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BMM 0121 - Apostila de Praticas MOD I
BMM 0121 - Apostila de Praticas MOD I
2007
MICROBIOLOGIA
NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS DE
MICROBIOLOGIA
indispensvel o uso de avental no laboratrio. O avental deve ser comprido, de
mangas compridas e estar abotoado;
No comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratrio;
O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido
longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material
necessrio ao trabalho prtico, como: roteiro de aula, papel e lpis ou caneta
para anotaes;
Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas,
ferimentos, aspirao de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o
tcnico responsvel pela aula prtica;
Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes prprios,
existentes nos laboratrios. NUNCA deix-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri devero ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lminas fornecidas para visualizao devero ser deixadas sobre as
bancadas;
d) Tubos com culturas devero ser deixados nas estantes.
Prestar ateno s atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes
Terminados os trabalhos prticos:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Mdulo I
Introduo microbiologia
Mdulo I............................................................................................................................4
Introduo microbiologia...............................................................................................4
Prtica 1 - NOES BSICAS DE ASSEPSIA...................................................................7
Tcnica de semeadura..................................................................................................7
Objetivo.......................................................................................................................10
Material........................................................................................................................10
Procedimento e Resultados........................................................................................10
Questionrio................................................................................................................11
PRTICA 2 - COLORAO DE GRAM.............................................................................12
Fixao e colorao de microrganismos....................................................................12
Preparao de esfregaos e colorao pelo mtodo de gram..................................13
A tcnica......................................................................................................................15
Objetivo.......................................................................................................................16
Material........................................................................................................................16
Procedimento:.............................................................................................................16
Resultados:.................................................................................................................18
Questionrio................................................................................................................18
PRTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCPICA E MICROSCPICA MICROBIANA.......19
Objetivo.......................................................................................................................19
Materiais......................................................................................................................19
Procedimento e resultados.........................................................................................19
A. Visualizao de bactrias:......................................................................................19
B. Visualizao de fungos...........................................................................................20
PRTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO........................................................................21
Crescimento Bacteriano..............................................................................................21
Curvas de crescimento...............................................................................................22
Objetivo.......................................................................................................................25
Material........................................................................................................................25
Procedimento..............................................................................................................25
Resultados..................................................................................................................25
Questionrio................................................................................................................25
PRTICA
5 - DETERMINAO DA CONCENTRAO MICROBIANA NUMA
SUSPENSO.....................................................................................................................26
Estimativa do nmero de clulas viveis....................................................................26
Problema:....................................................................................................................27
5
Verificao de entendimento:......................................................................................28
PRTICA 6 - AO DE ANTI-SPTICOS NA DESINFECO DA PELE........................29
Anti-spticos e desinfetantes......................................................................................29
Objetivos.....................................................................................................................31
Material........................................................................................................................31
Procedimento..............................................................................................................32
Resultados..................................................................................................................32
Questionrio................................................................................................................32
PRTICA 7 ANTIBIOGRAMA.........................................................................................33
Teoria...........................................................................................................................33
Objetivo.......................................................................................................................33
Materiais......................................................................................................................33
Procedimento..............................................................................................................34
Questionrio................................................................................................................34
PRTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS..................35
Introduo...................................................................................................................35
Objetivo.......................................................................................................................35
Material........................................................................................................................35
Procedimento..............................................................................................................35
Resultados..................................................................................................................35
Questionrio................................................................................................................35
PRTICA 9 - CONJUGAO DE BACTRIAS.................................................................36
Introduo...................................................................................................................36
Objetivo.......................................................................................................................37
Material........................................................................................................................37
Procedimento..............................................................................................................38
Resultados..................................................................................................................39
PRTICA 10 - POSTULADO DE KOCH............................................................................40
Abordagem clssica....................................................................................................40
TCNICA DE SEMEADURA
Toda a vez que se fizer uma semeadura importante seguir as regras abaixo
mencionadas para evitar a contaminao dos meios de cultura por microrganismos
presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais.
1. Flambagem da ala ou fio de platina:
Tanto a ala quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de
qualquer operao de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a
parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posio correta
para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45 o em relao mesa
de trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de
Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregao ou para uma
semeadura, esfriar previamente a ala. Esta dever ser esfriada na parte interna do
tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri;
2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a
6.
No esquea!!!!!!
Sempre resfrie a ala (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou
num pedao do gar sem cultura), antes de colocar a ala em contato com a cultura,
lembre-se: ela est muito QUENTE!!!
Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida.
OBJETIVO
Fazer semeaduras em meios lquido e slido de cultura de Eschirichia coli, e obter
colnias isoladas
MATERIAL
ala de platina;
tubo de ensaio com meio completo lquido
placa de Petri com meio completo slido;
tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.
PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo, no esquecendo
de ilustrar os resultados obtidos
A) SEMEADURA EM MEIO LQUIDO
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QUESTIONRIO
1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferncia?
2. Por que deve-se manter sempre que possvel a placa de Petri com meio slido
invertida?
3. Qual a finalidade de se fazer vrias estrias, na semeadura em placa, contendo
meio slido?
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Gram positiva
Membrana plasmtica
Membrana plasmtica
Gram negativa
Figura 5 Estruturas tpicas das paredes de bactrias Gram positivas e Gram negativas
Quando aplicado em clulas Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo
penetram facilmente, e dentro das clulas eles se combinam para formar o complexo
CV-Iodo, que maior que a molcula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o
complexo no pode ser lavado das clulas Gram (+) pelo lcool e ento estas clulas
permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta.
Nas clulas Gram (-) o lcool rompe a camada lipopolissacardica e o complexo
lavado atravs da camada fina de peptideoglicano, que no consegue reter o complexo.
Estas clulas so ento contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e
aparecem vermelhas.
Esta colorao o ponto de partida na identificao bacteriana, mas no deve
nunca ser utilizada como um diagnstico definitivo. importante ressaltar que a
colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til, quando corretamente
realizada e interpretada.
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A TCNICA
O mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana
crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido
de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma
colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em
seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona
(1:1 v:v). O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das bactrias
Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo removido, decorando as clulas. Por
outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Grampositivas e provoca a contrao dos poros do peptidioglicano, tornando-as
impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem
coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir
provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir
resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das
propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura,
densidade, porosidade e integridade.
Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Ao
microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta escuro e as
Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Gram-positivas,
clulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos,
tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou
todas as clulas coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco
importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" s so obtidos se o
tratamento com etanol-acetona for omitido.
O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo
azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substitudo pelo corante vermelho
safranina. A fucsina cora muitas bactrias Gram-negativas mais intensamente que a
safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O
solvente etanol-acetona pode ser substitudo por lcool 95%.
O objetivo desta prtica demonstrar a importncia desta colorao e fazer com
que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente,
devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.
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OBJETIVO
Colorao de microrganismos provenientes de meios, slido e lquido, pelo
mtodo de Gram.
MATERIAL
ala de platina;
lmina de vidro;
placa de Petri com cultura de microrganismo em meio slido;
tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio lqudo;
cristal violeta a 1%;
lugol;
soluo diferenciadora;
fucsina bsica;
PROCEDIMENTO:
A. PREPARO DO ESFREGAO
Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio lquido
1) Flambar a ala corretamente
2) Esfri-la nas paredes do tubo
3) Introduzi-la no meio lquido de maneira que este forme um filme sobre a ala.
4) Colocar o material coletado sobre uma lmina limpa e seca.
5) Espalhar o material sobre a lmina, procurando obter um esfregao fino.
6) Secar tempetatura ambiente.
7) Fixar o esfregao na chama do bico de Bunsen, passando a lmina algumas vzes
pela chama.
OBS. Esperar que o esfregao esteja completamente seco para fix-lo.
8) Realizar a colorao.
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3) Esfri-la na tampa da placa de Petri, ou no meio slido numa regio sem colnia.
4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano.
5) Homogeneizar este material com a gota de gua, cuidando para obter uma suspenso
pouco densa e sem grumos.
6)
7) Fixar o esfregao.
B. COLORAO
1) Cobrir o esfregao com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENO PARA NO
COLOCAR A LMINA INVERTIDA!!!!!!!!
2) Lavar rapidamente em gua corrente;
3) Cobrir todo o esfregao com lugol por 1 minuto;
4) Lavar rapidamente em gua corrente;
5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a soluo diferenciadora: lcool ou
acetona;
6) Lavar rapidamente em gua corrente;
7) Cobrir todo o esfregao com fucsina bsica por 30 segundos;
8) Lavar novamente em gua corrente;
9) Secar a lmina, tomando o cuidado de no remover o esfregao;
10) Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
estas culturas!
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RESULTADOS:
___________________
____________________
__________________
___________________
QUESTIONRIO
1. Descreva como so e do que se compem as paredes das bactrias Gram
positivas e Gram negativas?
2. Cite alguns fatores que podem influenciar na colorao de Gram, podendo
inclusive levar a erros?
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MATERIAIS
Lminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus
pyogenes e dois tipos de fungos);
Microscpio tico;
PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Faa um esboo das caractersticas morfolgicas e suas propriedades tintoriais
de cada uma das bactrias apresentadas. Repita o procedimento para os fungos
apresentados.
A. Visualizao de bactrias:
b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus
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B. Visualizao de fungos
Filamentosos
Leveduras
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CURVAS DE CRESCIMENTO
Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano a
obteno de curvas de crescimento. Estas so representaes grficas do aumento do
nmero de indivduos em um determinado perodo de tempo.
Em condies experimentais, quando se inocula uma populao bacteriana em
um frasco contendo uma quantidade inaltervel de meio de cultura (sistema fechado), o
crescimento dessa populao passa por quatro fases caractersticas, dependendo do
ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Essas
quatro fases esto representadas na Figura 6.
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Fase lag: fase de adaptao metablica ao novo ambiente; o metabolismo celular est
direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas
condies ambientais encontradas pelas clulas. O nmero de indivduos no aumenta
nesta fase, podendo at mesmo decrescer. A durao dessa fase depende das
condies ambientais nas quais as clulas se encontravam anteriormente. A fase lag
ser to mais longa quanto maiores as diferenas de composio do ambiente anterior
ou se a populao for constitudo de bactrias esporuladas.
Fase exponencial ou logartmica: fase na qual o nmero de clulas da populao
dobra a cada gerao. Esta taxa de crescimento no pode ser mantida indefinidamente
em um sistema fechado. Aps um determinado perodo de crescimento exponencial, as
condies ambientais tornam-se desfavorveis pela escassez de nutrientes essenciais,
acmulo de metablitos txicos e limitao de espao. A taxa de crescimento da
populao diminui e segue-se a fase estacionria.
Fase estacionria: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido
s condies limitantes do meio. As clulas continuam metabolizando e se dividindo,
mas parte das clulas torna-se invivel e a taxa de diviso celular muito prxima da
taxa de morte celular, o que mantm constante o nmero de clulas viveis na
populao. A curva de crescimento atinge um plat. A durao da fase estacionria
depende do balano entre a taxa de diviso celular e o nmero de clulas que vo se
tornando inviveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido s condies
ambientais tornarem-se progressivamente desfavorveis.
Fase de declnio: fase de declnio exponencial do nmero de clulas viveis: a taxa de
morte celular torna-se maior que a taxa de diviso. O nmero de clulas viveis entra
em declnio progressivo at a completa extino da populao.
Para a construo de uma curva de crescimento bacteriano, mede-se o aumento
da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio lquido atravs de
medidas da densidade ptica da cultura. Alquotas da cultura em crescimento so
retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbncia da cultura
contra um comprimento de onda de 600 nm. Para tal utiliza-se um espectrofotmetro
onde o branco o meio de cultura utilizado, ausente de inculo.
Cada medida obtida corresponde densidade ptica (DO) da cultura em um dado
momento do crescimento. A absorbncia aumenta proporcionalmente ao aumento do
nmero de clulas (biomassa) na populao. Desta forma pode-se construir um grfico
representativo do progresso do crescimento, relacionando-se a DO pelo tempo.
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Vantagens
simplicidade da metodologia;
Desvantagens e limitaes
no possvel a estimativa do
nmero de clulas/ml da populao;
possibilita o reconhecimento do
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OBJETIVO
Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de
atravs de medidas de densidade ptica.
E. coli
MATERIAL
PROCEDIMENTO
Durante a aulas sero obtidos apenas alguns pontos experimentais, os demais
pontos sero medidos pelos monitores e repassados para os grupos.
RESULTADOS
A) Construir um grfico a partir dos pontos obtidos.(No se esquea
de identificar os eixos, e suas unidades!!!)
B) Identificar cada uma das fases de crescimento no grfico.
QUESTIONRIO
1. Quais os problemas observados na construo dos grficos (em que etapa do
crescimento)? Voc diria que todos os pontos so confiveis? Justifique sua resposta.
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Vantagens
permite uma estimativa do nmero
de clulas viveis/ml da populao
possibilita o reconhecimento do
padro de crescimento da populao
bacteriana em estudo (as diferentes fases
do crescimento bacteriano podem ser
visualizadas em um grfico)
pode-se estabelecer comparaes
do padro de crescimento de diferentes
populaes bacterianas
pode-se estabelecer comparaes
do padro de crescimento sob diferentes
condies ambientais
Desvantagens e limitaes
detecta somente as clulas viveis e
que se repliquem, ou seja, aquelas
capazes de formarem colnias; muitos
indivduos viveis podem no se replicar,
prejudicando o clculo
se as clulas da bactria estudada
mantm-se agrupadas aps a diviso
celular (cada colnia em meio slido seria
formada por mais de uma clula)
se as diluies no forem
homogeneizadas adequadamente
se um nmero muito pequeno ou
muito grande de colnias for usado na
contagem
se o operador no fizer o
espalhamento rapidamente e de forma
adequada.
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A) BACTERIANA
A determinano da concentrao de bactrias feita geralmente pela tcnica de
determinao do Nmero de UFC (unidades formadoras de colnias).
PROBLEMA:
1. Voc tem um estoque de uma super bactria Escherichia coli (lac+). Voc fez
um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE
PRECISA RECUPERAR SUA BACTRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE,
QUE FAZER?
2. Mas digamos que voc precisa ou deseja conhecer o nvel de
que a bactria contaminante seja lac-. Neste caso voc poder:
0,1ml (diluio 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e
0,1ml (diluio 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e
0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e
0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e
contaminao e
_________lac_________lac_________lac_________lac-
original)? ( Y) _________
Qual porcentagem da contaminao? _( Y) / (X)_____________________
B) DE LEVEDURAS
Pela tcnica de contagem em cmara de Neubauer
VERIFICAO DE ENTENDIMENTO:
Vrias tcnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prtica. Voc
saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos?
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Derivados do mercrio
Parecem ser primariamente bacteriostticos e apenas levemente bactericidas. A
sua ao antibacteriana est relacionada inibio reversvel da atividade enzimtica
essencial da bactria e capacidade de se combinar com ons de compostos metlicos
orgnicos e inorgnicos. Possuem pouca atividade esporicida e so inativados por
restos orgnicos. O uso para anti-sepsia de superfcies e objetos inanimados parece
imprudente j que h agentes com um modo de ao mais eficiente.
Compostos de Prata
Produzem efeitos custicos, adstringentes, antibacterianos pela ao do on de
prata livre e produz desnaturao de protenas. Os preparados de Prata coloidal no
so corrosivos nem irritantes e so usados sobre tecidos sensveis. A prata metlica
precipita as protenas e produz efeito irritante.
AGENTES OXIDANTES
So compostos germicidas de ao breve sobre algumas bactrias aerbicas
Gram+ e Gram-. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaerbicos,
mas no destroem esporos bacterianos. Liberam Oxignio que se combina com a
matria orgnica se tornando inativos.
A soluo de Perxido de Hidrognio libera Oxignio livre rapidamente ao entrar
em contato com mucosas e superfcies sem plos que fornecem a enzima catalase.
Quando distribudo sobre ferida com exsudato, a sua efervescncia vai remover o pus
e restos celulares e confere atividade germicida limitada. valioso para limpar e
desodorizar o tecido infectado.
O Permanganato de Potssio libera Oxignio em contato com a matria orgnica.
As solues possuem uma grande ao antibacteriana.
OBJETIVOS
Verificar a ao de anti-spticos no crescimento bacteriano.
MATERIAL
4 Placas com gar-sangue : Meio base para gar sangue ou TSB enriquecido
com 5% sangue desfibrinado de carneiro;
4 zaragatoas (Swab) estreis;
3 cotonetes embrulhados em papel alumnio autoclavados, ou + 3 zaragatoas
estreis;
sabo, lcool iodado, mertiolate, anti-spticos comerciais (anti-spticos em geral
disponveis 1 para cada grupo, podendo haver repeties);
Ala de Platina , bico de Bunsen;
Microscpio ptico, bateria de Gram, lminas;
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PROCEDIMENTO
1. Umedecer um cotonete estril em soluo fisiolgica e esfregar vigorosamente
sobre as costas de uma das mos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de
dimetro;
2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio gar sangue;
3. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar
nas costas da outra mo, numa rea de mesmo dimetro da primeira;
4. Esperar 4 minutos para que haja ao do anti-sptico e passar na rea
desinfectada um terceiro cotonete umedecido com soluo fisiolgica.
Tomar
cuidado para no atingir a regio no desinfectada;
5. Espalhar o contedo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo
gar-sangue;
6. Marcar na placa o anti-sptico utilizado e o nmero do grupo que realizou o
experimento;
7. Incubar a placa por 24h, em estufa a 37C.
RESULTADOS
Na quinta-feira:
1. Observar os resultados e anotar.
2. Analisar a Morfologia MACROSCPICA das colnias e MICROSPICA das bactrias
aps colorao de Gram. (No se esquea de ilustrar o que voc observou!)
QUESTIONRIO
1. Descreva duas situaes: uma em que voc usaria um anti-sptico e uma em que
usaria um desinfetante.
2. Faa uma lista com pelo menos seis anti-spticos e seis desinfetantes.Nesta lista
deve conter o principal composto ativo, o nome comercial, e o uso .
PRTICA 7 ANTIBIOGRAMA
TEORIA
Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade
de bactrias aos antimicrobianos. Estes testes so utilizados para avaliar in vitro a
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OBJETIVO
Analisar pelo mtodo de difuso a ressitncia de E. coli a alguns antibiticos.
MATERIAIS
Swab estril;
cultura lquida fresca de Eschirichia coli;
placas de Petri, com meio Mueller-Hinton slido;
discos de papel com antibiticos;
pinas;
rgua.
PROCEDIMENTO
1. Introduzir nas culturas um swab estril, retirar o excesso de lquido comprimindo
a ponta do swab nas paredes do tubo;
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Carbemicilina
CB
(100g/mL)
Kanamicina
K
(30g/mL)
Rifampicina
RIF
(30g/mL)
Sulfonamida Estreptomicina
SUL
EST
(300g/mL)
(10g/mL)
R< 13
S> 17
R< 12
S> 15
R< 16
S> 20
R< 12
S> 17
Escherichia coli
Leituras
(mm)
Resultados
Padres
R< 10
S> 13
R< 11
S> 15
QUESTIONRIO
1.
2.
3.
4.
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OBJETIVO
Estudar a presena de compostos antimicrobianos em vegetais.
MATERIAL
PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspenso do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfcie do meio com o prprio cotonete embebido na
cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e coloc-los sobre a
superfcie do meio semeado;
5. Incubar a 25C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibio.
RESULTADOS
Descreva as observaes feitas ao final da incubao.
QUESTIONRIO
Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum j relatado na
literatura ou algum de conhecimento popular.
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conjugao, tra, mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugao entre
bactrias e bactrias e leveduras. Estes plasmdios ColE1 codificam protenas
chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensveis de E. coli.
Os plasmdios conjugativos aps serem transferidos e replicados podem
permanecerem livres (autnomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano
(chamados de estado integrado). No primeiro caso, a linhagem bacteriana chamada de
F+ e no segundo Hfr ( a integrao do fator F parece ser mediada por pequenas
sequncias chamadas de elementos IS). Neste estado, o fator F media a transferncia
do cromossoma da clula Hfr para a clula F . Raramente, o cromossomo inteiro da
clula Hfr transferido.
As clulas F+ aps contato com as clulas F -, transferem em alta frequncia
para esta ltima uma rplica ou cpia do plasmdio F, tornando-a F +. Por outro lado, a
linhagem Hfr cujo fator F est integrado ao cromossomo bacteriano, transfere,
sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Raramente, o
cromossomo inteiro da clula Hfr transferido. O fator F tambm raramente
transferido.
Aps a descoberta do fator F, outros plasmdios conjugativos foram sendo
descobertos como o caso dos fatores ou plasmdios R ou RTF (fator de transferncia
de resistncia). Estes plasmdios possuem marcadores para a resistncia s drogas
antibacterianas e no integram-se, normalmente no cromossomo bacteriano. Alguns
plasmdios no promovem conjugao, mas podem ser mobilizados por outros
plasmdios conjugativos.
OBJETIVO
Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmdio que carrega o gene que confere
resistncia a tetraciclina, para a Escherichia coli K12 .
MATERIAL
Tubos de ensaio ;
Placas com meio slido;
Linhagens
a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac- , Tetr ). Hospeda um
plasmdio que carrega o marcador que confere resistncia a tetraciclina (Tcr ).
b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ , Nalr). O fentipo de resistncia
ao cido Nalidxico deve-se a uma mutao cromossomal.
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Antibiticos
a) cido Nalidxico (Nal) usar a concentrao de 10g/ml
b) Tetraciclina (Tc) usar a concentrao de 50 g/ml
PROCEDIMENTO
1 Dia
1. Fazer os pr-inculos das linhagens doadoras e receptoras em 4,0ml de meio
TSB. Incubar temperatura de 37C por uma noite.
2Dia
1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1,0ml de TSB ou LB as seguintes
culturas:
1,0 ml da linhagem S. typhimurium MG031 (doadora) e
1,0 ml da linhagem E. coli K12 (receptora)
2. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitao temperatura de 37C.
3. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio slido:
3.1 Clula doadora: S. typhimurium MG031
0,1ml (sem diluio) em meio MacConkey-Nal
0,1ml (diluio 10-4) em meio MacConkey -Tc
0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey -Tc
0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey -Tc
3.2 Clula receptora: E. coli K12
0,1ml (sem diluio) em meio YT-Nal-Tc
0,1ml (diluio 10-4 ) em meio MacConkey -Nal
0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey -Nal
0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey -Nal
3.3 Mistura de conjugao (Transconjugantes):
0,1ml (sem diluio) em meio MacConkey -Nal-Tc
0,1ml (diluio 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc
0,1ml (diluio 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc
4. Incubar em estufa temperatura de 37C por 16-24 horas (durante uma noite).
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RESULTADOS
3Dia
Analisar os resultados e determinar a freqncia de conjugao. A freqncia
determinada dividindo o nmero de clulas transconjugantes pelo nmero total de
clulas receptoras.
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ABORDAGEM CLSSICA
Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava
deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relao casual entre um
microrganismo em particular e uma doena.
1. A bactria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doena; a bactria ou
seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doena;
2. A bactria deve ser isolada de leses de uma pessoa infectada e mantida em
culturas puras;
3. A cultura pura quando inoculada em voluntrio humano susceptvel ou animal
experimental deve produzir os sintomas da doena;
4. A mesma bactria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivduos
intencionalmente infectados.
Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactrias
causadoras de epidemias como a clera e a tuberculose. Estes se constituram nas
primeiras abordagens que forneceram bases cientficas para o estudo das doenas
infecciosas.
Estes postulados apresentam, contudo, uma srie de limitaes devido ao precrio
conhecimento, ao tempo de Koch, dos mecanismos que regem a infectividade
bacteriana.
1. Os postulados de Koch implicam que a virulncia uma caracterstica exclusiva das
bactrias e independente do hospedeiro. Na realidade, a susceptibilidade do hospedeiro
to ou mais importante que as caractersticas de virulncia da bactria:
Indivduos cujo sistema imunolgico esteja seriamente comprometido por
quimioterapia anti-cncer, tratamento com corticosterides, infeco por HIV ou
diabetes e que podem ser infectados por bactrias incapazes de causar infeco
em pessoas sadias;
A mesma bactria pode ou no satisfazer os postulados de Koch dependendo da
sub-populao usada como ponto de referncia.
2. O segundo postulado enfatiza a obteno de culturas puras do patgeno. H algumas
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doenas cujo agente causativo no pode ser cultivado em meios de laboratrio ou cujo
meio adequando no , ainda, disponvel:
H considerveis evidncias para implicar as bactrias Treponema pallidum e
Mycobacterium leprae como causadoras da sfilis e hansenase, respectivamente.
Antibiticos que causam o desaparecimento de sintomas tambm causam a
eliminao da bactria do tecido infectado. H tambm, uma resposta
imunolgica dos indivduos infectados contra os antgenos de superfcie das
bactrias observadas nas leses provocadas pela doena;
A combinao das tecnologia da reao em cadeia da polimerase (PCR) com as
de seqenciamento de cidos nuclicos possibilita a deteco e identificao de
bactrias no-cultivveis e revela o agente causativo de muitas doenas.
3. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espcie
bacteriana so igualmente virulentos e que somente uma nica espcie causa uma
determinada doena.
diferentes linhagens de uma espcie bacteriana no somente variam
consideravelmente em virulncia como podem causar doenas distintas;
os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espcies de bactrias e
h doenas cujas leses so causados por uma mistura de diferentes linhagens
(infeces polimicrobianas);
os casos nos quais uma nica espcie de bactria a nica responsvel por uma
doena parece mais uma exceo do que uma regra;
o cultivo de uma bactria em meio de laboratrio pode causar a "perda" do fator
de virulncia: no expresso dos genes nas condies ambientais do meio.
4. O terceiro postulado requer que a bactria seja reinoculada em um voluntrio humano
ou em um animal experimental e que a reinoculao cause os sintomas da doena.
Em muitos casos no possvel a utilizao de voluntrios humanos e a nica
alternativa a utilizao de um modelo animal, se houver um disponvel;
Alguns patgenos humanos no causam doenas em animais ou provocam
sintomas diferentes daqueles observados em humanos.
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