Metodologia Macrodiluição

M7-A6 Vol. 23 No. 2 Substitui a Norma M7-A5 Vol. 20 No.
Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio para Bactria de Crescimento Aerbico: Norma Aprovada - Sexta Edio
Este documento focaliza mtodos de referncia para a determinao das concentraes inibitrias mnimas (CIMs) das bactrias aerbicas por macrodiluio em caldo, microdiluio em caldo e diluio em gar. Uma norma de aplicao global desenvolvida mediante o processo consensual do NCCLS.
Permission to translate the M2-A8 has been granted to ANVISA by CLSI (Formerly NCCLS). In the event of any variations in meaning that may be introduced through translation, the original NCCLS publication (in English) is authoritative. For each standard, the interpretive data are valid only if the methodology in the standard is followed. NCCLS frequently updates the interpretive tables through new editions and supplements. Users should refer to the most recent edition. In January 2005, NCCLS changed its name to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Copies of the complete current standards and informational supplement (in English) may be obtained from CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, U.S.A.; telephone: +610.688.0100; fax: +610.688.700; Internet: www.clsi.org. The permission granted by NCCLS/CLSI is limited to distribution of M2-A8 by ANVISA to clinical laboratories in Brazil. Permission to reproduce additional copies or otherwise use the text of these documents to an extent not permitted under Copyright Law must be obtained in writing from the Clinical and Laboratory Standards Institute.
Coordenao da Traduo Silvia Figueiredo Costa Doutora em Doenas Infecciosas e Parasitrias pela Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Organizao Pan Americana de Sade Revisor: Emerson Cavassin. Mestre em Farmcia pela Faculdade de Farmcia da USP. E especializao em Anlises Clncas pela UEL. Laboratrio de Microbiologia do Hospital Universitrio da Universidade Estadual de Londrina. Direitos de Traduo e Reproduo Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Gerencia Geral de Tecnologia em Servios de Sade
NCCLS...
Servindo A Comunidade Mundial das Cincias Mdicas Atravs de Consenso Voluntrio
O NCCLS uma organizao internacional interdisciplinar, sem fins lucrativos, educacional e de desenvolvimento de normas/padres, que promove o desenvolvimento e uso de normas/padres e diretrizes consensuais voluntrias na comunidade de ateno sade. reconhecido no mundo inteiro pela aplicao de seu singular processo consensual ao desenvolvimento de normas/padres e diretrizes para testes de patologia clnica e questes relacionadas com a ateno sade. O NCCLS baseia-se no princpio de que o consenso uma maneira efetiva e custo-eficaz de melhorar os testes clnicos e servios de ateno sade. Alm de desenvolver e promover o uso voluntrio de normas/padres e diretrizes consensuais, o NCCLS fornece um foro aberto e isento para tratar questes que afetam a qualidade dos testes de patologia clnica e a ateno sade. Proposta Documento consensual do NCCLS que passa por um primeiro estgio de reviso pela comunidade de sade como proposta de norma/padro ou diretriz. O documento deve receber uma reviso tcnica abrangente e minuciosa, incluindo a reviso geral de seu escopo, enfoque e utilidade, e uma reviso detalhada de seu contedo tcnico e editorial. Tentativa - Uma norma/padro ou diretriz tentativa disponibilizada para reviso e comentrios apenas quando h necessidade evidente de avaliao de campo de um mtodo recomendado ou de coleta de dados especficos relativos a um protocolo recomendado. Deve ser revisada para assegurar sua utilidade. Aprovada Norma/padro ou diretriz que recebeu aprovao consensual da comunidade de ateno sade. Deve ser revisada para se avaliar a utilidade do documento final, garantir que se chegue a um consenso (ex., que os comentrios relativos a verses anteriores foram satisfatoriamente resolvidos) e identificar qualquer necessidade de documentos consensuais adicionais. As normas/padres e diretrizes do NCCLS representam uma opinio consensual sobre as boas prticas e refletem uma concordncia substancial das partes interessadas, competentes e afetadas materialmente, obtido por meio dos procedimentos consensuais estabelecidos pelo NCCLS. As exigncias das normas/padres e diretrizes do NCCLS podem ser mais ou menos rigorosas do que os regulamentos pertinentes. Conseqentemente, o acatamento desse documento consensual voluntrio no dispensa o usurio da responsabilidade de obedecer aos regulamentos pertinentes.
PUBLICAES
Os documentos do NCCLS so publicados como normas/padres, diretrizes ou relatrios de comit. Norma Documento desenvolvido atravs do processo de consenso, o qual identifica claramente os requisitos especficos e essenciais dos materiais, dos mtodos, ou das prticas a serem usados sem modificaes. Uma norma tambm pode conter elementos discricionrios, que so claramente identificados. Diretriz Documento desenvolvido atravs do processo de consenso, o qual descreve os critrios para as prticas e os procedimentos, ou os materiais operacionais gerais a serem usados de maneira voluntria. Uma diretriz pode ser usada conforme redigida, ou modificada pelo usurio para conform-la a suas necessidades especficas. Relatrio Documento que no passou pela reviso consensual e foi publicado pela Diretoria.
COMENTRIOS
Os comentrios dos usurios so essenciais ao processo consensual. Qualquer pessoa pode apresentar um comentrio, e todos os comentrios so considerados pelo comit do NCCLS que preparou o documento, em conformidade com o processo consensual. Todos os comentrios, incluindo aqueles que resultadoaram em mudana no documento quando publicado no prximo nvel consensual, bem como aqueles que no resultadoaram em mudana, so respondidos pelo comit num apndice do documento. Incentiva-se os leitores a tecer comentrios de qualquer formato e em qualquer oportunidade sobre qualquer documento do NCCLS. Envie seus comentrios ao seguinte endereo: NCCLS Executive Offices, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087, Estados Unidos. PARTICIPAO VOLUNTRIA Os profissionais de sade de todas as especialidades so instados a participar voluntariamente nos projetos do NCCLS. Para informaes adicionais sobre participao nos comits, favor contactar os Escritrios Executivos do NCCLS.
PROCESSO CONSENSUAL
O processo consensual voluntrio do NCCLS um protocolo que estabelece critrios formais para: autorizar um projeto; desenvolver e revisar documentos de maneira transparente; revisar documentos em resposta a comentrios de usurios; aceitar um documento como norma/padro ou diretriz consensual. A maioria dos documentos do NCCLS so sujeitos a dois nveis de consensoproposto e aprovado. Dependendo da necessidade de avaliao ou coleta de campo, os documentos tambm podem disponibilizados para reviso em nvel consensual intermedirio (ex., tentativo).
Volume 23
M7-A6
Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio para Bactria de Crescimento Aerbico; Norma Aprovada Sexta Edio
Resumo
Os testes de sensibilidade so indicados para qualquer organismo que contribua a um processo infeccioso que justifique terapeutica antimicrobiana, sempre que sua sensibilidade no possa ser predita de maneira confivel a partir do conhecimento da identidade do organismo. Os testes de sensibilidade so indicados, com maior freqncia, quando se acredita que o organismo causativo pertence a uma espcie capaz de apresentar resistncia aos agentes antimicrobianos geralmente usados. H diversos mtodos laboratoriais que podem ser usados para medir a sensibilidade in vitro das bactrias aos agentes antimicrobianos. O presente documento descreve tcnicas padro de diluio em caldo (macrodiluio e microdiluio) e diluio em gar, alm de incluir uma srie de procedimentos para padronizar a execuo dos testes. Alm disso, descreve o desempenho, as aplicaes e as limitaes dos mtodos atualmente recomendados pelo NCCLS. As informaes complementares (tabelas M100) apresentadas junto com a presente norma constituem as informaes mais atualizadas sobre a seleo das drogas, a interpretao dos resultados e o controle de qualidade usando os testes padro na Norma M7. Como de praxe, essas tabelas foram atualizadas e substituem as tabelas publicadas em anos anteriores. As mudanas nas tabelas efetuadas aps a edio anterior (M100-S12) so destacadas em negrito. Alm disso, acrescentou-se um glossrio de termos, classes e abreviaes dos antibiticos (para uso com os testes de sensibilidade in vitro aos agentes antimicrobianos). Acredita-se que esse glossrio prestar informaes adicionais sobre a Norma M7 aos usurios, uma vez que apresenta a terminologia antimicrobiana usada nos documentos sobre os testes de sensibilidade, que pode ser pouco familiar ou parecer confusa aos usurios nos laboratrios. O glossrio, como parte das informaes tabulares da M100, ser sempre atualizado em futuras revises (anuais) da Norma M100. NCCLS. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved StandardSixth Edition. NCCLS document M7-A6 (ISBN 1-56238-486-4). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.
Nmero 2
NCCLS
O processo consensual do NCCLS, mecanismo que permite a reviso de um documento, em dois ou mais nveis, pela comunidade de ateno sade, um processo permanente. Os usurios devem aguardar edies revisadas de qualquer documento. Uma vez que as rpidas mudanas nas tecnologias podem afetar os procedimentos, mtodos e protocolos nas normas/padres e diretrizes, os usurios devem substituir as edies ultrapassadas pelas edies atualizadas dos documentos do NCCLS. As edies atualizadas esto relacionadas no NCCLS Catalog, distribudo s organizaes membros e, mediante solicitao, aos nomembros. Se sua organizao no membro do NCCLS e gostaria de ser, assim como solicitar um exemplar do NCCLS Catalog, favor contatar os Escritrios Executivos do NCCLS. Telefone: +1 610.688.0100; Fax: +1 610.688.0700; E-Mail: exoffice@nccls.org; Website: www.nccls.org
ii
M7-A6 ISBN 1-56238-486-4 ISSN 0273-3099
Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio para Bactria de Crescimento Aerbico; Norma Aprovada Sexta Edio
Volume 23 Nmero 2
Mary Jane Ferraro, Ph.D., M.P.H., Presidente Matthew A. Wikler, M.D., M.B.A., Vice Presidente William A. Craig, M.D. Michael N. Dudley, Pharm.D. George M. Eliopoulos, M.D. David W. Hecht, M.D. Janet Hindler, MCLS, M.T. (ASCP) L. Barth Reller, M.D. Albert T. Sheldon, Jr., Ph.D. Jana M. Swenson, M.M.Sc. Fred C. Tenover, Ph.D. Raymond T. Testa, Ph.D. Melvin P. Weinstein, M.D.
Nmero 2
NCCLS
Esta publicao protegida por direitos autorais. Nenhuma parte pode ser reproduzida, armazenada em sistema de recuperao, transmitida, ou disponibilizada em qualquer formato ou por qualquer meio (eletrnico, mecnico, fotocpia, gravao, ou outros) sem consentimento prvio, por escrito, do NCCLS, exceto nos casos relacionados a seguir. Pelo presente instrumento, o NCCLS concede autorizao para reproduzir partes limitadas desta publicao, para uso em manuais de procedimentos laboratoriais, num nico local; para emprstimo entre bibliotecas; ou para uso em programas educacionais, sempre que as vrias cpias dessa reproduo sejam distribudas gratuitamente, no contenham, em qualquer circunstncia, mais do que 20% do texto do documento e incluam o seguinte aviso: Reproduzido mediante autorizao; parte da publicao M7-A6Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio para Bactria de Crescimento Aerbico; Norma AprovadaSexta Edio (ISBN 156238-486-4) do NCCLS. Cpias da atual edio podem ser obtidas no seguinte endereo: NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, Estados Unidos. Autorizao para reproduzir ou usar o texto deste documento alm das isenes aqui concedidas ou nos termos da Legislao de Direitos Intelectuais pode ser obtida do NCCLS mediante solicitao por escrito. As autorizaes podem ser obtidas no seguinte endereo: Executive Director, NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, Estados Unidos. Copyright 2003. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Citao Sugerida (NCCLS. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved StandardSixth Edition. NCCLS document M7-A6 [ISBN 1-56238-486-4]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.)
Norma Proposta Junho de 1980 Norma Tentativa Dezembro de 1982 Norma Aprovada Junho de 1986 Norma TentativaSegunda Edio Novembro de 1988 Norma AprovadaSegunda Edio Abril de 1990 Norma AprovadaTerceira Edio Dezembro de 1993 Norma AprovadaQuarta Edio Janiero de 1997 Norma AprovadaQuinta Edio Janeiro de 2000 Norma AprovadaSexta Edio Janeiro de 2003
ISBN 1-56238-486-4 ISSN 0273-3099
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An NCCLS global consensus standard. NCCLS. All rights reserved.
Volume 23
M7-A6
Membros do Comit
Comit da rea de Microbiologia
James H. Jorgensen, Ph.D. Presidente Mary Jane Ferraro, Ph.D., M.P.H. Vice Presidente University of Texas Health Science Center San Antonio, Texas Massachusetts General Hospital Boston, Massachusetts
Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana Mary Jane Ferraro, Ph.D., M.P.H. Presidente Matthew A. Wikler, M.D., M.B.A. Vice Presidente William A. Craig, M.D. Michael N. Dudley, Pharm.D. George M. Eliopoulos, M.D. David W. Hecht, M.D. Janet Hindler, MCLS, M.T. (ASCP) L. Barth Reller, M.D. Albert T. Sheldon, Jr., Ph.D. Jana M. Swenson, M.M.Sc. Fred C. Tenover, Ph.D. Raymond T. Testa, Ph.D. Melvin P. Weinstein, M.D. Massachusetts General Hospital Boston, Massachusetts ViroPharma, Incorporated Exton, Pennsylvania University of Wisconsin Madison, Wisconsin Essential Therapeutics, Inc. Mountain View, California Beth Israel Deaconess Medical Center Boston, Massachusetts Loyola University Medical Center Maywood, Illinois UCLA Medical Center Los Angeles, California Duke University Medical Center Durham, North Carolina Food and Drug Administration Rockville, Maryland Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia Wyeth-Ayerst Research Pearl River, New York Robert Wood Johnson Medical School New Brunswick, New Jersey
Nmero 2 Consultores Steven D. Brown, Ph.D. Karen Bush, Ph.D. Franklin R. Cockerill, III, M.D. Mike E. Cox Sharon K. Cullen, B.S., RAC Dwight J. Hardy, Ph.D. Ronald N. Jones, M.D. Donald E. Low, M.D. John E. McGowan, Jr., M.D. Professor Ian Phillips James A. Poupard, Ph.D. Robert P. Rennie, Ph.D. Rosemary Roberts, M.D. Daniel F. Sahm, Ph.D. Sally Selepak, M.T. (ASCP) Daniel L. Shungu, Ph.D. John D. Turnidge, M.D. Clinical Microbiology Institute Wilsonville, Oregon
NCCLS
R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute Raritan, New Jersey Mayo Clinic/Mayo Foundation Rochester, Minnesota Anaerobe Systems Morgan Hill, California Dade Behring Inc. MicroScan West Sacramento, California University of Rochester Medical Center Rochester, New York The JONES Grupo/JMI North Liberty, Iowa Toronto Medical Labs. & Mount Sinai Hospital University of Toronto Emory University, Rollins School of Public Health Atlanta, Georgia EUCAST Malaga, Spain GlaxoSmithKline Collegeville, Pennsylvania University of Alberta Hospital Edmonton, Alberta FDA Division of Anti-Infective Drug Products Rockville, Maryland Focus Technologies Inc. Herndon, Virginia FDA Center for Devices/Rad. Health Rockville, Maryland Merck & Company, Inc. Rahway, New Jersey Womens and Childrens Hospital North Adelaide, Australia
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Volume 23 Consultores (Continuao) Linda J. Utrup, Ph.D. USDA Riverdale, Maryland NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania NCCLS Wayne, Pennsylvania
M7-A6
Lois M. Schmidt, D.A. Oficial de Ligao Tracy A. Dooley, M.L.T.(ASCP) Gerente do Projeto Patrice E. Polgar Editor Donna M. Wilhelm Editor Assisstente
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Nmero 2 (em 1o de outubro de 2002)

Membros Mantenedores Abbott Laboratories American Association for Clinical Chemistry Beckman Coulter, Inc. BD and Company bioMrieux, Inc. CLMA College of American Pathologists GlaxoSmithKline Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Pfizer Inc Roche Diagnostics, Inc. Membros Profissionais AISAR-Associazione Italiana per lo Studio degli American Academy of Family Physicians American Association for Clinical Chemistry American Association for Respiratory Care American Chemical Society American Medical Technologists American Public Health Association American Society for Clinical Laboratory Science American Society of Hematology American Society for Microbiology American Type Culture Collection, Inc. Asociacion Mexicana de Bioquimica Clinica A.C. Assn. of Public Health Laboratories Assoc. Micro. Clinici ItalianiA.M.C.L.I. British Society for Antimicrobial Chemotherapy CADIME-Camara De Instituciones De Diagnostico Medico Canadian Society for Medical Laboratory ScienceSocit Canadienne de Science de Laboratoire Mdical Clinical Laboratory Management Association COLA College of American Pathologists College of Medical Laboratory Technologists of Ontario College of Physicians and Surgeons of Saskatchewan ESCMID Fundacin Bioqumica Argentina International Association of Medical Laboratory Technologists International Council for Standardization in Haematology International Federation of Clinical Chemistry Italian Society of Clinical Biochemistry and Clinical Molecular Biology Japan Society of Clinical Chemistry Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations National Academy of Clinical Biochemistry National Association of Testing Authorities Australia National Society for Histotechnology, Inc. Ontario Medical Association Quality Management ProgramLaboratory Service RCPA Quality Assurance Programs PTY Limited Sociedade Brasileira de Analises Clinicas Sociedad Espanola de Bioquimica Clinica y Patologia Molecular Taiwanese Committee for Clinical Laboratory Standards (TCCLS) Turkish Society of Microbiology Membros Governamentais Association of Public Health Laboratories Armed Forces Institute of Pathology BC Centre for Disease Control Centers for Disease Control and Prevention Centers for Medicare & Medicaid Services/CLIA Program Centers for Medicare & Medicaid Services Chinese Committee for Clinical Laboratory Standards Commonwealth of Pennsylvania Bureau of Laboratories Department of Veterans Affairs
NCCLS
Membros Ativos
Deutsches Institut fr Normung (DIN) FDA Center for Devices and Radiological Health FDA Center for Veterinary Medicine FDA Division of Anti-Infective Drug Products Iowa State Hygienic Laboratory Massachusetts Department of Public Health Laboratories National Center of Infectious and Parasitic Diseases (Bulgaria) National Health Laboratory Service (South Africa) National Institute of Standards and Technology New York State Department of Health Ohio Department of Health Ontario Ministry of Health Pennsylvania Dept. of Health Saskatchewan Health-Provincial Laboratory Scientific Institute of Public Health; Belgium Ministry of Social Affairs, Public Health and the Environment Swedish Institute for Infectious Disease Control Thailand Department of Medical Sciences Membros na Indstria AB Biodisk Abbott Laboratories Abbott Laboratories, MediSense Products Acrometrix Corporation Alifax S.P.A. Ammirati Regulatory Consulting Anaerobe Systems Assssor AstraZeneca AstraZeneca R & D Boston Avant Immunotherapeutics, Inc. Aventis Axis-Shield POC AS Bayer Corporation Elkhart, IN Bayer Corporation Tarrytown, NY Bayer Corporation West Haven, CT Bayer Medical Ltd.
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Volume 23
BD BD Biosciences San Jose, CA BD Consumer Products BD Diagnostic Systems BD Italia S.P.A. BD VACUTAINER Systems Beckman Coulter, Inc. Beckman Coulter, Inc. Primary Care Diagnostics Beckman Coulter K.K. (Japan) Bio-Development SRL Bio-Inova Life Sciences International Bio-Inova Life Sciences North America BioMedia Laboratories Sdn Bhd BioMrieux (NC) bioMrieux, Inc. (MO) Biometrology Consultants Bio-Rad Laboratories, Inc. Bio-Rad Laboratories, Inc. - France Biotest AG Blaine Healthcare Associates, Inc. Bristol-Myers Squibb Company Canadian External Quality Assessment Laboratory Capital Management Consulting, Inc. Carl Schaper Checkpoint Development Inc. Chiron Corporation ChromaVision Medical Systems, Inc. Chronolab Ag Clinical Design Grupo Inc. Clinical Laboratory Improvement Consultants Cognigen Community Medical Center (NJ) Control Lab (Brazil) Copan Diagnostics Inc. Cosmetic Ingredient Review Cubist Pharmaceuticals Dade Behring Inc. - Deerfield, IL Dade Behring Inc. - Glasgow, DE Dade Behring Inc. - Marburg, Germany Dade Behring Inc. - Sacramento, CA Dade Behring Inc. - San Jose, CA David G. Rhoads Associates, Inc. Diagnostics Consultancy Diagnostic Products Corporation Eiken Chemical Company, Ltd. Elan Pharmaceuticals Electa Lab s.r.l. Enterprise Analysis Corporation Essential Therapeutics, Inc. EXPERTech Associates, Inc. F. Hoffman-La Roche AG Fort Dodge Animal Health General Hospital Vienna (Austria) Gen-Probe GlaxoSmithKline Greiner Bio-One Inc. Helena Laboratories Home Diagnostics, Inc. IGEN Inc. Immunicon Corporation Instrumentation Laboratory International Technidyne Corporation IntraBiotics Pharmaceuticals, Inc. I-STAT Corporation Johnson and Johnson Pharmaceutical Research and Development, L.L.C. Kendall Sherwood-Davis & Geck LAB-Interlink, Inc. Laboratory Specialists, Inc. Labtest Diagnostica S.A. LifeScan, Inc. (a Johnson & Johnson Company) Lilly Research Laboratories Macemon Consultants Medical Device Consultants, Inc. Merck & Company, Inc. Minigrip/Zip-Pak Molecular Diagnostics, Inc. mvi Sciences (MA) Nabi Nichols Institute Diagnostics (Div. of Quest Diagnostics, Inc.) NimbleGen Systems, Inc. Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. Norfolk Associates, Inc. Novartis Pharmaceuticals Corporation Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. (Raritan, NJ) Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. (Rochester, NY) Oxoid Inc. Paratek Pharmaceuticals Pfizer Inc Pharmacia Corporation Philips Medical Systems Powers Consulting Services Premier Inc. Procter & Gamble Pharmaceuticals, Inc. The Product Development Grupo QSE Consulting Quintiles, Inc. Radiometer America, Inc. Radiometer Medical A/S
M7-A6
Replidyne Roche Diagnostics GmbH Roche Diagnostics, Inc. Roche Laboratories (Div. Hoffmann-La Roche Inc.) Sarstedt, Inc. SARL Laboratoire Carron (France) Schering Corporation Schleicher & Schuell, Inc. Second Opinion Showa Yakuhin Kako Company, Ltd. Streck Laboratories, Inc. SurroMed, Inc. Synermed Diagnostic Corp. Sysmex Corporation (Japan) Sysmex Corporation (Long Grove, IL) The Clinical Microbiology Institute The Toledo Hospital (OH) Theravance Inc. Transasia Engineers Trek Diagnostic Systems, Inc. Versicor, Inc. Vetoquinol S.A. Visible Genetics, Inc. Vysis, Inc. Wallac Oy Wyeth-Ayerst Xyletech Systems, Inc. YD Consultant YD Diagnostics (Seoul, Korea) Associaes de Classe AdvaMed Association of Medical Diagnostic Manufacturers Japan Association Clinical Reagents Ind. (Tokyo, Japan) Medical Industry Association of Australia Membros Associados Ativos 31st Medical Grupo/SGSL (APO, AE) 67th CSH Wuerzburg, GE (NY) 121st General Hospital (CA) Academisch Ziekenhuis-VUB (Belgium) Acadiana Medical Laboratories, LTD (LA) Adena Regional Medical Center (OH) Advocate Healthcare Lutheran General (IL)
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Nmero 2
Akershus Central Hospital and AFA (Norway) Albemarle Hospital (NC) Allegheny General Hospital (PA) Allina Health System (MN) Alton Ochsner Medical Foundation (LA) Antwerp University Hospital (Belgium) Arkansas Department of Health ARUP at University Hospital (UT) Armed Forces Research Institute of Medical Science (APO, AP) Associated Regional & University Pathologists (UT) Aurora Consolidated Laboratories (WI) Azienda Ospedale Di Lecco (Italy) Bay Medical Center (MI) Baystate Medical Center (MA) Bbaguas Duzen Laboratories (Turkey) Bermuda Hospitals Board Bo Ali Hospital (Iran) Brooks Air Force Base (TX) Broward General Medical Center (FL) Cadham Provincial Laboratory Calgary Laboratory Services Carilion Consolidated Laboratory (VA) Cathay General Hospital (Taiwan) Central Peninsula General Hospital (AK) Central Texas Veterans Health Care System Centre Hospitalier Regional del la Citadelle (Belgium) Centro Diagnostico Italiano (Milano, Italy) Champlain Valley Physicians Hospital (NY) Chang Gung Memorial Hospital (Taiwan) Changi General Hospital (Singapore) The Charlotte Hungerford Hospital (CT) Childrens Hospital (LA) Childrens Hospital (NE) Childrens Hospital & Clinics (MN) Childrens Hospital Medical Center (Akron, OH) Childrens Hospital of Philadelphia (PA) Childrens Medical Center of Dallas (TX) Clarian HealthMethodist Hospital Clendo Lab (Puerto Rico) Clinical Laboratory Partners, LLC (CT) CLSI Laboratories (PA) Columbia Regional Hospital (MO) Commonwealth of Kentucky Community Hospital of Lancaster (PA) CompuNet Clinical Laboratories (OH) Cook County Hospital (IL) Cook Childrens Medical Center (TX) Covance Central Laboratory Services (IN) Danish Veterinary Laboratory (Denmark) Danville Regional Medical Center (VA) Delaware Public Health Laboratory Department of Health & Community Services (New Brunswick, Canada) DesPeres Hospital (MO) DeTar Hospital (TX) Detroit Health Department (MI) Diagnosticos da Amrica S/A (Brazil) Dr. Everett Chalmers Hospital (New Brunswick, Canada) Doctors Hospital (Bahamas) Duke University Medical Center (NC) Dwight David Eisenhower Army Med. Ctr. (GA) E.A. Conway Medical Center (LA) Eastern Maine Medical Center East Side Clinical Laboratory (RI) Eastern Health (Vic., Australia) Elyria Memorial Hospital (OH) Emory University Hospital (GA) Esoterix Center for Infectious Disease (TX) Fairview-University Medical Center (MN) Federal Medical Center (MN) Florida Hospital East Orlando Focus Technologies (CA) Foothills Hospital (Calgary, AB, Canada) Fresenius Medical Care/Spectra East (NJ) Fresno Community Hospital and Medical Center Frye Regional Medical Center (NC) Gambro BCT (CO) Geisinger Medical Center (PA) Grady Memorial Hospital (GA)
NCCLS
Hahnemann University Hospital (PA) Harris Methodist Erath County (TX) Harris Methodist Fort Worth (TX) Hartford Hospital (CT) Headwaters Health Authority (Alberta, Canada) Health Network Lab (PA) Health Partners Laboratories (VA) Heartland Regional Medical Center (MO) Highlands Regional Medical Center (FL) Hoag Memorial Hospital Presbyterian (CA) Holmes Regional Medical Center (FL) Holzer Medical Center (OH) Hopital du Sacre-Coeur de Montreal (Montreal, Quebec, Canada) Hpital Maisonneuve Rosemont (Montreal, Canada) Hospital for Sick Children (Toronto, ON, Canada) Hospital Sousa Martins (Portugal) Hotel Dieu Hospital (Windsor, ON, Canada) Houston Medical Center (GA) Huddinge University Hospital (Sweden) Hurley Medical Center (MI) Indiana University Innova Fairfax Hospital (VA) Institute of Medical and Veterinary Science (Australia) International Health Management Associates, Inc. (IL) Jackson Memorial Hospital (FL) Jersey Shore Medical Center (NJ) John C. Lincoln Hospital (AZ) John F. Kennedy Medical Center (NJ) John Peter Smith Hospital (TX) Kadlec Medical Center (WA) Kaiser Permanente Medical Care (CA) Kaiser Permanente (MD) Kantonsspital (Switzerland) Keller Army Community Hospital (NY) Kenora-Rainy River Regional Laboratory Program (Ontario, Canada) Kern Medical Center (CA) Kimball Medical Center (NJ) King Faisal Specialist Hospital
Volume 23
(IN) King Khalid National Guard Hospital (Saudi Arabia) Kings Daughter Medical Center (KY) Klinini Center (Slovenia) Laboratories at Bonfils (CO) Laboratoire de Sant Publique du Quebec (Canada) Laboratrio Fleury S/C Ltda. (Brazil) Laboratory Corporation of America (NJ) Laboratory Corporation of America (MO) LAC and USC Healthcare Network (CA) Lakeland Regional Medical Center (FL) Lancaster General Hospital (PA) Langley Air Force Base (VA) LeBonheur Childrens Medical Center (TN) L'Hotel-Dieu de Quebec (Canada) Libero Instituto Univ. Campus BioMedico (Italy) Louisiana State University Medical Center Maccabi Medical Care and Health Fund (Israel) Malcolm Grow USAF Medical Center (MD) Martin Luther King/Drew Medical Center (CA) Massachusetts General Hospital (Microbiology Laboratory) MDS Metro Laboratory Services (Burnaby, BC, Canada) Medical College of Virginia Hospital Medicare/Medicaid Certification, State of North Carolina Memorial Hospital at Gulfport (MS) Memorial Medical Center (IL) Memorial Medical Center (LA) Jefferson Davis Hwy Memorial Medical Center (LA) Napoleon Avenue Mercy Medical Center (IA) Methodist Hospital (TX) Methodist Hospitals of Memphis (TN) MetroHealth Medical Center (OH) Michigan Department of Community Health Mississippi Baptist Medical Center Monte Tabor Centro Italo Brazileiro de Promocao (Brazil) Guthrie Clinic Laboratories (PA) Montreal Childrens Hospital (Canada) Montreal General Hospital (Canada) MRL Pharmaceutical Services, Inc. (VA) Nassau County Medical Center (NY) National Institutes of Health (MD) Naval Hospital Corpus Christi (TX) Naval Surface Warfare Center (IN) Nebraska Health System New Britain General Hospital (CT) New England Fertility Institute (CT) New Mexico VA Health Care System New York University Medical Center North Carolina State Laboratory of Public Health North Shore Long Island Jewish Health System Laboratories (NY) North Shore University Hospital (NY) Northwestern Memorial Hospital (IL) O.L. Vrouwziekenhuis (Belgium) Ordre professionnel des technologists mdicaux du Qubec Ospedali Riuniti (Italy) The Ottawa Hospital (Ottawa, ON, Canada) Our Lady of Lourdes Hospital (NJ) Our Lady of the Resurrection Medical Center (IL) Pathology and Cytology Laboratories, Inc. (KY) Pathology Associates Medical Laboratories (WA) The Permanente Medical Grupo (CA) Piedmont Hospital (GA) Pikeville Methodist Hospital (KY) Pocono Hospital (PA) Presbyterian Hospital of Dallas (TX) Providence Health Care Queen Elizabeth Hospital (Prince Edward Island, Canada) Queensland Health Pathology Services (Australia) Quest Diagnostics Incorporated (CA) Quintiles Laboratories, Ltd. (GA)
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(Saudi Arabia) Reid Hospital & Health Care Services (IN) Research Medical Center (MO) Rex Healthcare (NC) Rhode Island Department of Health Laboratories Riyadh Armed Forces Hospital (Saudi Arabia) Royal Columbian Hospital (New Westminster, BC, Canada) Sacred Heart Hospital (MD) Saint Marys Regional Medical Center (NV) St. Alexius Medical Center (ND) St. Anthony Hospital (CO) St. Anthonys Hospital (FL) St. Barnabas Medical Center (NJ) St-Eustache Hospital (Quebec, Canada) St. Francis Medical Ctr. (CA) St. John Hospital and Medical Center (MI) St. John Regional Hospital (St. John, NB, Canada) St. Joseph Hospital (NE) St. Josephs Hospital Marshfield Clinic (WI) St. Joseph's Medical Center (NY) St. Joseph Mercy Hospital (MI) St. Jude Children's Research Hospital (TN) St. Lukes Regional Medical Center (IA) St. Mary of the Plains Hospital (TX) St. Marys Hospital & Medical Center (CO) St. Vincent Medical Center (CA) Ste. Justine Hospital (Montreal, PQ, Canada) Salina Regional Health Center (KS) San Francisco General Hospital (CA) Santa Clara Valley Medical Center (CA) Seoul Natl University Hospital (Korea) Shanghai Center for the Clinical Laboratory (China) South Bend Medical Foundation (IN) Southwest Texas Methodist Hospital (TX) South Western Area Pathology Service (Australia) Southern Maine Medical Center Specialty Laboratories, Inc. (CA)
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Nmero 2
Regions Hospital
NCCLS
Stanford Hospital and Clinics (CA)
State of Washington Department of Health Stony Brook University Hospital (NY) Stormont-Vail Regional Medical Center (KS) Sun Health-Boswell Hospital (AZ) Swedish Medical Center Providence Campus (WA) Tampa General Hospital (FL) Temple University Hospital (PA) Tenet Odessa Regional Hospital (TX) The Toledo Hospital (OH) Touro Infirmary (LA) Trident Regional Medical Center (SC) Tripler Army Medical Center (HI) Truman Medical Center (MO) UCSF Medical Center (CA) UNC Hospitals (NC) University College Hospital (Galway, Ireland) University Hospital (Gent) (Belgium) University Hospitals of Cleveland (OH)
The University Hospitals (OK) University of Alabama-Birmingham Hospital University of Alberta Hospitals (Canada) University of Colorado Health Science Center University of Chicago Hospitals (IL) University of Illinois Medical Center University of the Ryukyus (Japan) University of Texas M.D. Anderson Cancer Center University of Virginia Medical Center University of Washington UZ-KUL Medical Center (Belgium) VA (Denver) Medical Center (CO) Virginia Department of Health VA (Hines) Medical Center VA (Kansas City) Medical Center (MO) VA (Western NY) Healthcare System VA (San Diego) Medical Center (CA) VA (Tuskegee) Medical Center (AL)
VA Outpatient Clinic (OH) Vejle Hospital (Denmark) Washington Adventist Hospital (MD) Washoe Medical Center Laboratory (NV) West Jefferson Medical Center (LA) West Shore Medical Center (MI) Wilford Hall Medical Center (TX) William Beaumont Army Medical Center (TX) William Beaumont Hospital (MI) William Osler Health Centre (Brampton, ON, Canada) Williamsburg Community Hospital (VA) Winn Army Community Hospital (GA) Winnipeg Regional Health Authority (Winnipeg, Canada) Wishard Memorial Hospital (IN) Yonsei University College of Medicine (Korea) York Hospital (PA)
AUTORIDADES Donna M. Meyer, Ph.D., Presidente CHRISTUS Health Thomas L. Hearn, Ph.D., Presidente Eleito Centers for Disease Control and Prevention
MEMBROS DA DIRETORIA Susan Blonshine, RRT, RPFT, FAARC TechEd Wayne Brinster BD Kurt H. Davis, FCSMLS, CAE Canadian Society for Medical Tadashi Kawai, M.D., Ph.D. International Clinical Pathology Center J. Stephen Kroger, M.D., MACP COLA Willie E. May, Ph.D. National Institute of Standards and
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Volume 23
Emil Voelkert, Ph.D., Secretrio Roche Diagnostics GmbH Gerald A. Hoeltge, M.D., Tesoureiro The Cleveland Clinic Foundation F. Alan Andersen, Ph.D., Presidente Imediatamente Anterior Cosmetic Ingredient Review John V. Bergen, Ph.D., Diretor Executivo Laboratory Science Lillian J. Gill, M.S. FDA Center for Devices and Radiological Health Robert L. Habig, Ph.D. Habig Consulting Grupo Carolyn D. Jones, J.D., M.P.H. AdvaMed Technology
M7-A6
Gary L. Myers, Ph.D. Centers for Disease Control and Prevention Barbara G. Painter, Ph.D. Pharma Micro Consultancy, LLC Judith A. Yost, M.A., M.T.(ASCP) Centers for Medicare & Medicaid Services
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Nmero 2
Sumrio
NCCLS
Resumo ..................................................................................................................................................................i Membros do Comit ..............................................................................................................................................v Membros Ativos ................................................................................................................................................. viii Prefcio ..............................................................................................................................................................xvi Resumo das Principais Mudanas neste Documento ........................................................................................ xvii Declarao da Misso do Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana do NCCLS ......................xix Precaues Padro ..............................................................................................................................................xix Enfoque de Sistema de Qualidade ......................................................................................................................xxi 1 Introduo ...............................................................................................................................................1 1.1 1.2 2 3 Abrangncia ...............................................................................................................................1 Definies ..................................................................................................................................2
Indicaes para a Execuo de Testes de Sensibilidade...........................................................................2 Agentes Antimicrobianos ........................................................................................................................... 3.1 3.2 3.3 3.4 Fonte ...........................................................................................................................................3 Pesagem de Ps Antimicrobianos ..............................................................................................3 Preparao de Solues Padro .................................................................................................5 Nmero de Concentraes Testadas ...........................................................................................5 Relatrios de Rotina ...................................................................................................................6 Nomes Genricos .......................................................................................................................6 Diretrizes de Seleo .................................................................................................................8 Sugesto de Diretrizes para Testes e Relatrio Rotineiros e Seletivos .......................................8 Soluo Padro de Turbidez para a Preparao do Inculo .......................................................9 Mtodo de Crescimento ...........................................................................................................10 Mtodo de Suspenso Direta de Colnias ................................................................................10 Reagentes e Materiais ...............................................................................................................11 Preparao das Placas de Diluio em gar ............................................................................12 Preparao do Inculo .............................................................................................................13 Inoculao das Placas de Diluio em gar ............................................................................13 Incubao das Placas de Diluio em gar .............................................................................14 Determinao dos Pontos Finais dos Testes de Diluio em gar ..........................................14 Meio Caldo Mueller-Hinton .....................................................................................................14 Preparao e Armazenamento de Agentes Antimicrobianos Diludos......................................16 Testes de Diluio em Caldo ...................................................................................................17
Seleo dos Agentes Antimicrobianos para Testes e Relatrio de Rotina ..............................................5 4.1 4.2 4.3 4.4
Preparao do Inculo para Testes de Diluio .......................................................................................9 5.1 5.2 5.3
Teste de Diluio em gar ....................................................................................................................10 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6
Testes de Diluio em Caldo (Macrodiluio e Microdiluio).............................................................14 7.1 7.2 7.3
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Volume 23
Sumrio (Continuao) 8
M7-A6
Organismos Fastidiosos..........................................................................................................................18 8.1 8.2 8.3 Espcies de Haemophilus ........................................................................................................18 Neisseria gonorrhoeae..............................................................................................................19 Streptococcus pneumoniae e Outros Streptococcus spp. ..........................................................20 Estafilococos ................................................................................................................................ Enterococos ..............................................................................................................................22 Bacilos Gram-Negativos de Espectro Ampliado Produtores de -Lactamase .........................23 Propsito ..................................................................................................................................24 Seleo do Testes de -Lactamase ...........................................................................................24 Sensvel ........................................................................................................................................ Intermediria ............................................................................................................................25 Resistente .................................................................................................................................25 Propsito ..................................................................................................................................25 Responsabilidades de Controle de Qualidade ..........................................................................25 Cepas de Referncia para Controle de Qualidade ....................................................................26 Armazenamento das Cepas de Controle de Qualidade ............................................................28 Controle de Qualidade de Lotes ...............................................................................................28 Limites de Controle de Qualidade da CIM ..............................................................................29 Freqncia dos Testes de Controle de Qualidade ....................................................................29 Freqncia dos Testes de Controle de Qualidade dos Testes de Triagem ...............................30 Ao Corretiva .........................................................................................................................30 Relatrio de Resultados de Testes Clnicos para Testes Fora-do-Controle............... ..............32 Verificao dos Resultados dos Testes Clnicos .....................................................................32 Outros Testes de Controle .......................................................................................................32 Aplicao dos Diversos Grupos de Organismos ......................................................................33 Resultados Enganadores ..........................................................................................................33 Emergncia de Resistncia ......................................................................................................33
Organismos Problema ............................................................................................................................21 9.1 9.2 9.3
10
Testes de -Lactamase ...........................................................................................................................24 10.1 10.2
11
Relatrios dos Resultados de CIM ........................................................................................................24 11.1 11.2 11.3
12
Testes de Controle de Qualidade ...........................................................................................................25 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10 12.11 12.12
13
Limitaes da Metodologia dos Testes de Diluio ..............................................................................33 13.1 13.2 13.3
14
Testes de Triagem .................................................................................................................................34
Referncias Bibliogrficas ...................................................................................................................................35 Apndice A. Fluxogramas do Protocolo de Controle de Qualidade ..................................................................37 Resumo dos Comentrios e das Respostas do Subcomit ...................................................................................39 Publicaes Afins do NCCLS .............................................................................................................................49
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NCCLS
Prefcio
Nesta reviso de 2003 da Norma M7Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically do NCCLS, vrias sees foram acrescentadas ou revisadas. Em especial, acrescentou-se uma nova seo sobre a verificao de resultados incomuns de testes clnicos, a qual est relacionada com uma nova Tabela 8 na M100. A seo sobre Controle de Qualidade detalha, agora, os critrios para uma opo de testes durante 20 ou 30 dias para converter o esquema de testes de dirios para semanais. A seo 8 sobre testes de organismos fastidiosos foi expandida. A verso mais recente das tabelas M100 (M100-S13), que so publicadas em separado nos anos entre revises do texto, foi includa neste documento para assegurar que os usurios estaro cientes das diretrizes mais recentes do Subcomit em relao aos mtodos e s informaes tabulares que normalmente so apresentadas nas tabelas anuais. A Norma M100-S14 ser atualizada durante as reunies do subcomit ao longo de 2003 e publicada novamente, como documento separado, em janeiro de 2004. Esta edio da M7 contm muitas outras mudanas editoriais e processuais resultado das reunies do Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana desde 2000, e vrias mudanas nas tabelas M100 ocorridas no ltimo ano. As mudanas especficas nas tabelas M100 encontram-se resumidas no incio das folhas volantes relativas M100-S13 com este documento. As mudanas mais importantes na Norma M7 encontram-se resumidas a seguir. Foi uma honra presidir o Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana durante os ltimos seis anos. Muitos membros do Subcomit (que agora totaliza mais de 180 voluntrios, incluindo membros, assessores e observadores) foram indispensveis para a elaborao desse documento. Alm disso, gostaria de agradecer aos presidentes dos grupos de trabalho do Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana por suas valiosas contribuies durante os trs ltimos anos. Dentre eles, gostaria de mencionar Karen Bush (Grupo de Trabalho para ESBL); Frank Cockerill (Grupo de Trabalho para Agentes de Bioterrorismo); Sharon Cullen (Grupo de Trabalho para Controle de Qualidade); Dwight Hardy (Grupo de Trabalho para Stenotrophomonas e Burkholderia); Janet Hindler (Grupo de Trabalho para a M39 Analysis and Presentation of Cumulative Antimicrobial Susceptibility Test Data); David Hecht (Metodologia dos Testes de Sensibilidade Antimicrobiana para Bactrias Anaerbicas); Jana Swenson (Grupo de Trabalho de Reviso de Textos); Fred Tenover (Grupos de Trabalho para Organismos Exigentes e Estafilococos); e Matt Wikler (Grupo de Trabalho para Enterobactrias e M23Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria and Quality Control Parameters Desenvolvimento de Critrios e Parmetros de Controle de Qualidade para Testes de Sensibilidade In Vitro). Mary Jane Ferraro, Ph.D., M.P.H. Presidente, Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana.
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Resumo das Principais Mudanas neste Documento

Acrscimos ao documento Informao Acrescentada Informao sobre a determinao da potncia da droga e exemplos de equaes Seo 4.2.1.3 Texto relativo s classes de agentes antimicrobianos e subclasses de cefens Seo 4.2.5 Texto relativo sensibilidade a tetraciclina Seo 6.1.1 (5) Texto relativo ao pH final do gar Mueller-Hinton Seo 7.1 (4) Informaes sobre como suplementar o caldo Mueller-Hinton com sangue lisado de cavalo Seo 9.1.1 Relatrio sobre oxacilina para isolados de estafilococos portadores do gene mecA Seo 9.1.1, 4o marcador Texto relativo a relatrios sobre resistncia a MRS Seo 9.1.3 Texto relativo a cepas de S. aureus resistentes a vancomicina Seo 9.2.1 Texto relativo a um teste positivo de -lactamase Seo 12.2 Responsabilidades de CQ adicionais dos fabricantes Seo 12.3 Explicao sobre as cepas de H. influenzae ATCC 49247 e 49766 Seo 12.4 Manuteno dos organismos para as cepas de CQ E. coli ATCC 35218 e K. pneumoniae ATCC 700603 o Seo 12.4, 3 marcador Texto relativo a subculturas de cepas de CQ Seo 12.5 (5) Recomendao sobre o uso de Haemophilus influenzae ATCC 10211 Seo 12.7.2.1 Texto sobre a opo de 20 dias de testes de CQ visando testes semanais Seo 12.7.2.2 Texto esclarecendo a freqncia dos testes de CQ Seo 12.8 Nova seo sobre a freqncia dos testes de CQ para triagem Seo 12.9.2.2 Texto sobre a opo de 20 dias de testes de CQ visando ao corretiva adicional Seo 12.11 Nova seo sobre a verificao dos resultados dos testes clnicos Seo 13.3 Recomendao relativa repetio de testes associada com a emergncia de resistncia Mudanas no documento Localizao Mudanas na Informao Seo 9.1.1, 5o marcador Recomendao sobre conscientizao em relao aos estafilococos resistentes a meticilina Seo 9.1.2 Mtodo de inoculao em gar para as placas de triagem de oxacilina Seo 11 Mudana na redao das categorias interpretativas recomendadas Excluses do documento Localizao Seo 13.4 Informao Excluida Medida de garantia de qualidade Localizao Seo 3.2
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NCCLS
importante que os usurios das normas M2-A8 e M7-A6 reconheam que os dispositivos comerciais para testar a sensibilidade no so discutidos nessas normas/padres. Os mtodos descritos no presente documento so procedimentos de referncia genricos, que podem ser usados para testes de sensibilidade de rotina nos laboratrios de patologia clnica para avaliar os dispositivos comerciais quando se contempla o uso rotineiro dos mesmos. Os resultados gerados com os mtodos de referncia do NCCLS so utilizados pela United States Food and Drug Administration-FDA para avaliar o desempenho dos sistemas comerciais antes de serem liberados para venda nos Estados Unidos. A liberao pela FDA indica que a agncia concluiu que aquele dispositivo comercial fornece resultados de sensibilidade substancialmente equivalentes aos gerados usando os mtodos de referncia do NCCLS para os organismos e agentes antimicrobianos descritos na bula do fabricante, que acompanha o produto. Alguns laboratrios podero achar que uma diluio comercial, gradiente de antibitico, colormtrico, turbidimtrico, fluoromtrico, ou outro mtodo apropriado factvel para uso seletivo ou rotineiro.
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Misso do Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana do NCCLS Volume 23 e M7-A6 O Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana do NCCLS constitudo por representantes das profisses, do governo e da indstria, incluindo laboratrios de microbiologia, agncias governamentais, provedores de ateno sade e educadores, e a indstria farmacutica e de microbiologia de diagnstico. Usando o processo de consenso do NCCLS, o subcomit desenvolve normas/padres que promovem testes de sensibilidade antimicrobiana acurados e relatrios apropriados. A misso do Subcomit para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana do NCCLS : desenvolver mtodos de referncia padro para os testes de sensibilidade antimicrobiana; fornecer parmetros de controle de qualidade para os testes padro; estabelecer critrios interpretativos para os resultados dos testes de sensibilidade antimicrobiana realizados usando testes padro; sugerir estratgias para os testes e relatrio que sejam clinicamente relevantes e custo-eficazes; refinar, em base permanente, as normas/padres e otimizar a deteco de mecanismos de resistncia emergente mediante o desenvolvimento de mtodos novos ou revisados, critrios de interpretao e parmetros de controle de qualidade; educar os usurios, atravs da comunicao multimdia, acerca das normas/padres e diretrizes; e promover o dilogo com os usurios desses mtodos e aqueles que os aplicam.
O propsito ltimo da misso do subcomit fornecer informaes teis que permitam que os laboratrios ajudem o clnico na seleo da terapia antimicrobiana apropriada para a conduta clnica. As normas/padres e diretrizes devem ser abrangentes e incluir todos os agentes antimicrobianos cujos dados atendem s diretrizes estabelecidas pelo NCCLS. Os valores que norteiam essa misso so qualidade, preciso, eqidade, oportunidade, trabalho de equipe, consenso e confiana. Precaues Padro Sendo impossvel, com freqncia, saber o que infeccioso, todos os espcimes de sangue humano devem ser tratados como infecciosos e manuseados de acordo com precaues padro. Essas so novas diretrizes que combinam as caractersticas principais das prticas de isolamento de substncias corpreas e precaues padro. As precaues padro cobrem a transmisso de qualquer patgeno e, por isso, so mais abrangentes do que as precaues universais, que visam apenas aos patgenos transmitidos pelo sangue. As diretrizes relativas s precaues padro e precaues universais so disponibilizadas pelo U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Guideline for Isolation Precautions in Hospitals. Infection Control and Hospital Epidemiology. CDC. 1996;Vol 17; 1:53-80), (MMWR 1987; 36[suppl 2S] 2S-18S) e (MMWR 1988; 37:377-382, 387-388). No caso de precaues especficas para a preveno da transmisso laboratorial de infeces transmitidas pelo sangue por instrumentos e materiais de laboratrio, assim como as recomendaes relativas conduta de exposies a sangue, favor reportar-se edio mais recente do documento M29Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections do NCCLS.
Palavras Chave
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NCCLS M7-A6
Diluio em gar, sensibilidade antimicrobiana, diluio em caldo, macrodiluio, microdiluio, concentrao inibitria mnima (CIM).
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Enfoque de Sistema de Qualidade

O NCCLS endossa o enfoque de sistema de qualidade para o desenvolvimento de normas/padres e diretrizes, visto que facilita a gesto de projetos; define a estrutura dos documentos por meio de um gabarito; e fornece um processo para identificar os documentos necessrios usando a anlise de lacunas (gap analysis). O enfoque baseia-se no modelo apresentado na edio mais recente do documento HS1 A Quality System Model for Health Care do NCCLS. O enfoque de sistema de qualidade aplica-se a um conjunto central de elementos essenciais dos sistemas de qualidade (EEQs), bsicos a qualquer organizao, a todas as operaes em qualquer rota de fluxograma, de qualquer organizao prestadora de servios de ateno sade. Os EEQs fornecem um arcabouo para a proviso de qualquer tipo de produto ou servio, servindo como guia dos gerentes. Os elementos essenciais dos sistemas de qualidade (EEQs) so os seguintes.
Elementos Essenciais dos Sistemas de Qualidade--EEQs Documentos e Registros Organizao Pessoal Equipamento Compras e Inventrio Controle de Processos Gesto da Informao Gesto de Ocorrncias Avaliao Melhoria de Processos Servios e Satisfao Instalaes e Segurana
A Norma M7-A6 trata dos seguintes elementos essncia(i)s dos sistemas de qualidade (EEQs):
Controle de Processos Gesto da Informao Compras e Inventrio
Servios e Satisfao
Aprimoramento de Processos
Documentos e Registros
Equipamento
Tabela adaptada do documento HS1 A Quality System Model for Health Care do NCCLS. Etapa do Fluxograma Uma etapa do fluxograma a descrio dos passos necessrios para prover um determinado produto ou servio fornecido pela organizao ou entidade. Por exemplo, a Norma GP26-A2 define uma etapa do fluxograma dos laboratrios clnicos que consiste em trs passos seqenciais: pr-analtico, analtico e ps-analtico. Todos os laboratrios clnicos seguem esses trs processos para prestar servios laboratoriais, a saber, informaes laboratoriais de qualidade. A seta mostra a seqncia, da esquerda para a direita, que todo laboratrio clnico segue. Alm disso, os passos ou subprocessos necessrios encontram-se relacionados logo abaixo do fluxograma.
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Instalaes e Segurana
Organizao
Gesto de Ocorrncias
Avaliao
Pessoal
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NCCLS
Laboratrio de Patologia Clnica

Pr-analticas Avaliao do paciente Solicitao do teste Coleta do espcime Transporte do espcime Recebimento do espcime Analtica Reviso do teste Interpretao Ps-analtica Relatrio de resultados Gerenciamento ps-teste
Adaptado do documento HS1 _ A Quality System Model for Health Care do NCCLS.
(na fase analtica: Interpretao laboratorial. E na ps: Gerenciamento do espcime aps teste)
A maioria dos documentos do NCCLS est relacionada com os laboratrios de patologia clnica, de maneira que a etapa mais comum do fluxograma pode ser representada conforme visto anteriormente. As rotas do fluxograma relativas a outras atividades de ateno sade, ex., servios respiratrios, servios de imagens, etc., ou a outros tipos de organizaes, (ex), fabricantes de dispositivos mdicos, iro diferir das dos laboratrios de patologia clnica sero diferentes das dos laboratrios de patologia clnica. Toda rota de fluxograma descreve a seqncia das atividades necessrias produo dos produtos ou servios de uma organizao ou entidade especfica. Para aqueles documentos relacionados com outras rotas de fluxograma, o cone refletir passos diferentes do processo. M7-A6 focaliza os Seguintes Passos na Etapa do Fluxograma dos Laboratrios de Patologia Clnica
Pr-analticos Avaliao do Paciente Solicitao do Teste Coleta do Espcime Transporte do Recebimento do Espcime Espcime Analticos Reviso do Teste X Interpretao Laboratorial X Ps-analticos Relatrio de Resultados X Gesto do Espcime Ps-teste
Adaptado do documento HS1 A Quality System Model for Health Care do NCCLS.
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Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio para Bactrias de Crescimento Aerbico; Norma AprovadaSexta Edio
1 Introduo
Os mtodos de diluio em caldo ou gar so igualmente aceitveis para medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano. Para realizar o teste, preparam-se vrios tubos de ensaio ou placas com meio caldo ou gar, aos quais so acrescentadas diversas concentraes dos agentes antimicrobianos. A seguir, os tubos ou as placas so inoculados com uma suspenso padro do organismo a ser testado. Aps incubao de um dia para outro, a 35 C, examinam-se os testes e determina-se a concentrao inibitria mnima (CIM). O resultado final influenciado, de maneira significativa, pela metodologia, que deve ser cuidadosamente controlada para se obter resultados reprodutveis (intra e interlaboratrio). O presente documento descreve a metodologia padro de referncia dos testes de diluio em caldo (macrodiluio and microdiluio) e diluio em gar. A metodologia bsica desses testes deriva-se, em grande parte, das informaes obtidas no Estudo Colaborativo Internacional.1 Embora sejam testes padres de referncia, alguns so suficientemente prticos para merecer uso rotineiro, tanto nos laboratrios clnicos, como nos laboratrios de pesquisa. Encontram-se disponveis no mercado sistemas comerciais baseados principalmente, ou em parte, em alguns desses mtodos, sendo que tais sistemas comerciais podem fornecer resultados essencialmente equivalentes aos testes dos testes do NCCLS descritos neste documento. O United States Food and Drug Administration (U.S. FDA) responsvel pela aprovao e liberao de dispositivos comerciais para uso nos Estados Unidos. O NCCLS no aprova ou endossa produtos ou dispositivos comerciais. Os testes descritos neste documento focalizam bactrias aerbicas ou facultativas comumente isoladas que crescem satisfatoriamente aps incubao de um dia para outro em meio Mueller-Hinton sem suplementao. Meios e mtodos alternativos para alguns organismos fastidiosos encontram-se descritos na Seo 8 e nas Tabelas 2E a 2J e na Tabela 7. A norma M11Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria do NCCLS descreve testes para bactrias anaerbicas.
1.1
Escopo
H uma diversidade de mtodos de laboratrio que podem ser usados para medir a sensibilidade in vitro das bactrias aos agentes antimicrobianos. A presente Norma descreve as tcnicas padro de diluio (macrodiluio and microdiluio) em caldo e em gar a serem utilizadas para determinar a sensibilidade in vitro das bactrias de crescimento aerbico. A Norma tambm discute a preparao dos testes de diluio em caldo e em gar, as condies dos testes (incluindo a preparao e o tamanho do inculo e o tempo e a temperatura de incubao), os relatrios dos resultados dos testes de CIM, os procedimentos de controle de qualidade e as limitaes da metodologia dos testes de diluio. Para auxiliar os laboratrios clnicos, so fornecidas diretrizes para a seleo de agentes antimicrobianos para testes e relatrios de rotina. As normas M2, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests e M11, Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria do NCCLS fornecem as normas para os testes de sensibilidade in vitro de bactrias de crescimento aerbico e anaerbico, respetivamente.
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NCCLS
1.2
Definies a
Categoria de Interpretao do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana, n - 1) Uma classificao baseada numa resposta in vitro de um organismo a um agente antimicrobiano em nveis desse agente que correspondem aos nveis sangneos ou tissulares atingveis com as doses do agente normalmente prescritas; 2) Categoria de Interpretao Sensvel do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana, n Categoria que implica que uma infeco devida a um isolado pode ser tratada apropriadamente com a dosagem de um agente antimicrobiano recomendado para esse tipo de infeco e espcie infecciosa, salvo quando de outra maneira indicado; 3) Categoria de Interpretao Intermediria do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana, n Categoria que implica que uma infeco devida a um isolado pode ser tratada apropriadamente em stios corpreos em que as drogas se encontram fisiologicamente concentradas ou quando uma dosagem mais alta da droga for possvel; tambm indica uma zona tampo(buffer zone) que deveria impedir que fatores tcnicos menores e fora de controle causem grandes discrepncias na interpretao; 4) Categoria de Interpretao Resistente do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana, n Os isolados resistentes no so inibidos pelas concentraes do agente antimicrobiano obtidas normalmente com os tratamentos usuais (freqncia e dosagem) e/ou caem na faixa em que os mecanismos de resistncia antimicrobiana especfica so mais provveis (ex., betalactamases), sendo que a eficcia clnica no foi confivel em estudos teraputicos. Concentrao Inibitria Mnima CIM, n A menor concentrao de um agente antimicrobiano que impede o crescimento visvel de um microorganismo em testes de sensibilidade por diluio em gar ou caldo. Controle de Qualidade, n Tcnicas e atividade operacionais usadas para atender aos requisitos de qualidade.
Indicaes para a Execuo de Testes de Sensibilidade
Os testes de sensibilidade so indicados para qualquer organismo que contribua a um processo infeccioso que justifique quimioterapia antimicrobiana, se sua sensibilidade no pode ser predita, de maneira confivel, a partir da identificao do organismo. Os testes de sensibilidade so iniciados, com mais freqncia, quando se acredita que o organismo causativo pertence a uma espcie capaz de apresentar resistncia aos agentes antimicrobianos mais freqentemente usados. Os mecanismos de resistncia incluem a produo de enzimas que inativam as drogas, a alterao do stio-alvo das drogas e a alterao da absoro ou do efluxo das drogas. Alguns organismos ainda possuem sensibilidade previsvel a agentes antimicrobianos, e a terapia emprica amplamente reconhecida. Os testes de sensibilidade so raramente necessrios quando a infeco se deve a um microorganismo reconhecidamente sensvel a uma droga muito eficaz (ex., a sensibilidade continuada de Streptococcus pyogenes penicilina nos Estados Unidos). Com S. pyogenes proveniente de pacientes alrgicos penicilina, pode-se testar a eritromicina ou outros macroldeos, de maneira a detectar as cepas resistentes a esses agentes. Os testes de sensibilidade tambm so importantes nos estudos da epidemiologia da resistncia e de novos agentes antimicrobianos. Deve-se selecionar colnias, isoladas em placas de gar, de cada tipo de organismo que possa desempenhar um papel patognico e testar sua sensibilidade. Com freqncia, o microorganismo identificado nesse momento. Misturas de diferentes tipos de microorganismos no devem ser testadas na mesma placa do teste de sensibilidade. A prtica de realizar testes de sensibilidade diretamente com material clnico (ex., urina e fluidos corpreos normalmente estreis) deve ser evitada, exceto em emergncias clnicas, quando a colorao direta do gram sugere um nico patgeno. Se o teste for efetuado diretamente com o material clnico, os resultados devem ser reportados como preliminares, repetindo-se o teste de sensibilidade usando
a
Algumas destas definies so encontradas na NRSCL8Terminology and Definitions for Use in NCCLS Documents do NCCLS. Para definies completas e informaes detalhadas sobre as fontes, favor reportar-se edio mais atualizada dessa Norma.
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a metodologia padronizada. Quando a natureza da infeco no est clara e o espcime contm crescimento misto ou flora normal, em que os organismos provavelmente tm pouca relao com o processo infeccioso que est sendo tratado, os testes de sensibilidade so freqentemente desnecessrios e os resultados podem ser enganadores. A CIM obtida usando o teste de diluio pode mostrar ao mdico qual a concentrao do agente antimicrobiano necessria no stio da infeco para inibir o organismo infectante. A CIM, entretanto, no representa um valor absoluto. A verdadeira CIM est num ponto entre a menor concentrao do teste que inibe o crescimento do organismo (ou seja, a leitura da CIM) e a prxima menor concentrao do teste. Por exemplo, se forem usadas diluies 2X e for determinado que a CIM 16g/mL, a verdadeira CIM estar entre 16 e 8g/mL. Mesmo nas melhores condies controladas, o teste de diluio poder no fornecer o mesmo ponto final toda vez que o teste realizado. Em geral, a reprodutibilidade aceitvel do teste fica dentro de uma diluio 2X do verdadeiro ponto final. Para evitar maior variabilidade, o teste de diluio deve ser normatizado e controlado cuidadosamente, conforme descrito nesta Norma. As CIMs tm sido determinadas usando concentraes derivadas, tradicionalmente, de diluies 2X em srie indexadas base 1 (ex., 1, 2, 4, 8, 16g/mL, etc.). Utilizam-se tambm outros esquemas de diluio, incluindo o uso de apenas duas concentraes bem separadas, ou de ponto de corte, ou concentraes entre os valores usuais (ex., 4, 6, 8, 12, 16g/mL). Os resultados desses mtodos alternativos podem ser igualmente teis do ponto de vista clnico; embora alguns sejam mais difceis de controlar (ver a Seo 12.3). Quando h inibio do crescimento na menor concentrao testada, o verdadeiro valor da CIM no pode ser determinado com preciso e deve ser relatado como igual a ou menor que a menor concentrao testada. Para aplicar os critrios de interpretao quando se testam as concentraes entre as diluies usuais, os resultados entre as diluies 2X em srie devem ser arredondados para a concentrao imediatamente superior (ex., uma CIM de 6g/mL se transformaria em 8g/mL). Sempre que os resultados da CIM forem relatados aos clnicos com a finalidade de orientar a terapia, o resultado da CIM deve ser acompanhado por uma categoria de interpretao (ex., sensvel, intermediria, ou resistente) baseada nos critrios apresentados nas Tabelas 2A a 2K e na Tabela 7. Nos testes de quatro ou menos concentraes consecutivas, ou quando so testadas concentraes no consecutivas, o relatrio dever incluir a categoria de interpretao do resultado. A faixa da CIM tambm pode ser includa no relatrio, se desejado.
3
3.1
Agentes Antimicrobianos
Fonte
Os ps antimicrobianos padro ou de referncia podem ser obtidos diretamente dos laboratrios farmacuticos, da empresa United States Pharmacopoeia (12601 Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, 800-227-8772), ou de algumas outras fontes comerciais. As preparaes parenterais padro no devem ser usadas para os testes de sensibilidade. Os ps aceitveis apresentam o nome genrico da droga no rtulo, bem como sua potncia (expressada, em geral, em microgramas [g] ou Unidades Internacionais [UI] por mg de p) e a data de vencimento. Os ps devem ser armazenados seguindo as instrues do fabricante, ou a -20 C, num dessecador (de preferncia, no vcuo). Quando o dessecador retirado da geladeira ou do congelador, deve permanecer a temperatura ambiente antes de ser aberto (para evitar a condensao de gua).
3.2
Pesagem de Ps Antimicrobianos
Todos os agentes antifngicos devem ser submetidos a um ensaio para determinar suas unidades padro de atividade. As unidades do ensaio podem diferir amplamente do peso real do p e, com freqncia,
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diferem dentro de cada lote de produo da droga. Por isso, o laboratrio deve normatizar suas solues antifngicas com base nos ensaios dos lotes de ps antifngicos que esto sendo usados. O valor de potncia fornecido pelo fabricante dever incluir considerao das medidas de pureza (em geral, por ensaio HPLC), teor de gua (e.g., por anlise de Karl Fischer ou por perda de peso na secagem) e a frao sal/contra-on (quando o produto fornecido em forma de sal ao invs de base ou cido livre). A potncia poder ser expressada como percentual, ou em unidades de g/mg (w/w). Em alguns casos, o fabricante anexa, ao p antibitico, um certificado de anlise, com os valores de cada componente; nesse caso, no ser fornecido, em geral, o valor geral da potencial, que poder ser calculado a partir da pureza de HPLC, do teor de gua e, quando aplicvel, da frao ativa das drogas fornecidas na forma de sal (ex., hidrocloreto, mesilato). Entretanto, se ao aplicar esses clculos, algum valor for desconhecido ou no claramente determinado com base no certificado de anlise, recomenda-se que os fatores usados no clculo sejam confirmados com o fornecedor ou fabricante. A seguir, apresenta-se um exemplo de clculo: Exemplo: meropenem tri-hidrato Dados do certificado de anlise: Pureza de ensaio (por HPLC): 99,8% Teor de gua medido (por anlise de Karl Fischer): 12,1% (w/w) Frao ativa: 100% (fornecida na forma de cido livre, e no sal) Clculo da potncia a partir dos dados anteriores: Potncia = (Pureza de ensaio) x (Frao ativa) x (1- Teor de gua) Potncia = (0,998) x (1.0) x (1- 0,121) Potncia = 0,877g/mg ou 87,7% Ambas as equaes a seguir podem ser usadas para determinar a quantidade de p ou diluente necessria para a soluo padro: Peso (mg) = Volume (mL) x Concentrao (g/mL) Potncia (g/mg) ou Volume (mL) = Peso (mg) x Potncia (g/mg) Concentrao (g/mL) (1)
(2)
O p antifngico deve ser pesado numa balana analtica calibrada com pesos do National Institute of Standards and Technology (KIST [Gaithersburg, MD]) (ou outros pesos de referncia aprovados). Se possvel, recomenda-se pesar com preciso uma quantidade de agente antifngico em excesso do necessrio e calcular o volume de diluente necessrio para obter a concentrao desejada, como na equao (2), anterior. Exemplo: Para preparar 100mL de uma soluo padro contendo 1.280g/mL de agente antimicrobiano com um p antimicrobiano cuja potncia de 750g/mg, deve-se pesar, com preciso, de 170 a 200mg do p antimicrobiano. Se o peso real for 182,6mg, o volume necessrio de diluente ser o seguinte: 182,6 mg 750g/mg Volume (mL) = (Peso Real) (Potncia) = 107,0mL 1.280 g/mL (Concentrao Desejada)
(3)
Volume 23 Assim, os 182,6mg de p antimicrobiano sero dissolvidos em 107,0mL de diluente.
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3.3
Preparao de Solues Padro
As solues padro de agente antimicrobiano so preparadas em concentraes de, pelo menos, 1.000g/mL (exemplo: 1.280g/mL) ou dez vezes a concentrao mais alta a ser testada, das duas a maior. Existem alguns agentes antimicrobianos de solubilidade limitada, porm, que podem precisar de concentraes mais baixas. Em todos os casos, as informaes fornecidas pelo fabricante da droga devem ser consideradas na determinao da solubilidade. Algumas drogas devem ser dissolvidas em solventes que no gua. Nesses casos: deve-se usar uma quantidade mnima de solvente para solubilizar o p antimicrobiano;
pode-se fazer a concentrao final da soluo padro com gua ou o diluente apropriado, conforme indicado na Tabela 4; e no caso de solventes potencialmente txicos, deve-se consultar as folhas de dados de segurana do material (MSDS) disponibilizadas pelo fabricante (ver a Tabela 4). Uma vez que a contaminao microbial extremamente rara, as solues no esterilizadas so, em geral, aceitveis. Se desejado, porm, pode-se esterilizar as solues por meio de membrana-filtro. Os filtros de papel, amianto, ou vidro sinterizado, que podem absorver quantidades apreciveis de certos agentes antimicrobianos, no devem ser usados. Sempre que se usar filtragem, importante documentar a ausncia de absoro por meio dos resultados de ensaios apropriados. Pequenos volumes de solues padro estreis podem ser colocados em frascos estreis de vidro, polipropileno, ou polietileno, selados cuidadosamente e armazenados (de preferncia a temperatura de 60 C ou menos, mas nunca a temperaturas superiores a -20 C). Os frascos so retirados conforme necessrio e usados no mesmo dia. Qualquer droga no usada deve ser descartada no fim do dia. As solues padro da maioria dos agentes antimicrobianos podem ser armazenadas a -60 C, ou menos, durante seis meses, ou mais, sem perda significativa de atividade. Em todo caso, qualquer orientao fornecida pelo fabricante da droga deve ser considerada como parte destas recomendaes gerais. Qualquer deteriorao significativa do agente antifngico poder se refletir nos resultados dos testes de sensibilidade usando cepas de controle de qualidade.
3.4
Nmero de Concentraes Testadas
As concentraes testadas para um determinado agente antimicrobiano devem abranger os pontos de corte de interpretao nas Tabelas 2A a 2K, mas os laboratrios devem decidir qual ser o nmero de concentraes a ser testado. Entretanto, recomenda-se escolher uma faixa que permita que, pelo menos, um organismo de controle de qualidade tenha valores dentro da escala. Concentraes singulares podem ser testadas para finalidades especiais (ex., altas concentraes de gentamicina e estreptomicina podem ser testadas para determinar se h um efeito sinrgico com um antibitico de penicilina ou glicopeptdeo contra enterococos.).
Seleo dos Agentes Antimicrobianos para Testes e Relatrios de Rotina
Em cada instituio, a seleo dos agentes antimicrobianos mais apropriados para testes e relatrios de rotina cabe aos laboratrios de patologia clnica, em consulta com os especialistas em doenas infecciosas e o farmacutico, assim como os comits de teraputica e de controle de infeces do corpo mdico. As
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recomendaes nas Tabelas 1 e 1A para cada grupo de organismos abrangem agentes de eficcia comprovada que apresentam desempenho aceitvel em testes in vitro. Na designao de agentes para grupos especficos de testes/relatrios, deve-se considerar a prevalncia de resistncia, a minimizao do surgimento de resistncia, o custo, as indicaes do FDA e as recomendaes consensuais em vigor para drogas de primeira escolha e alternativas, alm das questes especficas descritas. Os testes de seleo de agentes podem ser teis para fins de controle de infeces.
4.1
Relatrios de Rotina
As listas de agentes nas Tabelas 1 e 1A constituem recomendaes para testes e relatrios de rotina consideradas apropriadas no presente momento. Para evitar interpretaes equivocadas, os relatrios rotineiros aos mdicos devem incluir apenas as drogas apropriadas para uso teraputico, conforme sugerido nas Tabelas 1 e 1A. Deve-se acrescentar ou retirar agentes antimicrobianos conforme a situao exigir. Pode-se testar outras drogas, alm das consideradas apropriadas para uso teraputico, para obter dados taxonmicos e informaes epidemiolgicas, mas essas drogas no devem ser includas nos relatrios de patologia clnica. Entretanto, esses resultados devem ser disponibilizados no laboratrio para uso dos especialistas em controle de infeces e/ou o epidemiologista hospitalar.
4.2
Nomes Genricos
Para minimizar confuses, deve-se usar os nomes no-proprietrios oficiais (ex., genrico) de todos os agentes antimicrobianos. Para enfatizar a correlao de muitas das drogas atualmente disponveis, elas podem ser agrupadas por classe de droga, conforme indicado a seguir. 4.2.1 -Lactmicos
Todos os agentes antimicrobianos -lactmicos compartilham um anel central -lactmico de quatro membros comum, sendo seu principal modo de ao a inibio da sntese da parede celular. Estruturas adicionais em anel ou grupos substitutivos acrescentados ao anel -lactmico determinam se o agente , ou no, penicilina, cefem, carbapenem, ou monobactam. 4.2.1.1 Penicilinas O espectro de atividade da penicilina inclui, principalmente, bactrias gram-negativas gram-positivas e algumas fastidiosas que no produzem -lactamase. As aminopenicilinas (ampicilina e amoxicilina) so ativas contra espcies gram-negativas adicionais, incluindo alguns membros das Enterobacteriaceae. As carboxipenicilinas (carbenicilina e ticarcilina) e ureidopenicilinas (mezlocilina e piperacilina) possuem um espectro gram-negativo consideravelmente maior, incluindo atividade contra numerosos Pseudomonas e Burkholderia spp. As penicilinas penicilinase-resistentes (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina e oxacilina) tm um espectro predominantemente gram-positivo, que inclui os estafilococos produtores de penicilinase. 4.2.1.2 Combinaes -Lactmico/Inibidor da -Lactamase Essas combinaes de antimicrobianos incluem a penicilina e um segundo agente que tem atividade antibacteriana mnima, mas funciona como inibidor de algumas -lactamases. Atualmente, trs inibidores da -lactamase so utilizados: o cido clavulnico, sulbactam e tazobactam. Os resultados de testes de apenas a parte penicilina da combinao contra organismos produtores de -lactamase com freqncia no prediz a sensibilidade combinao das duas drogas.
Volume 23 4.2.1.3 Cefens (incluindo Cefalosporinas)
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Os diferentes agentes antimicrobianos cefens podem ter um espectro de atividade ligeiramente diferente contra as bactrias gram-positivas e gram-negativas. Essa classe de antimicrobianos, os cefens, inclui as clssicas cefalosporinas, assim como os agentes nas subclasses cefamicina, oxacefem e carbacefem (ver o Glossrio I). As diversas cefalosporinas so, com freqncia, denominadas cefalosporinas de primeira, segunda, terceira ou quarta gerao, com base no seu grau de atividade contra as bactrias gramnegativas resistentes a antibiticos. Nem todos os representantes de um grupo ou gerao especfico possuem necessariamente o mesmo espectro de atividade. Devido a essas diferenas em atividade, os representantes de cada grupo podem ser selecionados para testes de rotina. 4.2.1.4 Carbapenems A estrutura dos carbapenems difere ligeiramente da das penicilinas, sendo que os primeiros so muito mais resistente hidrlise por -lactamase, o que lhes d um amplo espectro de atividade contra muitas bactrias gram-positivas e gram-negativas. 4.2.1.5 Monobactams Os agentes antimicrobianos monobactans so -lactmicos monocclicos. Atualmente, o aztreonam, que possui atividade contra as bactrias aerbicas gram-negativas, o nico monobactam aprovado pelo FDA para uso nos Estados Unidos. 4.2.2 Glicopeptdeos Os antimicrobianos glicopeptdeos tm em comum uma estrutura qumica complexa, sendo seu principal modo de ao a inibio da sntese da parede celular num stio diferente do dos -lactmicos. A atividade deste grupo de agentes antimicrobianos dirigida s bactrias gram-positivas. A vancomicina um agente antimicrobiano aceito para tratamento de infeces bacterianas gram-positivas em pacientes alrgicos a penicilina, sendo til em infeces por cepas bacterianas gram-positivas resistentes aos -lactmicos, ao Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA) e a alguns enterococos. 4.2.3 Aminoglicosdeos Os membros desse grupo de agentes antimicrobianos estruturalmente afins inibem a sntese protica das bactrias em nvel de ribossoma. Essa classe inclui membros afetados em diferentes graus pelas enzimas que inativam os aminoglicosdeos, o que provoca algumas diferenas de espectro entre os agentes. Os aminoglicosdeos so usados, principalmente, para tratar infeces por bastes gram-negativos aerbios ou em combinaes sinrgicas com agentes antimicrobianos ativos na parede celular (ex., penicilina, ampicilina e vancomicina) contra algumas bactrias gram-positivas resistentes, como os enterococos. 4.2.4 Macroldeos Os macroldeos so agentes antimicrobianos estruturalmente afins que inibem a sntese protica em nvel ribossmico. Existem vrios membros desta classe em uso atualmente que poderia ser necessrio considerar para testes contra isolados de bactrias gram-negativas, gram-positivas ou fastidiosas. As drogas neste grupo esto estreitamente relacionadas e, com poucas excees, s necessrio testar rotineiramente com eritromicina. 4.2.5 Tetraciclinas As tetraciclinas inibem a sntese protica, em nvel ribossmico, de certas bactrias gram-positivas e gram-negativas. As drogas neste grupo esto estreitamente relacionadas e, com poucas excees, s
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necessrio testar a tetraciclina de forma rotineira. Os organismos sensiveis tetraciclina tambm so considerados sensiveis a doxiciclina e minociclina. Entretanto, alguns organismos de sensibilidade intermediria ou resistentes tetraciclina podem ser sensiveis a doxiciclina ou minociclina, ou a ambas. 4.2.6 Quinolonas Esse grupo de produtos (quinolonas e fluoroquinolonas) inclui um nmero de agentes estreitamente relacionados cujo principal modo de ao a inibio da atividade da DNA-girase de muitas bactrias gram-positivas e gram-negativas. Uma vez que existem algumas diferenas no espectro de atividade, pode ser necessrio testar individualmente os agentes. 4.2.7 Inibidores da Via Metablica do Folato Esse grupo de produtos abrange vrios agentes quimioterpicos com espectros de atividade similares resultantes da inibio da via metablica bacteriana dos folatos. O sulfisoxazole est entre as sulfonamidas mais freqentemente empregadas nas infeces do trato urinrio; portanto, pode ser o agente apropriado para os testes in vitro. Em geral, o sulfametoxazol testado em combinao com a trimetoprim, em que ocorre uma inibio seqencial de dois passos na via metablica dos folatos em algumas bactrias gram-positivas e gram-negativas. 4.2.8 Classes de Drogas nicas Para os seguintes agentes antimicrobianos no existem outros produtos relacionados apropriados para testes in vitro. Incluem cloranfenicol, clindamicina, linezolida e quinupristin-dalfopristin, que inibem a sntese protica, assim como rifampina, que inibe a sntese de RNA. A nitrofurantona, usada apenas no tratamento de infeces do trato urinrio, age inibindo a sntese de vrias protenas e em nvel ribossmico. A fosfomicina, tambm aprovada pelo FDA para infeces no trato urinrio, inibe as enzimas envolvidas na sntese da parede celular.
4.3
Diretrizes de Seleo
Para que os testes rotineiros de sensibilidade sejam relevantes e prticos, o nmero de agentes testados precisa ser limitado. As Tabelas 1 e 1A neste documento relacionam aquelas drogas que preenchem os requisitos bsicos de uso rotineiro na maioria dos laboratrios de patologia clnica. As tabelas esto divididas em colunas baseadas em organismos especficos ou grupos de organismos, indicando-se, a seguir, as diferentes drogas em ordem de prioridade de teste, de maneira a auxiliar os laboratrios na seleo das baterias de testes de rotina. As caixas na tabelas designam grupos de agentes comparveis que, em geral, no precisam ser duplicados nos testes, porque seus resultados interpretativos so geralmente similares e sua eficcia clnica, semelhante. Alm disso, a palavra ou designa um grupo conexo de agentes que apresentam espectro de atividade e resultados interpretativos quase idnticos e para os quais existe quase total resistncia e sensibilidade cruzadas. Portanto, s necessrio selecionar um dos agentes antimicrobianos em cada caixa de seleo (agrupamento ou grupo conexo) para os testes. Com poucas excees, o agente relatado dever ser testado, exceto quando relatar com base em testes de outro agente fornece um resultado mais preciso (ex., sensibilidade de estafilococos aos cefens com base em testes de oxacilina). Os agentes testados devem ser os mesmos includos no formulrio do hospital ou, ento, os relatrios devem incluir notas de rodap indicando quais outros agentes no testados podero ter atividade anloga.
4.4
Sugesto de Diretrizes para Testes e Relatrios de Rotina
Conforme relacionado nas tabelas 1 e 1A, os agentes no Grupo A so considerados apropriados para incluso num painel de testes primrios de rotina, assim como os relatrios rotineiros dos resultados de grupos especficos de organismos. 8
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O Grupo B inclui agentes clinicamente importantes (particularmente para as infeces nosocomiais) que podem justificar testes primrios. Entretanto, os relatrios podem ser seletivos, como quando o organismo resistente a agentes antimicrobianos da mesma classe, como no Grupo A. Outras indicaes para relatar resultados podem incluir fontes selecionadas de espcimes [ex., uma cefalosporina de terceira gerao contra bacilos entricos provenientes de fluido cerebroespinhal (LCR) ou sulfametoxazol-trimetoprim contra isolados do trato urinrio); infeces polimicrobianas; infeces que afetam mltiplos stios corpreos; mediante solicitao, em casos de alergia, intolerncia, ou falta de resposta a um agente no Grupo A; ou para fornecer informaes ao pessoal de controle de infeces, como ferramenta epidemiolgica. O Grupo C inclui agentes antimicrobianos alternativos ou complementares que devem ser testados em instituies afetadas por cepas endmicas ou epidmicas resistentes a vrias drogas primrias (especialmente na mesma classe, ex., -lactmicos ou aminoglicosdeos); para tratamento de pacientes alrgicos a drogas primrias; para tratamento de organismos incomuns (ex., cloranfenicol para isolados extra-intestinais de Salmonella spp. ou enterococos resistentes a vancomicina); ou para fornecer informaes ao pessoal de controle de infeces, como ferramenta epidemiolgica. O Grupo U relaciona certos agentes antimicrobianos (ex., nitrofurantopina e certas quinolonas) usadas, principalmente, no tratamento de infeces do trato urinrio; no necessrio emitir relatrios rotineiros sobre a ao desses agentes contra patgenos recuperados em outros stios de infeco. Outros agentes com indicaes mais amplas podem ser includos no Grupo U contra patgenos especficos do trato urinrio (ex., P. aeruginosa). O Grupo O (outros) inclui agentes que possuem indicao clnica para o grupo de organismos, mas que, em geral, no so candidatos para testes e relatrios de rotina nos Estados Unidos. O Grupo Inv. (investigao) inclui agentes que esto sendo pesquisados para o grupo de organismos, mas ainda no foram aprovados pelo FDA. Cada laboratrio deve decidir quais dos agentes relacionados nas Tabelas 1 e 1A devem ser objeto de relatrio rotineiro (Grupo A) e para quais se deve preparar relatrios seletivos (no Grupo B), em consulta com os especialistas em doenas infecciosas e o farmacutico, assim como os comits de farmcia, teraputica e controle de infeces do corpo mdico do hospital. Os relatrios seletivos podem ajudar a melhorar a relevncia clnica dos relatrios de resultados e a minimizar a seleo de cepas nosocomiais multirresistentes resultantes do uso excessivo de agentes antimicrobianos de amplo espectro. No caso dos agentes do Grupo B, os resultados que no forem liberados rotineiramente devero ser disponibilizados mediante solicitao, ou podero ser liberados para espcimes selecionados. Resistncia inesperada, quando confirmada, deve ser relatada, e.g., resistncia a um agente secundrio, mas sensibilidade a um agente primrio.
5
5.1
Preparao do Inculo para Testes de Diluio

Padro de Turbidez para a Preparao do Inculo
Para padronizar a densidade do inculo para um teste de sensibilidade, deve-se usar um controle de turbidez de BaSO4, equivalente a uma soluo padro McFarland de 0,5 ou seu equivalente ptico (ex., suspenso de partculas de ltex). A soluo padro McFarland de 0,5 de BaSO4 pode ser preparada da seguinte maneira. (1) Acrescenta-se uma alquota de 0,5mL de BaCl2 de 0.048 mol/L (1,175% (p)/v BaCl2 2H2O) a 99,5mL de H2SO4 de 0,18 mol/L (1% v/v), mexendo constantemente para manter a suspenso.
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(2) A densidade correta do controle de turbidez deve ser verificada usando um espectrofotmetro com fonte de luz de 1cm e cubetas apropriadas para determinar a absorbncia. A absorbncia em 625nm dever variar de 0,08 a 0,10 para a soluo padro McFarland de 0,5. (3) A suspenso de sulfato de brio deve ser transferida, em alquotas de 4 a 6mL, para tubos com tampas de rosca do mesmo tamanho usado para cultivar e diluir o inculo bacteriano. (4) Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, a temperatura ambiente. (5) O controle de turbidez de sulfato de brio deve ser agitado vigorosamente num misturador mecnico tipo vrtex antes de cada uso, verificando-se se est uniformemente trbido. No caso de partculas maiores, o controle deve ser substitudo. As suspenses de partculas de ltex devem ser misturadas invertendo-as suavemente, e no num misturado tipo vrtex. (6) Os controles de sulfato de brio devem ser substitudos, ou suas densidades verificadas, todo ms.
5.2
Mtodo de Crescimento
(1) Seleciona-se, pelo menos, de trs a cinco colnias, bem isoladas, do mesmo tipo morfolgico de cultura em placa de gar. Toca-se o topo de cada colnia com uma ala, transferindo-se os microorganismos para um tubo contendo 4-5mL de um meio de cultura adequado, como caldo de soja trptica. (2) Incuba-se a cultura em caldo, a 35 C, at alcanar ou exceder a turbidez de uma soluo padro McFarland de 0,5 (em geral, de duas a seis horas). (3) Ajusta-se a turbidez da cultura em caldo em crescimento ativo com soluo salina estril ou caldo, de modo a obter uma turbidez ptica comparvel da soluo padro McFarland de 0,5. Isso resulta numa suspenso contendo aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/mL de E. coli ATCC 25922. Para realizar essa operao corretamente, emprega-se um espectrmetro ou, quando executado a olho nu, luz suficiente para comparar o tubo de inculo e a soluo padro McFarland de 0,5 contra um carto de fundo branco e linhas contrastantes pretas.
5.3
Mtodo de Suspenso Direta das Colnias
(1) Como alternativa conveniente para o mtodo de crescimento, pode-se preparar o inculo fazendo uma suspenso direta, em caldo ou soluo salina, de colnias isoladas selecionadas numa placa de gar de 18-24 horas (deve-se usar um meio no seletivo, como gar sangue). A suspenso ajustada para que sua turbidez coincida com a da soluo padro McFarland de 0,5 conforme delineado na Seo 5.2. (2) Recomenda-se este mtodo para testar os organismos fastidiosos, Haemophilus spp. e Neisseria gonorrhoeae, bem como os estreptococos (ver Seo 8), e para testar possvel resistncia dos estafilococos a meticilina ou oxacilina.
Teste de Diluio em gar
A metodologia do teste de sensibilidade antimicrobiana por diluio em gar uma tcnica bem estabelecida.1,2 O agente antimicrobiano incorporado ao meio gar, sendo que cada placa contm uma concentrao diferente do agente. Os inculos podem ser aplicados rapida e simultaneamente s superfcies de gar usado um aparelho de replicao de inculo.3 A maioria dos aplicadores usada atualmente permite a transferncia de 32 a 36 inculos para cada placa.
10
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6.1
6.1.1
Reagentes e Materiais
Meio gar Mueller-Hinton
Dentre os muitos meios disponveis, o subcomit considera o gar Mueller-Hinton o melhor para testes rotineiros de sensibilidade contra bactrias no fastidiosas, pelas seguintes razes. Apresenta reprodutibilidade aceitvel entre lotes nos testes de sensibilidade. Contm baixos teores de inibidores de sulfonamida, trimetoprim e tetraciclina. Produz crescimento satisfatrio da maioria dos patgenos.
Existe um grande acervo de dados e experincias relativos a testes de sensibilidade realizados com esse meio. Embora o gar Mueller-Hinton seja geralmente confivel para uso nos testes de sensibilidade, os resultados obtidos com alguns lotes podem variar, ocasionalmente, de maneira significativa. Deve-se usar apenas formulaes do meio Mueller-Hinton que tenham sido testadas de acordo com o documento M6 Protocols for Evaluating Dehydrated Mueller-Hinton Agar do NCCLS e atendam aos limites de aceitao descritos nesse documento. (1) 12.5. Deve-se testar o desempenho de lotes novos do meio antes de usar conforme delineado na Seo
(2) Deve-se preparar o gar Mueller-Hinton a partir de uma base desidratada seguindo as instrues do fabricante. Aps autoclavado, o gar deve esfriar em banho-maria a 45-50 C, antes de se acrescentar, assepticamente, as solues antimicrobianas e os suplementos lbeis ao calor e coloc-lo, posteriormente, nas placas (ver a Seo 6.2). (3) O pH de cada lote de gar Mueller-Hinton deve ser verificado quando o meio preparado. O mtodo exato a ser usado depender, em grande parte, do tipo de equipamento disponvel no laboratrio. O meio gar deve ter pH entre 7,2 e 7,4 a temperatura ambiente aps gelificar. Se o pH for demasiado baixo, algumas drogas parecero ter perdido sua potncia (ex., aminoglicosdeos, quinolonas e macroldeos), enquanto que outros agentes podero parecer excessivamente ativos (ex., tetraciclinas). Se o pH for demasiado alto, pode-se esperar os efeitos opostos. O pH pode ser verificado das seguintes maneiras. Macerar uma quantidade suficiente de gar para submergir a ponta de um eletrodo de pH.
Permitir que uma pequena quantidade de gar solidifique em torno da ponta de um eletrodo de pH, num bquer ou xcara. Usar um eletrodo de superfcie devidamente calibrado.
(4) No se deve acrescentar ctions suplementares ao gar Mueller-Hinton. No caso de testes de oxacilina, meticilina, ou nafcilina contra estafilococos, deve-se acrescentar NaCl (2% p/v). (5) O gar Mueller-Hinton pode ser suplementado com sangue lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de carneiro a 5% (v/v), conforme descrito nas Tabelas 2H, 3A e 7. O pH verificado aps o acrscimo, em condies asspticas, do sangue ao meio autoclavado e resfriado. O pH final dever ser o mesmo do gar Mueller-Hinton sem suplemento.
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(6) O meio apropriado para testes de diluio em gar de Neisseria gonorrhoeae a base gar GC com suplemento de crescimento definido.4 (7) As Sees 8 e 9, assim como a Tabela 7, contm informaes adicionais sobre testes de diluio ou testes especiais de triagem para alguns organismos fastidiosos ou problemticos. 6.1.2 Aplicadores de Inculo
A maioria dos aplicadores de inculo disponveis transferem de 32 a 36 inculos para cada placa.2 Os aplicadores com pontas de 3mm de dimetro aplicam aproximadamente 2L (faixa de 1 a 3L) na superfcie de gar. Os aplicadores com pontas menores, de 1mm, aplicam dez vezes menos, aproximadamente de 0,1 a 0,2L.5
6.2
6.2.1
Preparao da Diluio em Placas de gar

Procedimento
(1) Acrescentam-se diluies apropriadas de soluo antimicrobiana a gars derretidos que se permitiu chegar ao equilbrio em banho-maria a temperaturas de 45 a 50 C. (2) O gar e a soluo antimicrobiana so misturados completamente e a mistura colocada em placas de Petri numa superfcie at se obter uma camada de gar de 3-4mm de profundidade. (3) As placas devem ser produzidas o mais rapidamente possvel aps misturar, para evitar o resfriamento e solidificao parcial do gar no misturador. Deve-se evitar a formao de bolhas. (4) O gar deve solidificar a temperatura ambiente e as placas devem ser usadas imediatamente, ou armazenadas em sacos de plstico a temperatura de 2-8 C, durante at cinco dias para trabalho de referncia, ou mais tempo para testes de rotina. Num estudo, placas de gar contendo cefaclor tiveram de ser preparadas dentro de um perodo de 48 horas devido degradao da droga, enquanto que o cefamandole permaneceu estvel por um perodo superior aos cinco dias recomendados.6 Outras drogas particularmente lbeis, alm do cefaclor, so ampicilina, meticilina, imipenem e cido clavulnico. OBSERVAO: No se pode presumir que todos os agentes antimicrobianos mantero sua potncia nessas condies de armazenamento. O usurio dever, portanto, avaliar a estabilidade das placas a partir dos resultados obtidos com cepas de controle e desenvolver critrios relativos validade em condies de armazenamento. Algumas vezes, essa informao pode ser obtida das empresas farmacuticas. (5) As placas armazenadas a temperaturas de 2 a 8 C devem ser mantidas a temperatura ambiente at chegar ao equilbrio antes de serem usadas. Certifique-se de que a superfcie de gar est seca antes de inocular as placas. Se necessrio, as placas podem ser colocadas num incubador ou cmara de fluxo laminar durante aproximadamente 30 minutos, semi-destampadas, para acelerar a secagem da superfcie de gar. 6.2.2 Esquema de Diluio para Testes de Referncia
Em geral, deve-se usar um esquema em que uma parte de soluo antimicrobiana acrescentada a nove parte de gar lquido, conforme indicado na Tabela 5.
12
Volume 23 6.2.3 Freqncia do Controle de Qualidade
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Embora seja aceitvel realizar controle de qualidade semanalmente, conforme de descrito nesta Norma, algumas combinaes droga/gar podem exigir testes mais freqentes, ex., as drogas lbeis descritas na Seo 6.2.1, anterior. Ver a Seo 12 para mais detalhes. 6.2.4 Placas de Controle
Deve-se usar placas sem droga preparadas a partir do meio base (com ou sem suplementos, conforme indicado na Seo 6.1.1) para cultivar os controles.
6.3
6.3.1
Preparao do Inculo
Preparao do Inculo
Pode-se preparar um inculo padro para os testes de diluio em gar seja cultivando o microorganismo at uma turbidez equivalente soluo padro de McFarland 0,5 ou suspendendo as colnias diretamente para conseguir a mesma densidade descrita na Seo 5. A preparao do inculo inicial e da diluio final pode variar no caso de certos organismos fastidiosos, como Helicobacter pylori (ver a Tabela 2J). 6.3.2 Diluio da Suspenso de Inculo
As culturas ajustadas ao padro McFarland 0,5 contm aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/mL com a maioria das espcies, sendo o inculo final necessrio de 104 UFC por ponto de 5 a 8mm de dimetro. Quando se usa aplicador com pontas de 3mm que aplicam 2L, a suspenso de McFarland 0,5 deve ser diluda 1:10 em caldo ou soluo salina estreis para obter uma concentrao de 107 UFC/mL. O inculo final em gar ter, ento, aproximadamente 104 UFC por ponto. No caso dos aplicadores com pontas de 1mm, que aplicam de 0,1 a 0,2L, no se deve realizar suspenso inicial. No melhor dos mundos, as suspenses ajustadas devem ser usadas na inoculao final at 15 minutos aps a preparao.
6.4
Diluio de Inoculao em Placas de gar
(1) Os tubos contendo as suspenses bacterianas ajustadas e diludas (107 UFC/mL) devem ser arrumados em ordem no suporte. Acrescenta-se uma alquota de cada suspenso bem misturada no correspondente poo no bloco do aplicador de inculo. (2) As placas de gar so marcadas para orientar os pontos de inculo. (3) Cada alquota de cada inculo aplicada superfcie de gar, por meio de um aparelho de aplicao de inculos ou alas ou pipetas padronizadas. imprescindvel diluir adequadamente a suspenso de inculo em funo do volume de inculo aplicado, a fim de obter uma concentrao final de 104 UFC/ponto (ver a Seo 6.3.2). (4) Primeiramente, inocula-se uma placa de controle do crescimento (sem agente antimicrobiano) e, a seguir, comeando pela concentrao mais baixa, inoculam-se as placas contendo as diferentes concentraes de antimicrobiano. Por ltimo, inocula-se uma segunda placa de controle do crescimento para verificar se houve contaminao ou transferncia significativa de antimicrobiano durante a inoculao. (5) Esfrega-se uma amostra de cada inculo numa placa apropriada de gar, incubando-a durante a noite para detectar culturas mistas e fornecer colnias recm isoladas, caso seja necessrio realizar novamente o teste.
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NCCLS
6.5
Incubao e Diluio em Placas de gar
(1) As placas inoculadas devem permanecer em temperatura ambiente at que a umidade nos pontos de inculo tenha sido absorvida pelo gar, i.e., at os pontos secarem, mas nunca mais de 30 minutos. A seguir, as placas so invertidas e incubadas, a 35 C, por um perodo de 16 a 20 horas (ver a Seo 9 para Staphylococcus aureus meticilina-resistente e Enterococcus vancomicina-resistente, assim como a Tabela 7, para outras excees). (2) Nos testes de organismos no fastidiosos, no se deve incubar as placas numa atmosfera com maior concentrao de CO2, pois o pH da superfcie pode ser alterado. Entretanto, N. meningitidis, N. gonorrhoeae e os estreptococos devem ser incubados em atmosfera contendo 5% de CO2 (ver a Seo 8 e as Tabelas 2F, 2H e 7). Helicobacter pylori deve ser incubado em atmosfera microaerbica (ver a Tabela 2J).
6.6
Determinao dos Pontos Finais nos Testes de Diluio em gar
(1) As placas devem ser colocadas numa superfcie escura, no refletiva, para determinar os pontos finais. A CIM registrada como a menor concentrao do agente antimicrobiano que inibe completamente o crescimento, descartando qualquer colnia nica ou turvao leve causada pelo inculo. Com trimetoprim e as sulfonamidas, os antagonistas no meio podem permitir um pequeno crescimento e, portanto, o ponto final deve ser lido na concentrao em que houver uma reduo de 80%, ou mais, no crescimento, em comparao com o controle. (2) Se duas ou mais colnias persistirem em concentraes do agente alm do ponto final bvio, ou se no houver crescimento em concentraes mais baixas, e sim em concentraes mais altas, ser necessrio verificar a pureza da cultura e, possivelmente, repetir o teste.
7
7.1
Testes de Diluio em Caldo (Macrodiluio e Microdiluio)

Meio Caldo de Mueller-Hinton
(1) Recomenda-se o caldo de Mueller-Hinton como meio de primeira escolha para testes de sensibilidade de organismos facultativos ou organismos aerbios de crescimento rpido mais comumente isolados.1 O caldo Mueller-Hinton apresenta uma boa reprodutibilidade entre lotes nos testes de sensibilidade; possui baixos teores de inibidores de sulfonamida, trimetoprim e tetraciclina; e produz crescimento satisfatrio da maioria dos patgenos. Alm disso, h um grande acervo de dados e experincias sobre testes realizados com esse meio. O caldo de Mueller-Hinton pode ser suplementado para suportar o crescimento de bactrias fastidiosas. Por exemplo, recomenda-se o Meio de Teste Haemophilus7 para testes de Haemophilus spp. Deve se acrescentar sangue para os testes de estreptococos. As Sees 8 e 9 e as Tabelas 2E, 2F, 2G, 2H e 7 fornecem recomendaes especficas de suplementao do meio de MuellerHinton para suportar o crescimento de organismos fastidiosos ou problemticos. (2) A realizao dos testes de CIM e as caractersticas qumicas do caldo de Mueller-Hinton devem ser monitoradas de maneira rotineira. O pH de cada lote de caldo de Mueller-Hinton deve ser verificado com um medidor de pH aps a preparao do meio; o pH dever ser de 7.2 a 7.4 a temperatura ambiente (25 C). (3) Se o caldo de Mueller-Hinton no tiver as concentraes corretas dos ctions divalentes Ca++ e Mg++ [de 20 a 25mg de Ca++/L (50mg/L nos testes de daptomicina) e de 10 a 12,5mg de Mg++/L], as CIMs dos aminoglicosdeos para P. aeruginosa e as de tetraciclina para todas as bactrias, bem como as CIMs de 14
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daptomicina para os organismos gram-positivos, sero diferentes dos obtidos com gar Mueller-Hinton. Alguns fabricantes fornecem caldo de Mueller-Hinton com o teor de ctions j ajustado. Portanto, as instrues para o ajuste dos ctions, a seguir, devem ser seguidas apenas quando o fabricante do caldode Mueller-Hinton inicial tiver certificado, ou o usurio tiver verificado, que o caldo fornecido no contm qualquer Ca++ ou Mg++, ou qualquer quantidade inadequada desses ctions, quando submetido a ensaios de espectrometria de absoro para determinar o teor total de ctions divalentes. O acrscimo de quantidade excessiva de ctions ao caldo de Mueller-Hinton pode levar a resultados errneos; entretanto, nos testes de daptomicina, o caldo precisa ser suplementado com 50mg/L de Ca++. Ajuste de Ctions do Caldo de Mueller-Hinton (a) Para preparar uma soluo padro de magnsio, dissolver 8,36g de MgCl26H2O em 100mL de gua desionizada. Essa soluo contm 10mg de Mg++/mL. (b) Para preparar uma soluo padro de clcio, dissolver 3,68g de CaCl22H2O em 100mL de gua desionizada. Essa soluo contm 10mg de Ca++/mL. As solues padro devem ser esterilizadas mediante filtragem atravs de membrana e armazenadas a temperatura de 2 a 8 C. (c) O caldo de Mueller-Hinton deve ser preparado conforme as instrues do fabricante, autoclavado e resfriado durante a noite em temperatura de 2 a 8 C ou num banho de gelo antes de se acrescentar os ctions, se for usado no mesmo dia. comum o meio desidratado preparado comercialmente conter pequenas quantidades de Ca++ ou Mg++. Essa concentrao inicial de ctions deve ser considerada ao calcular a quantidade de Ca++ ou Mg++ a ser acrescentada ao meio. (d) Agitando sempre, acrescenta-se 0,1mL de soluo padro fria de Ca++ ou Mg++ por litro de caldo, para cada incremento de 1 mg/L desejado na concentrao final do caldo Mueller-Hinton ajustado. Esse meio denominado caldo Mueller-Hinton de ction ajustado-CAMHB. Os ajustes de Ca++ ou Mg++, ou ambos, no so necessrios quando o caldo Mueller-Hinton recebido do fabricante j contm a concentraes corretas [de 20 a 25mg de Ca++/L (50mg/L para daptomicina) e de 10 a 12,5mg de Mg ++/L] de ctions divalentes. (4) O caldo de Mueller-Hinton pode ser suplementado com sangue lisado de cavalo (SLC) de 2 a 5% (v/v). Para preparar o sangue lisado de cavalo, congele e descongele sangue desfibrinado de cavalo at que o sangue esteja totalmente lisado (de cinco a sete vezes, aproximadamente). Misture, assepticamente, volumes iguais de sangue lisado e gua destilada esterilizada (agora 50% SLC). Para usar no teste de caldo, a combinao de caldo e SLC deve estar transparente, o que pode ser conseguido centrifugando o SLC a 50% a 12.000 x g, durante 20 minutos. Decante o supernatante e centrifugue novamente, se necessrio. Acrescente as quantidades corretas de SLC a 50% ao meio caldo para obter uma concentrao final de SLC de 2 a 5%. O pH verificado aps o acrscimo assptico do sangue ao meio autoclavado e resfriado. O sangue pode ser acrescentado s placas de microdiluio quando inicialmente dispensado, ou aps descongelar e logo antes da inoculao. Quando acrescentado aps a preparao das placas, o sangue deve ser acrescentado junto com o inculo, de maneira a evitar diluio adicional do agente antimicrobiano na placa (ver a Seo 7.3.2.2) e assegurar uma concentrao final de SLC no poo de 2 a 5%. (5) As caractersticas de desempenho dos testes de CIM para cada lote de caldo so avaliadas usado um conjunto padro de organismos de controle (ver a Seo 12.3). Se um lote novo de caldo de MuellerHinton no produzir as CIMs esperadas, ser necessrio investigar o teor de ctions, alm das outras variveis e dos componentes do teste.
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(6) Para determinar a adequabilidade do meio para testes de sulfonamida e trimetoprim, os testes de CIM podem ser realizados com Enterococcus faecalis ATCCb 29212. Os pontos finais devem ser fceis de ler (como uma reduo de 80% ou mais no crescimento, quando comparado com o controle). Se a CIM para trimetoprim-sulfametoxazol for 0,5/9,5g/mL, o meio poder ser considerado adequado.
7.2
7.2.1 (1)
Preparao e Armazenagem de Agentes Antimicrobianos Diludos

Mtodo de Macrodiluio (Tubo) em Caldo Usar tubos de ensaio esterilizados, de 13 x 100mm, para realizar o teste.
(2) Usar um tubo de controle contendo caldo sem agente antimicrobiano para cada organismo testado. (3) Fechar os tubos de ensaio com tampas de rosca ligeiramente soltas, tampas de plstico ou metal, ou tampes de algodo. (4) Preparar volumetricamente as diluies 2X (ou outras) finais de antibiticos em caldo. A Tabela 6 apresenta um procedimento conveniente e confivel para preparar as diluies. O volume mnimo final necessrio para o teste de 1mL de cada diluio. Pode-se usar uma nica pipeta para medir todos os diluentes e acrescentar, depois, a soluo padro de antimicrobiano ao primeiro tubo de ensaio. Deve-se usar outra pipeta para cada diluio restante naquele conjunto. Visto que haver uma diluio de 1:2 das drogas quando for acrescentado um volume equivalente de inculo, as diluies de antimicrobiano so preparadas, com freqncia, em concentraes 2X a concentrao final desejada. 7.2.2 Mtodo de Microdiluio em Caldo
(1) Este mtodo denominado microdiluio,porque envolve o uso de pequenos volumes de caldo colocados em placas de plstico estreis, prprias para microdiluio, que possuem poos de fundo redondo ou cnico. Cada poo dever conter 0,1mL de caldo. Para preparar as placas de microdiluio, pode-se diluir os agentes antimicrobianos conforme descrito na Seo 7.2.1 ou na Tabela 6. (2) A maneira mais conveniente de preparar as placas de microdiluio usar um dispositivo dispensador com diluies de antimicrobiano em, pelo menos, 10mL de caldo. Essas diluies so usadas para dispensar 0,1mL (0,02) em cada um dos 96 poos da placa padro. Quando o inculo acrescentado usando pipeta, conforme descrito na Seo 7.3.2.2, as solues de antimicrobiano so preparadas em concentraes 2X da concentrao final desejada e os poos preenchidos com 0,05mL, ao invs de 0,1mL. Cada placa dever incluir um poo de controle de crescimento e um poo negativo (no inoculado). (2) As placas cheias devem ser seladas em sacos de plstico e colocadas imediatamente num congelador a -20 C (de preferncia a -60 C) at serem utilizadas. Embora os agentes antimicrobianos nas placas congeladas permaneam estveis durante vrios meses, alguns agentes (ex., cido clavulnico e imipenem) so mais lbeis do que outros e devem ser armazenados a -60 C. As placas no devem ser mantidas em congelador auto-descongelante e as solues antimicrobianas descongeladas no devem ser congeladas de novo; os ciclos de congelar-descongelar aceleram a degradao de alguns agentes antimicrobianos, especialmente os -lactmicos.
ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.
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7.3
7.3.1
Testes de Diluio em Caldo

Preparao do Inculo
Pode se preparar um inculo padro para testes de macrodiluio ou microdiluio em caldo seja cultivando microorganismos at a fase log (crescimento exponencial), em geral de trs a cinco horas, at a turbidez de uma soluo padro de McFarland de 0,5, seja suspendendo as colnias diretamente at alcanar a mesma densidade, conforme descrito na Seo 5. (1) Em condies ideais, deve-se diluir o inculo ajustado em caldo (mtodo de macrodiluio), gua ou soluo salina at 15 minutos aps sua preparao, de maneira que, aps a inoculao, cada tubo de ensaio ou poo contenha aproximadamente 5 x 105 UFC/mL. O procedimento de diluio para obter esse inculo final varia conforme o mtodo de aplicao do inculo em cada poo ou tubo de ensaio e dependendo do organismo sendo testado, devendo ser calculado para cada situao. No caso dos testes de microdiluio, indispensvel saber o volume exato de inculo aplicado nos poos para fazer esse clculo. Por exemplo, se o volume do meio no poo for 0.1mL e o volume de inculo, 0,005mL, a suspenso McFarland 0,5 (1 x 108 UFC/mL) dever ser diluda 1:10 para se conseguir uma diluio de 107 UFC/mL. Quando 0,005mL dessa suspenso for inoculado no caldo, a concentrao final de bactrias do teste ser aproximadamente 5 x 105 UFC/mL (ou 5 x 104 UFC/poo, no mtodo de microdiluio). (2) Para Haemophilus spp. e os estreptococos, seguir as instrues especficas apresentadas nas Sees 8.1 e 8.3. (3) Recomenda-se que os laboratrios realizem periodicamente contagem de colnias nas suspenses de inculo a fim de verificar se a concentrao final de inculo obtida rotineiramente est bem prxima de 5 x 105 UFC/mL para E. coli ATCC 25922. Isso pode ser conseguido facilmente removendo uma alquota de 0,01mL do poo ou tubo de ensaio de controle de crescimento imediatamente aps a inoculao e diluindo-a em 10mL de soluo salina a 0,9% (9 g/L de cloreto de sdio) (diluio 1:1.000). Aps misturar, espalha-se uma alquota de 0,1mL sobre a superfcie de um meio gar apropriado. Aps incubao, a presena de aproximadamente 50 colnias indicar uma densidade de inculo de 5 x 105 UFC/mL. 7.3.2 7.3.2.1 Inoculao do Caldo em Tubos de Ensaio ou Placas de Microdiluio Mtodo de Macrodiluio (Tubo de Ensaio) em Caldo
Acrescenta-se 1mL de inculo ajustado a cada tubo contendo 1mL de agente antimicrobiano na srie de diluies (e a um tubo de controle positivo contendo apenas caldo) at 15 minutos aps a normatizao do inculo, conforme descrito anteriormente, misturando a seguir. Isso resulta numa diluio 1:2 de cada concentrao de antimicrobiano e uma diluio 1:2 do inculo. Recomenda-se efetuar uma verificao da pureza da suspenso de inculo por meio de subcultura de uma alquota numa placa de gar no-seletivo para incubao simultnea. 7.3.2.2 Mtodo de Microdiluio em Caldo
At 15 minutos aps a normatizao do inculo conforme descrito anteriormente, cada poo da placa de microdiluio pode ser inoculado usando um inoculador que aplique um volume de, no mximo, 10% do volume no poo (ex., 10L de inculo em 0,1mL de soluo de agente antimicrobiano). Por outra parte, usar uma pipeta de 0,05mL resulta numa diluio 1:2 diluio do contedo de cada poo (contendo 0,05mL), como no teste de macrodiluio. Recomenda-se realizar uma verificao da pureza da suspenso de inculo por meio de subcultura de uma alquota numa placa de gar no-seletivo para incubao simultnea.
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Para prevenir secagem, cada placa dever ser selada num saco de plstico, com fita aderente de plstico, ou tampa de plstico bem justa, antes de incubar a placa. 7.3.3 Incubao
Os tubos de macrodiluio, ou as placas de microdiluio, inoculados devem ser incubados a 35 C durante 16-20 horas num incubador em ar ambiente. Para manter a mesma temperatura de incubao para todas as culturas, s dever haver quatro placas de microdiluio em cada pilha. Nos testes de Haemophilus spp. e dos estreptococos, o perodo de incubao de 20-24 horas em ar ambiente antes de interpretar os resultados. No caso de estafilococos e enterococos, so necessrias 24 horas completas de incubao com oxacilina e vancomicina (ver as Sees 9.1 e 9.2). 7.3.4 Determinao dos Pontos Finais da CIM
A CIM a menor concentrao de agente antimicrobiano que inibe completamente o crescimento do organismo nos tubos ou poos de microdiluio conforme detectado a olho nu. Pode-se usar viso auxiliada por aparelhos para facilitar a leitura dos testes de microdiluio e registrar os resultados, contanto que no prejudique a habilidade de perceber crescimento nos poos. A quantidade de crescimento nos poos ou tubos contendo o antibitico deve ser comparada com a quantidade de crescimento nos poos ou tubos de controle de crescimento (sem antibitico) usada em cada conjunto de testes ao determinar os pontos finais de crescimento. Para que o teste seja considerado vlido, necessrio que haja crescimento (2mm turbidez definitiva) no poo de controle positivo. Com trimetoprim e as sulfonamidas, os antagonistas no meio podem permitir um ligeiro crescimento; portanto, deve-se ler o ponto final na concentrao em que haja uma reduo de 80% ou mais do crescimento, quando comparado com o controle. Quando se pula um nico poo em um teste de microdiluio, deve se ler a CIM mais alta. No se deve relatar os resultados dos testes de drogas das quais mais de um poo foi pulado. Em geral, as CIMs de microdiluio para os bacilos gram-negativos so iguais ou uma diluio 2X mais baixos do que as CIMs de testes de macrodiluio comparveis.8 8 Organismos Fastidiosos
O meio Mueller-Hinton descrito anteriormente para patgenos aerbios de crescimento rpido no apropriado para os testes de sensibilidade de organismos fastidiosos. Para fazer testes de CIM com organismos fastidiosos, indispensvel mudar o meio, os procedimentos de controle de qualidade e os critrios de interpretao em funo de cada organismo testado. Os testes de diluio para H. influenzae (usando Meio Haemophilus de Teste), N. gonorrhoeae (usando meio base de gar GC) e os estreptococos (usando caldo Mueller-Hinton de ction ajustado suplementado com sangue lisado de cavalo) tm se demonstrado confiveis; esses testes encontram-se descritos nesta Norma. Alm disso, a tabela indicada apresenta os meios e aspectos tcnicos importantes dos testes dos seguintes organismos: Bacillus anthracis (Tabela 2K), Campylobacter spp. (Tabela 3A), Helicobacter pylori (Tabela 2J), Listeria spp. (Tabela 7) e Neisseria meningitidis (Tabela 7). 8.1 Espcies Haemophilus
Os testes de CIM das espcies Haemophilus usando o Meio Haemophilus de Teste (HTM) foram desenvolvidos apenas para diluio em caldo, conforme anteriormente descrito. O teste de diluio em gar usando HTM ainda no foi estudado. 8.1.1 Meio Caldo
O meio preferido para os testes de diluio em caldo de Haemophilus spp. o HTM.7 Na forma de caldo, o HTM consiste em: 18
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Caldo de Mueller-Hinton; 15g/mL de -NAD; 15g/mL de hematina bovina; 5g/L de extrato de levedo; e 0,2 IU/mL de timidina fosforilase (nos testes de sulfonamidas ou trimetoprim). Para fazer HTM, prepara-se inicialmente uma soluo padro fresca de hematina, dissolvendo 50mg de p de hematina bovina em 100mL de NaOH 0,01 mol/L, aquecendo e mexendo at o p estar completamente dissolvido. Acrescentam-se 30mL da soluo padro de hematina a 1L de MHB com 5g de extrato de levedo. Aps autoclavar e resfriar, os ctions so acrescentados assepticamente, se necessrio, como na CAMHB, alm de 3mL de uma soluo padro de NAD (50mg de NAD dissolvidos em 10mL de gua destilada e esterilizado por filtragem), tambm acrescentados de maneira assptica. Se os testes forem com sulfonamidas ou trimetoprim, deve-se acrescentar tambm 0,2 IU de timidina fosforilase ao meio assptico. O pH dever ser de 7,2 a 7,4. 8.1.2 Metodologia do Teste
(1) Deve-se usar o procedimento de suspenso direta de colnias para os testes de Haemophilus spp. Usando colnias retiradas diretamente de uma placa de cultura incubada durante a noite (de preferncia, 20-24 horas), prepara-se uma suspenso do organismo do teste em caldo Mueller-Hinton ou soluo salina a 0,9%. A suspenso dever ser ajustada para uma turbidez equivalente soluo padro McFarland 0,5, usando um fotmetro. Essa suspenso dever conter aproximadamente de 1 a 4 x 108 UFC/mL. preciso cuidado ao preparar a suspenso, porque as concentraes mais altas de inculo podem levar a resultados falsos-resistentes com alguns agentes antimicrobianos -lactmicos, em especial quando se testa cepas de H. influenzae produtoras de -lactamase. A concentrao precisa dos organismos na suspenso inicial depender das condies de incubao na cultura em gar chocolate durante a noite; em especial, no perodo de incubao. Por exemplo, uma suspenso de H. influenzae em McFarland 0,5 preparada a partir de uma cultura em gar chocolate incubada durante 16-18 horas dever conter aproximadamente de 3 a 4 x 108 UFC/mL; enquanto que uma suspenso preparada a partir de uma cultura em gar chocolate incubada durante 24 horas apresentar menos clulas viveis, ex., aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/mL. Com Haemophilus spp., inculos apreciavelmente mais concentrados do que 5 x 105 UFC/mL podem levar a CIMs incorretamente altas com certas cefalosporinas, em especial com as cepas produtoras de -lactamase. A suspenso de inculo deve ser usada para a inoculao das placas at 15 minutos aps ajustar sua turbidez. (2) A metodologia do teste de diluio em caldo dever ser obedecida conforme descrito comeando na Seo 7.3.2. (3) As placas devem ser incubadas em ar ambiente, a 35 C, durante 20-24 horas, antes de fazer a leitura das CIMs. 8.1.3 Critrios de Interpretao da CIM
A Tabela 1A apresenta os agentes antimicrobianos sugeridos para testes rotineiros de Haemophilus spp, sendo que a Tabela 2E relaciona os critrios de interpretao da CIM a serem usados nos testes de Haemophilus spp. 8.2 Neisseria gonorrhoeae
Os nicos testes de CIM para N. gonorrhoeae desenvolvidos so os de diluio em gar usando base de gar GC e suplemento de crescimento definido a 1%, conforme descrito a seguir.
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O meio recomendado para os testes de N. gonorrhoeae gar GC, ao qual se acrescenta um suplemento de crescimento definido a 1% (1,1g de L-cistena; 0,03g de guanina cido clordrico (HCL); 3mg de tiamina HCL; 13mg de PABA; 0,01g de B12; 0,1g de cocarboxilase; 0,25g de NAD; 1,0g de adenina; 10g de L-glutamina; 100g de glicose; 0,02g de nitrato frrico [em 1 L de H2O]) aps autoclavar. necessrio usar um suplemento isento de cistena para testes com carbapenems e clavulanato. Os suplementos de crescimento definido que contm cistena no alteram significativamente os testes de diluio com outras drogas. 8.2.2 Metodologia do Teste
(1) Deve-se usar a metodologia de suspenso direta de colnias nos testes de N. gonorrhoeae. Usando colnias retiradas diretamente de uma placa de cultura em gar chocolate incubado durante a noite, prepara-se uma suspenso equivalente soluo padro McFarland 0,5 seja em caldo MuellerHinton ou em soluo salina a 0,9%. A suspenso de inculo dever ser usada para inocular as placas at 15 minutos aps ajustar sua turbidez. (2) Deve se seguir os passos da metodologia do teste de diluio em gar descritos na Seo 6 para bactrias no-fastidiosas. (3) As placas so incubadas em atmosfera com CO2 a 5%, a 35 C, durante 20-24 horas, antes de efetuar a leitura das CIMs. 8.2.3 Critrios de Interpretao da CIM
A Tabela 1A apresenta os agentes antimicrobianos sugeridos para testes rotineiros de N. gonorrhoeae, enquanto que a Tabela 2F relaciona os critrios especficos de interpretao da CIM a serem usados nos testes de N. gonorrhoeae. 8.3 Streptococcus pneumoniae e Outros Streptococcus spp.
Os nicos testes de CIM desenvolvidos para as espcies de Streptococcus usando caldo Mueller-Hinton com ction ajustado, acrescidos de 2-5% de sangue lisado de cavalo, so os de diluio em caldo, conforme descrito a seguir. O mtodo de diluio em gar ainda no foi estudado. 8.3.1 Meio Caldo
O meio recomendado para os testes de S. pneumoniae e outros estreptococos o caldo Mueller-Hinton com ction ajustado, suplementado com 2-5% de sangue lisado de cavalo. O mtodo de preparao do sangue lisado de cavalo e os detalhes de sua incorporao ao meio para os testes so apresentados na Seo 7.1. 8.3.2 Metodologia do Teste
(1) Deve-se usar o procedimento de suspenso direta de colnias nos testes de S. pneumoniae. Usando colnias retiradas diretamente de uma placa de cultura em gar sangue de carneiro incubada durante a noite (18-20 horas), prepara-se uma suspenso equivalente soluo padro McFarland 0,5 seja em caldo Mueller-Hinton, seja em soluo salina a 0,9%. A suspenso de inculo deve ser usada para inocular as placas at 15 minutos aps ajustar sua turbidez.
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(2) Deve se seguir os passos da metodologia dos testes de diluio em caldo descritos no comeo da Seo 7.3.2 para bactrias no-fastidiosas. (3) As placas devem ser incubadas em ar ambiente, a 35 C, durante 20-24 horas, antes de efetuar a leitura das CIMs. 8.3.3 Critrios de Interpretao da CIM
A Tabela 1A apresenta os agentes antimicrobianos sugeridos para testes rotineiros de pneumococos e outros estreptococos, enquanto que as Tabelas 2G e 2H, respectivamente, indicam os critrios especficos de interpretao das CIMs a serem usados nos testes de S. pneumoniae e outros estreptococos. 9 9.1 9.1.1 Organismos-Problema Estafilococos Resistncia a Meticilina/Oxacilina
Historicamente, a resistncia s penicilinas -lactamase-estveis anti-estafilococos tem sido denominadas de meticilina-resistentes, que a razo das siglas MRSA, em ingls (methycillin-resistant S. aureus), ou MRS (methicillin-resistant staphylococci), que ainda so usadas de maneira generalizada, embora a meticilina no seja mais o agente de escolha para testes ou tratamento. Nesta Norma, a resistncia a esses agentes denominadas usando vrios termos, ex., MRS,meticilina-resistente, ou oxacilinaresistente. Alguns laboratrios ainda tm problemas para detectar a MRS. Para melhor identificar essas cepas necessrio considerar os seguintes pontos. Os testes que incorporam oxacilina tm maior probabilidade de detectar resistncia do que os de meticilina ou nafcilina. Portanto, a oxacilina o agente de preferncia para testes de resistncia a meticilina/oxacilina. Recomenda-se acrescentar NaCl (2% p/v; 0,34 mol/L) ao meio, para diluio tanto em gar como em caldo, nos testes com meticilina, nafcilina e oxacilina. O inculo deve ser preparado usando o mtodo de suspenso direta de colnias (Seo 5.3), ao invs do mtodo de crescimento do inculo (Seo 5.2). Os testes para deteco de MRS devem ser incubados durante 24 horas completas (ao invs de 16 a 20 horas), a 33-35 C (no exceder os 35 C), antes de se relatar sensibilidade. A resistncia pode ser relatada sempre que se observar crescimento aps incubao durante, pelo menos, 16 horas. Os microbiologistas devem lembrar de que os estafilococos resistentes a meticilina so, com freqncia, resistentes a mltiplas classes de agentes antimicrobianos, incluindo os aminoglicosdeos, clindamicina, macroldeos, fenicis, quinolonas, sulfonamidas e tetraciclina. A observao de resistncia mltipla dever indicar a possibilidade de resistncia a meticilina. Entretanto, h registros de cepas de S. aureus resistentes a meticilina, mas que no apresentam resistncia a outras classes de agentes antimicrobianos, isoladas em populaes de pacientes ambulatoriais e hospitalizados. Se houver dvidas quanto ao resultado de um teste de CIM com um S. aureus possivelmente resistente a meticilina, ser necessrio realizar testes confirmatrios adicionais, como o teste de triagem em gar com sal de oxacilina descrito a seguir e na Tabela 2C.
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S. aureus meticilina-resistente e os estafilococos coagulase-negativos devem ser relatados como resistentes a todos os cefens e outros -lactmicos, como amoxicilina-cido clavulnico, ampicilinasulbactam, ticarcilina-cido clavulnico, piperacilina-tazobactam e imipenem, independentemente dos resultados dos testes in vitro com esses agentes. Isso porque a maioria dos casos documentados de infeces MRS respondeu mal a terapia com -lactmico, ou porque ainda no foram apresentados dados clnicos convincentes documentando a eficcia clnica desses agentes. Quaisquer isolados de estafilococos que apresentem o gene mecA, ou produzam PBP2a, o produto do gene mecA, devem ser relatados como resistentes a oxacilina. 9.1.2 Placas de Triagem de Oxacilina
O teste de triagem de oxacilina usando placas de gar NaCl pode ser realizado em acrscimo aos mtodos de diluio antes descritos para a deteco de MRSA. O teste executado inoculando um isolado de S. aureus em gar Mueller-Hinton suplementado com NaCl (4% p/v; 0,68mol/L) e contendo 6g de oxacilina/mL. O gar inoculado com uma suspenso direta de colnias equivalente soluo padro de McFarland 0,5, por meio de uma ala ou um swab de 1L. Usando uma ala de 1L, espalhe o inculo numa rea com 10-15mm de dimetro. Alternativamente, pode-se usar um swab, pressionando, como no teste de disco difuso, e depois salpicando uma rea de, pelo menos, 10-15mm de dimetro ou riscando todo um quadrante. A placa dever ser incubada em temperatura de at 35 C, no mximo, durante 24 horas e examinada usando luz transmitida para verificar a presena de pequenas colnias (>1 colnia) ou um tnue filme de crescimento, que indica a presena de resistncia a oxacilina (ver a Tabela 2C).9 As placas no devem ser usadas novamente aps incubadas. 9.1.3 Sensibilidade Reduzida a Vancomicina e Resistncia a Vancomicina
A literatura descreve cepas de estafilococos coagulase-negativas e resistentes s CIMs de vancomicina e teicoplanin.10,11 A primeira ocorrncia de cepas de S. aureus com sensibilidade diminuda a vancomicina (CIMs de 4 a 8g/mL) foi relatada no Japo em 1997,12 seguida de relatrios nos Estados Unidos e na Frana.13 O mecanismo exato de resistncia que resulta nessas CIMs elevadas desconhecido, embora provvel que implique alteraes na parede celular e hiperexpresso das protenas ligadoras da penicilina (PBPs). At a data, todas essas cepas de S. aureus parecem ter desenvolvido MRSA. Para identificar cepas com CIMs de vancomicina na faixa de 4 a 8g/mL, necessrio realizar testes de CIM. O teste de triagem de vancomicina usando gar descrito para os enterococos pode detectar esses isolados, 14 incubando as placas durante 24 horas completas, a 35 C, embora deva ser confirmado pela CIM. O uso de uma cepa de controle de qualidade sensvel, como S. aureus ATCC 29213, importncia crtica para assegurar a especificidade. Enquanto no se dispes de dados sobre a prevalncia e significncia clnica desses isolados, os laboratrios devem examinas as cepas MRSA mais cuidadosamente, visando a detectar CIMs elevadas para vancomicina. Duas cepas de S. aureus com CIMs de 1024 g/mL e 32 g/mL foram relatadas em julho e outubro de 2002. Ambas as cepas continham um gene vanA similar ao encontrado nos enterococos.15,16 9.2 9.2.1 Enterococos Resistncia a Penicilina/Ampicilina
Os enterococos podem ser resistentes a penicilina e ampicilina devido produo de protenas ligadoras de penicilina de baixa afinidade (PBPs) ou, mais raramente, devido produo de -lactamase. O teste de diluio em gar ou caldo pode detectar, com preciso, isolados com PBPs alterados, mas no confivel para detectar as cepas produtoras de -lactamase. A melhor maneira de detectar essas cepas mais raras 22
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produtoras de -lactamase usando um teste direto de -lactamase baseado em nitrocefim (ver a Seo 10). O teste de -lactamase positivo prediz a resistncia penicilina, assim como as amino-, carboxi- e ureidopenicilinas. Certos enterococos resistentes a penicilina ou ampicilina podem apresentar um alto grau de resistncia (ex, CIMs 128 g/mL de penicilina). Os enterococos com menores graus de resistncia (penicilina 64 g/mL ou ampicilina 32 g/mL) podem ser sensiveis ao sinergtica dessas penicilinas em combinao com gentamicina ou estreptomicina (na ausncia de alto grau de resistncia) se forem usadas doses altas de penicilina, enquanto que as cepas com altos nveis de resistncia (penicilina >64 g/mL ou ampicilina >32 g/mL) podem no ser sensiveis ao efeito sinergtico.17,18 Deve se considerar os pedidos dos mdicos de determinar a verdadeira CIM de penicilina ou ampicilina para isolados de enterococos de sangue ou LCR. 9.2.2 Resistncia a Vancomicina
A identificao acurada dos enterococos resistentes vancomicina mediante o teste de diluio em gar ou caldo requer incubao durante 24 horas completas (ao invs de 16 a 20 horas) antes de liberar resultados de sensvel, alm de um exame cuidadoso das placas, tubos de ensaio, ou poos para detectar evidncia de crescimento fraco. Tambm possvel usar o teste de triagem de vancomicina em gar, conforme descrito a seguir e na Tabela 2D. 9.2.3 Placas de Triagem de Vancomicina
O teste de triagem de vancomicina usando placas de gar pode ser usado em acrscimo aos mtodos de diluio descritos anteriormente para a deteco de enterococos resistentes a vancomicina. O teste realizado inoculando um isolado de enterococo em gar BHI suplementado com 6g de vancomicina/mL.19 O gar inoculado com uma suspenso direta de colnias equivalente soluo padro de McFarland 0,5, por meio de uma ala ou um swab de 1 ou 10L.20 Usando uma ala, espalhe o inculo numa rea com 10-15mm de dimetro. Alternativamente, pode-se usar um swab, pressionando, como no teste de disco difuso, e depois salpicando uma rea de, pelo menos, 10-15mm de dimetro. A placa dever ser incubada a 35 C, durante 24 horas, e examinada cuidadosamente para verificar a presena de pequenas colnias (>1 colnia) ou um tnue filme de crescimento, que indica a presena de resistncia a vancomicina (ver a Tabela 2D). 9.2.4 Alto Nvel de Resistncia aos Aminoglicosdeos
Um alto nvel de resistncia aos aminoglicosdeos indica que um isolado de enterococos no ser afetado sinergeticamente por uma combinao de penicilina ou glicopeptdeo + um aminoglicosdeo.17 Pode-se usar teste de gar ou caldo com alta concentrao de gentamicina (500 g/mL) e estreptomicina (1.000 g/mL com microdiluio em caldo; 2.000 g/mL com gar) para fazer a triagem deste tipo de resistncia (ver a Tabela 2D). A Tabela 2D tambm apresenta o controle de qualidade para esses testes. No necessrio testar outros aminoglicosdeos, uma vez que sua atividade contra os enterococos no superior da gentamicina ou estreptomicina. 9.3 Bacilos Gram-negativos Produtores de -Lactamase de Espectro Ampliado
As -lactamases de espectro ampliado (ESBLs) so enzimas resultantes da mutao do gene da -lactamase comum mediada por plasmdio, como TEM-1, TEM-2 e SHV-1. As ESBLs podem conferir resistncia s penicilinas, cefalosporinas e ao aztreonam em isolados clnicos de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e alguns outros gneros da famlia Enterobacteriaceae que, em geral, so sensiveis a esses agentes.21 Algumas dessas cepas apresentaro CIMs acima das da populao sensvel normal, embora abaixo dos pontos de corte padro para aztreonam e certas cefalosporinas de espectro ampliado. Pode se fazer a triagem dessas cepas para potencial produo de ESBL usando os pontos de corte para triagem relacionados no quadro no fim da Tabela 2A. Outras cepas podem ser classificadas
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como resistentes ou de resistncia intermediria usando os pontos de corte padro para um ou mais desses agentes. Em todas as cepas que expressam as ESBLs, as CIMs de uma ou mais cefalosporinas de espectro ampliado ou aztreonam devero diminuir na presena de cido clavulnico (ver o quadro de ESBL no fim da Tabela 2A). Para todas as cepas produtoras de ESBL, a interpretao dos resultados dos testes deve ser relatada como resistente a todas as penicilinas, cefalosporinas e ao aztreonam. As atuais recomendaes de testes e relatrios adicionais so apresentadas nas Tabelas 1 e 2A. 10 Testes de -Lactamase 10.1 Propsito Um teste rpido de -lactamase pode fornecer mais informaes clinicamente relevantes, mais precocemente, do que o resultado de um teste de CIM com Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e Moraxella catarrhalis; o nico teste confivel para a deteco de Enterococcus spp produtores de -lactamase. Alm disso, os testes de -lactamase podem esclarecer os resultados dos testes de sensibilidade dos estafilococos penicilina, determinada por microdiluio em caldo, especialmente nas cepas com CIMs limtrofes (0.06 to 0.25 g/mL). O resultado positivo de teste de -lactamase prediz o seguinte: resistncia a penicilina, ampicilina e amoxicilina nas Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e M. catarrhalis; e resistncia a penicilina, assim como s amino-, carboxy- e ureidopenicilinas em estafilococos e enterococos. Um resultado negativo do teste de -lactamase no elimina a possibilidade de resistncia devida a outros mecanismos. No se deve testar os membros da famlia Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. e outros bacilos gram-negativos aerbios, porque os resultados podem no predizer a sensibilidade aos lactmicos mais freqentemente usados na terapia. 10.2 Seleo de um Teste de -Lactamase O mtodo de preferncia para testar Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, M. catarrhalis, estafilococos e enterococos22 o teste baseado em nitrocefin. Os testes de -lactamase acidimtricos tm produzido, em geral, resultados aceitveis com Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e os estafilococos. Os testes iodomtricos podem ser usados para N. gonorrhoeae, mas apenas os testes baseados em nitrocefin devem ser usados para testar M. catarrhalis.23 A deteco acurada da -lactamase em estafilococos pode exigir a induo da enzima e incubao de um teste baseado em nitrocefin durante at uma hora. A induo pode ser realizada com facilidade testando o crescimento a partir da margem do halo em volta de um teste de disco de oxacilina. necessrio ser cauteloso ao efetuar esses ensaios, de maneira a assegurar resultados acurados, incluindo testes de cepas de controle positivas e negativas quando os isolados clnicos so examinados. 11 Relatrios dos Resultados de CIM Os valores de CIM determinados conforme descrito nesta Norma podem ser relatados diretamente aos clnicos visando a auxiliar na determinao da terapia apropriada. Entretanto, para que todos os clnicos entendam os dados, essencial que as diferentes categorias de resultado sejam informadas de maneira rotineira. As categorias interpretativas recomendadas para os diversos valores de CIM esto includas nas tabelas relativas a cada grupo de organismos e baseiam-se nos dados de avaliao descritos na Norma M23Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria e Quality Control Parameters do NCCLS. 24
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Para a maioria dos agentes, essas categorias foram desenvolvidas mediante determinao das CIMs de um grande nmero de isolados, incluindo aqueles com mecanismos conhecidos relevantes de resistncia a uma determinada classe de drogas. Em segundo lugar, as CIMs foram analisadas em relao farmacocintica da droga em esquemas de dosagem normal. Terceiro, sempre que possvel, os critrios interpretativos tentativos dos testes in vitro foram analisados em relao a estudos de eficcia clnica no tratamento de patgenos especficos, conforme delineado na Norma M23 Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria e Quality Control Parameters do NCCLS. 11.1 Sensvel A categoria sensvel significa que uma infeco por uma determinada cepa pode ser tratada adequadamente com a dose de agente antimicrobiano recomendada para esse tipo de infeco e espcie infectante, exceto quando contra-indicado. 11.2 Intermediria A categoria intermediria inclui isolados com CIMs do agente antimicrobiano que se aproximam de nveis sangneos e tissulares atingveis e para os quais as taxas de resposta podem ser mais baixas do que nos isolados sensiveis. A categoria intermediria implica eficcia clnica nos stios corpreos de concentrao fisiolgica das drogas (ex., quinolonas e -lactmicos na urina) ou possibilidade de se usar uma dose da droga maior do que a normal (ex., -lactmicos). Essa categoria tambm inclui uma zonatampo, o que dever impedir que pequenos fatores tcnicos no sujeitos a controle causem discrepncias importantes na interpretao, especialmente no caso de drogas com margens estreitas de farmacotoxicidade. 11.3 Resistente As cepas resistentes no so inibidas pelas concentraes sistmicas dos agentes antimicrobianos geralmente atingveis nos regimes teraputicos normais; e/ou podem ter CIMs dentro da faixa de maior probabilidade de ocorrncia de mecanismos especficos de resistncia microbiana (ex., -lactamases), alm de sua eficcia clnica no ter sido confivel em regimes teraputicos. 12 Testes de Controle de Qualidade 12.1 Propsito As metas do programa de controle de qualidade so auxiliar no monitoramento dos seguintes itens: a preciso (reprodutibilidade) e acurcia dos testes de sensibilidade; o desempenho dos reagentes usados nos testes; e o desempenho das pessoas que realizam os testes e fazem a leitura dos resultados.
Embora outros fatores tambm intervenham, a melhor maneira de alcanar essas metas est nos testes de cepas de controle de qualidade com estabilidade gentica conhecida aos agentes antimicrobianos a serem testados. 12.2 Responsabilidades do Controle de Qualidade Os laboratrios modernos dependem muito dos fabricantes de produtos farmacuticos e de diagnstico que fornecem reagentes, meios, ou sistemas para realizar testes de sensibilidade antimicrobiana. Embora esta seo vise aplicao dos mtodos de referncia padro, pode ser aplicada a certos sistemas disponveis no mercado que se baseiam, principalmente ou em parte, nesses mtodos.
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Nmero 2 Uma diviso lgica das responsabilidades pode ser descrita da seguinte maneira. Fabricantes (Produtos Comerciais ou Internos):
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estabilidade do antimicrobiano; identificao do antimicrobiano; potncia das solues padro de antimicrobianos; adeso aos Regulamentos do Sistema de Qualidade do U.S. FDA; integridade do produto; e responsabilidade e rastreabilidade a um consignatrio.
Laboratrio (Usurio):
armazenamento nas condies ambientais recomendadas pelo fabricante (para evitar a deteriorao da droga); proficincia dos tcnicos de laboratrio; e adeso metodologia estabelecida, ex., preparao do inculo, condies de incubao, interpretao dos pontos finais.
Os fabricantes de produtos comerciais devem desenhar e recomendar um programa de controle de qualidade que permita que o usurio avalie as variveis (ex., densidade do inculo, condies de armazenamento/transporte) que mais tendem a causar problemas de desempenho laboratorial e determine se o ensaio tem desempenho correto quando executado de acordo com as instrues de uso. 12.3 Cepas de Controle de Qualidade de Referncia As cepas de referncia ideais para o controle de qualidade dos mtodos de diluio tm CIMs prximas ao meio da faixa da concentrao, para todos os agentes antifngicos testados, ex., uma cepa de controle ideal inibida na quarta diluio de uma srie de sete diluies, mas as cepas com CIMs entre a terceira ou a quinta diluio tambm so aceitveis. Em certas circunstncias, no caso dos agentes antimicrobianos mais novos e potentes, poder ser necessrio testar cepas adicionais de controle de qualidade, que no so testadas normalmente, a fim de fornecer valores em escala. Nos testes de trs ou menos diluies 2X adjacentes de um agente antimicrobiano usando esses mtodos, necessrio modificar a metodologia do controle de qualidade. Uma alternativa possvel usar um organismo de controle com um valor modal de CIM igual, ou no inferior, a uma diluio 2X da concentrao mais baixa e um segundo organismo de controle com uma CIM modal igual, e no superior, a uma diluio 2X da concentrao mais alta. A combinao dos resultados derivados dos testes dessas duas cepas dever fornecer, pelo menos, um ponto final em escala. Para os usurios de sistemas comerciais, o melhor uso dessa estratgia pode ser testar, seletivamente, os agentes mais lbeis includos nos painis, e.g., combinaes de cido clavulnico, meticilina, imipenem e cefaclor. As cepas de controle de qualidade usadas nos testes padro de disco difuso tambm tm sido usadas, com freqncia, como cepas de controle para os testes de sensibilidade por diluio. A cepa 26
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Staphylococcus aureus ATCC 25923, entretanto, no possui grande utilidade nos testes de diluio, devido a sua extrema sensibilidade maioria das drogas. O Staphylococcus aureus ATCC 29213 uma cepa fraca produtora de -lactamase, til como cepa de controle para os testes de diluio. A cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 desenvolve resistncia aos antimicrobianos -lactmicos aps transferncias repetidas aos meios de laboratrio, embora esse problema possa ser minimizado retirando uma nova cultura de armazenagem a intervalos apropriados, ou sempre que a cepa comear a se mostrar resistente. Embora no exista um conjunto perfeito de cepas de controle de qualidade, as cepas relacionadas a seguir e nas Tabelas 3 e 3A devero atender s necessidades da maioria dos laboratrios quando realizam testes de referncia padro por diluio. As seguintes cepas de referncia so recomendadas para controle dos testes de diluio: Enterococcus faecalis ATCC 29212; Enterococcus faecalis ATCC 51299; Escherichia coli ATCC 25922; Escherichia coli ATCC 35218; Haemophilus influenzae ATCC 49247; Haemophilus influenzae ATCC 49766; Helicobacter pylori ATCC 43504; Klebsiella pneumoniae ATCC 700603; Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Staphylococcus aureus ATCC 29213; Staphylococcus aureus ATCC 43300; e Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.
Enterococcus faecalis ATCC 51299 e Enterococcus faecalis ATCC 29212 so usadas como organismos de controle para os testes de triagem de vancomicina e aminoglicosdeos de alto nvel (Tabela 2D). Escherichia coli ATCC 35218 recomendada apenas como organismo de controle para combinaes de inibidores de -lactamase, como aquelas que contm cido clavulnico, sulbactam, ou tazobactam. Haemophilus influenzae ATCC 49247 um organismo -lactamase-negativo resistente ampicilina. Haemophilus influenzae ATCC 49766 um organismo sensvel ampicilina, mais reprodutvel do que a cepa H. influenzae ATCC 49247 no controle de -lactmicos selecionados. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 usada como controle para os testes de ESBL (Tabela 2A).
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Staphylococcus aureus ATCC 43300 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 so usados como organismos de controle para os testes de triagem com sais de oxacilina (Tabela 2C). 12.4 Armazenamento das Cepas de Controle de Qualidade As cepas de controle de qualidade devem ser testadas usando os mtodos de diluio padro descritos nesta Norma, usando os mesmos materiais e mtodos usados nos testes de isolados clnicos. No caso de armazenamento prolongado, essas culturas de referncia devem ser mantidas a temperatura de 20 C, ou menos, (de preferncia a -60 C ou menos, ou em nitrognio lquido) num estabilizador adequado (ex., soro bovino fetal em caldo a 50%, glicerol em caldo de soja trptica a 10-15%, sangue de carneiro desfibrinado, ou leite desnatado), ou dessecadas-congeladas, sem risco significativo de alterao de sua sensibilidade antimicrobiana. As culturas de controle em manipulao devem ser armazenadas em gar de soja trptica (cepas no fastidiosas) ou em gar chocolate enriquecido (cepas fastidiosas), a temperatura de 2 a 8 C, fazendo-se uma subcultura toda semana durante, no mximo, trs semanas consecutivas. Novas culturas para manipulao devem ser preparadas pelo menos mensalmente, a partir de culturas congeladas, dessecadas-congeladas, ou comerciais. Antes do teste, deve-se fazer subculturas das cepas em placas de gar, a fim de se obter colnias isoladas. As culturas congeladas ou dessecadas-congeladas devem passar por duas subculturas antes do teste. As colnias so cultivadas ou suspensas para os testes de acordo com as tcnicas recomendadas de preparao de inculos. Pode-se usar uma cultura de controle de qualidade para monitorar a preciso (reprodutibilidade) e acurcia do teste de diluio, contanto que no haja qualquer mudana significativa nas CIMs que no possa ser atribuda a falha metodolgica. Se um resultado inexplicvel sugerir uma mudana na sensibilidade inerente do organismo, ser necessrio obter uma cultura fresca da cepa de controle. Ateno especial manuteno do organismo (ex., subculturas mnimas) e a seu armazenamento (ex., -60 C, ou menos) so particularmente importantes para as cepas de controle de qualidade E. coli ATCC 35218 e K. pneumoniae ATCC 700603, visto que tem sido documentada perda espontnea do plasmdeo que codifica a -lactamase. Isso pode levar a resultados de controle de qualidade alm dos limites aceitveis.
12.5 Controle de Qualidade de Lotes

(1) Cada novo lote de tubos e placas de microdiluio, assim como placas de gar para testes de diluio, deve ser testado com cepas de referncia apropriadas, a fim de determinar se as CIMs obtidas com o lote esto dentro da faixa de resultados esperados (ver as Tabelas 3 e 3A); caso contrrio, o lote deve ser rejeitado. (2) Pelo menos um tubo, uma placa ou uma placa de gar, no inoculado, de cada lote dever ser incubado durante a noite para verificar a esterilidade do meio. (3) Pode ser necessrio testar lotes novos de caldo Mueller-Hinton usados para preparar tubos ou placas de macrodiluio para verificar se tm um contedo aceitvel de ctions. No caso do caldo MuellerHinton, ser necessrio determinar a CIM de gentamicina para Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e compar-la com a faixa esperada (Tabela 3). Se a CIM for baixa, o caldo pode precisar de suplemento de ctions, conforme indicado na Seo 7.1. Nos testes de daptomicina, os nveis de ctions de clcio no caldo devem ser de 50 mg/L. O gar Mueller-Hinton tambm pode ser testado para verificar se o teor de 28
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clcio apropriado. Isso feito mediante teste de disco difuso com Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, usando um disco de 10g de gentamicina, e com Staphylococcus aureus ATCC 25923, usando um disco de 30g de daptomicina, conforme descrito na Norma M2Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests do NCCLS. Para ser aceitvel, o dimetro do halo de inibio dever estar dentro da faixa de controle especificada para gentamicina ou daptomicina, conforme definido na verso mais recente do suplemento M100 Norma M2. (4) indispensvel manter registros dos nmeros dos lotes de todos os materiais e reagentes usados nos testes de sensibilidade. (5) O Haemophilus influenzae ATCC 10211 pode ser til como cepa adicional de controle de qualidade para verificar as propriedades de promoo de crescimento do HTM. Em especial, incentiva-se os fabricantes de HTM a usar Haemophilus influenzae ATCC 10211 como cepa de controle de qualidade. 12.6 Limites de Controle de Qualidade da CIM Os limites aceitveis de controle de qualidade da CIM para um nico teste de controle de qualidade (combinao droga nica/organismo nico) so apresentados nas Tabelas 3 e 3A. O desempenho geral do sistema de testes deve ser monitorado usando esses limites, por meio de testes de cepas apropriadas de controle, todo dia que o teste realizado ou, se se documentar desempenho satisfatrio (ver a Seo 12.7.2.1), os testes podem ser realizados toda semana (ver o prximo item). 12.7 Freqncia dos Testes de Controle de Qualidade (ver tambm o Apndice A) A opo de realizar testes semanais de controle de qualidade aplica-se apenas a testes rotineiros de CIM. Os testes de controle de qualidade devem ser realizados diariamente no caso de testes de CIM realizados infreqentemente. 12.7.1 Testes Dirios Quando os testes de controle de qualidade so efetuados todo dia, para cada combinao agente antimicrobiano/organismo, 1 dentre cada 20 resultados consecutivos poder estar fora da faixa aceitvel (com base em limites de confiana de 95%). Qualquer resultado que exceda o limite de 1 dentre 20 testes consecutivos exigir ao corretiva (ver Seo 12,9). 12.7.2Testes Semanais 12.7.2.1 Demonstrando Desempenho Satisfatrio para Converso da Freqncia dos Testes de Controle de Qualidade, passando de Dirios para Semanais Testar todas as cepas de controle pertinentes durante 20 a 30 dias consecutivos de teste e documentar os resultados. Para mudar a freqncia dos testes de controle de qualidade de dirios para semanais, no mximo 1 dentre 20, ou 3 dentre 30, CIMs, para cada combinao agente antimicrobiano/organismo, poder estar fora dos limites aceitveis de CIM que constam das tabelas 3 e 3A. 12.7.2.2 Implementando Testes de Controle de Qualidade Semanais Os testes de controle de qualidade podem ser realizados semanalmente aps ter documentado desempenho satisfatrio (ver a Seo 12.7.2.1)
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Realize testes de controle de qualidade uma vez por semana e sempre que qualquer reagente do teste (ex., um novo lote de caldo do mesmo fabricante) for mudado. Sempre que algum resultado dos testes semanais de controle de qualidade estiver fora da faixa aceitvel, indispensvel implementar ao corretiva (ver a Seo 12.9). Se um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou o caldo de um fabricante diferente for usado, o mesmo deve ser testado e documentado durante 20 ou 30 dias consecutivos de desempenho satisfatrio, antes de passar para uma freqncia semanal de testes de controle de qualidade. Alm disso, 20 ou 30 dias de testes sero necessrios sempre que houver uma mudana importante no mtodo de leitura dos resultados dos testes, como a converso de leitura visual das CIMs para leitura instrumental, ou uma mudana no tipo de painel usado (ex., mudana de pontos de corte para painis de CIM). Essas diretrizes tambm podem ser usadas nos sistemas de testes em que a CIM determinada usando trs, ou menos, diluies 2X adjacentes de um agente antimicrobiano. Para algumas drogas, os registros de controle de qualidade podem indicar a necessidade de testar com mais freqncia do que uma vez por semana, devido rpida degradao da droga (ver as Sees 6.2.1 e 7.2.2). 12.8 Freqncia dos Testes de Controle de Qualidade para os Testes de Triagem A freqncia dos testes de controle de qualidade de triagem a seguinte. O controle de qualidade das placas de triagem da vancomicina e dos aminoglicosdeo de alto nvel pode ser realizado semanalmente, contanto que esses testes sejam efetuados rotineiramente (ex., uma vez por semana, pelo menos) pelo laboratrio e os critrios de mudana da freqncia dos testes de controle de qualidade de dirio para semanal tenham sido atendidos. Pode ser necessria a realizao de testes de controle de qualidade de triagem todo dia que o teste realizado, se o teste no for executado rotineiramente (uma vez por semana, pelo menos) ou se o agente antimicrobiano for lbil (ex., teste de triagem de oxacilina gar para S. aureus). 12.9 Ao Corretiva 12.9.1 Resultado em Desacordo com o Controle Devido a Erro Evidente Se existir uma razo evidente para o resultado fora dos padres, incluindo: uso da cepa de controle errada; contaminao evidente da cepa ou o meio; ou uso inadvertido de condies ou temperatura de incubao erradas,
documente a razo do erro e teste novamente a cepa no dia em que o erro for observado. Se os resultados da retestagem estiverem dentro dos limites, no ser necessrio tomar qualquer outra medida corretiva. 12.9.2 Resultado em Desacordo com o Controle No Devido a Erro Evidente
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Se no existir uma razo evidente para o resultado fora dos padres, devero ser tomadas medidas corretivas imediatas. Teste a combinao agente antimicrobiano/organismo em questo no dia em que o erro for observado e acompanhe os testes durante cinco dias consecutivos. Documente todos os resultados. Se as cinco CIMs para a combinao agente antimicrobiano/organismo estiverem dentro das faixas aceitveis, conforme definido nas tabelas 3 e 3A, no ser necessrio executar ao corretiva adicional. Se quaisquer das cinco mensuraes de dimetro do halo estiver fora da faixa aceitvel, sero necessrias medidas corretivas (ver a Seo 12.9.2.2). Ser necessrio continuar a realizar testes dirios de controle de qualidade at solucionar o problema.
12.9.2.2 Ao Corretiva Adicional Quando a ao corretiva imediata no resolve o problema, provvel que seja um erro de sistema versus um erro aleatrio. As seguintes fontes de erros mais comuns devem ser investigadas para certificar-se de que: a soluo padro de turbidez no expirou, est sendo armazenada corretamente, atende aos requisitos de desempenho (ver Seo 5,1) e foi misturada corretamente antes de ser usada; todos os materiais usados esto dentro do prazo de validade e foram armazenados na temperatura correta; o incubador est na temperatura e atmosfera corretas; outros equipamentos usados (ex., pipetas) esto funcionando adequadamente; as placas foram armazenadas na temperatura correta; a cepa de controle de qualidade no foi mudada e no est contaminada; as suspenses de inculo foram preparadas e ajustadas corretamente; e
o inculo para o teste foi preparado a partir de uma placa incubada durante o perodo correto e no tem, em qualquer circunstncia, mais de 24 horas. Poder ser necessrio obter uma nova cepa de controle de qualidade (seja do congelador onde est armazenada ou de uma fonte confivel) e novos lotes de materiais (incluindo novas solues padro de turbidez), possivelmente de outros fabricantes. Se o problema parece estar relacionado com um determinado fabricante, ele deve ser contactado. Tambm til trocar cepas de controle de qualidade e materiais com outro laboratrio que use o mesmo mtodo, a fim de determinar a fonte dos problemas inexplicados no sistema de testes. At que o problema seja resolvido, poder ser necessrio usar um mtodo alternativo de teste.
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Quando o problema tiver sido resolvido, a fim de voltar ao esquema de testes semanais de controle de qualidade, ser imprescindvel documentar um desempenho satisfatrio durante outros 20 ou 30 dias consecutivos (ver a Seo 12.7.2.1). 12.10 Relatando os Resultados Quando Ocorrem Testes Fora do Padro Sempre que ocorrer um resultado fora do padro ou for necessrio tomar uma medida corretiva, ser preciso avaliar, cuidadosamente, se os resultados de patologia clnica devem ser relatados em base individual, avaliando se a fonte do erro, quando conhecida, pode afetar os resultados relevantes de patologia clnica. As opes a serem consideradas incluem suprimir os resultados de um determinado agente antimicrobiano; revisar, retrospectivamente, os dados do paciente ou os dados acumulados para padres pouco usuais; e usar uma metodologia alternativa, ou um laboratrio de referncia, at resolver o problema. 12.11 Verificao dos Resultados Clnicos Diversos parmetros dos testes so monitorados quando se adotam as recomendaes de controle de qualidade descritas nesta Norma. Entretanto, resultados aceitveis derivados dos testes de cepas de controle de qualidade no garantem resultados acurados nos testes de isolados clnicos. importante analisar todos os resultados obtidos, de todas as drogas testadas, num isolado clnico, antes de liberar os resultados. Isso inclui, sem se limitar a, assegurar-se de que: 1) os resultados de sensibilidade antimicrobiana so coerentes com a identificao do isolado; 2) os resultados de agentes individuais com uma classe especfica de drogas acompanham a hierarquia estabelecida pelos padres de atividade (ex., as cefalosporinas de terceira gerao so mais ativas do que as cefalosporinas de primeira e segunda gerao contra as Enterobacteriaceae); e 3) o isolado sensvel queles agentes para os quais ainda no foi documentada resistncia (ex., vancomicina e Streptococcus spp.) e para os quais o nico critrio interpretativo na Norma M100 o de sensvel. Os resultados pouco usuais ou incoerentes devem ser verificados checando os seguintes elementos: 1) erros de transcrio; 2) contaminao do teste (verificar novamente a pureza das placas, etc.); e 3) uso de placa, painel, ou carto defeituoso (ex., quebrado, preenchimento incompleto, etc.); e 4) resultados anteriores daquele paciente (ex., Esse paciente teve anteriormente um antibiograma incomum com o mesmo isolado?). Se no for possvel descobrir a causa do resultado incomum ou incoerente, ser necessrio repetir o teste de sensibilidade ou a identificao do microorganismo, ou ambos. til, algumas vezes, usar uma metodologia alternativa para repetir o teste. A Tabela 4 da Norma M100 fornece uma lista de resultados que vale a pena consultar. Cada laboratrio deve desenvolver suas prprias polticas de verificao de resultados incomuns ou incoerentes de testes de sensibilidade antimicrobiana. Essa lista deve enfatizar aqueles resultados que podem ter um impacto significativo no tratamento dos pacientes. 12.12 Outros Testes de Controle 12.12.1 Controle de Crescimento Cada placa de microdiluio em caldo, srie de macrodiluio em caldo e srie de placas de diluio em gar dever incluir um controle de crescimento em meio basal, sem agente antimicrobiano, a fim de avaliar a viabilidade dos organismos do teste. Em ambos os testes em caldo, o controle de crescimento tambm serve como controle de turbidez para a leitura dos pontos finais. 12.12.2 Controle de Pureza Aps a inoculao nos testes de diluio em gar ou caldo, esfrega-se cada inculo numa placa apropriada de gar. Essa placa dever ser incubada durante a noite, a fim de detectar culturas misturadas e fornecer colnias recm isoladas, se for necessrio repetir o teste. Esse passo especialmente importante no caso dos testes de diluio em caldo, nos quais as misturas de culturas passam desapercebidas com muita facilidade. 32
Volume 23 12.12.3 Controle de Inculo
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A contagem das placas realizada periodicamente usando inculos representativos, de maneira a assegurar que a soluo padro de McFarland 0,5 e os procedimentos de normatizao e diluio dos inculos continuam sob controle. Imediatamente aps a inoculao, retiram-se amostras, para fins de contagem de placas, do poo de controle de crescimento das placas de microdiluio, do tubo de ensaio de controle de crescimento nas sries de macrodiluio, ou (no caso de diluio em gar) de um poo selecionado aleatoriamente do bloco replicador de sementes. 12.12.4 Controle da Interpretao dos Pontos Finais A interpretao dos pontos finais deve ser monitorada periodicamente para minimizar possveis variaes na interpretao dos pontos finais dos testes de CIM entre os observadores. Todos os tcnicos de laboratrio que realizam esses testes devem realizar leituras independentes de um conjunto selecionado de testes de diluio. Os resultados devem ser registrados e comparados com os resultados obtidos por um tcnico experiente. Todas as leituras devero estar dentro de 1 incremento de concentrao 2X, uma da outra.24 13 Limitaes da Metodologia dos Testes de Diluio 13.1 Aplicao aos diversos Grupos de Organismos Os testes de diluio descritos neste documento foram padronizados para testes de patgenos de crescimento rpido, que incluem Staphylococcus spp., Enterococcus spp., as Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia e Bacillus anthracis e foram modificados para testar alguns organismos fastidiosos, como Haemophilus spp. (Tabela 2E), N. gonorrhoeae (Tabela 2F), estreptococos (Tabelas 2G e 2H) e Helicobacter pylori (Tabela 2J). 13.2 Resultados Enganadores Podem ocorrer resultados perigosamente enganadores quando certos agentes antimicrobianos so testados e relatados como sensiveis contra organismos especficos. Essas combinaes incluem as seguintes, embora possam no se limitar as mesmas: cefalosporinas de primeira e segunda gerao e aminoglicosdeos contra Salmonella e Shigella spp.;
todos os agentes antimicrobianos -lactmicos (excetuando-se oxacilina, meticilina e nafcilina) contra estafilococos resistentes a meticilina; cefalosporinas, aminoglicosdeos (com exceo dos testes para alto nvel de resistncia), clindamicina e trimetoprim-sufametoxazol contra enterococos; e cefalosporinas contra Listeria spp.
13.3 Surgimento de Resistncia Alguns agentes antimicrobianos esto associados com o surgimento de resistncia durante cursos prolongados de terapia. Assim, isolados inicialmente sensiveis podem se tornar resistentes nos trs ou quatro primeiros dias aps o incio da terapia. Isso ocorre com mais freqncia em Enterobacter, Citrobacter e Serratia spp. com as cefalosporinas de terceira gerao; em P. aeruginosa com todos os agentes antimicrobianos; e nos estafilococos com as quinolonas.
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Em certas circunstncias, justifica-se a repetio dos testes antes mesmo dos trs ou quatro dias iniciais, sendo que a deciso de retestar s exige conhecimento da situao especfica e da gravidade da condio do paciente. As diretrizes laboratoriais relativas repetio dos testes devem ser definidas aps consulta ao corpo mdico. 14 Testes de Triagem A confiabilidade dos testes de triagem para Staphylococcus aureus oxacilina-resistente e enterococos com alta resistncia aos aminoglicosdeos tm se mostrado comparvel dos testes padro na deteco de resistncia clinicamente significativa, tornando desnecessria a realizao de testes confirmatrios adicionais. As limitaes de outros testes de triagem, ex., para resistncia a vancomicina nos enterococos (Tabela 2D) e ESBLs em certas Enterobacteriaceae (Tabela 2A), sendo que a necessidade de confirmao ulterior apresentada nas tabelas individuais.
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Referncias
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Bibliogrficas
Ericsson HM, Sherris JC. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol Microbiol Scand. 1971;217(suppl B):1-90. Jorgensen JH, Turnidy JD, Washington JA. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al, eds. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC: American Society for Microbiology. 1999:1526-1543. Steers E, Foltz EL, Graves BS. An inocula replicating apparatus for routine testing of bacterial susceptibility to antibiotics. Antibiotic Chemother. 1959;9:307-311. Jones RN, Gavan TL, Thornberry C, et al. Standardization of disk diffusion and agar dilution susceptibility tests for Neisseria gonorrhoeae: Interpretive criteria and quality control guidelines for ceftriaxone, penicillin, spectinomycin, and tetracycline. J Clin Microbiol. 1989;27:2758-2766. Rousseau D, Harbec PS. Delivery of the 1- and 3-mm pins of a Cathra replicator. J Clin Microbiol. 1987;25:1311. Surprenant AM, Preston DA. Effect of refrigerated storage on cefaclor in Mueller-Hinton agar. J Clin Microbiol. 1985;21:133-134. Jorgensen JH, Redding JS, Maher LA, Howell AW. Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J Clin Microbiol. 1987;25:2105-2113. Barry AL, Jones RN, Gavan TL. Evaluation of the Micro-Media System for quantitative antimicrobial drug susceptibility testing. Antimicrob Agents Chemother. 1978;13:61-69. Thornsberry C, McDougal LK. Successful use of broth microdilution in susceptibility tests for methicillin-resistant (heteroresistant) staphylococci. J Clin Microbiol. 1983;18:1084-1091. Schwalbe RS, Stapleton JT, Gilligan PH. Emergence of vancomycin resistncia in coagulase-negative staphylococci. N Engl J Med. 1987;316:927-931. Kremery V Jr., Trupl J, Drogna L, Kukuckova E, Oravcova E. Nosocomial bacteremia due to vancomycin-resistant Staphylococcus epidermidis in four patients with cancer, neutropenia, and previous treatment with vancomycin. Eur J Clin Microbiol Inf Dis. 1996;115:259-261. Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother. 1997;40:135136. Centers for Disease Control and Prevention. Update: Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin - United States. MMWR. 1997;46:813-815. Tenover FC, Lancaster MV, Hill BC, Steward CD, Stocker SA, Hancock GA, et al. Characterization of staphylococci with reduced susceptibility to vancomycin and other glycopeptides. J Clin Microbiol. 1998;36:1020-1027. Centers for Disease Control and Prevention. Staphylococcus aureus resistant to vancomycin. MMWR. 2002;51(26):565-567.
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15
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16
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Centers for Disease Control and Prevention. Public Health Dispatch: Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. MMWR. 2002;51(40):902. Torres C, Tenolio C, Lantero M, Gastnares M, Baquero F. High-level penicillin resistance and penicillin-gentamicin synergy in Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemother. 1993;37:2427-2431. Murray BE. Vancomycin-resistant enterococci. Am J Med. 1997;102:284-293. Swenson JM, Clark NC, Ferraro MJ, Sahm DF, Doern G, Pfaller MA, et al. Development of a standardized screening method for detection of vancomycin-resistant enterococci. J Clin Microbiol. 1994;32:1700-1704. Jorgensen JH, McElmeel ML, Trippy CW. Comparison of inoculation methods for testing enterococci by using vancomycin screening agar. J Clin Microbiol. 1996;34:2841-2842. Jacoby GA, Medeiros AA. More extended-spectrum -lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1991;35:1697-1704. Swenson JM, Hindler JA, Peterson LR. Special tests for detecting antibacterial resistncia. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al, eds. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC: American Society for Microbiology. 1999:1563-1577. Doern GV, Tubert TA. Detection of -lactamase activity among clinical isolates of Branhamella catarrhalis with six different -lactamase assays. J Clin Microbiol. 1987;25:1380-1383. Barry AL, Braun LE. Reader error in determining minimal inhibitory concentrations with microdilution susceptibility test panels. J Clin Microbiol. 1981;3:228-230.
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Apndice A. Fluxogramas do Protocolo de Controle de Qualidade

Protocolo dos Testes Dirios de Controle de Qualidade para Diluio Aerbica
Testes dirios (Seo 12.7.1)
1 dentre 20 testes fora-da-faixa
> 1 dentre 20 testes fora-da-faixa
Continuar testes dirios
Ao Corretiva (Seo 12.9)
Causa do Erro Evidente Retestar no mesmo dia
Causa do erro no evidente Ao Corretiva Imediata (Seo 12.9.2.1) Retestar no mesmo dia e monitorar durante 5 dias consecutivos
Resultados na faixa continuar testes dirios
Resultados na faixa
Qualquer resultado fora da faixa
Continuar testes dirios
Ao Corretiva Adicional (Seo 12.9.2.2)
Investigar possveis fontes de erros
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Apndice A. (Continuao) Protocolo dos Testes Semanais de Controle de Qualidade para Diluio Aerbica
Demonstrar Desempenho Satisfatrio (Seo 12.7.2.1) 1 dentre 20 ou 3 dentre 30 resultados fora-da-faixa
Implementar testes semanais
Qualquer resultado fora-da-faixa
Ao Corretiva (Seo 12.9)
Causa do Erro Evidente Retestar no mesmo
Causa do erro no evidente
Resultados na faixa Resultados fora-da-faixa
Ao Corretiva Imediata (Seo 12.9.2.1)
Retomar testes dirios
Retestar no mesmo dia e monitorar durante 5 dias consecutivos
Resultados na faixa
Qualquer resultadoado fora-daf i
Retomar testes dirios
Ao Corretiva Imediata (Seo 12.9.2.2)
Investigar possveis fontes de erros
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Os procedimentos consensuais do NCCLS incluem o processo de recurso descrito, detalhadamente, na Seo 9.0 dos Procedimentos Administrativos. Para mais informaes, favor contactar os Escritrios Executivos ou visitar nosso website em www.nccls.org. Resumo dos Comentrios e das Respostas do Subcomit M7-A5: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved StandardFifth Edition Geral 1. Estamos testando um painel de agentes antimicrobianos contra Moraxella catarrhalis para pacientes na nossa rea. Temos a seguinte pergunta. Gostaramos de saber se seria possvel desenvolver normas interpretativas para Moraxella catarrhalis no futuro. Deveremos enviar, no futuro, apenas o valor da CIM no relatrio do paciente, mas no temos normas de interpretao (S, I, ou R) que possam ser anexadas. Existe algum mtodo que poderamos utilizar para interpretar esses resultados? Alm disso, deveremos enviar os resultados com um comentrio explicando que no um mtodo padro. Por favor, comente e fornea alguma informao que possamos utilizar. A atual recomendao na Seo 10 usar um teste de -lactamase para detectar resistncia a penicilina, ampicilina, and amoxicilina para M. catarrhalis. A necessidade de um mtodo de teste especfico e critrios interpretativos para esses e outros agentes contra este organismo uma questo que o subcomit espera focalizar no futuro.
Seo 3.1 2. Seguimos as diretrizes do NCCLS ao preparar nossos painis internos congelados de CIM, e isso tem sido relativamente fcil para nos uma vez que a potncia da droga fornecida pela empresa farmacutica claramente indicada no frasco. Vamos preparar uma srie de placas de CIM para as quais o patrocinador forneceu o p, mas a potncia no foi indicada. O certificado de anlise especifica o valor de ensaio (que um percentual). A empresa farmacutica nos recomendou que ajustssemos nossos clculos para teor de gua (~ 8%), mas isso no discutido na Norma M7 do NCCLS. Trata-se de alguma coisa que deveramos estar fazendo? Foi acrescentada uma explicao ao documento (ver a Seo 3.2) esclarecendo essa questo.
Sees 6.1 e 6.3 3. Estamos realizando testes in vitro de novos agentes antibiticos contra Streptococcus spp. usando os testes recomendados pelo NCCLS na Norma M7-A4. Temos tido uma correlao muito ruim entre nossa microdiluio, diluio em gar e os testes de sensibilidade Kirby Bauer. Tenho duas perguntas para o comit. a). Gostaria de saber o raciocnio histrico subjacente escolha, pelo comit, de LHB (sangue lisado de cavalo) como suplemento dos meios nos testes de microdiluio, porque a suplementao, para os meios para os testes Kirby Bauer de diluio em gar, sangue de carneiro. O sangue lisado de cavalo foi selecionado para o mtodo de microdiluio porque fornece um crescimento muito bom dos isolados clnicos de pneumococos e porque 1) tem sido usado 39
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durante bastante tempo, por vrios laboratrios com conhecimentos especializados nos testes de pneumococos; 2) constitui um meio claro; e 3) no contm os inibidores de trimetoprim ou sulfonamida presentes em sangue de outras origens. Aps tomar essa deciso, descobriu-se que o sangue de carneiro no parecia inibir a ao de sulfametoxazol-trimetoprim sobre os pneumococos, como acontecia com outros organismos e que havia uma correlao muito boa da CIM com os dimetros do halo quando se usava sangue de carneiro nos testes de disco difuso com pneumococos. b) Atualmente, o nico mtodo recomendado para a preparao do inculo de Streptococcus pneumoniae utilizando a suspenso padro de McFarland 0.5 a partir de uma placa de gar sangue de carneiro incubado durante a noite. No nosso laboratrio, esse mtodo produz, sistematicamente, um inculo ligeiramente mais fraco do que o esperado (aproximadamente 107 UFC/mL). O mtodo de cultura em caldo, recomendado para outros organismos, poderia ser uma alternativa vivel para obter o inculo apropriado? Sabemos que, com algumas cepas de pneumococos, a suspenso de McFarland 0,5 no produz a contagem pretendida de 1,5 x 108 UFC/mL. Entretanto, tanto com os pneumococos como com Haemophilus spp., a idade da placa a partir da qual o inculo foi preparado pode afetar as contagens finais (ver a Seo 7.3.1). As suspenses de inculo para os pneumococos devem ser preparadas a partir de uma placa de, no mximo, 18 a 20 horas. Preferimos o mtodo de preparao direta do inculo para os pneumococos, porque o crescimento desses organismos, assim como o de outros organismos fastidiosos, imprevisvel em meio de caldo.
Seo 7.3.1 4. Eu encontrei um possvel erro na Seo 7.3.1 (4) sob Testes de Diluio em Caldo. Aps repetidos clculos, acreditamos que a frase Aps homogeneizar, espalha-se uma alquota de 0,1mL . a presena de aproximadamente 50 colnias indicaria uma densidade de 5 x 105 UFC/mL incorreta. A alquota deveria ser 0,001mL (ou 1L) para se conseguir ~50 colnias. O subcomit tem usado o seguinte clculo. Se h 5 x 105 UFC/mL no poo da placa de CIM e fazemos uma diluio de 1:1000 nele (acrescentando 0,01mL a 10mL), teremos 5 x 102 UFC/mL (ou 500 UFC/mL). Se, a seguir, colocamos 0,1mL disso em BAP, deveremos ter ~50 colnias.
Sees 9.2.1 e 9.3 5. Eu aprecio o formato mais amigvel ao usurio destas normas adotadas recentemente. Por favor, estenda nossos cumprimentos ao subcomit pelo excelente trabalho de melhorar os textos das Normas M2 e M7. Nossa nica preocupao sobre esse tpico que a indstria no est atendendo as recomendaes do NCCLS fornecendo produtos fceis de obter (especialmente, automatizados) para lidar com as questes emergentes na rea de testes de sensibilidade antimicrobiana. Os exemplos de mudanas recentes para as quais no h solues de fcil obteno e implementao inclui ESBLs (M7-A5, Seo 9.3) e os enterococos resistentes penicilina/ampicilina (M7-A5, Seo 9.2.1). Estamos gratos que o NCCLS estuda minuciosamente e define essas questes, mas tambm nos sentimos frustrados pelo volume crescente de testes manuais, off-line, necessrio para atender essas recomendaes. So muitos os fatores que contribuem para esta situao, incluindo o tempo necessrio para se obter aprovao do FDA para novos produtos e mtodos. Esse no verdadeiramente um problema do NCCLS, mas uma realidade em um ambiente de laboratrio mdico que muda com muita rapidez.
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As aes consideradas timas so incorporadas a nossos documentos no formato de recomendaes; entretanto, evidente que, medida que surgem novos mecanismos de resistncia, as recomendaes em vigor podem deixar de ser timas e, ento, preciso elaborar novas recomendaes complementares para os testes. Sempre que possvel, continuaremos a refinar os mtodos bsicos para minimizar a necessidade de testes adicionais.
6. Na Norma M7-A5, Seo 9.2.1 (M2-A7, Seo 6.5.1), o NCCLS recomenda os testes de CIM de E. faecium (recuperado de sangue ou LCR) com ampicilina e penicilina. A finalidade testar a sensibilidade da sinergia potencial com os aminoglicosdeos. No encontro isso na Norma M100-S11. Ainda recomendado?
Na Norma M7-A6, continuamos a sugerir que, para cepas de E. faecium resistentes penicilina ou ampicilina, pode ser apropriado determinar as CIMs reais, uma vez que cepas com CIMs 64 g/mL com penicilina, ou 32 g/mL com ampicilina, podem responder a tratamento com um -lactmico + um aminoglicosdeo na ausncia de resistncia de alto nvel aos aminoglicosdeos. Entretanto, uma vez que se trata de passo opcional, que pode valer a pena em raras circunstncias, quando solicitado pelo especialista em doenas infecciosas que trata de um paciente acometido por infeco grave, acreditamos que apropriado mencion-lo apenas no texto, e no nas tabelas. O teste pode ser realizado usando um mtodo de CIM baseado em diluio em caldo ou gar.
Seo 12.7.2.2 7. Na tentativa de reduzir os custos laboratoriais sem comprometer a ateno aos pacientes, tenho revisado os requisitos de controle de qualidade para os testes de sensibilidade. Utilizamos atualmente o sistema VITEK. Perguntei ao departamento de controle de qualidade de Bio-Merieux o seguinte: Vocs interpretam o diluente salino como um reagente componente do seu sistema? Atualmente, compramos soluo salina preparada de Bio-Merieux para uso com o sistema VITEK e, com freqncia, recebemos solues de diversos lotes, conforme atestado pelos nmeros de lote. Me disseram que eles no tm essa recomendao, mas que eu deveria verificar a documentao do NCCLS. Dependendo de como se interpreta a Norma M7-A5 do NCCLS, pgina 20 (Seo 12.7.2.2): Realizar testes de controle de qualidade uma vez por semana e sempre que for mudado qualquer reagente do teste, o laboratrio poder estar fazendo controle de qualidade duas ou trs vezes por semana. No nosso laboratrio, queremos realizar os teste de maneira apropriada e correta, mas sem trabalho ou despesas extras. Quando comeamos a usar o sistema VITEK, considervamos que a soluo salina era um reagente componente, mas gostaria que isso fosse esclarecido por aqueles que pesquisam e escrevem as diretrizes dos testes. Gostaria que me esclarecessem essa questo. Consideramos a soluo salina e/ou a gua utilizada para preparar o inculo como um reagente componente que no precisa de testes de um lote para outro. Entretanto, o risco tanto com gua como com soluo salina a contaminao, especialmente quando se usa dosadores de repetio para medir as alquotas na preparao do inculo. Nos testes de CIM, recomenda-se verificar a pureza usando um meio no-seletivo, e, ento, pode se eliminar qualquer suspeita de contaminao cada vez que o teste realizado.
Seo 12.7.2.2 8. Aps a instituio ter estabelecido que o CQ pode ser realizado semanalmente, usando os protocolos de teste que prevem 30 dias consecutivos de testes, eu acredito que excessiva a instituio se ver forada a realizar testes durante 30 dias consecutivos com vrias cepas quando uma nova droga, ou painel incorporado, sendo que a metodologia dos testes permanece inalterada. Por exemplo, usamos o instrumento Vitek para os testes de CIM. Realizamos testes de CQ durante 30 dias para trs tipos diferentes de painel de CIM, com mltiplas cepas de CQ, conforme recomendando e no tivemos
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qualquer falha de CQ. Conforme as atuais diretrizes, se quisermos selecionar ou atualizar um painel, deveremos executar os testes de CQ, novamente, com mltiplas cepas. Eu recomendo que sejam realizados testes de CQ num esquema de cinco ou sete dias consecutivos, ao invs de 30 dias, se o painel for mudado mais o mtodo permanecer inalterado. Meu raciocnio o seguinte: 1) o fabricante j realizou muitos testes de CQ nos painis antes de coloc-los no mercado; 2) a instituio de patologia clnica j realizou P&D e testes de CQ durante 30 dias e, portanto, tem a experincia necessria; 3) os laboratrios, em geral, so constantemente pressionados a cortar custos, dos quais CQ excessivo representa um componente substancial; e 4) os painis mudam com freqncia devido disponibilidade de drogas e mudanas nas recomendaes. Isso me parece razovel porque, nos meus 20 anos realizando testes de CIM, nunca tive uma falha de CQ de 30 dias com os diversos mtodos utilizados. prudente executar testes de CQ durante 30 dias toda vez que se muda o mtodo, mas, uma vez estabelecido, eu acredito ser excessivo testar durante 30 dias quando cinco ou sete dias consecutivos de testes confirmariam o que o fabricante j provou. Embora as recomendaes originais de controle de qualidade baseavam-se em pressupostos estatsticos, e no em dados reais, relutamos em mud-las sem estudos vlidos ou outro elemento de sustentao mostrando que um esquema de testes menos freqentes demonstraria se o desempenho adequado. Com base nos atuais critrios de desempenho aceitvel de controle de qualidade (Seo 12.7), acrescentou-se uma opo de protocolo com 20 dias de testes, para poder passar de testes de controle de qualidade dirios para semanais. Essa opo inclui um protocolo simplificado com limites aceitveis de confiana. O subcomit avaliar enfoques alternativos no futuro, visando a simplificar ainda mais o controle de qualidade. Por enquanto, acreditamos que acrescentar uma nova droga (no caso de mudana ou atualizao de um painel) uma circunstncia que justifica testes durante 20 ou 30 dias.
Seo 12.9.1 9. A parte desta recomendao que acredito excessiva diz respeito aos testes de CQ durante cinco dias consecutivos recomendados no caso de uma droga falhar no CQ sem razo aparente. Eu recomendo que o painel/droga seja repetido imediatamente e, se estiver O.K., no haver necessidade de qualquer ao ulterior. Meu raciocnio o seguinte: 1) se podemos errar trs vezes durante 30 dias consecutivos de testes de CQ, ento parece incoerente presumir que no teremos um erro aleatrio ocasional com os testes semanais; 2) na minha experincia com a ocorrncia ocasional de uma droga fora-do-controle, a repetio sempre foi aceitvel; e 3) diminuir os custos eliminando desperdcio cada vez mais importante para os laboratrios. Na minha proposta de repetir o teste uma s vez, ao invs de cinco dias consecutivos de testes, no caso de o teste repetido no se encaixar na faixa aceitvel, esse teste repetido seria seguido por um protocolo de cinco dias de testes, conforme delineado no documento. Conforme colocamos na resposta ao comentrio 7, relutamos em mudanas as recomendaes sem dados suficientes para sustentar a mudana.
Tabelas 10. A formulao oral de cefuroxima fornece concentraes sricas e tissulares mais baixas do que a formulao parenteral. De maneira que, para os organismos gram-negativos, os pontos de corte para as formulaes orais so mais baixos do que para as formulaes parenterais. Isso est certo. O que eu no entendo, e acredito que esteja errado na Norma M100-S10 (M7), Tabela 2G, que os pontos de corte da cefuroxima oral sejam mais altos (1 e 4g) do que os da cefuroxima parenteral (0,5 e 2g), 42
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no caso dos pneumococos. Algum poderia verificar esse item? Qualquer erro tem conseqncias abrangentes, uma vez que a formulao oral entendida, em geral, e o risco de seleo de resistncia aumenta. O ponto de corte da sensibilidade a cefuroxima sdica (parenteral) para Streptococcus pneumoniae mais baixo do que o valor da cefuroxima axetil (oral) porque a cefuroxima foi aprovada pelo FDA para o tratamento da meningite pneumoccica. As concentraes menores da droga atingidas no fluido cerebroespinhal (LCR), comparadas com as concentraes sricas, exigem ponto de corte mais baixo.
11. Eu tenho uma pergunta relativa aos atuais pontos de corte da gentaminicina para Pseudomonas. Atualmente, uma CIM =4 para gentamicina deve ser lida como sensvel e =8 como intermediria. Entretanto, considerando a dosagem de gentamicina praticada, se o paciente estiver recebendo a dosagem tradicional (ex., 1-1,5mg/kg, a cada 8-12h), quase nunca sero alcanadas concentraes superiores 6-9g/mL e, mais realisticamente, essas concentraes devero variar de 5 a 7g/mL. Essas concentraes sricas so apenas 1-2X a CIM do organismo. Com a dose diria nica (7mg/kg), os picos de gentamicina ficam, em geral, entre 13 e 20g/mL; melhor, mas ainda longe do ideal para um organismo com uma CIM de 4. evidente que nem todos os pacientes so candidatos dose diria nica de gentamicina (i.e., idosos, baixa taxa de depurao (clearance) de creatinina, hipermetablicos, etc.), pelo que preciso administrar dosagens tradicionais a esses pacientes. Como vocs sabem, a meta subjacente s doses dirias nicas de aminoglicosdeos maximizar a farmacocintica e farmacodinmica dessas drogas, atravs da maximizao da razo pico: CIM, conseguindo, assim, uma eliminao melhor e mais rpida do microorganismo, com uma toxicidade potencialmente menor. Em geral, acredita-se que a melhor maneira de se conseguir esse efeito atingir um pico de 8-10X o valor da CIM. Para um organismo com CIM =4, isso no nem remotamente possvel com segurana. Minha preocupao, portanto, que esses pontos de corte de CIM (4 e 8) no refletem as questes prticas relativas s dosagens de gentamicina (e tobramicina) na prtica clnica. Eu estou interessado em seus comentrios relativos a essa questo e se isso j foi, ou no, discutido, ou se pontos de corte alternativos tm sido propostos. A farmacodinmica no o nico critrio usado pelo NCCLS para desenvolver os critrios de interpretao. Um ponto mais baixo para gentamicina dividiria a distribuio da populao de CIMs com Pseudomonas aeruginosa. Pequenos fatores tcnicos, sem controle, poderiam, ento, determinar se um organismo deveria ser, ou no, considerado sensvel. Embora os atuais pontos de corte sejam adequados para monoterapia de infeces do trato urinrio, recomendamos terapia combinada, com doses mximas, no caso de infeces graves por Pseudomonas (ver a Tabela 2B, comentrio 4, da Norma M100).
12. Eu estou procurando diretrizes para a freqncia tima de repetio de testes de sensibilidade de isolados de bactrias provenientes de um mesmo paciente e fonte. Uma nota de rodap nas diretrizes da M100-S9 explica que duas combinaes organismo/antimicrobiano (Staphylococcus spp. versus quinolonas e Enterobacter, Citrobacter e Serratia spp. versus cefens) podero exigir a repetio dos testes de sensibilidade trs ou quatro dias aps o incio da terapia, mas no fornece qualquer outra recomendao geral para a repetio dos testes de sensibilidade. Existe alguma outra informao disponvel sobre essa questo? Conforme colocado na Seo 13.3, Alguns agentes antimicrobianos esto associados com o surgimento de resistncia durante terapia prolongada. Portanto, isolados inicialmente sensveis podem se tornar resistentes aps o incio da terapia. Isso ocorre nos trs ou quatro dias aps o incio da terapia, e mais freqentemente em Enterobacter, Citrobacter e Serratia spp. com as 43
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cefalosporinas de terceira gerao; em P. aeruginosa com todos os agentes antimicrobianos; e nos estafilococos com as quinolonas. Relutamos em explicitar o nmero de dias antes de repetir o teste, exceto quando sabemos que, se o teste no for repetido, poder ocorrer erro mdico grave. Em certas circunstncias, a repetio do teste justifica-se antes dos trs ou quatro dias, com base na situao especfica e na gravidade da condio do paciente. As diretrizes laboratoriais sobre quando repetir testes de sensibilidade devem ser estabelecidas aps consultas ao corpo mdico. Na gerao de antibiogramas, os resultados dos testes repetidos devem ser excludos, conforme recomendado na Norma M39Analysis and Presentation of Cumulative Antimicrobial Susceptibility Test Data do NCCLS. 13. Escrevo em relao ao ponto de corte da CIM de ciprofloxacina contra S. typhi. Conforme as recomendaes do NCCLS, 1g/mL significa sensvel e 4g/mL, resistente. Seguimos esse critrio nos relatrios sobre a CIM de ciprofloxacina. Temos isolado cepas de S. typhi com CIMs de at 0,5g/mL, em pacientes que no respondem clinicamente ao tratamento com ciprofloxacina, e os clnicos nos dizem que a febre s diminui aps sete dias de tratamento. Essa tem sido a experincia de vrios centros na ndia e as cepas de alguns desses centros, que nos foram enviadas, tambm tm uma CIM 1g/mL. O tamanho do halo correspondente no teste de disco difuso de 21 a 22mm. Temos monitorado essa elevao da CIM no nosso centro. Devemos continua com o ponto de corte da CIM conforme recomendado? Quando esses pontos de corte foram desenvolvidos inicialmente, a resistncia a fluoroquinolona ainda no tinha sido documentada. Tambm estamos cientes de vrios relatrios, na literatura, relativos a fracassos clnicos em que os atuais pontos de corte so usados para detectar resistncia a fluoroquinolona em Salmonella. O subcomit dever em breve revisar os dados existentes sobre essa questo. Uma vez que temos dados insuficientes para mudar os atuais pontos de corte nesta oportunidade, acrescentamos a seguinte sugesto Tabela 2A (comentrio 13), que diz o seguinte: As cepas de Salmonella com resultados do teste de sensibilidade classificando-as como sensveis a cido nalidxico podem estar associadas com fracasso clnico ou resposta demorada em pacientes de salmonelose extra-intestinal tratados com fluoroquinolona. Deve-se considerar a realizao de testes de isolados extra-intestinais de Salmonella para resistncia ao cido nalidxico.
14. Qual o raciocnio subjacente aos diferentes pontos de corte de levofloxacina, gatifloxacina e moxifloxacina no caso de Streptococcus pneumoniae? Em geral, moxifloxacina e gatifloxacina tm CIMs mais baixos do que levofloxacina, conforme demonstrado nos dados do estudo SENTRY (Clinical Infectious Diseases 2001; 32(Suppl 2): S81-93). Atualmente, o NCCLS no estabelece pontos de corte para ciprofloxacina contra Streptococcus pneumoniae. Eu acredito que os atuais pontos de corte levam os clnicos a concluir que todas as fluoroquinolonas so essencialmente equivalentes contra Streptococcus pneumoniae. Para cada uma das trs quinolonas, os pontos de corte citados foram estabelecidos com base numa anlise da atividade in vitro do respectivo agente, incluindo sua atividade contra pneumococos com resistncia bem caracterizada, devida a mutao nos genes que afetam as enzimas-alvo girase e topoissomerase nessa classe. Alm disso, avaliou-se, independentemente, a farmacocintica e a farmacodinmica de cada agente, incluindo a relao entre a rea sob a curva e a concentrao inibitria mnima (AUC/CIM) das concentraes livres da droga para cada agente. Por ltimo, analisaram-se os dados de ensaios clnicos descrevendo as taxas de respostas clnica e bacteriolgica para cada agente. Assim, cada droga foi avaliada individualmente, com base em dados especficos para o respectivo agente, e no como um ensaio comparativo dos trs produtos. O NCCLS no estabeleceu pontos de corte para a ciprofloxacina, devido, em parte, ao fato de que os especialistas que tratam infeces por pneumococos no defendem seu uso teraputico nessas infeces, e, tambm, porque no faz
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parte da relao de drogas recomendadas para o tratamento de pneumonia adquirida na comunidade de quaisquer das diretrizes publicadas. 15. Estamos nos debatendo com algumas questes relativas os testes de referncia de sensibilidade antimicrobiana das espcies de Streptococcus, incluindo S. pneumoniae. A Norma M7-A5 do NCCLS, na Seo 8, recomenda que os testes de sensibilidade antimicrobiana sejam realizados usando caldo Mueller-Hinton ajustado por ction e suplementado com sangue lisado de cavalo. Entretanto, o sangue lisado de cavalo pode ser acrescentado quando se preparam os painis para o teste de sensibilidade antimicrobiana antes de congel-los, ou quando os painis so inoculados (mtodo de diluio em microcaldo). Gostaramos de fazer as seguintes perguntas: 1) H alguma dvida ou impacto nos resultados dos testes de sensibilidade antimicrobiana devido ao acrscimo de sangue lisado de cavalo aos paneis dos testes de sensibilidade antimicrobiana? 2) Ambos os mtodos de acrescentar sangue lisado de cavalo ao caldo atendem as atuais diretrizes do NCCLS que definem os painis de referncia para uso nos testes de sensibilidade antimicrobiana para Streptococcus? Foi acrescentada uma explicao sobre essa questo (ver a Seo 7.1).
16. Sabemos que existem normas em vigor para Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia e Acinetobacter spp., mas no estamos cientes, entretanto, de qualquer norma disponvel para quaisquer dos outros membros desse grupo. Temos considerado vrias opes para os testes de sensibilidade desses organismos incomuns, a saber: I. Declarar que no h normas existentes e que no possvel realizar testes de sensibilidade. Ii. Realizar um teste de diluio em caldo para obter a CIM e relatar os resultados sem interpretao S, I, R, incluindo um comentrio no sentido de que no existe referncia validada vigente para os testes e que os dados de sensibilidade no esto necessariamente correlacionados com a atividade clnica. Iii. Enviar o isolado a um laboratrio de referncia. S existe uma metodologia dos testes de disco difuso para bacilos gram-negativos, no fermentadores de glicose e no fastidiosos no caso de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Alm disso, acrescentou-se um comentrio geral Tabela 2B de que possvel realizar testes de isolados de P. aeruginosa de pacientes com fibrose cstica, mas que pode ser necessrio um perodo de incubao de at 24 horas. O subcomit est trabalhando em recomendaes para os testes de S. maltophilia e B. cepacia mediante CIM e disco difuso. No meio tempo, esses organismos (e outros nesse grupo) podem ser testados usando um mtodo de CIM e os resultados, interpretados usando os pontos de corte fornecidos na Norma M7, Tabela 2B, para outros organismos no Enterobacteriaceae (ver o comentrio geral 1, nessa tabela).
17. Estamos realmente preocupados com a faixa de CIM da ofloxacina para Salmonella typhi. Conforme as diretrizes do NCCLS para Enterobacteriaceae, o resultado deveria ser 2g/mL para que o microorganismo seja considerado sensvel. Mas h evidncia de que mesmo quando o resultado 0,25 ou 0,5g/mL, esse agente antimicrobiano no a droga de escolha, uma vez que os pacientes no respondem. Qual a sua sugesto a esse respeito? Alm disso, apropriado checar a sensibilidade ao cido nalidxico de isolados sangneos de Salmonella typhi como verificao cruzada da sensibilidade a ofloxacina? E se o isolado for resistente ao cido nalidxico e sensvel a ofloxacina?
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O subcomit espera tratar dessa questo no futuro. Por favor, reporte-se resposta ao comentrio 13.
18. Tenho algumas perguntas sobre as informaes apresentadas na Norma M100-S11. Na Tabela 2G da Norma M2-A7 (Zone Diameter Interpretive Standards and Equivalent MIC Breakpoints for Streptococcus pneumoniae), recomenda-se incubar a 35 C, em CO2 a 5%, durante 20-24 horas. Na Tabela 2G da Norma M7-A5 (MIC Interpretive Standards for S. pneumoniae), recomenda-se incubar a 35 C, em ar ambiente, durante 20-24 horas. Eu uso tiras de E-test nas determinaes da CIM para S. pneumoniae e, com freqncia, coloco os discos de antibitico na mesma placa. Essa prtica aceitvel, uma vez que as atmosferas recomendadas para os testes de CIM e disco difuso so diferentes? Eu realmente no gosto da idia de montar duas placas diferentes para cada CQ e isolado clnico quando preciso fazer tanto os testes de CIM como os de disco difuso. Nos anos que levo fazendo as determinaes de CIM com o Etest para S. pneumoniae, sempre incubei o CQ e as cepas do paciente em CO2 a 5%. Alis, a empresa AB Biodisk (fabricante das tiras de Etest) recomenda a incubao de isolados de S. pneumoniae em CO2 a 5%. Eu no tenho tido problemas de resultados de CQ fora das faixas aceitveis. As recomendaes do fabricante prevalecem sobre as recomendaes do NCCLS? Poderia me fornecer informaes sobre as diferenas nas recomendaes relativas a incubao? Nas tabelas do NCCLS, os critrios de interpretao para S. pneumoniae foram desenvolvidos usando incubao em CO2 para os testes de disco difuso e ar ambiente para os de microdiluio em caldo. A correlao entre as CIMs e os dimetros do halo basearam-se nesses testes. No se fez a correlao da diluio em gar com o disco difuso para S. pneumoniae quando esses critrios de interpretao foram estabelecidos. Testar com CO2 pode mudar os resultados para certas drogas, ex., fluoroquinolonas, macroldeos e tetraciclinas. A questo de como isso pode afetar os testes realizados por mtodos diferentes dos mtodos de referncia do NCCLS deve ser tratada pelos fabricantes desses mtodos. A liberao dos sistemas comerciais pelo FDA indica que a agncia concluiu que os dispositivos comerciais fornecem resultados de sensibilidade que so substancialmente equivalentes aos resultados gerados usando os mtodos de referncia do NCCLS para os organismos e agentes antimicrobianos descritos na literatura inserida no pacote dos agentes antimicrobiano aprovado pelo FDA.
19. Observo que vocs recomendam apenas testes de CIM por diluio para Helicobacter pylori. Vocs pretendem elaborar diretrizes sobre testes de sensibilidade por disco difuso ou Etest? O Grupo de Trabalho PHLS para Helicobacter do Reino Unido deseja desenvolver orientao para testes de disco e estamos revisando a literatura. Gostaramos de mencionar as recomendaes do NCCLS. Se estiverem interessados nas nossas opinies teremos o maior prazer em compartilh-las com vocs. O teste de diluio em gar para H. pylori foi desenvolvido como um mtodo de referncia que pudesse ser usado em ensaios clnicos, de maneira que os resultados desses ensaios pudessem ser avaliados com maior preciso durante o processo de aprovao de novas drogas pelo FDA. No planejamos desenvolver um teste de disco para Helicobacter, o que, de toda forma, poderia ser difcil devido natureza fastidiosa do organismo. Uma vez que o Etest um sistema comercial, no podemos recomendar testes usando esse mtodo.
20. So notveis as mudanas recentes nas categorias de sensibilidade em funo dos pontos de corte de ceftriaxona, cefotaxima e cefepima na Norma M100-S12, Tabela 2G M7-CIM. Entretanto, ainda restam vrias perguntas importantes. Eu gostaria de algum feedback e comentrios sobre as seguintes questes. (a) Por que os pontos de corte da penicilina G permaneceram inalterados? 46
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Os pontos de corte da CIM da penicilina para S. pneumoniae foram estabelecidos muitos anos atrs, visando, principalmente, a orientar o tratamento da meningite pneumoccica, no qual CIMs acima de 0,1g/mL prediziam fracasso clnico. Um resultado sensvel penicilina, seja com teste de CIM seja mediante o uso de teste de triagem por disco de oxacilina, indica que a cepa de pneumococo continua essencialmente sensvel a todos os agentes beta-lactmicos. Portanto, o valor preditivo de um resultado sensvel penicilina usando os atuais pontos de corte tem utilidade considervel, especialmente em laboratrios onde no possvel realizar testes de CIM. Ao longo de vrias reunies, os membros do NCCLS expressaram sua preocupao de que um segundo conjunto de pontos de corte de CIM para penicilina poderia levar algumas pessoas a acreditar que um resultado sensvel de 1g/mL indicaria ainda ampla sensibilidade a todos os beta-lactmicos, o que seria incorreto. Alm disso, uma reviso detalhada dos dados de PK/PD e das simulaes de Monte Carlo sugeriu que um ponto de corte de 1g/mL, de sensvel, no teria suporte, embora dados clnicos limitados sugerem que pacientes com pneumonia pneumoccica por tais cepas tiveram respostas favorveis. A perda do valor preditivo de um resultado de sensvel a penicilina, a confuso quanto aplicao de um segundo conjunto de pontos de corte e os dados de PK/PD convenceram o subcomit a manter o conjunto de pontos de corte e elaborar a nota de rodap 5 como a melhor orientao possvel para os mdicos.
(b) Qual a base lgica para permitir a amoxicilina e amoxicilina-clavulanate o luxo de ter pontos de corte que so uma diluio mais alta do que os dos agentes parenterais?
Favor reportar-se resposta ao comentrio 10.
(c) Como o comit recomenda relatar S. pneumoniae resistente penicilina? Deve-se recomendar cefotaxime e ceftriaxone para substituir a penicilina ao relatar resistncia?
No. Os resultados dos testes de cada produto devem ser relatados conforme delineado na Tabela 2G.
(d) Poderia o comit explicar por que levofloxacina tem pontos de corte que so uma diluio mais alta do que gatifloxacina e moxifloxacina? Os atuais pontos de corte levam os clnicos a pensar que a potncia das fluoroquinolonas mais novas so equivalentes. Eu apreciaria qualquer esclarecimento que pudessem me prestar.
Favor reportar-se resposta ao comentrio 14.
21. Com as recentes mudanas nas normas de interpretao para Streptococcus pneumoniae (Tabela 2G), as cefalosporinas de terceira gerao tm CIMs diferentes dependendo de a amostra ser originria de LCR ou de outros stios corpreos. No caso de S. pneumoniae, existem alguns problemas potenciais para os laboratrios, para os quais deveriam ser alertados. Tivemos um paciente de cinco anos de idade com esmagamento da face; dois dias mais tarde, apresentou estado mental alterado. Como a administrao de agentes antimicrobianos foi iniciada antes de se realizar a puno lombar, as culturas sangneas produziram S. pneumoniae. Cinco horas mais tarde, quando a puno lombar foi realizada, era evidente que o paciente estava realmente com meningite, mas as culturas e as coloraes gram eram negativas. Pelo Etest, a CIM para cefotaxime era 1. Minha preocupao que um laboratrio, no futuro, relate tal resultado como sensvel e que o clnico no esteja ciente dos valores especficos de CIM no Etest e de seu significado, e trate esse paciente com cefotaxima como droga nica para sua meningite, baseado na sensibilidade de um isolado de sangue perifrico. Nesse caso, e provavelmente em muitos outros, administram-se as drogas aos pacientes antes de se obter um espcime de LCR. Nesse caso, a cultura era negativa,
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embora o paciente estava, claramente, com meningite. Se o organismo tivesse sido cultivado com base num espcime de LCR, teria sido considerado de resistncia intermediria, e a terapia do paciente teria includo cefotaxima e vancomicina. Em todo o pas, h hospitais que carecem de especialista em doenas infecciosas. Esses hospitais precisam de algum tipo de alerta, nos formulrios dos relatrios, chamando a ateno dos clnicos sobre essa questo. Estamos implementado esse tipo de alerta no nosso hospital, e acreditamos que o sistema de comunicao atravs do NCCLS poder ser a melhor maneira de disseminar estas informaes.
Durante o perodo em que o subcomit discutiu a propriedade de criar novos pontos de corte para pacientes que no tm meningite, reconhecemos que o pessoal dos laboratrios de microbiologia no sabem, com freqncia, se o paciente tem, ou no, meningite, exceto quando se trata de esfregao ou cultura positiva de LCR. Portanto, a nova Norma do NCCLS recomenda que os laboratrios relatem as interpretaes de meningite apenas para os isolados de LCR, mas relatem ambas as interpretaes para todos os outros espcimes, de maneira que os clnicos possam tomar a deciso correta para cada paciente. Os comentrios 7 a 10 da Tabela 2G fornecem orientao adicional para uso com esses novos pontos de corte. Reconhecemos que implementar novos pontos de corte poder trazer algumas dificuldades na comunicao acurada de resultados individuais de sensibilidade. Acompanharemos de perto essas preocupaes durante o prximo ano. Pretendemos facilitar a ateno aos pacientes oferecendo critrios de interpretao clinicamente relevantes para os -lactmicos, de maneira a evitar a percepo de que so necessrios agentes potencialmente mais txicos ou mais caros para infeces que no so do SNC, como a pneumonia.
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Publicaes Afins do NCCLS*

GP2-A4 Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals; Approved GuidelineFourth Edition (2002). Este documento fornece diretrizes para o desenho, a preparao, a manuteno e o uso de manuais de procedimentos tcnicos (seja em material impresso, seja em formato eletrnico) para uso nos laboratrios de patologia clnica. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved StandardEighth Edition (2003). Este documento descreve as tcnicas recomendadas atualmente para testes de sensibilidade por disco difuso e os critrios para os testes de controle de qualidade. Protocols for Evaluation Dehydrated Mueller-Hinton Agar; Approved Standard (1996). Este documento inclui procedimentos para a avaliao de lotes de produo de gar Mueller-Hinton, bem como o desenvolvimento e a aplicao de meios de referncia. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved StandardFifth Edition (2001). Este documento fornece mtodos de referncia para a determinao das concentraes inibitrias mnimas (CIMs) das bactrias anaerbicas pelos mtodos de macrodiluio em caldo, microdiluio em caldo e diluio em gar, alm de tabelas interpretativas e de controle de qualidade. Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria and Quality Control Parameters; Approved GuidelineSecond Edition (2001). Este documento trata dos dados requeridos e recomendados necessrios para a seleo de normas interpretativas e diretrizes de controle de qualidade apropriadas para os novos agentes antimicrobianos. Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections; Approved GuidelineSecond Edition (2001). Com base nos regulamentos dos Estados Unidos, este documento fornece orientao relativa ao risco de transmisso dos vrus da hepatite e do vrus da imunodeficincia humana em qualquer ambiente laboratorial; precaues especficas para a preveno da transmisso laboratorial de infeces transmitidas pelo sangue a partir de instrumentos e materiais de laboratrio; assim como recomendaes sobre a conduta em casos de exposio a microorganismos transmitidos pelo sangue. Terminology and Definitions for Use in NCCLS Documents; Approved Standard (1998). Este documento fornece definies padro para uso com as normas e diretrizes do NCCLS e para a apresentao, para aprovao, de mtodos e materiais de referncia ao National Reference System for the Clinical Laboratory.
M2-A8
M6-A
M11-A5
M23-A2
M29-A2
NRSCL8-A
Documentos propostos e tentativos esto sendo apresentados atravs do processo consensual do NCCLS; portanto, os leitores devero se reportar s edies mais recentes.
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M7-A6 Vol. 23 No. 2 Substitui a Norma M7-A5 Vol. 20 No.

M7-A6 ISBN 1-56238-486-4 ISSN 0273-3099

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Nmero 2 (em 1o de outubro de 2002)

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Preparao do Inculo para Testes de Diluio .......................................................................................9 5.1 5.2 5.3

Testes de Diluio em Caldo (Macrodiluio e Microdiluio).............................................................14 7.1 7.2 7.3

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Organismos Problema ............................................................................................................................21 9.1 9.2 9.3

Testes de -Lactamase ...........................................................................................................................24 10.1 10.2

Relatrios dos Resultados de CIM ........................................................................................................24 11.1 11.2 11.3

Limitaes da Metodologia dos Testes de Diluio ..............................................................................33 13.1 13.2 13.3

Testes de Triagem .................................................................................................................................34

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Resumo das Principais Mudanas neste Documento

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Enfoque de Sistema de Qualidade

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Laboratrio de Patologia Clnica

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Indicaes para a Execuo de Testes de Sensibilidade

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Volume 23 Assim, os 182,6mg de p antimicrobiano sero dissolvidos em 107,0mL de diluente.

Preparao de Solues Padro

Nmero de Concentraes Testadas

Seleo dos Agentes Antimicrobianos para Testes e Relatrios de Rotina

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Volume 23 4.2.1.3 Cefens (incluindo Cefalosporinas)

Sugesto de Diretrizes para Testes e Relatrios de Rotina

Preparao do Inculo para Testes de Diluio

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Mtodo de Suspenso Direta das Colnias

Teste de Diluio em gar

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Preparao da Diluio em Placas de gar

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Volume 23 6.2.3 Freqncia do Controle de Qualidade

Diluio de Inoculao em Placas de gar

Incubao e Diluio em Placas de gar

Determinao dos Pontos Finais nos Testes de Diluio em gar

Testes de Diluio em Caldo (Macrodiluio e Microdiluio)

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Preparao e Armazenagem de Agentes Antimicrobianos Diludos

ATCC marca registrada da American Type Culture Collection.

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Testes de Diluio em Caldo

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