Extrao e Caracterizao

Espetroscpica da
Mioglobina da Carne
Bioqumica Experimental II
Faculdade de Cincias
Licenciatura em Bioqumica
PL23 | Grupo 1
2013/2014
Alexandra Lana 43230
Olena Mukan 44359
Patrcia Antunes 43149
Patrcia Sequeira 43242
Docente: Maria Lusa Serralheiro
Mioglobina
Objetivos Gerais
Extrao e identificao das formas reduzida e oxidada da Mioglobina atravs das
duas propriedades espetrais.
Estudo das reaes redox de interconverso das espcies.
2
Mioglobina
Protena monomrica
Massa molecular: 16,949Da
Armazenamento e transporte de oxignio
Possui um grupo heme
Msculos cardaco e esqueltico
Figura 1 Diversas representaes da
estrutura da Mioglobina.
3
Figura 2 Representao da estrutura da
Mioglobina.
4
Transporte de Oxignio
Oxignio pouco
solvel em solues
aquosas
Difuso do oxignio
pelos tecidos
ineficiente
Nenhuma das cadeias
laterais das protenas
adequada para a
ligao reversvel do
oxignio.
Metal de
Transio
Ferro
Cobre
Tm de possuir elevada
tendncia para ligao
ao oxignio
5
Ferro nas protenas
Ferro Livre Espcies altamente
reativas de oxignio
Danos no DNA
e noutras molculas
Ligao a estruturas
que sequestram e/ou o
tornam menos reativo.
Grupo Heme
Composto associado de modo
permanente a uma protena e
que contribui para a funo
dessa protena.
6
Grupo Heme
Complexa estrutura orgnica em anel: porfirina IX qual est ligada um
nico tomo de Fe no
estado ferroso.
Carcter doador de
eletres pelo que ajudam
a impedir a converso do
ferro do heme (estado
ferroso) para frrico.
Estado ferroso: liga o oxignio de
forma reversvel.
Estado frrico: no liga o oxignio.
Figura 3 Grupo Heme.
7
Met-Mb e Oxy-Mb
Figura 4 Representao das
duas ligaes de coordenao
do Fe perpendiculares ao
plano do sistema do anel da
porfirina.
8
Met-Mb e Oxy-Mb
Met-Mb Oxy-Mb
oxidao
reduo
[FeIII-H2O-Mb]
[FeII-O2-Mb]
Figura 5 Representao da forma Met-Mb.
Figura 6 Representao da formaOxy-Mb.
9
Procedimento
Esquema 1 Procedimento do trabalho realizado.
10
Met-Mb e Oxy-Mb
Soluo A
A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,0549g de ferricianeto de potssio,
conduzindo produo de Met-Mb:
Fe
2+
-O
2
-Mb + K
6
[FeCN
6
] Fe
3+
-H
2
O-Mb (Equao 1)
Soluo B
A 5mL do sobrenadante juntou-se 0,1135 g de ditionito de sdio,
conduzindo produo de Oxy-Mb:
Fe
3+
-H
2
O-Mb + Na
2
S
2
O
4
Fe
2+
-O
2
-Mb (Equao 2)
11
Anlise dos Espetros
Sobrenadante
Soluo A
Soluo B
Anlise dos Espetros
12
Espetros de Absoro no UV-Visvel
Amostra Regio Visvel Regio de Soret
Met-Mb 635nm 504nm 409nm
Oxy-Mb 580nm 542nm 417nm
348nm
Quadro 1 Picos de absoro das formas da mioglobina na regio do visvel e na regio de Soret.

409

= 179
1
.
1

417

= 128
1
.
1
13
Espetros de Absoro no UV-Visvel - Sobrenadante
Figura 7 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para o
Sobrenadante. Foram lidas as absorvncias nos
comprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,
409nme 417nm.
Figura 8 Espectro de Absoro (UV-Vis) do Sobrenadante. Fonte:
Artigo Microburger Biochemistry: Extraction and Spectral
Characterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas and
Laura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, Kansas
State University, Manhattan, KS 66506.
14
Espetros de Absoro no UV-Visvel Soluo A
Figura 9 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para a
soluo A (Met-Mb). Foram lidas absorvncias nos
comprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,
409nme 417nm.
Figura 10 Espectro de Absoro (UV-Vis) da Soluo A (Met-
Mb). Fonte: Artigo Microburger Biochemistry: Extraction and Spectral
Characterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas and
Laura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, Kansas
State University, Manhattan, KS 66506.
15
Figura 11 Espectro de Absoro (UV-Vis) obtido para a
soluo B (Oxy-Mb). Foram lidas absorvncias nos
comprimentos de onda 635nm, 580nm, 542nm, 505nm,
409nme 417nm.
Figura 12 Espectro de Absoro (UV-Vis) da Soluo B (Oxy-
Mb). Fonte: Artigo Microburger Biochemistry: Extraction and Spectral
Characterization of Myoglobin from Hamburger. Sheri A. Bylkas and
Laura A. Andersson*Department of Biochemistry, 103 Willard Hall, Kansas
State University, Manhattan, KS 66506.
Espetros de Absoro no UV-Visvel Soluo B
16
Registo das Absorvncias
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Sobrenadante
1/3
635 0,172
542 0,523
505 0,395
580 0,488
409 3,152
417 3,222
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Soluo A
1/5
635 -0,005
542 0,009
505 0,028
580 -0,002
409 0,801
417 0,533
Amostra C.d.O.
(nm)
Abs
Soluo B
1/5
635 -0,003
542 0,05
505 0,022
580 0,049
409 0,415
417 0,499
Quadro 2 Registo das absorvncias
medidas para o sobrenadante nos
respetivos comprimentos de onda aps
leitura dos espetros.
Quadro 3 Registo das absorvncias
medidas para a soluo A nos respetivos
comprimentos de onda aps leitura dos
espetros.
Quadro 4 Registo das absorvncias
medidas para a soluo B nos respetivos
comprimentos de onda aps leitura dos
espetros.
17
Determinao da massa de protena nas solues A e B:
Lei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer: Abs=lc
Soluo A
Abs Absorvncia (a 409nm registou-se 0,801)
- Coeficiente de absoro molar (=179mM
-1
.cm
-1
)
c Concentrao de Met-Mb
l percurso tico (l=1 cm)
=
=

=
0,801
179 1

= 4,47 10
3

= 5


= 4,47 10
3
5


= 2,235 10
2
= 2,235 10
5

Como a soluo A sofreu uma diluio de 1:5 tem-se

que a concentrao de Met-Mb :
18
Determinao da massa de protena nas solues A e B:
Lei de Lambert-Beer
A massa molecular da mioglobina 16949 g/mol, como a Met-Mb possui na
sua constituio gua tem-se que a massa molar da Met-Mb corresponde a
16949+2x1+15,999=16966,99gmol
-1
:
=
= 16966,99/ 2,235 10
5
/ = 0,3792
1
= 0,3792 /
Como o volume de amostra recolhido na SEC foi de 1,2mL obtm-se a massa de Met-
Mb:
= 0,3792

1,2 = 0,4550
19
Determinao da massa de protena nas solues A e B:
Lei de Lambert-Beer
Para a soluo B, correspondente Oxy-Mb foram aplicados os mesmo
clculos.
Soluo A (Met-Mb) Soluo B (Oxy-Mb)
Comprimento de onda utilizado (nm) 409 417
Absorvncia 0,801 0,499
(mM
-1
.cm
-1
) 179 128
[protena] M 2,235 10
5
1,949 10
5
Massa molar (g/mol) 16966,99 16964,99
Volume recolhido (mL) 1,2 2,8
Massa (mg) 0,4550 0,9257
Quadro 5 Comparao de diversos parmetros para determinao da massa de protena entre as solues A e B.
20
Doseamento proteico
Mtodo de Lowry
Mtodo do Biureto
Mtodo de Bradford
Sobrenadante
Soluo A
Soluo B
21
Mtodo de Lowry
Tcnica com o objetivo de determinar a concentrao proteica numa determinada
soluo recorrendo ao reagente Folin Ciocalteau.
Soluo proteica Reagente de Folin
Ciocalteau
Complexo de cor Azul
Condies alcalinas
22
Mtodo do Biureto
Amostra de protena
contendo duas ou mais
ligaes peptdicas.
Reagente de Biureto
(Sulfato de Cobre Alcalino)
Complexo prpura
Leitura das Absorvncias a 280nm.
Construo de uma reta de calibrao.
Os extratos celulares contm
muitos outros compostos
que absorvem a 280nm.
.
1
= 1.55
280
0.76
260 23
Mtodo de Bradford
Resduos de aminocidos
com cadeias laterais
bsicas/aromticas
Corante Coomassie Blue
G-250
Colorao Azul
24
Mtodo Biureto Lowry Bradford
Exactido Alta Mdia Mais alta que Lowry
Especificidade
Para compostos com
2 ou mais ligaes
peptdicas
Reage com resduos de
tirosina e triptofano.
Suscetvel a agentes
interferentes
Reage comresduos de
aminocidos com
cadeias laterias
bsicas/aromticas
Rapidez da Execuo Lenta Mdia Rpido
Preciso Preciso Preciso Preciso
Quadro Resumo dos Mtodos
Quadro 6 Comparao dos trs mtodos de doseamento proteico.
25
Preparao da Curva de Calibrao
Soluo
(mL)
Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
BSA
(0,35
mg/mL)
0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 0 0 0
Amostra 0 0 0 0 0 0 0 0,10 0,20 0,30 0,40
gua 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,40 0,30 0,20 0,10
Reagente C 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
MISTRURAR TODOS OS TUBOS E AGUARDAR 10 MINUTOS.
Reagente D 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
DEIXAR REPOUSAR TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 30 MINUTOS.
Volume final 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25 3,25
Quadro 7
Composio dos
tubos utilizados
para o mtodo
de Lowry..
26
Preparao da Curva de Calibrao
Tubos Absorvncia
Registada
1 0,000
2 0,093
3 0,182
4 0,278
5 0,324
6 0,400
7 0,520
Determinao da concentrao de
protena padro em cada tubo:
[]
2
=
[] ()

[]
2
=
0,35 0,05
3,25
= 0,0054 /
Quadro 8 Registo das absorvncias relativas
aos tubos para construo da reta de calibrao.
27
Curva de Calibrao
Tubos Absorvncia [protena]
(mg/mL)
1 0,000 0,0000
2 0,093 0,0054
3 0,182 0,0108
4 0,278 0,0162
5 0,324 0,0215
6 0,400 0,0269
7 0,520 0,0323
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300 0,0350
A
b
s
(
7
5
0
n
m
)
[protena]/tubo (mg/mL)
Curva de Calibrao - Mtodo de Lowry
y = 15,361x + 0,0086
R = 0,992
Quadro 9 Registo das absorvncias e
concentraes proteicas determinadas relativas
aos tubos para construo da reta de calibrao.
Grfico 1 Reta de Calibrao para o mtodo de
Lowry.
28
Determinao da concentrao proteica
Sobrenadante
Tubos Absorvncia
8 0,480
9 0,789
10 1,025
11 1,231
y=mx+b y=Abs e x=[protena]
Abs=m[protena]+b
Com m=15,361 e b=0,0086
Exemplo Tubo 8:

8
= []
8
+ []
8
=

[]
8
=
0,4800,0086
15,361
[]
8
=0,031 mg/mL
Quadro 10 Registo das absorvncias
dos tubos com as amostras relativas ao
sobrenadante.
29
Determinao da concentrao proteica Fatores de Diluio
Inicialmente realizou-se uma diluio de 1:20 para anlise
espetrofotomtrica e para o doseamento proteico, ento concentrao
determinada pelo mtodo de Lowry multiplica-se o fator de diluio que temo valor
20:

8
(1) = []
8

[]
8
= (1) 20 0,031
8
(1) =0,6138 mg/mL
30
Determinao da concentrao proteica Fatores de Diluio
Quando adicionada a amostra aos tubos de ensaio a analisar, deu-se uma
nova diluio devido presena do reagente C, do reagente D e da gua. Assim
necessrio determinar o fator de diluio:
=


=
0,1
3,25
= 0,030769

8
(2) = 0,6138
1
0,030769
= 19,95 /
Volume de amostra = 0,1 mL
Volume total do tubo = 3,25 mL
31
Registo das concentraes proteicas - Sobrenadante
O mesmo procedimento foi aplicado a todos os restantes tubos do
sobrenadante, da soluoA e da Soluo B.
Tubos Absorvncia 1 Fator diluio 2 Fator diluio [protena] final
(mg/mL)
8 0,480 1/20 0,0308 19,95
9 0,789 1/20 0,0615 16,51
10 1,025 1/20 0,0923 14,34
11 1,231 1/20 0,1231 12,93
Quadro 11 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas
ao sobrenadante.
32
Registo das concentraes proteicas Soluo A
Tubos Absorvncia 1 Fator de Diluio 2 Fator de Diluio [protena] final
8 0,566 1:5 0,0308 5,897
9 0,940 1:5 0,0615 4,926
10 0,186 1:5 0,0923 0,625
11 1,425 1:5 0,1231 3,746
Quadro 12 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas soluo A.
33
Tubos Absorvncia 1 Fator de Diluio 2 Fator de Diluio [protena] final
8 0,439 1:5 0,0308 4,553
9 0,657 1:5 0,0615 3,430
10 0,882 1:5 0,0923 3,080
11 1,075 1:5 0,1231 2,820
Registo das concentraes proteicas Soluo B
Quadro 13 Registo das absorvncias, diluies e concentrao proteica final relativas soluo B.
34
[Protena]
mg mL
-1
[Met-Mb]
mg mL
-1
[Oxi-Mb]
mg mL
-1
M
protena
(mg)
(%) Grau de
Purificao
Sobrenadante 19,95 - - 19,95 100 1
Soluo A 5,897 0,3792 - 7,0764 35,47 0,023
Soluo B 4,552 - 0,3306 12,7456 63,88 0,0464
Quadro de purificao
=


100
o =


Quadro 14 Quadro de purificao.
35
http://www.uniprot.org/uniprot/P02192 consultado a 21/03/2014 14h19
http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=1 consultado a 21/03/2014 14h34
http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/Bradford.html consultado a 22/03/2014
15h20
Bibliografia
36