem ao grupo dos hialohifomicetos, pois tm hifas hialinas e septadas. Outros grupos de fungos filamentosos, como zigomicetos (Rhizopus sp, Mucor sp), caracterizados por hifas no-septadas (cenocticas) e alguns feo-hifomicetos (fungos negros ou demcios) que tm hifas amarronzadas, podem tambm ser agentes de infeco hospitalar.

GENERALIDADES SOBRE FUNGOS

Os fungos de interesse mdico, agentes de micoses, so de dois tipos morfolgicos: leveduras, que so unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, que so multicelulares (Fig.1). Existe um subgrupo dentro dos filamentosos, chamados fungos dimrficos, que se apresentam sob ambas as formas, dependendo principalmente da temperatura, mas sob influncia tambm do teor de CO2 e condies nutricionais. As leveduras tm como estrutura primria, clulas que se reproduzem por brotamento, nico ou mltiplo, em geral, de forma arredondada. Estas clulas so esporos de origem assexual e se denominam blastocondios. Alguns gneros de leveduras menos importantes em micologia mdica, reproduzem-se por fisso. Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte bsico a hifa, que pode ser septada ou no septada (cenoctica). A partir da hifa formam-se esporos, para propagao das espcies. Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de condios, pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas ligas a elas. Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificao de um fungo, pois a classificao de filamentosos feita, em regra, pelas caractersticas morfolgicas, tanto macroscpicas (cor, aspecto, textura da colnia, etc.), quanto microscpicas (forma e cor da hifa, presena ou no de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.), alm da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rpida). A identificao de leveduras, ao contrrio, feita, principalmente, por caractersticas fisiolgicas, desde que, a morfologia destes fungos no muito variada e no permite distino entre espcies e, em regra, entre gneros. Com o advento da terapia com antibiticos de largo espectro e o tratamento de pacientes com doenas metablicas crnicas, neoplsicos e transplantados, em uso de agentes citotxicos e imunossupressores, alm da AIDS, a diferena entre fungos contaminantes e patognicos (classicamente os agentes de micoses superficiais, subcutneas e profundas), tornou-se pouco clara. Agentes como Aspergillus, Candida, Cryptococcus e espcies de zigomicetos, considerados antigamente, como contaminantes de laboratrio e, portanto, de pouca importncia clnica, so agora conhecidos como causadores de enfermidades disseminadas, endocardites, infeces pulmonares, ceratites entre outras, em pacientes imunodeprimidos. Portanto, estes fungos devem ser considerados, alm dos patgenos clssicos, como por ex., Paracoccidiodes brasiliensis e Histoplasma capsulatum, como possveis agentes de quadros infecciosos. Neste mdulo, ser apresentada uma viso geral das principais infeces fngicas, de modo que, os microbiologistas possam adquirir certa habilidade para identificar fungos isolados de amostras biolgicas. Para um estudo mais completo sobre diagnstico de infeces fngicas, recomenda-se as referncias citadas ao final do captulo.

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Estruturas microscpicas bsicas de fungos: a, b, c - filamentosos, d - leveduras

a Filamentosos b Filamentosos c Filamentosos d Leveduras

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2. COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS

O tipo e a qualidade da amostra biolgica, submetida ao laboratrio de micologia, so fatores importantes no sucesso do isolamento e identificao do verdadeiro agente etiolgico de infeces fngicas. A amostra deve ser submetida ao exame microscpico direto e cultura em meios para isolamento e identificao acurada do agente etiolgico. Por isso, a assepsia na coleta e o volume da amostra so fatores bsicos para o sucesso do diagnstico da infeco.

RECOMENDAES GERAIS DE COLETA E TRANSPORTE DE AMOSTRAS

Coletar a amostra biolgica com assepsia e coloc-la em recipiente estril e vedado, sempre em quantidade suficiente (>2 ml ou 0,5 cm3) para permitir todos os procedimentos laboratoriais necessrios. Os swabs usados para coleta de material de ouvido, nasofaringe e orofaringe, secreo vaginal e leses abertas, devem ser colocados em tubos contendo salina estril para o transporte, de modo a evitar a dessecao da amostra. Sempre que possvel, coletar amostras antes do incio da terapia especfica e, particularmente, para leses cutneas de pele e unhas, orientar o paciente para evitar uso de medicao tpica por 4 a 5 dias antes da coleta de escamas. A amostra deve ser identificada com nome do paciente , nmero de registro hospitalar (quando for o caso), tipo de amostra e data da coleta. A requisio mdica que acompanha a amostra, deve conter, sempre que possvel, as hipteses diagnsticas que auxiliaro o micologista na escolha da colorao e do meio de cultura mais adequado para o isolamento do agente etiolgico. Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em 2 ou 3 dias consecutivos, importante para a interpretao correta de resultados positivos para fungos considerados como saprfitas, ou seja, contaminantes do meio ambiente, ou mesmo, constituinte da microbiota normal do paciente. Nestes pacientes, os fungos saprfitas podem se tornar oportunistas e comportarem-se como patgenos. Os materiais ditos contaminados, tais como urina, fezes, ps, secrees de feridas ou trato respiratrio, devem ser enviados, sob gelo, ao laboratrio, o mais rpido possvel (<2 h). Liquor e lquidos cavitrios devem ser mantidos temperatura ambiente e encaminhados com urgncia ao laboratrio para processamento imediato. Sangue e material de puno de medula ssea so os nicos materiais biolgicos que devem ser semeados diretamente, em frascos contendo meio de cultura lquido ou bifsico (lquido sobre slido), de modo a evitar coagulao e consequente diminuio da sensibilidade do exame.

PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE AMOSTRAS

Escarro

Recolher, de preferncia, a primeira expectorao da manh, aps gargarejo com gua limpa ou fervida, em frasco de boca larga, esterilizado. No deve conter saliva. Aspirar cerca de 5 a 10 ml de suco gstrico, atravs de sonda nasogstrica, pela manh, em jejum. Procedimento realizado por mdico treinado. O material colhido deve ser colocado em recipiente estril. Fazer assepsia rigorosa no local da puno e coletar cerca de 5 a 6 ml de sangue venoso, que dever ser injetado diretamente, em frasco contendo meio de cultura (ver detalhes no prximo tem). A ltima gota de material deve ser distendida em uma lmina de microscopia, para colorao de Giemsa.

Aspirado gstrico Aspirado traqueal e secreo obtida por broncoscopia Sangue e aspirado de medula ssea

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Lquor

Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar 2 ml ou mais, para exame microscpico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar, devem ser usados na seguinte sequncia: 1 exame bioqumico, 2 exame de celularidade, 3 microbiolgico, reduzindo assim a possibilidade de isolamento de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em tubos especficos para cada um desses exames, aumenta a sensibilidade do exame micolgico e, por isso, deve ser recomendada. Colher assepticamente, utilizando instrumentos estreis e colocar o material em recipiente estril, com salina. No adicionar nenhum liquido fixador. A amostra biolgica mais apropriada para o diagnstico de micose do trato urinrio obtida por sondagem ou citoscopia. Quando no for possvel, e para evitar contaminao com microrganismos presentes nas reas vizinhas, fazer limpeza prvia da regio perineal com gua e sabo, desprezar o primeiro jato de urina da manh, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio estril. Colees de 24 horas, no tm valor para diagnstico micolgico. Fazer lavagem prvia da regio anal com gua e sabo, coletar pores de fezes em recipiente estril com tampa ou swab anal, mergulhar o swab em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Colher material por curetagem da leso ou com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.

Tecido obtido por bipsia, necrpsia e peas operatrias

Urina

Fezes

Secreo ou pele de conduto auditivo externo

O melhor mtodo para recuperao de fungos, requer raspado de crnea, Material de micose aspirao de lquido intra-ocular ou bipsia. A coleta com auxlio de swab no ocular indicada em local de drenagem. Leso de nariz e seios paranasais Mucosa oral e orofaringe Coletar secreo, material necrtico ou tecido obtido por bipsia em recipiente estril. Coletar com swab estril o material de leso de mucosa jugal, papilas linguais ou regio tonsilar. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Com auxlio de espculo, coletar material da leso ou do fundo de saco vaginal com swab estril. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio.

Secreo vaginal

Liqudos corporais Fazer assepsia rigorosa no local da puno. Coletar cerca de 5 a 10mL de (pleural, asctico, lquido em tubo de ensaio estril. pericrdico, sinovial) Devem ser colhidos de preferncia, por aspirao de abscessos fechados, com seringa e agulha estril. Se a leso for aberta, limpar o local, com gaze esterilizada embebida em salina estril, para eliminar os exsudatos superfciais que so altamente, contaminados com bactrias. A seguir, colher o material com swab. Mergulhar o swab umedecido em salina estril e enviar o tubo ao laboratrio. Se possvel, descontaminar a pele com lcool 70% antes da coleta. Raspar com lmina de bisturi as escamas cutneas da borda das leses . Pode-se utilizar tambm, uma lmina de microscopia. Colocar o material entre duas lminas limpas, de preferncia esterilizadas, vedando-se as bordas das lminas com fita adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados, devem ser retirados com pina estril e acondicionados entre lminas ou em potes, de preferncia esterilizados. Fazer limpeza prvia das unhas, escovando com gua e sabo. Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lmina de bisturi, raspar as reas mais profundas e pulverulentas. Colocar este material entre lminas e ved-las com fita adesiva.

Pus e material de abscesso

Pele e pelos

Unhas

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3. PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS
O sucesso na visualizao e isolamento do agente etiolgico depende, alm da coleta e transporte adequados e volume suficiente da amostra, de seu processamento correto antes do exame micolgico. As seguintes recomendaes devem ser cuidadosamente, seguidas para boa resoluo diagnstica: Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame microscpico e cultura pois, para exame so clarificadas com soluo aquosa de KOH a 20% e, para cultura, no podem sofrer nenhum tratamento prvio, sendo por isso, inoculadas diretamente na superfcie do meio de cultura. Lquor, secrees e fludos corporais (lquido pleural, asctico, sinovial, pericrdico, aspirado transtraqueal, lavado gstrico e broncoalveolar [BAL]) devem ser concentrados por centrifugao (1500 a 2000 rpm por 10 minutos). Os materiais coletados com swabs devem ser eluidos em soluo salina e tambm devem ser centrifugados. O sedimento obtido o material adequado para o exame microscpico e semeadura em meios de cultura. Para urina, recomendvel que uma alquota (ala calibrada) seja semeada, por esgotamento, sobre o meio de cultura distribudo em placa de Petri, para exame quantitativo, pela contagem de unidades formadoras de colnias (UFC). A outra alquota deve ser centrifugada (1500 a 2000 rpm por 10 minutos) e o sedimento ser utilizado para exame microscpico e nova semeadura em tubo (cultura qualitativa). Escarro pode ser digerido com enzima (v/v) N-acetil-L-cisteina (250 mg de enzima dissolvidas em 1 L de soluo-tampo citrato ou soluo fisiolgica), que fluidifica e facilita a manipulao da amostra e formao de sedimento aps centrifugao. Porm, no foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperao de fungos da amostra sendo, portanto, opcional. Pode-se utilizar, como alternativa, para digesto da amostra, soluo de KOH 20%. A poro purulenta da amostra prefervel e pores liqefeitas no so adequadas para isolamento do agente. A poro da amostra tratada com KOH, porm, s pode ser usada para exame microscpico, pois a potassa destri, aps algumas horas, as estruturas do fungo, inviabilizando seu isolamento em meio de cultura. Neste caso, outra poro da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura. Tecidos obtidos por bipsia requerem fragmentao, com o auxlio de um bisturi estril ou macerao (gnglio) com pistilo em almofariz; pode ser feito dentro de uma placa de Petri estril. Esse procedimento visa aumentar a rea de superfcie e expor o microrganismo ligado ao tecido, ao maior contato com o meio de cultura. Sangue e aspirado de medula ssea no necessitam preparao, sendo que o exame microscpico tem baixa sensibilidade e, portanto a cultura importante para identificao do agente. Para cultura, as amostras so semeadas imediatamente, aps a coleta, em frascos contendo meio de cultura. O meio pode ser bifsico (15 ml de gar inclinado sob 50 ml de caldo) composto de infuso de crebro-corao (meio BHI) ou Sabouraud. Meios contendo saponina para lise e posterior centrifugao da amostra so indicados. Na prtica, frascos para hemocultura bacteriolgica (simples ou automatizada), proporcionam isolamento adequado de fungos, desde que respeitado os perodos necessrios ao seu desenvolvimento. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (>15 d), muitos autores consideram o mtodo de lise-centrifugao o mais sensvel. O sangue e medula ssea no devem ser coletados em seringas contendo EDTA, pois esta substncia se combina com elementos da parede dos fungos, diminuindo a sensibilidade do exame. Um dos procedimentos recomendados para a inoculao de 5 a 6 ml da amostra no frasco com meio bifsico sendo, uma parte para 10 partes do meio liqudo, que deve ser ento, incubado temperatura de 30C.

EXAME MICROSCPICO DE AMOSTRAS

A observao de um fungo na amostra biolgica tem grande valor diagnstico pois demonstra a invaso do fungo no tecido e permite uma informao imediata ao mdico, a qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biolgica for insuficiente para o exame microscpico e cultura do material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exame microscpico, desde que mtodo mais especfico e em muitos casos, mais sensvel. O exame microscpico da amostra realizado por vrias tcnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita clnica.

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EXAME MICROSCPICO DIRETO COM HIDRXIDO DE POTSSIO (KOH) A 20%

usado para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido por bipsia, exsudatos espessos e outros materiais densos. Colocar uma gota de KOH (aquoso a 20%) em uma lmina de microscopia e sobre esta, uma poro da amostra a ser examinada. Cobrir a preparao com uma lamnula e, para intensificar a clarificao, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examinar a preparao aps 20 minutos, em microscpio ptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x.

EXAME MICROSCPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA)

Utilizada em amostras de lquor, urina, secrees ou exsudatos, para visualizao de leveduras capsuladas do gnero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada, sobre uma lmina. Cobrir a preparao com lamnula e observar ao microscpio ptico (objetivas de 10x e 40 x). Nesta tcnica, um erro bastante frequente confundir linfcitos com clulas de leveduras. A diferenciao feita pela refringncia da parede celular e das incluses no citoplasma das leveduras, alm da presena de brotamentos. Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cpsula polissacardica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim

Cpsula Polissacardica

Clulas em brotamento

Incluses citoplasmticas

Tinta da China

EXAME MICROSCPICO COM COLORAO PELO MTODO DE GRAM

Todos os fungos so Gram- positivos, assim a utilizao da colorao no visa a diferenciao dos microrganismos, mas possibilita discriminar elementos fngicos de artefatos existentes em urina, secrees e fezes. A amostra espalhada de modo homogneo, em movimentos circulares, em uma lmina de microscopia, fixada com calor e submetida colorao.

EXAME MICROSCPICO COM COLORAO PANTICA (GIEMSA, LEISHMAN OU WRIGHT)

Estas coloraes so usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diversas amostras biolgicas: medula ssea, sangue, aspirados e secreo cutnea. Nestes casos, faz-se um esfregao semelhante ao usado para colorao de Gram. Fixa-se com metanol e cora-se segundo o mtodo escolhido. Podem ser usadas ainda, para corar imprints de tecidos obtidos por bipsia. Abaixo esto esquematizados os principais aspectos morfolgicos observados ao exame microscpico e os possveis agentes etiolgicos de acordo com a amostra biolgica.

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Interpretao de aspectos amostras biolgicas

Amostra biolgica Pelos

morfolgicos

encontrados

em

exames

microscpicos

de

Aspecto Morfolgico a. Hifas hialinas e/ou artrosporos (1) a. Hifas regulares, septadas, ramificadas, hialinas, artrosporadas (1) b. Leveduras e pseudohifas c. Grupo de leveduras e/ou pequenas hifas tortuosas, hialinas (1)

Interpretao a. Dermatfitos a. Dermatfitos b. Candida spp c. Malassezia sp a. CRYPTOCOCCUS SP a. Fungos filamentosos hialinos (5) b. CRYPTOCOCCUS SP c. Candida spp d. Paracoccidioides brasiliensis

Unhas, escamas de pele

Lquor Secrees (trato respiratrio, vaginal, nasal, oral, naso-faringe)

a. Levedura capsulada (2) a. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (3) b. Levedura capsulada (2) c. Levedura e pseudohifa (1,3) d. Leveduras globosas ou multiformes, de parede espessa, incluses citoplasmticas, com mltiplos brotamentos (1) a. Hifas irregulares, largas, cenocticas (1,3) b. Hifas ramificadas, hialinas, septadas (1,3)

a. Zigomicetos b. Fungos filamentosos hialinos(5) d. Cromomicetos (agentes de cromomicose) e. Candida spp f. CRYPTOCOCCUS SP

c. Hifas septadas de cor castanha ou marrom (1,3) c. Feohifomicetos (fungos demcios) Tecidos, pus e aspirados (subcutneo, ganglionar, cerebral, pulmonar, mucosa ou outro) d. Estruturas ovaladas, com ou sem septos, de cor castanha (estruturas muriformes) (1) e. Levedura e pseudohifa (1,2) f. Levedura capsulada (2)

g. Levedura globosa ou ovide, de parede espessa, g. Paracoccidioides brasiliensis incluses citoplasmticas, com brotamento nico ou mltiplos (1) h. Leveduras pequenas, tipo charuto (achado muito raro) (3) i. Leveduras pequenas em macrfagos (4) h. Sporothrix schenckii i. Histoplasma capsulatum a. Fungos filamentosos hialinos (5) b. Candida spp a. Fungos filamentosos (5) b. CRYPTOCOCCUS SP c. Leveduras (6) d. Histoplasma capsulatum

Fludos oculares

a. Fragmentos de hifas, hialinas, septadas (1,3) b. Leveduras e pseudohifas (1,3) a. Fragmentos de hifas ramificadas, hialinas, septadas (3,4) b. Levedura capsulada (2) c. Leveduras em brotamento (3,4) d. Leveduras pequenas em macrfagos (4)

Sangue e medula ssea

(1) (2) (3) (4) (5)

Exame microscpico com KOH Exame microscpico com tinta nanquim Exame microscpico com colorao de Gram Exame microscpico com colorao de Giemsa ou pantica So fungos saprfitas que podem se tornar oportunistas, por ex. Aspergillus, Fusarium, Acremonium, cuja identificao s possvel pela cultura. (6) No sangue, leveduras do genero Candida no formam pseudohifas e a identificao de gnero e espcie possvel somente, aps isolamento em meio de cultura.

CULTURA DE AMOSTRAS BIOLGICAS PARA ISOLAMENTO DE FUNGOS

A amostra, aps o processamento, poder ser usada para isolamento do agente etiolgico. Para tanto, dever ser semeada em movimentos de estrias (zig-zag) sobre a superfcie de meios slidos de cultura, distribudos em alquotas de 12 a 20 ml, dentro de tubos de ensaio tamponados com tampo hidrfilo.

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MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura utilizados para o isolamento primrio de fungos, a partir de amostras biolgicas, podem ser adquiridos no comrcio, sob a forma desidratada, no precisando ser formulados no laboratrio. Aps a hidratao, conforme instrues do fabricante, o meio deve ser distribudo, de preferncia, em tubos e esterilizados por autoclavao. Para gar, recomenda-se a solidificao com tubo inclinado, deixando espao de 3 cm do final do meio at o tampo, para evitar contaminao via meio externo. Todos estes meios de cultura so distribudos e esterilizados, de preferncia em tubos de ensaio pois, desta forma, h maior resistncia desidratao e contaminao, alm de oferecer menor bio-risco na manipulao da cultura. O armazenamento dos tubos, contendo meios de cultura, deve ser em saco plstico fechado, dentro de armrios, temperatura ambiente. Desse modo, se houver uma contaminao durante o tempo de armazenamento, as colnias de fungos contaminantes sero facilmente observadas, ao contrrio do que ocorre, quando se armazena sob refrigerao. O controle de esterilidade deve ser feito por 7 dias, temperatura ambiente, antes do uso de qualquer meio de cultura. Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra, devem ser utilizados meios no seletivos, que permitam crescimento de fungos patognicos e bolores de crescimento rpido (< de 7dias). Estes fungos, apesar de serem contaminantes de meio ambiente, podem ser agentes de micoses em pacientes suscetveis, ou seja, so potencialmente, oportunistas. O isolamento desses fungos, em meio de cultura est sendo, cada vez mais, importante para diagnstico laboratorial das infeces ditas oportunsticas. O meio bsico em laboratrio de micologia o gar Sabouraud dextrose (ASD), chamado simplesmente, gar Sabouraud. Em regra, usa-se um antibitico para impedir o crescimento de bactrias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos. O cloranfenicol o mais indicado, pois resiste autoclavao. Pode ser colocado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos. Meios ditos seletivos para fungos patognicos, contm cicloheximida que inibe parcialmente, ou totalmente, fungos anemfilos. Estes meios so indicados para cultivo de materiais coletados de leses com suspeita de dermatofitose, para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatfitos. Mas, deve-se ressaltar que esta substncia poder inibir o isolamento de fungos oportunistas, como Aspergillus sp, alm de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras patognicas dos gneros Candida e Cryptococcus. Existem meios presuntivos que indicam presena de certos grupos de fungos ou determinados gneros, como por ex., gar contendo compostos fenlicos para Cryptococcus sp (gar contendo sementes de niger ou Guizzotia abssinica), ou gar especial para dermatfitos (Dermatophyte Test Medium). Existem ainda, meios presuntivos, por reao enzimtica e colorimtrica, de espcies de Candida spp (Candida Medium, ChromAgar, Biggy Agar, etc). So meios mais caros que ASD e alm disso, sua maior aplicao no isolamento primrio de leveduras, a partir de amostras biolgicas muito contaminadas, tais como: secreo vaginal, fezes e urina. A identificao, no entanto, feita somente, aps anlise morfolgica e fisiolgica. Para isolamento ou subcultivo de dermatfitos recomenda-se o gar batata, encontrado no comrcio, sob forma desidratada, para aumentar a esporulao e facilitar a identificao do gnero e espcie do fungo. Para fungos dimrficos, de crescimento lento (> 15 dias), recomenda-se o uso de meios enriquecidos como o gar infuso de cerebro-corao (BHI) para obteno, em menor tempo, de culturas melhor desenvolvidas. Pode ser acrescido de 5 a 10% de sangue de carneiro e de antibiticos (de preferncia, cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina). O meio de cultura pode ser selecionado segundo: tipo de amostra e agente etiolgico, conforme a suspeita clnica. De acordo com os aspectos observados ao exame microscpico da amostra, pode-se ainda, redirecionar o procedimento para isolamento do agente. Recomenda-se sempre 2 tubos de meio para semeadura da amostra biolgica, os quais devero ser incubados temperatura de 30C, usada atualmente, para todos os tipos de amostras.

GAR SABOURAUD-DEXTROSE (ASD)

Dextrose ........................................................40 g Peptona .........................................................10 g gar ..............................................................15 g gua destilada ..............................................1000 ml

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Dissolver os componentes na gua destilada. Acertar o ph em 5,6 . Aquecer at a completa dissoluo. Distribuir cerca de 10 ml por tubo. Esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.

GAR SABOURAUD-DEXTROSE COM CLORANFENICOL

Dissolver 100 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C. Adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao.

GAR-SABOURAUD-DEXTROSE COM CLORANFENICOL E CICLOHEXIMIDA

(MEIOS COMERCIAIS MYCOSEL, MICOBIOTIC AGAR OU MEIO SELETIVO PARA FUNGOS)

Diluir separadamente 400 mg de cicloheximida (Actidione) em 10 ml de acetona. Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C. Misturar as solues e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilizao. pH= 7,0

BRAIN HEART INFUSION AGAR COM CLORANFENICOL (BHI)

Dissolver 50 mg de cloranfenicol em 10 ml de lcool 95C. Adicionar em 1 litro de BHI desidratado antes da esterilizao.

PROCEDIMENTOS PARA CULTURA

Os materiais devidamente, processados devem ser semeados na superfcie dos meios de cultura, com ala de nquel-cromo ou pipeta Pasteur, com movimentos em estrias em zig-zag, para permitir separao de eventuais contaminantes da amostra. O material no deve ser colocado em profundidade no gar, mas apenas aderido superfcie do meio.O ASD o meio mais utilizado, por ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fungos, com rarssimas excees. A temperatura de incubao recomendada, para todas as amostras 30C, devido a possibilidade de o agente etiolgico ser oportunista, e desse modo, crescer melhor a 30C do que a 37C, no primo isolamento. Alm disso, pensando em Brasil, em que, as temperaturas so muito altas na regio norte e nordeste, dificilmente alcanam 25C, a menos que se utiliza estufa BOD (body oxigen demand). A temperatura de 30C verificada, mais facilmente, durante muitas horas do dia. Hemoculturas fazem parte da rotina diagnstica para casos de infeco hospitalar e merecem algumas recomendaes parte, para isolamento de fungos. Os frascos contendo meio bifsico e sangue ou aspirado de medula ssea, devem ser submetidas agitao manual peridica, para maior homogeneizao do oxignio na fase lquida do frasco. Exames macroscpicos dirios da superfcie da fase slida so indicados para verificar aparecimento de colnias de: leveduras dos gneros Candida sp, Cryptococcus sp e outros (24 h-7 dias), fungos filamentosos e Sporothrix schenckii (2 a 15 d) e fungos dimrficos, como: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum (15 a 30d). Qualquer colnia de fungo deve ser repicada em ASD, para posterior identificao. O crescimento de fungos, ao contrrio de bactrias, no resulta em turvao imediata do meio lquido, de modo que, a anlise microscpica de uma gota do meio, abrevia o prazo de resultados positivos. Recomenda-se a pesquisa microscpica do crescimento de fungos corando por Gram, duas gotas do meio liquido, periodicamente, em cada um dos perodos acima citados. Alm do exame microscpico da fase lquida, um procedimento que resulta em maior sensibilidade da cultura, a realizao de repiques de 1 ml da fase lquida, para tubos contendo ASD ou BHI, em dias alternados: 2, 10 e 30 dia. Visto que a maioria dos laboratrios brasileiros no trabalha com o meio bifsico, pode-se inocular a amostra, na mesma proporo de 10%, em frascos de hemocultura bacteriolgica e fazer a leitura como anteriormente, descrito. Entretanto, sistemas automatizados para hemoculturas, que acusam o crescimento de qualquer microrganismo em at 7 dias, no permitem identificar a presena de fungos de crescimento mais lento. Nesses casos, a incubao por periodo de at 30 dias, com repiques do caldo em ASD. O procedimento para sangue e aspirado de medula ssea, denominado lise-centrifugao, no muito difundido no Brasil, pelo custo de importao do sistema. O material biolgico inoculado diretamente no frasco do sistema, que contem

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saponina, que lisa as clulas liberando assim os microrganismos intracelulares. A seguir, deve-se realizar centrifugao que direcionar os elementos fngicos para o fundo do tubo que j contem o meio de cultura. O sobrenadante desprezado e, desta forma, a cultura foi realizada, evitandose subcultivos, que so necessrios quando se inocula o material em meios bifsicos ou lquidos. A incubao feita a 37C por perodo de at 30 dias. Abaixo esto os procedimentos recomendados para exame direto e cultura, visando obter melhor rendimento no isolamento primrio de fungos, de acordo com tipo de amostra biolgica. Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos, segundo amostra biolgica
AMOSTRA BIOLGICA PROCESSAMENTO - Fluidificao (recomendada) - Centrifugao - Uso do sedimento EXAME MICROSCPICO a fresco KOH a 20% Giemsa Tinta nanquim MEIO DE CULTURA* - ASD - BHI

Secreo respiratria

Lquor

- Centrifugao - Uso de sedimento - Centrifugao - Uso de sedimento - Centrifugao - Uso de sedimento - Nenhum

- Tinta nanquim - Gram - a fresco - Gram - KOH a 20% - Giemsa - KOH a 20% - Giemsa - Gram

- ASD

Urina** Fludos corporais (pleural, asctico, sinovial,

pericrdico, gstrico, brnquico)

- ASD

- ASD - BHI - ASD - BHI - ASD

Pus e secrees de abscessos

swab embebido em salina - Centrifugao (mucosa oral, nasal, - Uso de sedimento vaginal, anal, olhos, conduto auditivo) Pele, pelos e escamas Tecidos e peas - Nenhum - Fragmentao ou macerao - Imprint em lmina - Semeadura em meio de cultura - Esfregao ou distenso em lmina

- KOH a 20% - KOH a 20% - Giemsa - Tinta naquim - Giemsa

- ASD - ASD e BHI

Sangue e medula ssea

- BHI bifsico ou lquido - ASD bifsico ou lquido

* Todos os meios slidos, para isolamento de fungos devem conter cloranfenicol. ** Para contagem de colnias (UFC/ml), semear 0,1 ml de urina em ASD distribudo em placa de Petri, antes de centrifugar.

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4. IDENTIFICAO DE FUNGOS
O profissional de laboratrio deve tentar identificar todas as culturas positivas e emitir o resultado mais acurado possvel. Muitas vezes, o exame microscpico da amostra suficiente para medidas de controle da infeco, outras vezes somente o isolamento e identificao do fungo pode orientar a conduta clnica. A identificao dos fungos, de modo ideal, deve contemplar o gnero e a espcie; porm, muitas vezes, isso no possvel, pelo grau de dificuldade e complexidade do exame. Nestes casos a identificao do grupo de fungos, suficiente para o diagnstico de micose, por ex., zigomicetos, feo-hifomicetos, dermatfitos, leveduras, etc. O isolamento de um fungo em meio de cultura no significa, necessariamente, que ele o agente etiolgico da infeco. A presena de fungos na microbiota (flora) de pacientes, por ex. Candida sp e no meio ambiente, por ex. Aspergillus sp, pode resultar em cultura positiva. Isto explica o grande nmero de culturas positivas para fungos, a partir de uma amostra biolgica. A relao entre o fungo isolado em meio de cultura e sinais e sintomas, critrio clnico-epidemiolgico. No entanto, deve-se sempre valorizar o isolamento de um fungo procedente de: Qualquer amostra biolgica que mostrou resultado positivo ao exame microscpico Micose cutnea Fludos corporais normalmente estreis Tecidos obtidos por bipsias ou peas operatrias Urina, obtida por sondagem ou cistoscopia, independente da contagem de colnias Raspado de crnea Paciente imunodeprimido (transplantado ou com Aids) Paciente em uso de antibiticos por longo tempo, internado em unidade de terapia intensiva ou submetido a ventilao, cateterismo ou outras manipulao Paciente de hemodilise ou debilitado que apresente algum sintoma ou sinal de doena infecciosa independente do tipo de amostra clnica Alm desses casos, tm importncia as culturas de fungos: Dimrficos Isolados mais de uma vez, do mesmo tipo de amostra biolgica, coletada em diferentes dias e procedentes do mesmo paciente Isolados de ponta de cateter (alimentao parenteral, infuses venosas, etc.)

IDENTIFICAO DE LEVEDURAS (Morfolgica e Bioqumica)

A morfologia das leveduras, ao contrrio do que ocorre com os bolores, no apresenta muita diversidade e, portanto, nem sempre um parmetro suficiente para sua identificao. Em determinadas situaes, no entanto, a identificao rpida, simples e presuntiva pode ser feita, contribuindo para o diagnstico do quadro infeccioso. Desse modo, se a levedura apresenta hifas hialinas e ramificadas, sugestivo do gnero Candida sps e se, alm disso, desenvolver clamidsporos -clulas de reserva- ou tubos germinativos, em determinadas condies in vitro, identificada como Candida albicans. Outros gneros, tais como, Cryptococcus, Rhodotorula, Geotrichum e Trichosporon, tambm podem, na grande maioria das vezes, ser identificados apenas, por sua morfologia caracterstica. O restante dos gneros e espcies, porm, necessita de provas bioqumicas para sua identificao. No entanto, do ponto de vista clnico, nem sempre importante a identificao acurada da levedura. Por outro lado, a identificao, pode ter interesse epidemiolgico. Para leveduras relacionadas a episdios de infeco hospitalar, por ex., h grande preocupao no estudo das espcies dos agentes, como marcador epidemiolgico temporal e espacial de infeces, como no caso de espcies de Candida que tm menor sensibilidade a antifngicos azlicos. Colnias de levedura obtidas de amostra biolgica, s devem ser identificadas, quando estiverem puras, ou seja, sem contaminao bacteriana ou em mistura de espcies. Para tanto, deve ser realizado o plaqueamento de cada colnia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza, por microscopia. De cada colnia deve ser feito um repique em ASD para sua identificao.

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As provas fisiolgicas mais comuns e mais simples para identificao de Candida albicans e Candida sp so: tubo germinativo e filamentao em cultivo em lmina. No cultivo em lmina, avalia-se a capacidade de produo de hifas hialinas ramificadas que podem se fragmentar em esporos, denominados artrocondios. Estas hifas ocorrem nos gneros Geotrichum e Trichosporon. Caso a levedura forme hifas hialinas ramificadas sem fragmentao, provavelmente pertence ao gnero Candida e se houver formao de clamidsporos caracteristicos, Candida albicans. A pesquisa de cpsula, caracterstica marcante do gnero Cryptococcus feita com uma gota de tinta nanquim e uma alada da cultura. A cpsula, constituda de material polissacardico, aparece como um halo claro ao redor dos blastocondios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lmina. A prova de urease, disponvel em todo laboratrio de microbiologia muito utilizada em micologia. A reao positiva para urease, junto com anlise morfolgica permite identificao presuntiva de Cryptococcus sp. Leveduras do gnero Rhodotorula so tambm urease positiva mas, como em regra, apresentam colnias com pigmento avermelhado ou salmo, so facilmente distinguidas de Cryptococcus sp. Outros gneros incluindo Candida sp, produzem urease, mas tem outras caractersticas para sua identificao. O esquema abaixo prope um fluxo para identificao das principais leveduras de interesse mdico. Se as provas no conduzirem identificao presuntiva do gnero, provas de assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de carboidratos (zimograma) devem ser realizadas e interpretadas segundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste captulo. Um exemplo simplificado a Tabela 1. Esquema simplificado para identificao de alguns gneros de leveduras
Tubo Germinativo

Positivo Candida albicans

Negativo

Cultivo em lmina

Hifas

Somente blastocondios

Artrosporadas

no-artrosporadas + blastocondios Candida albicans

Prova da Urease

com blastocondios Trichosporon sp

sem blastocondios Geotrichum sp

Positiva

Negativa

Associar cor da colnia

Laranja, Avermelhada, Salmo Rhodotorula sp

Branca Bege Associar pesquisa de cpsula

Positiva Cryptococcus sp

Negativa

Auxanograma e Zimograma

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PROVA DO TUBO GERMINATIVO

A partir de uma alada da colnia isolada, fazer uma suspenso em tubo de ensaio contendo 0,5 ml de soro humano (pode-se usar tambm soro estril de bovino, cavalo ou coelho). Incubar a 37C durante perodo mximo de 3 horas. Este prazo importante porque, aps esse perodo, outras espcies de Candida e de outros gneros, formam tambm tubo germinativo. Depositar ento, uma gota da suspenso sobre lmina, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio ptico. A presena de tubo germinativo, na forma de pequeno filamento que brota do blastocondio, sem formar constrico com a clula-me, permite a identificao presuntiva de Candida albicans.

Prova do tubo germinativo com blastocondios, tubo germinativo e pseudo-hifas de Candida albicans

CULTIVO EM LMINA PARA PROVA DE FILAMENTAO E CLAMIDSPORO

Depositar 3 ml de gar-fub fundido, sobre uma lmina contida sobre um suporte dentro de uma placa de Petri. O suporte para a lmina pode ser um basto de vidro, outra lmina ou apenas dois palitos de madeira Aps solidificao do meio, semear a levedura, com auxlio de uma agulha em L, fazendo 2 estrias paralelas. Recobrir as estrias com lamnula esterilizada. Fazer uma cmara mida, acrescentando 2 ml de gua destilada estril na placa, ou embebendo um algodo estril, para evitar dessecao do meio, durante o perodo de incubao da prova. Tampar a placa e aps 24h, 48h e 72h, examinar a preparao em microscpio tico. A presena de hifas hialinas, septadas e ramificadas, caracterstica o gnero Candida e se houver formao de clamidsporos indica Candida albicans. Formao exclusiva de artrsporos permite identificao de Geotrichum, mas quando so formados tambm blastocondios trata-se de Trichosporon. O meio de gar fub ou farinha de milho pode ser adquirido no comrcio (CornMeal agar) mas sua formulao simples , ressaltando-se que de todos as maneiras, deve-se acrescentar a substncia tensoativa tween 80, para que a prova d resultados confiveis. O meio tem a seguinte composio e preparo:

Meio gar Fub Fub 20 g gar 10 g Tween 80 5 ml

Adicionar o fub em 250 ml de gua e ferver at borbulhar. Filtrar o fub em gaze dobrada em quatro. Dissolver o gar em 250 ml de gua. Restaurar o volume da infuso de fub para 250 ml, com gua quente, juntar as suspenses, ajustar o pH para 6,6 6,8 e adicionar o Tween 80. Distribuir volumes de 5 ml em tubos e esterilizar em autoclave a 120C por 15 minutos.

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Cultivo em lmina para prova de filamentao e clamidsporo

Lmina

Basto de vidro

Lamnula

3 estrias com inculo da levedura

gar fub

gua estril sobre papel de filtro

PROVA DA UREASE
Semear uma alada da levedura na superficie do meio de urease (gar uria de Christensen). Incubar temperatura de 37C. A mudana da cor do meio para rosa bispo em 24 h, indica reao positiva.

PROVA DE ASSIMILAO DE FONTES DE CARBONO E NITROGNIO OU AUXANOGRAMA

Nessa prova so usados 2 meios, que podem ser adquiridos no comrcio, na forma desidratada (Yeast Nitrogen Base e Yeast Carbon Base) ou formulados. A levedura semeada "pour plate", homogeneizando-se 2 ml de uma suspenso das colnias, a cada meio fundido ou semeada na superfcie de cada um dos meios, previamente, distribudos em 2 placas de Petri. So ento adicionadas pequenas alquotas de diferentes carboidratos que servem de fonte de carbono, sobre a superfcie do meio isento de carbono. Vrias substncias, incluindo lcoois, protenas e aminocidos servem de fontes de nitrognio e so colocadas sobre a superfcie do meio isento de nitrognio. Aps incubao temperatura ambiente ou 25C, por perodo de uma semana, a levedura ir assimilar e crescer em volta de determinadas fontes, de acordo com o metabolismo caracterstico de sua espcie. A leitura feita pelo halo de turvao resultante do crescimento e indica prova de assimilao positiva para a respectiva fonte. Os resultados so comparados a tabelas existentes na bibliografia recomendada e um exemplo simplificado consta na tabela abaixo. Identificao das principais leveduras de interesse mdico
Levedura Tg Cultivo em lmina Hifa Ar + + + + + + + + + Ur Sa + V + + + + + + + + + Ma + + + + + + V + La + Assimilao Ce V V + V + V Tr + + + + + + V + V Ra + + + + V V + + X + + + + + + + + I + V NO3 Gl + + + + + + V + Sa V + + Fermentao Ma + + + La Ra + + Tr V + V V + V

C. albicans C. tropicalis C. parapsilosis C. krusei C.guilliermondii C. glabrata C. neoformans Geotrichum Trichosporon Rhodotorula sp Saccharomyces

+ -

Tg = tubo germinativo, Ar = artrsporo, Ur= urease, Sa = sacarose, Ma=maltose,La = lactose, Ce = celubiose, Tr = trealose, Ra = rafinose, X = xilose, I = inositol,NO3 = nitrato, Gl = glicose, + = pos, - = neg, V= varivel

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FERMENTAO DE ACCARES OU ZIMOGRAMA

A capacidade de fermentar carboidratos, ao lado do auxanograma, ir completar o perfil bioqumico da levedura permitindo, em regra, a identificao acurada de gnero e espcie (QUADRO 3). As caractersticas morfolgicas so fundamentais para concluir a identificao, desde que diversas espcies tm perfis bioqumicos idnticos, mas morfologias distintas. Para o zimograma, diversas fontes de carboidratos so colocadas em tubos respectivos, contendo meio bsico lquido. A levedura semeada em cada tubo e aps perodo de at 15 dias a 25C, a fermentao revelada por formao de bolhas de gs, observadas dentro de tubos de Durhan, colocados previamente, durante a preparao do meio bsico.

IDENTIFICAO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

A identificao de fungos filamentosos tem, como fundamento, a observao da morfologia da colnia e aspectos microscpicos. A anlise da colnia visa observar: cor, textura, superfcie, pigmento difusvel no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primria do fungo. Porm, o mais adequado a anlise a partir da colnia gigante, ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de gar distribudo em placa de Petri. A velocidade de crescimento, que pode ser rpida (< 7 dias), intermediria (8 a 14 dias) ou lenta (> 15 dias) fundamental para identificao presuntiva do fungo. A observao das estruturas microscpicas, tais como: hifa hialina ou demcia, septada ou cenoctica, forma, disposio e formao dos esporos, so suficientes, em geral, para a identificao de fungos filamentosos. Em alguns grupos porm, como os fungos demcios, pode ser necessrio tambm uso de provas bioqumicas. A morfologia microscpica melhor visualizada com a tcnica de microcultivo que preserva a disposio original dos esporos sobre as hifas e mantm ntegras certas estruturas formadoras de esporos, por ex. esporngios que so rgos de reproduo de zigomicetos. Os fungos filamentosos, patognicos ou contaminantes ambientais, potencialmente oportunistas, formam um grupo muito extenso, impossvel de ser tratado neste Manual. Para identificao das diversas espcies ou grupos existe bibliografia especializada de textos, manuais e atlas, indicados no final deste captulo. Dentro do objetivo deste Manual sero ilustrados aspectos microscpicos de alguns fungos de interesse em medicina (vide Figuras adiante).

TCNICA DE MICROCULTIVO PARA FUNGOS FILAMENTOSOS

Colocar sobre uma lmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estril, um cubo de gar: ASD ou gar batata. A lmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lmina, ou um pequeno basto de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fsforo. Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de gar. Recobrir com uma lamnula esterilizada. Fazer uma cmara mida, adicionando 1 a 2 ml de gua destilada estril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumao de algodo estril, para evitar a dessecao do meio de cultura, durante o crescimento do fungo. Tampar a placa e deixar temperatura ambiente por 7 a 10 dias, at que se observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentao. Aps esse perodo, inativar a esporulao, adicionando 1 ml de formol ao algodo e vedando a placa com fita adesiva durante 24h-48h. O vapor de formaol, alm de inativar o fungo, ir auxiliar na fixao das estruturas microscpicas. Retirar a lamnula com auxlio de uma pina, cuidadosamente, uma vez que nela devero estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodo (Cotton Blue) e montar sobre uma lmina. Desprezar o cubo de gar e, em seu lugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com lamnula, para visualizar esporos e hifas tambm aderidos lmina. Observar em microscpio tico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma disposio e formao de esporos. O corante azul de lactofenol-azul algodo, utilizado na microscopia de culturas de fungos filamentosos, formulado e preparado da seguinte forma:

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Azul de lactofenol-algodo cido ltico Cristais de fenol Glicerina Azul algodo gua destilada

20g 20g 20g 0,05g 20g

Fundir os cristais de fenol em banho-maria e juntar Esperar 24 h e filtrar O azul algodo pode ser substitudo pelo azul de metileno. Tcnica de microcultivo para anlise microscpica de fungos filamentosos

Lmina

Basto de vidro

Lamnula

4 inculos de fungo nas laterais do cubo

Cubo de gar

gua estril sobre papel de filtro

Fungos anemfilos de hifas hialinas e septadas (hialohifomicetos)

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FUNGO ANEMFILO DE HIFAS SEPTADAS E MARRONS (DEMCIO)

Cladosporium

FUNGO ANEMFILO DE HIFAS HIALINAS E CENOCTICAS (ZIGOMICETO)

Dermatfitos agentes de micoses cutneas Rhizopus

Dermatfitos agentes de micoses cutneas

IDENTIFICAO DE FUNGOS DIMRFICOS

Dimrficos so fungos filamentosos que podem, sob determinadas condies, assumir forma de levedura, diminuindo a capacidade de filamentao e dividindo-se por brotamento, conferindo s colnias aspecto cremoso. Esta fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30C, de preferncia a 37C. So fungos de crescimento lento (>15 dias) no primo-isolamento (Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis ou moderado (8 a 14 dias), como Sporothrix schenckii. A identificao feita pela comprovao do dimorfismo e pelo aspecto microscpico caracterstico de cada fase.

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Paracoccidioides brasiliensis in vivo e in vitro (37C).

Histoplasma capsulatum (a) e Sporothrix schenckii (b) in vitro (25C).

Mod VII - 19

5. DESCRIO DAS PRINCIPAIS MICOSES

As localizaes topogrficas mais frequentes, relacionadas aos agentes fngicos, sero apresentadas de forma resumida. Agentes etiolgicos e localizaes topogrficas
Dermatfitos Trato respiratrio Sangue Osso Medula ssea Pele e Unha Pelo Crebro Lquor Ouvidos Olhos Fgado e Bao Naso-faringe Mucosas Tecido subcutneo e gnglios Trato urinrio Trato gastrointestinal X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X H. capsulatum X X P. brasiliensis X X X X S. schenckii Aspergillus sp X X X Candida sp X X X C. neoforman X X X Zigomicetos X X

X X

X X

DERMATOFITOSES (TINEAS)
So infeces fngicas limitadas s camadas superfciais queratinizadas da pele, pelos e unhas, popularmente, conhecida como epinge ou frieira, dependendo da localizao das leses que so extremamente pruriginosas. Em imunodeprimidos podem acometem tecidos subcutneos. Agentes etiolgicos: Microsporum spp, Trichophyton spp e Epidermophyton floccosum Ocorrncia: universal, acometendo indivduos de qualquer idade, sexo ou raa. Fontes de infeco: contgio direto com animais, solo ou indivduo infectado. Procedimento laboratorial: Amostra: escamas de pele, unha e cabelos Exame da amostra com KOH a 20%, revela hifas regulares, hialinas, septadas, refrigentes, frequentemente artrosporadas. Cultura: material deve ser semeado em ASD, com auxlio de uma ala em L, de forma a ficar em perfeito contato com o meio de cultura. As colnias de dermatfitos geralmente, crescem a partir do 10 dia de incubao temperatura ambiente e os fungos so identificados pela sua morfologia macroscpica e microscpica. No Brasil, os dermatfitos mais freqentes so T. rubrum e M. canis. Mod VII - 20

PARACOCCIDIOIDOMICOSE
Doena granulomatosa, crnica que pode acometer pele, mucosas, linfonodos, sistema respiratrio, trato gastrointestinal, adrenais, fgado, bao e SNC. Apresenta grande variabilidade de manifestaes clnicas, desde formas localizadas at formas disseminadas de mau prognstico, na dependncia da resposta imune do hospedeiro. Existe tambm a paracoccidioidomicose-infeco, em que o indivduo no apresenta sinais e sintomas mas, demonstra por testes intradrmicos positivos, que entrou anteriormente, em contato com o fungo. Apresenta muitas semelhanas com a tuberculose. Agente etiolgico: Paracoccidioides brasiliensis Ocorrncia: pases da Amrica Latina, principalmente Brasil. Procedimento laboratorial: Amostra: raspado de leso e mucosa, secreo do trato respiratrio, aspirado de linfonodos, tecido obtido por bipsia. Exame direto com KOH a 20% revela a presena da forma leveduriforme constituda de clulas grandes (10m a 60 m), globosas, com parede celular dupla e refringente e com mltiplos brotamentos, semelhana de roda de leme, orelhas de Mickey Mouse ou argolas entrelaadas. Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (> 15 dias). Culturas desenvolvidas a < 30C so filamentosas, de cor branca, cotonosa, com sulcos centrais, composta de hifas hialinas finas, septadas e fragmentadas em esporos multiformes. As colnias incubadas entre 30C a 35C so de cor creme, pregueadas e enrugadas, cuja microscopia revela as formas caractersticas leveduriformes que permitem a identificao do agente.

HISTOPLASMOSE
Doena que acomete primariamente o sistema retculoendotelial. A infeco pode ser localizada ou generalizada. A histoplasmose primria afeta o sistema respiratrio e a histoplasmose progressiva atinge fgado, bao, linfonodos, mucosas, mdula ssea, etc. Em indivduos hgidos, a infeco tem bom prognstico porm atualmente, importante infeco oportunista associada Aids, nos quais ocorre a forma grave e disseminada. Agente etiolgico: Histoplasma capsulatum Ocorrncia: distribuio universal, principalmente em pases de clima temperado. Fontes de infeco: inalao de esporos presentes em aerossis formados por solos contaminados com excretas de galinhas e morcgos. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, sangue, puno de mdula ssea, tecido obtido por bipsia de mucosas e outros. Exame microscpico direto, sem colorao, requer muita habilidade do tcnico. Recomenda-se colorao por Giemsa, para melhor visualizao do agente em de cortes histolgicos, onde se evidencia sob imerso, pequenas leveduras (2-5 m), intracelulares, dentro de clulas mononucleares. Cultura: fungo dimrfico de crescimento lento (15 a 30 dias) sendo que no primo-isolamento mais fcil obter a forma filamentosa de cor branca, aspecto cotonoso e sulcado, temperatura < 30C. A confirmao do dimorfismo feita atravs de repique em meio rico (BHI) e incubao entre 30C e 35C. A transformao da forma filamentosa ou miceliana fase leveduriforme, vista com a formao de pequenas (2-5 m) leveduras em brotamento. A identificao porm, feita pela micromorfologia da forma filamentosa, com a observao de esporos grandemacrocondios- arredondados e com inmeras espculas ou granulaes na parede celular, chamados hipnsporos ou esporos tuberculados.

ESPOROTRICOSE
Infeco crnica cuja forma clnica mais freqente em nosso meio a forma linfangtica nodular ascendente. Atinge em geral, uma das extremidades sob forma de leso ulcerada no ponto de inoculao e acomete a drenagem linftica regional com formao de gomas no trajeto. As formas disseminadas so raras, em paciente imunocompetentes, mas frequentes em pacientes com Aids.

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Agente etiolgico: Sporothrix schenckii Ocorrncia: doena de distribuio universal que acomete principalmente, trabalhadores rurais e floristas. Procedimento laboratorial: Amostra: aspirado das leses gomosas ou tecido subcutneo. Exame microscpico da amostra apresenta baixa sensibilidade mas, exame de cortes de tecido corados, pode revelar leveduras em forma de charuto ou apenas formas ovaladas com diviso em brotamento (blastocondios). Cultura: fungo dimrfico que se desenvolve bem em ASD, entre 7 a 12 dias e cuja forma filamentosa (< 30C) apresenta hifas hialinas finas e septadas com esporos disposto em arranjo semelhante flor "margarida". A forma leveduriforme (> 30C), no caracterstica do gnero e requer meios ricos acrescidos de sangue, cisteina e submetidos a tenso de CO2. O interesse na obteno da fase leveduriforme para a diferenciar o agente da esporotricose, do gnero Sporothricum, fungo filamentoso no-dimrfico e anemfilo de meio ambiente. A forma filamentosa apresenta na microscopia a forma adequada para identificao do agente.

ASPERGILOSE
A aspergilose pode se apresentar em indivduos imunocompetentes, como leses localizadas em unhas, ps, canal auditivo, olhos e forma bronco-pulmonar alrgica. Em pacientes imunocomprometidos, tende forma disseminada ou cerebral, de alta letalidade, geralmente, associada a neutropenia ou doenas debilitantes. Agente etiolgico: Aspergillus fumigatus (o mais comumente isolado) Ocorrncia: tem distribuio universal. crescente o nmero de relatos desta doena como infeco secundria em pacientes em tratamento prolongado com antibitico e corticosterides, doenas debilitantes como carcinoma, tuberculose, pacientes neutropnicos, e em leses de tecidos subcutneos, da pele ou da crnea. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo do trato respiratrio, material de bipsia e lavado brnquico. O exame microscpico revela hifas septadas e hialinas, com 4 a 6 m de dimetro e que se ramificam em ngulo de at 45. Cultura: colnias de Aspergillus fumigatus, a espcie mais associada doena em humanos, podem ser facilmente, isoladas em ASD, em at 7 dias (crescimento rpido) com desenvolvimento, na superfcie do meio, de filamentos brancos-hifas - que se tornam verde a verde-acinzentado, com a formao de esporos.

CRIPTOCOCOSE
A criptococose uma infeco subaguda ou crnica que envolve primariamente, os pulmes, com tropismo pelo sistema nervoso central -meninges-, podendo atingir pele e outros tecidos. Agente etiolgico: Cryptococcus neoformans Ocorrncia: no homem, a distribuio da doena universal. Procedimento laboratorial: Amostra: lquor, secreo do trato respiratrio ou de leso de pele, aspirado de formao tumoral subcutnea e tecidos obtidos por bipsia. O exame laboratorial dever incluir urina, de preferncia aps massagem prosttica, para monitorar a presena do agente na prstata que constitui seu rgo de reserva. Exame obrigatoriamente, com tinta nanquim para observao de clulas capsuladas, com dimetro varivel, entre 5 m a 20 m, que sugerem Cryptococcus sp. Cultura: secreo do trato respiratrio, lquor e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer outro meio, desde que no contenham cicloheximida que inibe Cryptococcus. O agente cresce rpido (< 7 dias) entre 25C e 37C, sob forma de colnias mucides de colorao creme parda. A identificao de gnero e espcie feita atravs de provas bioqumicas, como: teste da urease e auxanograma.

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CANDIDASE
Candidiase uma doena com manifestaes clnicas variadas. As infeces aguda e crnica mostram leses na boca, faringe, pele, unhas, sistema broncopulmonar, intestinal e perianal. Ocasionalmente, endocardite, meningite, fungemia ou infeces em outras localizaes podem ser observadas. Agentes etiolgicos: Candida albicans e outras espcies, que esto freqentemente, envolvidas em casos de micoses oportunistas em pacientes debilitados. So os principais agentes etiolgicos de Infeces hospitalares. As espcies de Candida podem ser isoladas de vrios locais do corpo humano, como microbiota normal de cavidade oral, mucosa vagina, regio perianal e trato gastrointestinal. Ocorrncia: - universal, incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para desenvolvimento da doena, tais como: desnutrio, obesidade, diabetes, gravidez, antibioticoterapia, quimioterapia e uso de corticosterides, manipulao endovenosa inadequada, neoplasias e outras doenas debilitantes. Procedimento laboratorial: Amostra: (depender da sintomatologia clnica) fragmentos de pele e unhas; raspados da mucosa oral, vaginal ou anal; secreo do trato respiratrio, sangue, liquor, urina e fezes. Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com soluo de KOH 20%. Secreo do trato respiratrio ou material de mucosa podem ser examinados pela colorao de Gram. A levedura aparece como clulas arredondadas, com brotamentos com ou sem hifas. Pequenas clulas podem ter dimetro de 2-6m, mas formas maiores so tambm observadas. Cultura: o crescimento rpido (24-72h) entre 25C e 37C. O aparecimento ocorre em torno de 3 a 4 dias, com formao de colnias com colorao branca bege. A habilidade de formar tubo germinativo e/ou clamidsporos na prova de cultivo em lmina, permite a identificao de C.albicans. Para a identificao das outras espcies do gnero Candida deve-se, alm do cultivo em lmina, procecer-se assimilao de fontes de carbono e nitrognio (auxanograma) e fermentao de fontes de carbono (zimograma) .

ZIGOMICOSE
Infeco geralmente, subaguda de evoluo rpida que acomete indivduos debilitados, transplantados, diabticos descompensados ou ainda com Aids. Pode acometer seios paranasais, tecido subcutneo, pulmo e vasos sanguneos, causando embolia no SNC e trombose. A micose, em indivduos imunodeficientes , em geral, fatal se o diagnstico no for rpido e o tratamento especfico no for prontamente, estabelecido. Agentes etiolgicos: fungos da classe dos Zigomicetos, compreendendo os gneros Mucor, Rhizopus e Absidia, entre outros. Ocorrncia: distribuio universal. Procedimento laboratorial: Amostra: secreo de sinus nasal ou tecidos obtidos por bipsia de seios paranasais ou leses subcutneas. Exame com KOH a 20%, revela hifas hialinas e largas (6-50m), cuja caracterstica principal a ausncia de septos, que caracterizam as hifas cenocticas, desse grupo de fungos. Cultura: fungos de crescimento rpido (< 72 h) a 25C em ASD, com hifas ereas abundantes. A identificao feita pela microscopia da colnia que evidencia hifas cenocticas e esporos contidos dentro de estruturas fechadas denominads esporngios.

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