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Bioquímica e Biofísica
Clonagem
AC Santos - 2008/2009
Clonagem é o processo natural ou artificial pelo qual são produzidos clones,
cópias fiéis geneticamente de outro ser, por reprodução assexuada.
A clonagem tem sido um assunto muito debatido recentemente com o advento de
técnicas que permitem a clonagem de animais a partir de óvulos não fecundados. Mas
processos de clonagem artificial são conhecidos desde o século XIX entre os horticultores,
que já obtinham clones de orquídeas através da cultura de tecidos meristemáticos de uma
planta matriz, que originava dezenas de novas plantas geneticamente idênticas.
O termo clone foi criado em 1903 pelo botânico Herbert J. Webber enquanto
pesquisava plantas no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos.
Segundo Webber, o termo vem da palavra grega Klón, que significa broto vegetal.
É basicamente um conjunto de células, moléculas ou organismos descendentes de uma
célula e que são geneticamente idênticas a célula original.
Desta forma, a clonagem é um processo de reprodução assexuada, onde são
obtidos indivíduos geneticamente iguais (microorganismo, vegetal ou animal) a partir de
uma célula-mãe. É um mecanismo comum de propagação de espécies de plantas, bactérias e
protozoários.
Em humanos, os clones naturais são gémeos univitelinos, seres que compartilham
do mesmo DNA, ou seja, do mesmo material genético originado pela divisão do óvulo
fertilizado.
A clonagem alcançou a ficção aquando da escrita de "Admirável
Mundo Novo", por Aldous Huxley, que talvez não imaginasse que algum
dia a ciência poderia aproximar-se tanto da ficção da sua obra. Ainda que
com possibilidades remotas de tornar-se realidade, a produção de
indivíduos em laboratório, como diz Huxley, já ultrapassou a linha
divisória entre a ficção e a realidade.
Características Funções
Serem estáveis na célula hospedeira Permite a replicação
Controlarem a sua própria replicação Permite a sua multiplicação dentro da
célula com aumento do nº de cópias
Possuirem pequena dimensões Permite uma rápida introdução na célula
por transformação, electroporação ou
transdução
Serem cortadas num só local por uma Permite a inibição do DNA dador e a
enzima de restrição circularização do plasmídeo
Não serem transferidos por conjugação Evita que o DNA recombinante se
dissocie para as populações nativas das
bactérias
Terem carcaterísticas facilmente detectá- Evita possível distinguir as células
veis transformadas das não transformadas
Serem facilmente isoladas das células Aumenta o rendimento do plasmídeo
recombinante
Diagramas de vectores de clonagem simples derivados de um plasmídeo. O plasmídeo pode transportar um ou mais
genes que lhe confiram propriedades particulares, tais como a resistência a certos antibióticos. O gene selectivo ampr
codifica a enzima β -lactamase, que inactiva a amplicilina (antibiótico).
Vector de
expressão 4,85 Kb
Local
centrómero promotor
Local múlpiplo
de clonagem
Insert de DNA origem (MCS ou
polylinker)
Local terminador
telómero bla
ex: pGEM (1959
pb)
Vector de expressão.
Plasmídeo: segmento circular de DNA de cadeia dupla
que se encontra no interior das bactérias e se replica
autonomamente.
Cosmídeo: vectores sintéticos para clonagem de genes que podem inserir grandes fragmentos
de DNA estranho.
Componentes Função
DNA dador (insert) Fonte do DNA ou gene a ser clonado
Endonuclease de restrição Enzima utilizada para cortar tanto o DNA
do dador como o do vector em locais
específicos, de modo a que o DNA do dador
possa ser inserido no vector
Vectores Plasmídeo ou bacteriofago utilizado para
introduzir o gene a ser clonado numa célula
hospedeira adequada
Ligase de DNA Enzima utilizada pata ligar as extremidades
livres e adaptáveis do DNA do vector e do
dador e assim formar um vector
recombinante
Célula hospedeira Geralmente uma bactéria ou uma célula de
levedura. Os vectores recombinantes
introduzem-se nas células hospedeiras de
modo a obter maior quantidade de
moléculas de DNA recombinante
Técnicas de amplificação in vitro (PCR) em Biologia Molecular
volta-se a iniciar outro ciclo e assim sucessivamente ... várias vezes (é só preciso
juntar mais primers, a Taq não se gasta)
Probes: (sondas): moléculas de DNA ou RNA marcadas com isótopos radioactivos (ex:
32P) ou não radioactivas (ex: peroxidase; avidina-biotina + peroxidase = fluorescência)
usadas para detectar a presença de sequências complementares por hibridização.
Aplicação de sondas:
- diagnóstico genético pré-natal
- diagnóstico genético pré-sintomático
- identificação individual (DNA fingerprints)
Com a PCR pode fazer-se a sequenciação do genoma, mas utilizam-se várias outras
técnicas em Biologia Molecular:
- Southern Blotting
- Northern blotting
- Western blotting
O blotting é a transferência do DNA (ou RNA ou proteínas) de um gel para uma
membrana sintética (nylon ou nitrocelulose).
Após a hibridização, por ex: tendo usado 32P-DNA, tem de se “revelar” =
autorradiografia.
O autorradiograma serve então para fazer a leitura (sempre de baixo para cima) da
sequência de nucleótidos.
Hoje em dia há aparelhos automáticos para fazer quer a PCR quer a hibridização e a
leitura dos blots.
Aplicação prática - ex: verificação de mutação genética na fenilcetonúria ou nas anemias (ex: anemia
falciforme forma mediterrânica caracterizada por fragilidade dos glóbulos vermelhos).
Hb S (anemia
falciforme)
Hb A (normal)
heterozigótico
Fig. 3 - Esquema das bandas electroforéticas num gel de poliacrilamida na anemia falciforme.
SOUTHERN BLOT:
- técnica usada para testes de hibridização em fragmentos de DNA separados por
electroforese em gel, após acção de enzimas de restrição.
A designação Southern vem do nome do cientista que a inventou. As designações de
Northern e Western surgiram depois desta e apontam as regiões dos USA onde foram
descobertas as respectivas técnicas.
Vacinas Hepatite B
Herpes
Gripe
Malária
Pesquisa do genoma humano
Há três grande projectos a nível mundial nesta área desde 1985: USA, Japão e CEE.
O genoma humano haplóide (23 com) tem 3 × 109 pb. Pretende-se fazer a sequenciação
do genoma, isto é, determinar a ordem efectiva das 3 × 109 unidades (nucleótidos) que
constituem o genoma. Conhecendo o genoma teremos mais possibilidades de entender a
fisiologia normal, ver quais os mecanismos etiológicos e etiopatogénicos das doenças, para
produzir novos medicamentos, novos alimentos, etc..
Até ao momento já foi feito o mapeamento cromosómico, ou seja, a identificação de
marcadores moleculares que permitem uma localização rápida e aproximada de genes, e a
divisão dos cromosomas em fragmentos de DNA com extremos comuns. Ainda não está
terminado para os 23 crom a sequenciação dos fragmentos de DNA obtidos; a
reconstituição da ordem das bases púricas e pirimídicas nos cromosomas, recorrndo à
sobreposição das regiões comuns nos extremos dos fragmentos de DNA; a comparação
das sequências entre diversos genes, indivíduoas da mesma espécie ou mesmo de outras
espécies. Já estão descobertos cerca de metade dos nossos genes e com os novos
conhecimento entretanto adquiridos o número de genes diminuiu para 20 a 25 mil
genes…
1º é preciso fazer um mapa genético (em cada cromosoma encontrar marcadores
moleculares, onde as enzimas de restrição vão actuar; 1 centimorgan = 1 milhão de pares
de bases). Depois faz-se um mapa físico, formado por várias sequências. A seguir é
necessário pô-los topo a topo até encontrar o comprimento total do cromosoma. Por fim
quando se tiverem todas as sequências é que se vê o que é “lixo” ou não (o DNA
codificante é só entre 5 a 10%)…
Chromosome 1
GBA. In Gaucher disease,
the defective enzyme is
unable to metabolize
glucocerebrosides which
accumulate in characteristic,
distended phagocytic cells
AD4.
Brain
scans
of
a
healthy
elderly
person
and
a
patient
with
Alzheimer's
disease
Cromosoma 1
DMD FMR1
Defects
in
the
dystrophin An
unstable
nucleotide
repeat
is
gene
cause
Duchenne associated
with
the
most
common
muscular
dystrophy,
a form
of
mental
retardation
known
fatal
progressive as
Fragile
X
syndrome
degeneration
of
muscle
tissue
ATP7A ALD
Abnormal
Purkinje
cell
Mylein-stained
section
of
brain
in
dendrites
in
the
brain adrenoleukodystrophy,
characterized
by
of
a
patient
with defective
catabolism
of
long
chain
fatty
Menkes
disease acids
Cromosoma X
TDF
-
Testis-determining
factor
(also
known
as
SRY)
binds
to
DNA
and
regulates
genes
controlling
the
development
of
the
testis
http://www.genome.gov/12513430
Como resultado do avanço no conhecimento científico, tanto a clonagem
humana como a animal estão na ordem do dia. Isto ficou mais evidente em Fevereiro de
1997 com o nascimento da ovelha Dolly, o primeiro mamífero a ser clonado a partir de
uma célula adulta, na Escócia.
Clonagem
Plasmídeo Bactéria
recombinante hospedeira (E. coli)
Transformação da bactéria
hospedeira por mistura com
o plasmídeo recombinante
1997 - Ian Wilmut (Edimburg, UK) - 1º clone de animal adulto (ovelha Dolly):
Ovelha Finn Dorset → célula do dador (glândula mamária), clonada numa cultura com muito
baixa concentração de nutrientes para que não se exprimisse.
Ovelha Blackface → óvulo (colhido por sucção). Fundiu as duas células (1º impluso eléctrico
serve para as pôr em contacto e o 2º impulso eléctrico funde-as). O embrião resultante foi
implantado (mórula com 6 a 8 células) no útero de outra ovelha. O resultado foi um cordeiro
da raça Finn Dorset, geneticamente igual ao dador inicial.
Como o que foi clonado foi uma célula adulta houve envelhecimento precoce, devido à
peristase (o ambiente intra-uterino mantém o extra-uterino).
Com os avanços obtidos na área animal, abriram-se perspectivas para que a
técnica também fosse estudada em seres humanos com fins terapêuticos. No entanto, a
manipulação de células humanas gerou polémica que culminou quando foi levada para o
plano reprodutivo.
Num futuro próximo, a investigação das células estaminais poderá revolucionar a forma
de tratamento de muitas "doenças mortais" como, por exemplo, acidentes vasculares
cerebrais, a diabetes, doenças cardíacas e até mesmo a paralisia.
As atitudes relativamente à utilização de células estaminais embrionárias para fins
de investigação e tratamentos médicos variam de país para país. Na Alemanha, por
exemplo, a remoção de células estaminais de um embrião humano é considerada
ilegal.
Na Grã-Bretanha é legal mas, de acordo com regulamentos rigorosos, os cientistas
britânicos podem utilizar embriões humanos para investigação até 14 dias após a fertilização.
Nesta altura, o embrião é uma bola de células com cerca de um quarto do tamanho de
uma cabeça de alfinete (0,2 mm).
Muitos países ainda não possuem leis claras que regulem a investigação de
células estaminais humanas.
Uma vez que a utilização de embriões é uma questão
controversa eticamente, os cientistas em todo o mundo estão à
procura de outras fontes de células estaminais. As células
estaminais encontradas na medula óssea dos adultos são uma
possibilidade. Estas células têm o potencial para se
"diferenciarem" em diferentes glóbulos vermelhos ao longo do
ciclo da vida.
No futuro, os cientistas esperam manipular estas células estaminais adultas para
que, em vez de produzirem apenas glóbulos vermelhos possam produzir células do cérebro,
fígado, coração e células nervosas.
Existem actualmente pelo menos 100 000 embriões excedentários congelados
armazenados por toda a União Europeia.
Estes embriões foram criados como uma fase de rotina dos tratamentos
da esterilidade (FIV). Um único ciclo de tratamento de FIV envolve
normalmente a fertilização simultânea de vários ovos. De seguida, vários
ovos fertilizados são reimplantados na mãe e os restantes são congelados,
caso a primeira tentativa de gravidez não seja bem sucedida.
Se a mulher sujeita à FVI engravidar de imediato, o casal pode optar por não
utilizar os restantes embriões. Em alguns países, os casais podem optar por doar os embriões
para investigação ou pela sua eliminação.
No entanto, nunca chegou a ser tomada uma decisão sobre o destino de alguns
embriões armazenados. Nos últimos 20 anos, desde o início da FIV, muitos dos dadores de
ovos e esperma mudaram de casa, voltaram a casar e mudaram de nome ou talvez até já
tenham morrido. As clínicas de fertilidade podem não conseguir encontrá-los. O destino de
muitos embriões armazenados é, por isso, incerto.
Uma segunda fonte de embriões para o fornecimento de células estaminais, ainda
mais controversa, seria a criação de embriões somente para investigação ou tratamento.
Contudo, já existem milhões de espermatozóides e milhares de ovos não fertilizados
congelados em clínicas de FIV em toda a Europa. Se os espermatozóides fossem utilizados
para fertilizar os ovos, existiriam ainda mais embriões para fornecer células estaminais de
modo a curar doenças.
Medula óssea de adultos
Uma fonte promissora de células estaminais poderia ser a medula óssea de um adulto.
As células estaminais da medula óssea dos adultos produzem normalmente glóbulos
vermelhos e células da medula óssea.
Sangue placentar