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Contagem de Fitoplancton
Contagem de Fitoplancton
L5.303
Dez/2005
23 PGINAS
L5.303
DEZ/2005
Mtodo de Ensaio
Sumrio
Pgina
Introduo ..................................................................................................................................
1. Objetivos ..............................................................................................................................
2. Documentos Complementares ...............................................................................................
3. Definies .............................................................................................................................
4. Equipamentos e Reagentes ....................................................................................................
5. Execuo do Ensaio ..............................................................................................................
6. Expresso dos Resultados .....................................................................................................
7. Controle Laboratorial e Estocagem .......................................................................................
8. Equipamentos de Coleta e Anlise do Fitoplncton de gua Doce ........................................
9. Modelo de Ficha de Anlise do Fitoplncton de gua Doce .................................................
10. Exemplo de Boletim Tcnico ...............................................................................................
11. Referncias Bibliogrficas ....................................................................................................
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Introduo
Fitoplncton a comunidade de organismos microscpicos fotossintetizantes que flutuam livremente nas
diversas camadas dos corpos dgua e que constituda principalmente por algas: clorofceas,
diatomceas, euglenofceas, crisofceas, dinofceas, xantofceas e tambm cianobactrias (cianofceas).
Algas so organismos vegetais unicelulares ou multicelulares que fazem parte da comunidade produtora
primria de um ecossistema aqutico, podendo constituir a base da cadeia alimentar desse ambiente.
Utilizando a energia solar, transformam nutrientes minerais em matria orgnica, fenmeno conhecido
como fotossntese.
Em geral, guas limpas e pobres em nutrientes apresentam uma comunidade fitoplanctnica pouco
abundante, com alta diversidade, enquanto que guas ricas em nutrientes apresentam grande nmero de
organismos, pertencentes a poucas espcies.
Alm da quantidade de nutrientes da gua, outros fatores influenciam a composio e distribuio espacial
e temporal da comunidade fitoplanctnica, tais como: correntes, estratificao trmica, circulao, hora do
dia, profundidade de penetrao da luz, intensidade luminosa, temperatura e presena de substncias
txicas.
Em mananciais que recebem despejos domsticos, industriais ou de fontes agrcolas difusas, ocorrem altas
concentraes de nutrientes, principalmente fsforo e nitrognio. Este fenmeno de desequilbrio
ecolgico, conhecido como eutrofizao ou enriquecimento das guas, favorece a proliferao rpida de
algas e cianobactrias, fato que pode acarretar vrios problemas no ambiente aqutico, tais como:
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Norma Tcnica CETESB L5.313 - Coleta de fitoplncton marinho e de gua doce: procedimento,
(CETESB, 1991);
Guia de coleta e preservao de amostras de gua. AGUDO, E. G. (Coord.). So Paulo:
CETESB, 1988;
Portaria n 518 de 03/2004. Ministrio da Sade. BRASIL. Dirio Oficial [da] Repblica
Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 26 mar. 2004. Seo 1, p. 266-270;
Resoluo CONAMA n 357 de 03/2005. Ministrio do Meio Ambiente. BRASIL. Dirio Oficial
[da] Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 17 mar. 2005. Seo 1, p.
58-63;
Trabalhos tcnicos sobre identificao do fitoplncton de gua doce (item 11.1).
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3. Definies
3.1 - Auttrofo
Ser vivo capaz de produzir seu prprio alimento ou matria orgnica, a partir de material inorgnico e
energia luminosa ou qumica.
3.2 - Biomassa
Quantidade de material vivo que pode ser expressa em peso, volume ou rea.
3.3 - Cianotoxinas
Toxinas produzidas por cianobactrias que causam efeitos adversos sade do homem e de alguns
animais.
3.4 - Ecossistema
Unidade de natureza ativa que combina comunidades biticas e fatores abiticos com os quais interagem.
Os ecossistemas apresentam grande variabilidade em relao s suas dimenses e caractersticas.
3.5 - Eutrofizao
Aumento da concentrao de nutrientes, principalmente nitrognio e fsforo, tendo como conseqncia o
aumento da produtividade do ambiente aqutico.
3.6 - Fitoplncton
Comunidade vegetal microscpica que vive em suspenso nas diversas camadas de gua onde, graas
presena de energia luminosa, promove o processo fotossinttico, principal responsvel pela base da
cadeia alimentar no meio aqutico.
3.7 - Florao
Crescimento intenso de algas potencialmente txicas ou no, geralmente causado por aumento de
nutrientes, como nitratos e fosfatos. Essas altas densidades de organismos podem ocorrer em curtos
perodos e durante todo o ano.
3.7.1 - Floraes Txicas ou Floraes de Algas Nocivas (FAN)
Causam riscos para o abastecimento pblico ou balneabilidade. Esses florescimentos tambm podem
matar os peixes e tornar os moluscos txicos ao consumo humano, alm de causar morte em animais que
utilizam esta gua para dessedentao.
3.8 - Frstula
Parede celular dura, silicosa, das diatomceas, constituda por duas partes que se assemelham s partes
superior e inferior de uma caixa perfeitamente ajustada. Essas partes so chamadas de valvas ou epiteca e
hipoteca.
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3.9 - Fotossntese
Processo de converso de dixido de carbono para carbono orgnico (carbohidrato) que ocorre ao nvel
dos cloroplastos, pela ao da energia luminosa absorvida pelos pigmentos fotossintetizantes,
especialmente clorofila.
3.10 - Hetertrofo
Organismo que no produz seu prprio alimento e retira sua nutrio consumindo as complexas molculas
orgnicas produzidas por plantas ou presentes em outros organismos, vivos ou em decomposio.
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Informaes sobre a temperatura da gua, turbidez, pH, oxignio dissolvido e nutrientes so valiosas e
podem facilitar a interpretao dos resultados sobre a comunidade fitoplanctnica propriamente dita.
5.2 - Procedimento
5.2.1 - Preservao da amostra
Para anlise quantitativa necessrio que a amostra seja preservada.
A amostra poder ser preservada com formalina, lugol, soluo transeau ou glutaraldeido. Para a
identificao de determinados grupos de cianobactrias e flagelados, necessria a observao do
material antes da preservao, para verificao de movimento e de estruturas s visveis no organismo
vivo. Havendo necessidade de observao dos organismos vivos, a amostra deve ser resfriada no
transporte do local de coleta ao laboratrio.
No quadro abaixo esto discriminadas as vantagens e desvantagens de cada conservante.
TIPO
LUGOL
FORMOL
TRANSEAU
GLUTARALDEDO
VANTAGENS
Preservao de flagelos e aumento do
peso especfico das clulas, facilitando
a sedimentao.
Pode ser estocado por vrios anos e
no muda a colorao das algas.
Mantm as caractersticas das clulas
como flagelos e plastos.
No provoca alteraes nas clulas e
pode ser utilizado em epifluorescncia.
DESVANTAGENS
Dissolve frstulas de diatomceas mais delicadas e
escamas de silicoflagelados.
Distorce a forma da clula de flagelados nus, provoca
perda de flagelos, toxicidade sade humana.
Grande volume utilizado.
altamente txico.
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amostra; se a concentrao final para a anlise for muito elevada, a contagem ser mais trabalhosa e
demorada.
Se em funo da capacidade da centrfuga, houver necessidade de dividir a amostra em dois volumes,
procede-se da seguinte forma: para 100mL, por exemplo, aps a centrifugao de cada um dos dois tubos
de 50mL referentes mesma amostra, so desprezados 45mL do sobrenadante. Homogeneizam-se os
5mL restantes de um dos tubos e verte-se ao outro, obtendo-se desta forma, 10mL de amostra
concentrada 10 vezes. As amostras devem ser centrifugadas a 2500 rpm durante 20 minutos.
A anlise do material centrifugado pode ser feita em cmaras de Sedgwick-Rafter ou, utilizando-se uma
micropipeta e adicionando uma gota de volume definido, em lmina normal de microscpio com lamnula
selada. Este ltimo mtodo recomendado apenas na ausncia dos demais, uma vez que devido ao
pequeno volume utilizado pode ocorrer perda de material.
Observao 1: Para amostras provenientes de ambientes que apresentam grande quantidade de
algas, como por exemplo lagoas de estabilizao, no necessrio que se concentre o material.
Observao 2: Para rios ou corpos dgua que apresentem muito material em suspenso
necessrio diluir a amostra e, se a concentrao fitoplanctnica for baixa, analisar vrias
subamostras e proceder aos clculos correspondentes.
5.2.4 - Concentrao das amostras por sedimentao
Outro mtodo de concentrao de amostra o de sedimentao de organismos em cmaras de Utermhl,
nas quais a amostra preservada colocada e levada a uma cmara mida, onde permanece durante 12
horas ou mais. Alguns autores recomendam 2 horas de repouso da amostra para cada centmetro da
coluna, enquanto outros sugerem de 3 a 4 horas por centmetro.
Quando a amostra estiver preservada com formalina, o tempo necessrio para sedimentao ser o dobro.
Dependendo da quantidade de algas presentes na amostra, utilizam-se cmaras de volumes diferentes,
sendo as mais comumente empregadas de 2,5 a 10mL (Figura 4) podendo variar at 50 ou 100mL.
Para a preparao de uma cmara de Utermhl deve-se proceder da seguinte forma:
5.2.4.1 - Colocar a cmara em posio plana e horizontal;
5.2.4.2 - Homogeneizar a amostra preservada e retirar, com auxlio de uma pipeta, uma subamostra em
quantidade suficiente para preencher o volume da cmara de Utermhl;
5.2.4.3 - Com a lmina de vidro espesso, recobrir cuidadosamente a cmara, evitando a formao de
bolhas;
5.2.4.4 - Levar a subamostra preparada a uma cmara mida onde deve permanecer durante o tempo
necessrio para sedimentao dos organismos.
Se no houver disponibilidade de um microscpio invertido ou centrfuga, tambm possvel sedimentar a
amostra em proveta e desprezar o sobrenadante.
Observao 3: Todo o material utilizado, principalmente as cmaras de Sedgwick-Rafter e
Utermhl deve estar limpo, isento de poeira ou gordura.
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No contar
este
organismo
Contar este
organismo
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colnias sejam muito densas, e levando-se em conta que estas podem possuir vrias camadas de
clulas, pode-se multiplicar o nmero de clulas contado em cada quadrado do retculo por 2, ou pelo
nmero de camadas existentes, para obter uma estimativa mais precisa.
Quanto s filamentosas, caso no seja possvel a visualizao das clulas em aumento de 40X, pode ser
medido o comprimento do tricoma e, com auxlio de bibliografia especializada, verificar o comprimento
celular e assim estimar o nmero de clulas por tricoma.
Colnia
Filamento
Retculo de Whipple
5.3.3 - Clculo para contagem de organismos em cmara de Sedgwick-Rafter
A contagem de organismos de uma faixa horizontal corresponder contagem dos organismos contidos no
retngulo cuja largura ser delimitada pelo retculo de Whipple (que igual a 380m, ou 0,038cm, no
exemplo citado no item 5.2.6) e o comprimento ser o da prpria cmara (5cm). A rea desse retngulo
ser igual a 0,19cm2. Como a rea da cmara de Sedgwick-Rafter de 10cm2 e a rea examinada de
0,19cm2, dividindo-se a primeira pela segunda, obter-se- o fator de contagem para esse microscpio.
F=A/a
Onde:
F = fator de contagem
A = rea da cmara
a = rea de faixa horizontal
Exemplo: F = 10/0,19 = 52,63
Para a contagem de organismos numa faixa vertical, utiliza-se o mesmo raciocnio. Neste caso, o fator de
contagem obtido da seguinte forma:
F=A/a
Onde:
a = rea da faixa vertical
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F = A/10a
Onde:
a = rea do retculo de Whipple
Exemplo: F = 10/10 x (0,038)2 = 692,52
Quando se tem uma densidade muito elevada de organismos por campo (10 ou mais), a contagem por
campos aleatrios, utilizando-se uma rea menor, mais indicada do que por transectos, que demanda
maior tempo e esforo. O nmero de campos ir depender da densidade da amostra e da acuracidade
desejada.
O nmero de organismos/mL ou clulas/mL calculado multiplicando-se o nmero de unidades contadas
pelo fator. Quando a amostra fixada com formol 2%, este representa 5% do volume total da amostra, e
nesse caso, o fator deve ser dividido por 0,95.
Portanto:
A=R2
Onde:
A= rea da cmara de Utermhl
R= raio da cmara de Utermhl
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= 3,1416
Exemplo: A= 3,1416 x (1,3)2= 5,3093cm2
O transecto ter 0,0192cm de largura (lado do retculo de Whipple) por 2,6cm de comprimento (dimetro
da cmara).
Assim:
F=
A / a' '
v
Multiplicando-se o fator assim obtido pelo nmero de organismos ou clulas encontrados em dois
transectos, ter-se- o nmero de organismos ou clulas por mL de amostra preservada com lugol. A
localizao de um transecto na cmara para a contagem de transectos feita pelo retculo de Whipple,
superpondo-o a borda da cmara. A partir deste ponto, inicia-se o exame at que o retculo atinja o outro
lado da cmara. Quando a amostra preservada com formol 2%, este passa a representar 5% do volume
total da amostra. Neste caso, para o clculo do fator, deve-se subtrair 5% do volume da cmara.
5.3.5 - Estimativas de biomassa
a) Clculo de UPA
Em exames de gua para abastecimento, alm da contagem e identificao, pode ser calculada a rea
de cada organismo, tendo sido adotada para isso uma unidade padro de rea (UPA), cujo valor
4002. Utiliza-se um fator de correo para o retculo de Whipple do microscpio, para a unidade
padro 4002. Se o quadrado menor do retculo de Whipple medisse 20 de lado, sua rea seria
exatamente a de 1UPA. Como difcil adaptar o microscpio de tal forma que a rea do quadrado
menor seja de 1UPA, calcula-se o fator de correo da seguinte maneira: para um retculo que possua
380 de lado, o quadrado menor ter 7,60 de lado. A rea deste quadrado menor ser de 57,762.
Dividindo-se 4002 por 57,762 verifica-se que a rea deste quadrado 6,93 vezes menor que 1UPA,
portanto 6,93 ser o fator de correo.
Durante o exame, cada alga superposta aos quadrados pequenos do retculo de Whipple, anota-se o
nmero de quadrados que ela ocupa, supondo que cada um eqivale a 1UPA. Este nmero suposto
de UPA est superestimado pois na realidade, cada quadrado tem uma rea 6,93 vezes menor que
1UPA. Dividindo-se o nmero de quadrados ocupados por uma alga, por 6,93, tem-se o nmero de
UPA que ela realmente ocupa.
b) Clculo de biovolume
Em estudos ecolgicos e tambm para atendimento Portaria n 518/2004 do Ministrio da Sade
(BRASIL, 2004) e Resoluo CONAMA n 357 (BRASIL, 2005), a estimativa de biomassa mais
aceita o biovolume.
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No clculo do biovolume celular, contam-se as clulas e o resultado multiplicado pelo volume celular
mdio de cada espcie. O volume mdio determinado com base na figura geomtrica mais prxima,
por exemplo, esferas para clulas esfricas e cilindros para filamentos. Dependendo da variabilidade,
10 a 30 clulas devem ser medidas.
Exemplo: Ao se medirem 20 clulas de Microcystis, foi estimado um dimetro mdio de 5m.
Assumindo que a forma da clula aproxima-se de uma esfera, cujo volume 4/3r3 = 65,4m3, ao se
quantificar 1 milho de clulas por mL, o biovolume ser 65,4 x 106m 3 /mL.
5.4 - Estimativa do erro na contagem
O objetivo da contagem dos organismos fitoplanctnicos assegurar que o nmero quantificado
represente o mais prximo possvel, o tamanho da populao natural. Em funo dos erros inerentes ao
mtodo, nunca alcanado o valor real, mas avaliada a probabilidade de que o valor medido se
encontre, dentro de certos limites, em torno do valor verdadeiro. Ao se iniciar a contagem, essencial
avaliar o nvel de preciso requerido. importante verificar se a distribuio dos organismos no fundo da
cmara aleatria, e caso no seja, os dados necessitam ser normalizados antes da estimativa de erro ou
limites de confiana.
Para um limite de confiana de 95%, o erro de contagem expresso em porcentagem pode ser estimado
pela frmula:
erro de contagem (%) =
2
x 100%
N
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quantitativamente, pela freqncia ou abundncia relativa dos organismos presentes na amostra, quando
no se tm condies de avaliar o volume da amostra. A quantidade de organismos presentes na alquota
contada convertida para freqncia de ocorrncia, segundo a expresso:
% Sp i =
N i x100
N
Onde:
Spi = espcie i
Ni = nmero de organismos da espcie i
N = nmero total de organismos na alquota.
6.2 - Exame quantitativo
O resultado do exame de fitoplncton em mananciais expresso geralmente em nmero de
organismos/mL. O resultado do exame de fitoplncton em guas para abastecimento expresso, alm do
nmero de organismos/mL, em nmero de UPA/mL ou cls./mL.
Observao 5: Certos tipos de organismos, quando excedem determinado nmero de UPA/mL ou
nmero de clulas, podem causar problemas de sabor e/ou odor, obstruo de filtros e toxicidade
na gua.
7. Controle Laboratorial e Estocagem
Aps a anlise, uma subamostra mantida em um frasco devidamente etiquetado. A etiqueta deve conter
todas as informaes necessrias para a pronta identificao da amostra. recomendado manter um
registro de todas as amostras analisadas e estocadas. A estocagem, especialmente de amostras
preservadas com lugol, deve ser no escuro, com reposio peridica do conservante com durao de at
3 meses. O prazo de estocagem de 6 meses a vrios anos para amostras preservadas com formol.
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CIANOFCEAS
N ORGANISMOS
N UPA
CLOROFCEAS
N ORGANISMOS
N UPA
DIATOMCEAS
N ORGANISMOS
N UPA
EUGLENOFCEAS
N ORGANISMOS
N UPA
FITOFLAGELADOS
N ORGANISMOS
N UPA
XANTOFCEAS
N ORGANISMOS
N UPA
OBSERVAES: clulas de
cianobactrias (cls./mL)=
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Data Entrada:
Data Emisso:
Dados do Cliente:
Nome:
Municpio:
U.F:
Dados de Campo:
Manancial:
Local:
Coletor:
Fator de Concentrao: 2,12
RESULTADOS
GRUPO
N ORG/mL
N UPA/mL
CIANOFCEAS
Microcystis aeruginosa
Pseudanabaena mucicola
20
15
15,0
07,5
CLOROFCEAS
Scenedesmus bicaudatus
Chlorella sp.
05
12
02,5
04,0
DIATOMCEAS
Nitzschia palea
Cyclotella sp.
30
25
12,0
06,0
FITOFLAGELADOS
Strombomonas sp.
Cryptomonas sp.
05
10
02,5
08,0
Total:122
35,0
Observao:
Metodologia:
Nota:
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Bilogo Responsvel
CRBio n.
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