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Culturacelular
Culturacelular
2004/2005
Orientadora: Prof Doutora Delminda Neves Diana Gonalves; Filipa Fernandes; Hugo Oliveira; Ilidia Carmesim; Liliana Teixeira
ndice
O que ? Histria Classificao Heterocarion Hibridoma Linhagem de clulas Preparao Vantagens Desvantagens Limitaes Exemplo Referncias Agradecimentos
O que ?
Conjunto de tcnicas que permitem cultivar ou manter clulas isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as caractersticas prprias; - Podem fazer-se culturas a partir tecidos humanos, animais e vegetais; A cultura de tecidos implica a prvia desagregao (mecnica ou enzimtica) do tecido original e em que as clulas so cultivadas numa camada aderente, num substrato slido ou em suspenso em meio de cultura.
1977 WIGLER e AXEL mtodo eficiente para introduzir genes de cpia nica de mamferos em clulas cultivadas, adaptando um mtodo anterior desenvolvido por Graham e Van der EB. 1986 MARTIN e EVANS isolam e cultivam clulas embrionrias totipotenciais do rato estaminais. 1998 TOMSON e GEARHART isolam clulas embrionrias humano.
Histria
Primeiras culturas foram feitas a partir de fragmentos de tecidos colocados em cogulos de plasma. Grande avano (1940): | | crescimento de linhagens celulares a partir de clulas isoladas que aderiam superfcie de placas de cultura Mas As clulas eram cultivadas em meios combinao de soro e extractos embrionrios. indefinidos:
Histria
Em 1952: Crescimento de clulas num meio contendo: - Plasma de galinha - Extracto de embrio bovino - Soro de cordo umbilical Mas O meio era complexo e indefinido tornando impossvel analisar as necessidades especficas para o crescimento de clulas animais.
Histria
HARRY EAGLE
Fig.1- Harry Eagle
Realizou uma anlise sistemtica dos nutrientes necessrios ao crescimento de clulas animais em cultura; Estudou o crescimento de duas linhagens de clulas: -- clulas HeLa -- clulas L O meio em que cultivou estas clulas continha: -- Mistura de sais -- Carbohidratos -- Aminocidos -- Vitaminas suplementadas com soro de protenas
Histria
VARIANDO ESTES COMPOSTOS Eagle determinou os necessrios para o crescimento celular: -- Sais -- Glicose -- 13 a.a. -- Vitaminas -- Juntamente com soro de protenas Actualmente ainda usado o meio desenvolvido por Eagle como meio bsico para cultura de clulas animais. O seu uso permitiu aos cientistas cultivar uma ampla variedade de clulas sob condies experimentais definidas.
Classificao
Cultura celular
Mtodo cada vez mais utilizado que consiste em cultivar clulas isoladas fora do organismo onde existe. H dois tipos de cultura celular:
de uma cultura primria, elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.
Heterocarion
possvel fundir uma clula com outra para formar uma clula combinada, com dois ncleos separados;
Fig. 2 - Heterocario
Hibridoma
Fig. 3 Hibridoma
Linhagem de clulas
As clulas podem proliferar indefinidamente e podero ser propagadas como uma linhagem de clulas; | | | | podem ser preparadas a partir de clulas cancergenas
Linhagem de clulas
Tanto as linhagens de clulas transformadas quanto as de clulas no-transformadas so extremamente teis na pesquisa celular, como fonte de grandes quantidades de clulas de um tipo uniforme; As linhagens de clulas transformadas podem frequentemente causar tumores, se injectadas num animal susceptvel; Porm Clulas de um mesmo tecido podem diferir entre si.
Linhagem de clulas
Assim A uniformidade gentica de uma linhagem de clulas pode ser melhorada pela clonagem celular, em que uma nica clula isolada e prolifera-se para formar posteriormente uma colnia; Podem ser armazenadas em azoto (N) lquido a - 196C, por um perodo muito longo e continuarem viveis, quando descongeladas.
Preparao
A- Isolamento
De forma a preservar mais informaes sobre cada tipo individual de clulas, os bilogos desenvolveram meios de dissociar as clulas dos tecidos e separar os vrios tipos;
Fig. 5 - Centrifugadora
Isolamento
O primeiro passo consiste em romper a matriz extracelular e as junes intercelulares que mantm as clulas juntas; As clulas de tecidos fetal ou neonatal so as melhores produes de clulas dissociveis viveis; | | Atravs de tratamento: -- dissociao mecnica -- enzimas proteolticas - (tripsina e colagenase) -- agentes - (cido etilenodiaminotetractico, EDTA)
Isolamento
Clulas grandes so separadas das clulas pequenas e clulas densas de clulas no densas por centrifugao fraccionada;
Isolamento
Anticorpos que se ligam especificamente superfcie de apenas um tipo de clula num tecido podem ser acopladas a vrias matrizes como: -- colagnio; -- steres de polissacardeos ou plstico ; | | | para formar uma superfcie de afinidade, qual somente as clulas reconhecidas pelo anticorpo, se aderem.
Isolamento
Marcao especfica das clulas com anticorpos acoplados a um corante fluorescente, em seguida, a separao destas clulas marcadas das no marcadas num separador de clulas activado por fluorescncia;
Preparao
B- Cultivo em placas de cultura
Geralmente as culturas so feitas a partir de suspenso de clulas dissociadas de tecidos.
Fig.8 - Microdisseco
Placa de cultura
Ao contrrio das bactrias, a maior parte das clulas de tecidos no esto adaptadas para viverem em suspenso e necessitam de uma superfcie slida para crescerem e dividirem-se, que agora usualmente a superfcie plstica de uma placa de cultura de tecidos; Certas culturas celulares incluem: Factores de crescimento + | | estimulam a proliferao celular Transferrina | | transporta ferro para a clula
Algumas clulas no crescem nem se diferenciam se a placa no estiver coberta com componentes especficos da matriz extracelular
Limitaes
Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos da tcnica em condies asspticas, etc); Perda de caractersticas fenotpicas; Necessidade do uso de marcadores devido perda de caractersticas fenotpicas; Instabilidade das clulas (sobretudo em linhas celulares imortais).
Produo de vacinas anti-virais; Compreenso de fenmenos de neoplasia; Estudo da Imunologia; Ensaios de frmacos e cosmticos in vitro;
Exemplo
As clulas para anlise cromossmica devem ter crescimento e diviso rpida em cultura. As clulas mais acessveis so os leuccitos, especificamente linfcitos T. O procedimento seguinte, mostra como preparar, a curto prazo, uma cultura destas clulas adequadas para anlise:
Exemplo
1) Obtm-se uma amostra de sangue perifrico e acrescenta-se heparina para evitar coagulao; A amostra de seguida centrifugada a uma velocidade que permita aos leuccitos sedimentarem-se como uma camada distinta; Os leuccitos so colhidos, colocados em meio de cultura tecidual e estimulados a dividirem-se pelo acrscimo de um agente mitognico (estimulante da mitose), a fitohemaglutinina.
2)
3)
Exemplo
4) A cultura incubada cerca de 72 horas, at que as clulas estejam a multiplicar-se rapidamente; Acrescenta-se, ento, uma soluo diluda de colchicina, para impedir a concluso da diviso celular, inibindo a formao de fusos e retardando a separao dos centrmeros. Em consequncia, as clulas paradas na metfase acumulam-se na cultura; Em seguida, adiciona-se uma soluo hipotnica para causar tumefaco nas clulas, alisando-as e libertando os cromossomas, mas mantendo os centrmeros intactos; Os cromossomas so fixados, espalhados em lminas e corados por uma de vrias tcnicas e prontos para anlises.
5)
6)
7)
Fig. 13 - Centrfuga
Referncias
Alberts, B; Bray, D; Lewis, J; Raff, M; Roberts, K; Watson, JD (1997). Biologia Molecular da Clula. 3a ed. Porto Alegre/RS: Editora Artes Mdicas. Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA Debergh, P.C.; Read, P.E. (1991) Micropropagation in: Debergh, P.C. & Zimmerman, R.H. (eds). Micropropagation: Technology and Application. London, Kluwer Acad. Publishers; Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition; Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books
Agradecimentos
Este trabalho foi possvel com a ajuda de Prof Doutora Delminda Neves ; Servio de Biologia Celular e Molecular da FMUP
E obrigado a TODOS!!!