A coleo

Cadernos Acadmicos da UFGD

tem como objetivo divulgar
o material produzido
pelos docentes da universidade,
para uso didtico nas atividades
de ensino e extenso.

TCNICAS LABORATORIAIS
NA ANLISE DE ALIMENTOS

Rafael Henrique de Tonissi e Buschinelli de Goes

Hellen Leles Lima

Universidade Federal da Grande Dourados

COED
Editora UFGD
Coordenador Editorial : Edvaldo Cesar Moretti
Tcnico de apoio: Givaldo Ramos da Silva Filho
Redatora: Raquel Correia de Oliveira
Programadora Visual: Marise Massen Frainer
e-mail: editora@ufgd.edu.br
Conselho Editorial - 2009/2010
Edvaldo Cesar Moretti | Presidente
Wedson Desidrio Fernandes | Vice-Reitor
Paulo Roberto Cim Queiroz
Guilherme Augusto Biscaro
Rita de Cssia Aparecida Pacheco Limberti
Rozanna Marques Muzzi
Fbio Edir dos Santos Costa
Reviso: Raquel Correia de Oliveira
Projeto grfico e capa: Marise Massen Frainer
Impresso: Grfica Centro Imagem | Campo Grande | MS

Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca Central - UFGD

636.0855 Goes, Rafael Henrique de Tonissi e Buschinelli
G598t

Tcnicas laboratoriais na anlise de alimentos. /

Rafael Henrique de Tonissi e Buschinelli Goes,

Hellen Leles Lima. Dourados, MS: Ed.UFGD,
2010.
52p . (Cadernos acadmicos UFGD. Cincias
agrrias).

ISBN
973-85-61228-66-8

1. Nutrio animal Anlise. 2. Alimentos - Anlise. I Lima, Hellen Leles. II. Ttulo.

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1.
2.

Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

SUMRIO
Introduo
7
Amostragem na Bromatologia
9
Coleta e cuidados com a amostra
Cuidados a serem realizados
na amostragem/coleta da amostra
Preparao da amostra
Amostragem de fezes e urina
Gros
Roteiro para coleta de amostras
de produtos a granel
Roteiro para coleta de amostras
de produtos ensacados
Consideraes gerais

3. Composio Centesimal

20
Matria seca (MS) e umidade
Matria seca parcial ou pr-secagem (ASA)
Matria seca total ou secagem definitiva (ASE)
Matria mineral ou cinza
Protena bruta (PB) ou nitrognio total
Fibra bruta (FB)
O mtodo de Van Soest na determinao
da qualidade de forrageiras
Determinao de fibra em detergente neutro
Determinao da fibra em detergente cido
Determinao de lignina
Gordura ou extrato etreo

4. Avaliao da Digestibilidade
IN VITRO da Matria Seca

40
Digestibilidade in vitro
da matria seca (DIVMS) usando o
instrumento daisy
(in vitro true digestibility- ivtd)
Segundo Estgio (Pepsina + HCl 6N)
Clculos
Procedimentos de coleta,
preparo e incubao do incuo

5. Bibliografia
50

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

1. Introduo

Esse manual tem como objetivo facilitar o acesso de estudantes

de graduao em Zootecnia e profissionais ligados rea de avaliao
de alimentos para animais, seguindo as metodologias mais utilizadas
em laboratrios de anlise de alimentos.
A produo animal uma rea voltada principalmente para o
fornecimento de alimentos e outros produtos de origem animal para
atendimento das necessidades do homem. O objetivo prtico da avaliao de alimentos aperfeioar a sua eficincia de utilizao, oferecendo assim uma resposta mais confivel em relao produo animal e
proporcionando retorno financeiro mais adequado ao produtor (BERCHIELLI, 2006).
A anlise de alimentos a serem utilizados para raes animais,
forrageiras e outros alimentos de muita importncia para todos os
pesquisadores. O objetivo principal destas anlises conhecer a composio qumica, alm de verificar a identidade e pureza, sejam elas
de natureza orgnica ou inorgnica, do material analisado. Um estudo
mais completo desses alimentos e dessas forragens conter propriedades como: aroma, aspecto, sabor, alteraes, estruturas microscpicas e
a digestibilidade que interessa especialmente ao zootecnista que ir
determinar o valor nutritivo deste alimento, ou seja, a parte do alimento
que estaria disponvel para o animal.
importante saber que essas anlises no representam compostos quimicamente definidos, mas sim grupos de compostos qumicos.
A protena, por exemplo, no s abrange vrios compostos qumicos e
compostos de nitrognio, como o extrato etreo; ela inclui tambm os
triglicerdeos, outros compostos solveis em ter, como pigmentos e
ceras.
O mtodo normalmente usado para as anlises chamado de
7

Weende. Por este mtodo que se tem a anlise aproximativa dos

alimentos, desde 1864, com exceo do nitrognio, que feito pelo
mtodo KJELDAHL (A.O.A.C.,1984).
As anlises clssicas comumente feitas visam obter informaes
sobre Matria Seca, Protena Bruta, Gordura ou Extrato Etreo, Fibra
Bruta, Extrato No Nitrogenado e Cinza ou Matria Mineral.
O mtodo descrito por VAN SOEST (1967) foi usado de forma
complementar para se obter maiores informaes sobre a forrageira estudada, por ser mais preciso nas informaes de carboidratos, separando a fibra bruta em fibra em detergente neutro e detergente cido.
Procurou-se a forma mais prtica e fcil de construir este material, para corresponder s principais necessidades de estudo ligadas
nutrio animal e anlise de alimentos, buscando as tcnicas mais
recentes e visando atender aos novos e mais dinmicos conceitos dessa
rea cientfica.

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

2. Amostragem na Bromatologia
2.1. Coleta e cuidados com a amostra

A coleta tem por finalidade obter amostras representativas da

mdia do material e ser analisado. Deve ser realizada da forma mais
cuidadosa possvel para obter uma amostra que, mediante sua anlise,
indique com preciso a qualidade real do lote, transferncia e propriedade, sada ou nas inspees que porventura ocorram. Deve-se retirar numerosa quantidade de amostras parciais, colhidas em diferentes pontos
e locais de interesse: campo, fabricao, depsito, transporte, sacaria,
etc. Desta amostra s vezes volumosa, aps homogeneizada, podem ser
retiradas amostras parciais, antes que sejam enviadas ao laboratrio.
Aps a coleta a amostra deve ser armazenada de forma correta, a
fim de se preservar o valor nutritivo, e ao mesmo tempo deve ser identificada corretamente (selada ou rotulada), para finalmente ser transportada ao laboratrio.
Uma amostragem deficiente resultar sempre em valores errneos em anlises posteriores, impossibilitando o estabelecimento de manejo adequado para a perfeita estocagem e conservao dos alimentos.
2.2. Cuidados a serem realizados
na amostragem /coleta da amostra

- Amostragem deve ser ao acaso

- Nmero de amostras (varivel)
4 (sempre)
100 recipientes

10% a coletar (mnimo 5)

101-200 recipientes

5% a coletar (mnimo 10)

201-2000

3% a coletar (mnimo 25)

> 2000

1% a coletar (mnimo 50)

9

- Quantidade de amostra (a quantidade deve ser suficiente para se

realizar todas as anlises propostas).
- Embalagem (preservar o alimento contra alteraes entre o local de coleta e o laboratrio)
- Rotulagem (identificao da amostra)
- Produto, local da coleta, data da coleta (horrio, se pertinente),
observao.
- Transporte (imediatamente para o laboratrio, evitar alteraes,
refrigerao amostras deteriorveis).
2.3. Preparao da amostra

Durante a preparao da amostra no laboratrio deve-se assegurar a homogeneizao, de tal forma que qualquer poro utilizada possa
ser representativa de um todo.
As amostras que se necessite ao chegar devem ser cortadas em
pequenos pedaos com faca inoxidvel, para posterior homogeneizao. Aps esta tritura prvia, o material deve ser identificado e colocado
em saco de papel previamente pesado e levado balana (com preciso
de duas casas decimais). O peso total (amostra mais saco de papel)
deve ser anotado no formulrio prprio. Antes de levar o material para
a estufa de secagem com ventilao forada, deve-se perfurar o saco de
papel, para permitir melhor circulao de ar.
2.3.1. Forrageiras pastagens

Devem ser coletadas amostras em zig zag, no mnimo 15. Logo

em seguida devem ser homogeneizadas e misturadas, retirando uma
sub-amostra para posterior anlise. Acondicion-las em sacos plsticos,
alocadas em caixa de isopor ou refrigeradas para que no ocorra uma
perda de umidade.

10

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

To logo as amostras sejam colhidas devero ser embaladas e enviadas ao laboratrio com rapidez, a fim de se evitar perdas de umidade
e a ocorrncia de fermentaes indesejveis. Muitas vezes a amostra
encaminhada tem sua origem de amostras parciais, colhidas em diferentes pontos do local de interesse. A manipulao da amostra, at o
momento de sua anlise, dever ser to cuidadosa quanto possvel, para
evitar a ocorrncia de alteraes nos princpios nutritivos existentes
(SILVA e QUEIROZ, 2002).
Ao coletar amostras rentes ao solo, deve-se ter cuidado para que
no haja contaminao de material morto e/ou terra.
2.3.2. Silagens, feno e outras amostras

Para fenos a amostra deve ser retirada de acordo com o tamanho

do experimento, utilizando-se o bom senso. Por exemplo: em lotes de
um (1) a 10 fardos, todos devem ser avaliados; em lotes com 10 a 100
fardos retira-se uma amostragem de 10 fardos ao acaso e em lotes com
mais de 100 fardos pode-se amostrar 10% dos fardos ao acaso.
Na avaliao de silagens, geralmente 10 a 15 amostras so coletas
de locais diferentes do silo, dependendo este nmero do tipo e tamanho
do silo. O material deve ser devidamente ensacado, com etiqueta escrita
a lpis. O ar deve ser retirado e devem constar na ficha de encaminhamento das amostras informaes sobre o perodo de armazenamento,
condies do clima no momento da ensilagem, aditivos utilizados e a
data de plantio e colheita. O material deve ser mantido no freezer antes
de ser encaminhado ao laboratrio.
2.4. Amostragem de fezes e urina

Amostras de fezes, geralmente coletadas para ensaios de digestibilidade, devem ser bem homogeneizadas e corresponder entre um (1)
e 5% da quantidade produzida diariamente, ao longo de sete (7) dias de
11

coleta. O material deve ser congelado. J a coleta da urina deve ser efetuada uma vez ao dia, durante 7 dias consecutivos. Ao final as amostras
devem ser bem misturadas, dando origem a pelo menos duas amostras
representativas. O material deve ser conservado a 10C.
2.5. Gros
2.5.1. Equipamentos utilizados

Os seguintes equipamentos so usados na amostragem de gros

sob diferentes circunstncias e na manuteno da representatividade da
amostra durante o perodo necessrio.
2.5.2. Caladores simples

So extratores metlicos utilizados para a retirada de amostras

em sacaria de aniagem ou algodo atravs de simples furao dos sacos.
2.5.3. Caladores (sondas manuais)

So extratores metlicos utilizados na amostragem de gros a

granel, possuem divises (septos) no seu interior, permitindo a retirada
de muitas pequenas amostras de uma s vez, em vrias profundidades.

2.5.4. Sondas Pneumticas

So equipamentos que retiram as amostras atravs de suco dos

gros. Deve-se observar que o uso desses equipamentos na recepo de
gros no permitido j que pode causar erros na amostragem devido
retirada de mais quantidades de impurezas leves do que deveria e
12

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menos impurezas pesadas do que realmente possa existir. Poder ser

utilizada em fbricas que recebam produtos limpos e secos.

2.5.5. Sondas Torpedo

So extratores utilizados para coleta de amostras de produtos a

granel a grandes profundidades e dotados de varetas auxiliares que vo
se encaixando uma outra pelo sistema de roscas, possuindo ainda um
terminal para facilitar a sua introduo no interior da massa de gros.
Tais equipamentos so prprios para o controle de armazenagem ou
verificao parcial da qualidade de um silo ou graneleiro.

2.5.6. Pelicanos

So coletores de amostras de produtos a granel em queda livre

(dutos de descarga) ou na sada dos transportadores, como correias
transportadoras, elevadores de caneca, roscas sem fim. Devem ser utilizados baldes para depsito das pequenas amostras medida que elas
vo sendo retiradas, visando posterior homogeneizao.
Tais equipamentos so adotados como padro na coleta de amostras de produtos descarregados em nossas moegas, no podendo em
hiptese alguma serem utilizados outros equipamentos.
13

2.6. Roteiro para coleta de amostras de produtos a granel

2.6.1. pocas de coleta

a) Antes de efetuar a pesagem do veculo pr-amostragem

dos gros, seja ainda na fila de espera ou j no ptio do armazm. Essa operao dar informaes sobre a qualidade
do produto, atravs de determinaes de sua sanidade, teor
de umidade e de impurezas, permitindo escolher o local e/
ou moega onde ser descarregado ou optar pela rejeio
do mesmo.
Tal procedimento, alm de facilitar a secagem devido
separao de produtos de mesma umidade, agiliza o recebimento na unidade. O equipamento indicado para a pramostragem o calador.
b) Durante a descarga nas moegas, ser feita a amostragem
oficial utilizando-se o pelicano. A partir dessas amostras,
depois de homogeneizadas, feita a determinao da qualidade dos gros.
c) No decorrer do perodo de armazenamento devero ser
realizadas amostragens da massa de gros a ttulo de inspeo, a fim de se verificar o estado qualitativo e fitossanitrio do produto estocado. Para esta atividade devero ser
utilizadas sondas torpedo na coleta de amostras superficial
e o pelicano na coleta de amostras pelas bocas de descarga.
d) Por ocasio da expedio do produto, devero ser reti14

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

radas amostras para sanar as dvidas quanto natureza e

caractersticas do produto expedido. Pode-se utilizar o pelicano durante o carregamento, todavia o calador o mais
indicado.
2.6.2. Procedimento operacional propriamente dito

a) Na coleta de amostras realizada com introduo em posio oblqua do calador na massa de gros, o esquema de
coleta a ser utilizado ser determinado pelo classificador
que poder alternar para cada operao.
Esquema A
Esquema B

b) As amostras relativas entrada do produto na unidade

de armazenagem devero ser coletadas com uso de pelicanos. Tal coleta se d durante toda a descarga, com no
mnimo trs giros no caminho (um no incio, um no meio
e outro no fim da descarga). Nos caminhes basculantes
a coleta semelhante realizada nos caminhes convencionais.

c) No caso de silos pode-se estabelecer para coleta de

amostras os quatro pontos cardeais e o centro da massa a
15

alturas pr-determinadas da massa de gros, como mostra

e esquema abaixo:

- As amostras podem ser coletadas com sonda pneumtica, sonda

torpedo ou mesmo caladores. Neste tipo de amostragem, as amostras
devem ser analisadas separadamente, segundo as diferentes alturas em
que forem coletadas para verificao da existncia de possveis bolsas de calor ou umidade.
Para armazns graneleiros ou piscinas o procedimento semelhante, devendo-se aumentar o nmero de pontos de coleta e distribulos de acordo com o dimensionamento das estruturas armazenadoras
em questo.
2.7. Roteiro para coleta de amostras

de produtos ensacados
2.7.1. pocas de coleta

A operao dever ser realizada por ocasio do recebimento e

expedio do produto, bem como em casos de transferncia de propriedade, visando determinao de seu percentual de umidade e de
impurezas.
No recebimento da mercadoria, deve-se avaliar as condies em
que os gros se apresentam. Averiguar a necessidade de equipamentos
de secagem e/ou limpeza ou da opo pelo seu armazenamento imediato quando as caractersticas de teor de umidade e impurezas assim
o permitirem.

16

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

No decorrer do perodo de armazenagem, amostragens podero

ser realizadas a ttulo de inspeo sempre que houver indcios de infestao por insetos ou de deteriorao no produto estocado.
2.7.2. Quantidades a extrair

a) Nos lotes de produtos ensacados, proceder retirado de

amostras em no mnimo 10% do total de sacas, numa proporo mnima de 30 gramas de cada saca.
2.7.3. Procedimento operacional propriamente dito

As amostras so obtidas atravs da furao dos volumes

(sacas) com caladores simples. A operao consiste em
introduzir o calador no sentido de baixo para cima, promovendo-se o movimento vai e vem para facilitar o deslizamento do produto.

2.8. Consideraes gerais

De acordo com Silva e Queiroz (2002), a maioria das amostras se

encontram em uma das seguintes categorias: (1) suficientemente secas
para serem finamente modas e analisadas imediatamente (amostra com
mais de 90% de matria seca); (2) suficientemente secas para serem
grosseiramente modas (peneira de 3-6 mm), mas ainda muito midas,
que precisem ser pr-secas ou parcialmente secas antes de finamente

17

serem modas (amostra com mais ou menos 85% de matria seca); e

(3) amostras que precisam ser pr-secas antes de serem grosseiramente
modas (peneiras de 4-6 mm) e finamente modas (amostra com baixo
teor de matria seca).
Estas categorias de amostras devem ser manejadas diferentemente, isto , necessitam de tritura prvia, moagem preliminar ou moagem
final.
Tritura prvia a primeira tritura de amostras feitas com tesouras ou facas, que geralmente ocorre com as forragens verdes, razes,
tubrculos e etc. que necessitam ser cortados antes da secagem final. Os
gros so grosseiramente triturados em moinhos adequados, enquanto
as forragens ensiladas e as raes fareladas no necessitam dessa tritura.
Moagem preliminar ocorre aps a triturao prvia em amostras
com 85 % ou mais de matria seca (raes fareladas) ou em amostras
com menos de 85% de MS (forragens verdes) que j foram pr-secas,
de acordo com a Figura 1.
Moagem final nessa etapa mi-se as amostras ate obter um p
bem fino, usando-se moinho de facas ou ciclone com peneiras de 1 mm.
realizada aps a moagem prvia e preliminar com amostras.

18

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

Amostra como oferecida

ou como coletada

Amostra contendo
mais do que 88% de
matria seca

Amostra contendo
menos do que 88% de
matria seca

Moer, usando peneira

de 1mm

Determine % de matria seca parcial no alimento como oferecido a

600C ou seca a frio;
Deixe equilibrar com a
umidade do ambiente;
Pese;
Esta anlise ser denominadacomo sendo
% de matria parcialmente seca do alimento
como oferecida ou
como coletado

Analise as amostras
quimicamente

Determine a matria
seca a 1050C

Moer, usando peneira

de 1mm

Este ser conhecido como:

Matria Seca como
oferecida ou colhida para
demonstrar a produo

Analise quimicamente
as amostras se os
elementos no foram
afetados pela secagem

Este valor de matria

seca pode ser usado
para calcular a produo
de matria seca por
unidade de rea

Determine a % de matria
seca a 1050C. Esta anlise
ser conhecida como % de
matria seca na amostra
parcialmente seca

Matria Seca do
alimento como oferecida para demonstrar a produo

Figura 1- Fluxograma de preparo das amostras enviadas ao laboratrio

de nutrio animal
19

3. Composio centesimal
3.1. Matria seca (MS) e umidade

o ponto de partida para anlise de alimentos, tanto no aspecto

de conservao como no de comparao do valor nutritivo dos alimentos.
Pode ser dividido em matria seca parcial ou pr-secagem e secagem definitiva para ento se determinar a matria seca total.
3.2. Matria seca parcial ou pr-secagem (ASA)

A umidade evaporada da amostra e a matria parcialmente seca

determinada como resduo remanescente aps a secagem em estufa.
Realizada quando as amostras contem alto teor de umidade (gramneas, silagens, etc.), em estufa de circulao forada de ar com temperatura de 55 C por 16 / 24 horas para se evitar perdas por volatilizao ou alterao dos nutrientes.
O tempo de secagem pode variar de acordo com a umidade da
amostra e pode durar at trs dias ou quando a amostra estiver em aspecto quebradio, permitindo a moagem perfeita. A perda de gua deve
ser computada no clculo da umidade final, portanto o material deve ser
pesado antes de ser colocado na estufa. Deve-se pesar o material em que
sero acondicionadas as amostras (sacos de papis, plsticos, etc...)
Feito isso, leva-se o saco com amostra para a estufa com circulao de ar forado, a uma temperatura de 60 5 C por 72 horas para
pr-secagem (atingir aspecto quebradio / ponto de feno, aproximadamente 18% de matria seca). Aps este perodo, o material deve ser
retirado da estufa e colocado sobre um balco por 1 hora, para que a
umidade da amostra entre em equilbrio com a umidade do ambiente.
Este material chamado de amostra seca ao ar (ASA).
20

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

Aps resfriado, faz-se pesagem do saco contendo a amostra seca

ao ar (ASA). A seguir, a ASA deve ser processada em moinho contendo peneira de 30 mesh, ou seja, 30 furos por polegada linear (1mm).
A frao moda deve ser recolhida em um frasco de vidro escuro com
tampa de polietileno, que deve ser etiquetado e armazenado para posteriores anlises.
Exemplo: Amostra de Braquiria do brejo (B. arrecta)
Tara (saco de papel): 9,32g
Tara mais amostra verde: 446,00g
Tara mais ASA: 200,27g
Amostra verde: 436,68g
ASA = 200,27 9,32 = 190,95
%ASA = = 43,7276

3.3. Matria seca total ou secagem definitiva (ASE)

Usadas em amostras submetidas pr-secagem ou que contenham mais de 80% de MS (raes fareladas, gros, farelos, etc...)
A determinao da matria seca (MS) o ponto de partida da
anlise de alimentos, pois possibilita a comparao dos dados encontrados com outros afins (independente de poca, local ou regio). A anlise de MS feita retirando-se a gua livre do material a ser analisado,
que a maior frao de gua existente nos alimentos. As demais formas
de gua encontradas nas forrageiras e alimentos concentrados so denominadas de estrutura e de constituio, que apesar da importncia sob
o aspecto fsico-qumico no apresentam valores no aspecto prtico,
pelos baixos teores com que esto presentes.
A determinao de umidade pode ser feita por dois processos: direto e indireto. De um modo geral, o procedimento constitui-se de duas
21

fases: secagem prvia (ASA), e secagem definitiva conhecida como

Amostra Seca em Estufa (ASE).
O mtodo indireto consiste na determinao da MS, considerada
por diferena de peso, sendo que esta correspondente perda de gua
na realidade ocorrem perdas de outras substncias volteis, alm de
gua, que acabam sendo consideradas como gua, levando a um erro
que considerado uma desvantagem deste mtodo.
A umidade eliminada da amostra pela secagem em estufa a uma
temperatura de 135C por duas horas, ou 100C por 24 horas, ou 105C
por 16 horas (uma noite).
Procedimento:
A secagem definitiva realizada a partir do material coletado, em
duplicata, cada uma pesando aproximadamente 2g. Pese as amostras
em um pesa filtro ou placa de petri com tampa, previamente secos e
tarados, fazendo a secagem em estufa a 105.C durante uma noite.
Depois retire os pesa filtros da estufa, colocando-os em dessecador durante 1 hora para esfriar, quando forem pesados. Nesses procedimentos, realize as pesagens para determinao da MS realizadas em
balana analtica com preciso de 0,0001g. O material assim obtido
chamado de amostra seca em estufa (ASE).
Clculo percentual da Amostra Seca na Estufa (ASE)
% ASE = ASE(g)
* 100
ASA(g)
A determinao de matria seca total (MST) obtida atravs da
seguinte expresso:
% MST = % ASA* % ASE
100
A determinao da umidade total calculada subtraindo-se de
100 g a percentagem de matria seca.
Umidade = 100 MST
22

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61,5682

61,5684

38,4318

38,4316

43,7276

42,7276

87,8892

87,8888

2,0486
36,0215
36,2696
Mdia

83
2

34,2210

2,2210
37,5053
37,7743
148

35,5533

1,8005

61,5686
38,4314
43,7276

%U = 100 MST (%)

1,9520

ASE (%) = peso amostra seca

87,8883

Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

Resumindo:

Pesa
Filtro +
ASE (g)
Pesa
Filtro +
ASA (g)
Pesa Filtro
(g)
N PF

Quadro 1. Determinao da Secagem Definitiva.

ASA (g)

ASE (g)

ASE
%

ASA
%

MST
%

Umidade %

ASA (%) =

AMOSTRA

X 100

ASA

ASA

* 100

100

%MST = %ASA*%ASE

MST% = 100 U%

3.4. Matria mineral ou cinza

Cinza ou resduo mineral o produto que se obtm aps o aquecimento de uma

amostra, temperatura de 500 a 600C, at
o aquecimento ao rubro, porm no superior
a 600C, durante quatro horas ou at a combusto total da matria orgnica. Por meio de
aquecimento em temperatura elevada, todas as
substncias volteis que se decompem pelo
calor so eliminadas, e a matria orgnica
toda transformada em CO2 ,H2O, etc.
A cinza, nos alimentos, contm principalmente os seguintes ctions: clcio, potssio, sdio, magnsio, ferro, cobre, cobalto,
alumnio; e nions: sulfato, cloreto, silicato,
fosfato, etc.
A determinao da cinza feita muitas
vezes apenas para se conhecer o extrato no
nitrogenado (ENN), e/ou matria orgnica de
determinadas amostras, sem a preocupao do
teor de minerais. Assim sendo, pode-se fazer a
determinao da matria mineral, dependendo
do objetivo do pesquisador em seu trabalho e
23

tambm do tipo de alimento a ser analisado. Por exemplo, quando analisamos produtos como farinha de ossos ou produtos de origem marinha, o teor de cinzas pode permitir uma boa estimativa da riqueza de
clcio e fsforo, no entanto, quando analisamos produtos vegetais, a
determinao da cinza tem relativamente pouco valor, isto porque seus
componentes minerais so muito variveis.
Forrageiras ricas em slica resultam em valor elevado de cinzas,
porm essa no apresenta nenhum benefcio nutricional ao animal.
Existem dois mtodos para se determinar as cinzas: incinerao
simples e incinerao dupla (no mais usado pelos inconvenientes que
apresenta na prtica).
Na determinao da matria mineral so usados cadinhos de porcelana limpos, colocados na mufla por 15 minutos temperatura de
550oC. Em seguida so resfriados em dessecador e pesados. Dentro dos
cadinhos ser colocada uma quantidade de aproximadamente um (1)
grama. Os cadinhos com as amostras so colocados na mufla, que
ligada em seguida. A elevao da temperatura deve ser lenta inicialmente, para evitar que a queima da amostra seja violenta, provocando
perdas indesejveis.
Por ocasio da colocao dos cadinhos na mufla, recomenda-se
pingar umas gotas de cido ntrico por cima das amostras, facilitando a
oxidao do carbono e sua conseqente volatilizao. O resultado final
da anlise no alterado porque o cido ntrico tambm volatilizado.
Uma vez queimadas as amostras so retiradas da mufla, esfriadas em
dessecador e pesadas.
Calculo:

A - peso do cadinho + cinzas

B - peso do cadinho
C - peso da amostra parcialmente seca (ASA)
% CINZAS =
24

* 100
( (A-B)
C )

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3,1197
8,1174

2,9781
7,7490

7,1343

87,8888
6,8105
0,1376
24,6751
2,0204
26,5579

Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

3.5. Protena bruta (PB)

ou nitrognio total
O termo Protena Bruta (PB) envolve
um grande grupo de substncias com estruturas
semelhantes, porm com funes fisiolgicas
diferentes. Baseado no fato das protenas terem
porcentagem de nitrognio quase constante
(em torno de 16%), o que se faz determinar o
nitrognio e por meio de um fator de converso
a porcentagem de protena bruta obtida pela
multiplicao desta porcentagem de nitrognio
no alimento pelo fator de converso 6,25
transformando o resultado em Protena Bruta.
O mtodo de Kjeldahl (1883) o mais
utilizado, principalmente em forragens, e vem
sendo usado nos laboratrios de nutrio animal por mais de 120 anos. Este mtodo determina o nitrognio contido na matria orgnica,
incluindo o nitrognio protico propriamente
dito e outros compostos nitrogenados no proticos, como: aminas, amidas, lecitinas, nitrilas
e aminocidos.
O mtodo Kjeldahl se baseia numa digesto cida, na qual o nitrognio da amostra
transformado em amnio (NH4+), sendo posteriormente separado por destilao e finalmente
dosado pela titulao.

Mdia

D1
2

24,5375

3,2613
8,4858
87,8888
7,4580
0,1653
27,9604
2,2164
30,0115
27,7951
20
1

Cad.+
Cinza (g)
ASA (g)
Cad. +
ASA (g)
Peso
Cad. (g)
Amostra Cad.n

Quadro 2. Determinao da Anlise de Matria Mineral.

Peso da
Cinza (g)

Cinza
ASA %

ASE %

Cinza MS
%

Cinza MN
%

25

 O mtodo est baseado em trs etapas:

1) Digesto - Nitrognio orgnico foi transformado em amnia
que reage com o H2SO4, formando sulfato de amnio (NH4)2SO4 e os
compostos orgnicos so convertidos em CO2, H2O etc.
2) Destilao - A amnia separada e recolhida em uma soluo
receptora (H3BO3 + indicador).
3) Titulao - Determinao quantitativa da amnia contida na
soluo receptora.
Na determinao do nitrognio so pesadas duas amostras de
ASA de aproximadamente 200 mg cada e introduzidas em tubos abertos, onde recebem aproximadamente 2 gramas de mistura digestora
(K2SO4 +CUSO4.5H2O+Se) e 5 mL de cido sulfrico concentrado.
A mistura digestora serve para aumentar o ponto de ebulio do cido
sulfrico, acelerando a digesto cida.
Durante a digesto cida a temperatura deve ser elevada gradativamente at atingir 350C. No final da digesto, o material fica completamente claro indicando a produo de sulfato de amnia. Prximo
fase final da digesto, deve-se agitar o balo de modo a uniformizar o
material em digesto, para obter total combusto (no deixar que o material parcialmente oxidado se fixe nas paredes do balo). Em seguida,
esfria-se o balo naturalmente colocando um pouco de gua destilada.
Durante a fase de digesto so observadas
as seguintes reaes:
mat. orgnica
R-NH2 + H2O
R-CONH2 + H2O
H3 + H2SO4
26

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H2SO4
H2SO4
[ H+]

SO2 + CO2+ H2O + R-NH2

R-OH + NH3
R-COOH2 + NH3
(NH4)2SO4

Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

Salienta-se que o ndice cido regula a perda do nitrognio, e

para isso uma quantidade especfica de cido deve estar presente durante a digesto, a fim de evitar perda de nitrognio.
Efetuada a digesto cida, o tubo levado para que o material
resultante sofra destilao. Assim que esfriar transfira imediatamente o
tubo para o conjunto de destilao, balo ou tubo digestor, e num erlenmeyer de 125 mL adicionar 20-50 mL de cido brico a 4% + indicador
misto (ou volume estimado de cido sulfrico 0,2 N de acordo com a
porcentagem de protena estimada e duas gotas de soluo de vermelho
metila 0,1%). Adapte o erlenmeyer ao conjunto destilador para receber
amnia. A ponta do condensador deve ser introduzida na soluo, a fim
de evitar perda de amnia. Destile por arraste, mantendo a ponta do
condensador na soluo ate que toda a amnia seja liberada, o volume
destilado aproximadamente 75 mL. Retire o elernmeyer lave a ponta
do condensador com gua destilada, assim como as paredes superiores
do elernmeyer.
Durante esta etapa o (NH)2SO4 formado na digesto sofre adio de NaOH, formando NH4OH + Na2SO4 em presena de aquecimento, sendo ento o produto destilado para o erlenmeyer contendo um
composto de cor verde (cido brico) NH4H2BO3.
(NH4)2SO4 + 2Na4OH
NH4OH
NH3+ H3BO3

2NH4OH + Na4SO4
NH3 + H2O
NH4+ H2BO3

Obtm-se, ento, cerca de 75 ml deste composto, titula-se o mesmo com HCl de normalidade conhecida (0,005N ou 0,1N) com fator
conhecido at viragem do indicador.
Para se evitar perdas de NH4, a sada do condensador deve ficar
imersa no cido brico.
27

NH4+ + H2BO3 + HCl

H3BO3 + NH4Cl

Durante a titulao com HCl o indicador adquirir uma cor de

verde para rosa, se a titulao for realizada com soluo de hidrxido
de sdio 0,2 N a viragem do indicador, ser de vermelho para amarelo.
aconselhvel fazer um teste em branco com o objetivo de eliminar qualquer interferncia do papel e/ou de reagente. A quantidade
de HCl gasta na titulao da amostra em branco subtrada da quantidade gasta na titulao da amostra.

Obs: Todos os reagentes para esta marcha so obrigatoriamente
(P. A.).
O clculo da % de Nitrognio obtido atravs da frmula:

% de N =

V x N x f x 14 x 100
peso da amostra (mg)

% de N x 6,25 = % de protena bruta,

28

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2,3864

2,3864

2,3864

PB MN
(%)

Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

Vt : volume total
Br: Branco

6,2095

6,2095

5,4574

5,4574
27,45

0,3782

N = 0,02
F = 0,9804

O clculo da porcentagem de Protena feito multiplicando-se o percentual de

nitrognio pelo fator 6,25, que se originou
da constncia nos teores de protena na
maioria dos produtos, que est em torno de
16%.
3.6. Fibra bruta (FB)

Mdia

0,2 0,40 9,60

0,2966
2

Cte: (N*F*14*100) = 27,45

Nitrognio: Mdia = 0,8732 %

87,8888

6,2095
87,8888
5,4574
0,8732
0,2847
1

0,2 0,40 9,60

27,45

PB ASA
(%)
N(%)
Cte
HCl(ml)
Br Vr Vt
ASA (g)
Amostra

Quadro 3 - Determinao de nitrognio e da Protena bruta.

ASE
(%)

PB MS
(%)

Vr: Volume real = Vt - Br

Representa o resduo de substncia

da parede celular. Na fibra bruta encontram-se como constituintes fraes de celulose e de lignina insolvel em lcali, que
estimada atravs do mtodo de Wendee.
A FB a parte dos carboidratos resistentes
ao tratamento sucessivo com cido e base
diludos, e representa a grande parte da frao fibrosa dos alimentos.
Constitui-se como uma amostra livre de umidade e aps a extrao por ter,
digerida inicialmente com uma soluo

29

de cido fraco e posteriormente com uma soluo cida fraca. O resduo orgnico coletado num cadinho filtrante, e a perda de peso aps a
filtragem denominada Fibra Bruta.
Procedimento para determinao da fibra bruta:
Pese 2-3 gramas da amostra seca ao ar, desengordurada ou no,
dependendo do seu teor de gordura (>1%).
Digesto cida
Coloque a amostra em um bquer de 600 ml, prprio para ser
ajustado ao digestor, adicione 200 ml da soluo de cido sulfrico a
1,25%, fervente. Coloque no aparelho digestor, pode-se adicionar tambm algumas gotas de anti espumante. Deixe ferver por trinta minutos,
aps o inicio da ebulio. Filtre em funil de Buchner com tela de nilon,
fazendo lavagens sucessivas com gua destilada quente ou fervente at
a neutralizao do material, que verificado com papel de tornassol
azul.
Digesto bsica
O resduo retido na tela quantitativamente transferido para o
bquer de 600 ml, utilizando-se para transferncia 200 ml da soluo de
NaOH a 1,25%, fervente, e algumas gotas de anti espumante. Coloque
o bquer no digestor. Proceda a digesto bsica por trinta minutos aps
o incio da ebulio.
Transfira o resduo (fibras + minerais), com o auxlio de gua
quente para o cadinho filtrante (previamente seco em estufa de 105 C
por duas horas) e lave at a neutralizao do material use o papel de
tornassol azul. Aps a filtragem lave o material com lcool (20 ml) e
posteriormente com ter (acetona) (20 ml) a fim de facilitar a secagem.

30

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Faa a secagem dos cadinhos durante uma noite em estufa a 105C (4-6
horas) e leve-os ao dessecador para esfriar e equilibrar com a temperatura ambiente. Pese e registre os pesos.
Coloque os cadinhos filtrantes com resduos na mufla a 500C,
durante duas horas, desligue a mufla e espere a temperatura baixar a
250C. Coloque no dessecador e espere at que a temperatura se equilibre com o meio exterior. Pese e registre o peso a diferena de peso
antes e aps a queima nos fornece o peso da fibra bruta das amostras.
A pesagem nos fornece o peso do cadinho, da fibra bruta e dos
minerais.
Clculo:

P2 - peso final do cadinho mais fibra

P1 - peso do cadinho
A - quantidade de amostra
% de Fibra Bruta =

p2-p1
X 100
A

3.7. O MTODO DE VAN SOEST NA DETERMINAO

DA QUALIDADE DE FORRAGEIRAS
O mtodo de VAN SOEST se baseia na separao das diversas
fraes constituintes da forrageira, por meio de reagentes especficos,
denominados detergentes. Este mtodo apresenta vantagens em relao
a outros em virtude de sua maior preciso, alm de fornecer informaes sobre importantes componentes FDN, FDA, celulose, lignina,
cinza, slica, etc.
Por meio do Detergente Neutro, possvel separar o contedo
celular (parte das forragens solveis no detergente neutro) constitu-

31

do de protenas, gorduras, carboidratos solveis em gua, da parede

celular, tambm chamada Fibra em Detergente Neutro (FDN), que
constituda basicamente de celulose, hemicelulose, lignina e protena
lignificada.
A fim de solubilizar o contedo celular e a hemicelulose, alm
da maior parte da protena insolvel, VAN SOEST props um detergente cido especfico. Aps a digesto por este detergente, o produto
resultante ser quase que na sua maioria lignina e celulose (lignocelulose), sendo este produto conhecido como Fibra em Detergente cido
(FDA).
Conhecendo-se a porcentagem dos constituintes da parede celular (FDN) e da FDA do material analisado, possvel calcular a frao
de hemicelulose, apenas pela diferena entre aquelas fraes.
3.8. Determinao de fibra em detergente neutro

O mtodo Weende no parece satisfatrio para se obter informaes sobre os carboidratos, pois inclui no grupo da fibra bruta a celulose e somente a lignina insolvel em lcali. Parte da lignina passa a
fazer parte do extrato no nitrogenado, calculado por diferena, alm
de subestimar a fibra bruta. Por outro lado, no grupo dos extratos no
nitrogenados encontram-se fraes de naturezas diversas como: amido,
hemicelulose, pectina, lignina solvel em lcali e os carboidratos solveis em gua (amilose, frutasanas).
Esta diviso pode ser insatisfatria sob o ponto de vista nutricional, visto que a hemicelulose, pectina e lignina solvel em lcali no
apresentam as mesmas caractersticas nutricionais dos outros componentes sob o termo de extratos no nitrogenados.
O detergente neutro separa o contedo celular composto pelas
protenas, gorduras, carboidratos solveis, pectina e outros componen32

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tes solveis em gua presentes na parede celular (parte da forragem

insolvel em detergente neutro), tambm chamado de Fibra em Detergente Neutro (FDN).
Uma soluo em detergente neutra usada para dissolver substncias (pectinas) facilmente digeridas e o contedo celular das plantas
(protenas, acares e lipdios), deixando um resduo fibroso (FDN).
O detergente usado para solubilizar as protenas e o sulfito de
sdio e ajuda tambm a remover alguns compostos nitrogenados.
3.8.1. Procedimento para amostras
com baixo teor de amido
Pese cerca de 0,5 / 1,0 g de amostra seca ao ar, previamente
trituradas em moinhos com peneiras de 1 mm, coloque em bquer de
600 ml, adicione 100 ml do detergente neutro (temperatura ambiente).
Aquea at ferver (cerca de 5 minutos), reduzindo a temperatura para
evitar a formao de espuma, deixe em digesto durante 60 minutos,
logo em seguida faa a filtragem em cadinho filtrante, previamente pesado, por suco a vcuo. Lave com gua quente o material dentro do
cadinho filtrante e repita essa operao, certificando que todo material
passou para o cadinho. Lave igualmente o cadinho, tomando cuidado de
quebrar a crosta formada com ajuda de um basto de vidro, facilitando a
lavagem e removendo todo complexo gelatinoso formado.
Lave uma vez com 30 ml de acetona, leve os cadinhos para a estufa de 105C e deixe secar por uma noite ou por 8 horas temperatura
de 105C. Esfrie em dessecador e proceda a pesagem.
Considere fibra em detergente neutro a percentagem dos constituintes da parede celular, calculada pela diferena entre as pesagens.
3.8.2. Procedimento para alimentos

com alto teor de amido

O procedimento para a anlise o mesmo para amostras com
baixo teor de amido, o que muda que as amostras passam por um pr33

tratamento e por pequenas alteraes no procedimento: as amostras so

tratadas inicialmente com 30 ml de soluo de uria 8M e 50 de amilase, estvel ao calor. Devem ser bem misturadas e aquecidas em banhomaria a 90C por cinco minutos, e levadas ao dessecador por quatro
horas. A mistura deve ser diluda com 100 ml em detergente neutro, e
na seqncia seguir o procedimento norma para estimar FDA.
3.9. Determinao da fibra em detergente cido
A FDA a poro menos digestvel da parede celular das forrageiras pelos microorganismos do rmem. Constitui-se na sua quase
totalidade por lignina e celulose.
Para a determinao da fibra em detergente cido pode-se utilizar
o mtodo sequencial aproveitando os resduos da determinao de fibra
em detergente neutro, por ser mais rpido e permitir que se determine
mais de uma frao com uma mesma amostra.
Adicione 100 ml de soluo de detergente cido, levando os copos ao aparelho, deixando-os aquecer por cinco minutos a uma temperatura branda para evitar a formao de espuma. Aps iniciada a fervura, marcado o tempo de 60 min. para digesto. Aps este perodo,
faa filtragem imediatamente em cadinho filtrante de vidro, previamente pesado, por suco a vcuo. Lave com gua quente o material dentro
do copo certificando que todo material passou para o cadinho e tambm
lave dentro do cadinho. Lave igualmente com acetona, levando, aps
este procedimento, os cadinhos para estufa a 105C por 8 horas, deixando esfriar em dessecador, e depois pese os cadinhos.

A diferena entre FDN e FDA fornece a Hemicelulose.

34

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3.10. Determinao de lignina

Na nutrio animal, a lignina exerce um influncia negativa sobre a digestibilidade de outros nutrientes, j que atua como barreira
fsica na digesto dos nutrientes concentrados no interior da clula. A
lignina pouco digervel, e seu contedo varia de quatro a 12%, podendo chegar at a 20% da MS das plantas mais fibrosas ou com avanada
maturidade. Durante o processo da pr-secagem, a ao do calor pode
elevar o teor aparente da lignina. Por isso importante que a temperatura de pr-secagem no seja superior a 55oC.
Para se determinar a lignina parte-se da fibra em detergente cido, existindo dois mtodos: o do cido sulfrico 72% e o do permanganato de potssio.
O mtodo do permanganato possui vantagens sobre o cido sulfrico: mais rapidez, menos corrosivo, menos afetado pelos danos da
temperatura ambiente durante a secagem inicial da amostra. Entre as
desvantagens cita-se: o tamanho da partcula da amostra deve ser inferior a 1 mm a fim de que haja melhor contato com os reagentes.
Procedimento:

Determinada a fibra em detergente cido, coloque os cadinhos

contendo a fibra em uma bandeja de vidro, contendo gua. Adicione
30 ml de soluo de permanganato 2:1 em cada cadinho, colocando,
em cada, um basto de vidro, para agitar o contedo e permitir que a
soluo de 2:1 entre em contato com todas as partculas por mais ou
menos 15 minutos. Faa filtrao por suco a vcuo. Renove a gua
da bandeja e coloque a soluo 2:1 nos cadinhos, permanecendo ento
por 1:30 horas. A cor prpura deve estar presente por todo o processo
da oxidao.
35

Os cadinhos so ento novamente succionados a vcuo e colocados em bandeja limpa com gua, adicionando-se 30 ml de soluo
desmineralizadora. Depois de 10 min., succione e renove a soluo desmineralizadora, a fim de que a fibra fique de cor clara. Lave os cadinhos
com etanol e acetona e deixe-os secar em estufa a 105C. Calcule o teor
de lignina pela diferena de peso.

Figura 2: Diagrama do mtodo seqencial na determinao dos componentes

da parede celular.
36

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87,8888

0,515

0,4526

0,4825

MS
(g)
834

874

0,515

0,4526

0,4825

30,265

30,257
0,334

0,323

0,344

71,3304

71,3654

71,2953

Cad. + resResduo (g) CPC MS (%)

duo (g)

27,4134

27,4269

27,3999

MN %

29,942

29,913
30,092

30,078
0,150

0,165

30,033

33,6694 6,6321

33,1418

30,046 0,032 34,1969 6,6321

13,0358

0,059 13,0358

Cad. +
Cel. + Lignina FDA MS Lignina Celulo- Celulose
Peso Cad. Cad. +FDA
FDA (g)
(g)
(%)
(%)
se (g)
(%)
Cinza
(g)
(g)
(g)

Hemicelulose = FDN-FDA = 71,3304 33,6694 = 37,661

* mtodo do permanganato
** mtodo do cido sulfrico 72%

Mdia

87,888

0,549

1*

2**

87,888

ASE (%)

Amostra ASA (g)

MS
(g)

29,942

29,913

N Cad. Peso Cad. (g)

Quadro 5- Determinao de FDA, Lignina e Celulose

Contedo celular = 100 - FDN = 28.6696.

Mdia

87,8888

0,549

ASE %

ASA (g)

Amostra

Quadro 4- Determinao dos Constituintes da Parede Celular

( C.P.C.)

Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

37

3.11. Gordura ou extrato etreo

As gorduras ou lipdios so substncias insolveis em gua, mas

solveis em solventes orgnicos chamados extratores, como ter, clorofrmio, benzeno, etc. A gordura constitui a frao mais energtica
dos alimentos e composta de carbono, hidrognio e oxignio. Alm
das gorduras existem muitos outros compostos intimamente ligados ou
associados, tais como: fosfatdeos, esteris (colesterol), clorofila, leos
volteis, resina, etc., que so arrastados na presena destes solventes
orgnicos.
Gorduras, leos, pigmentos e outras substncias gordurosas solveis contidas em uma amostra seca so dissolvidos atravs da extrao
com ter, que ento evaporado desta soluo gordurosa. O resduo
resultante pesado, sendo chamado de extrato etreo ou gordura bruta.
O ter e as amostras devem ser livres de umidade, para evitar a co- extrao de componentes solveis em guas presentes na amostra, como
carboidrato, uria, acido lctico, glicerol e etc.
A riqueza em gordura pode influenciar o armazenamento de alguns produtos, uma vez que as gorduras dos alimentos constituem uma
frao bastante instvel, pois os alimentos ricos em tal substncia rancificam facilmente. Os alimentos rancificados perdem grande quantidade
de certos nutrientes essenciais, como as pr-vitaminas A e D, caroteno,
complexo B, Tc..., e alguns cidos graxos podem sofrer oxidao oxidativa.
O valor alimentar do extrato etreo no constante. Considera-se
que um grama de gordura produz 9,35 Kcal de energia bruta, quando
medida na bomba calorimtrica, o que corresponde aproximadamente
a 9 Kcal de energia metabolizvel. Os alimentos com maior teor de
gordura tm valores mais altos de NDT, pelo fato de a gordura fornecer
2,25 vezes mais energia que os carboidratos.
38

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Tcnicas Laboratoriais na Anlise de Alimentos

Os reagentes usados devem ser puros para anlise (P.A.), para

evitarmos que haja qualquer tipo de contaminao do material a ser
analisado.
Para se fazer a determinao de gordura existem dois mtodos,
que se diferenciam quanto ao solvente utilizado: mtodo frio (usando
ter sulfrico, cujo ponto de ebulio de 35 C e extrator Soxhlet),
e quente (usando ter de petrleo, cujo ponto de ebulio de 60 C).
O mtodo a frio leva em torno de 12-24 horas de extrao enquanto o
mtodo a quente dura em torno de 04-06 horas.
O mtodo quente mais rpido que o mtodo frio, e assim
chamado pois a extrao feita com temperatura mais elevada, cujo
ponto de ebulio esteja entre 40-65 C.
Procedimento (Extrao e Destilao)
Tome amostras de aproximadamente 2 gramas cada de ASA, em
papel de filtro e faa cartuchos. Pese os papis usados antes de pesar a
amostra e anote os dados em formulrio prprio. Coloque cada amostra
em recipiente prprio do aparelho de extrao Godifish ou Soxhlet.
Em um becker previamente limpo e de peso conhecido, em balana analtica, adicione 40 ml de ter de petrleo (P. A.) e coloque sob
o condensador fixando-o ao anel de rosca. Ligue a gua do condensador
e tome as devidas precaues para evitar o vazamento de ter durante
sua fervura e condensao.
O aparelho permanece ligado de 4 - 6 horas, com verificaes
ocasionais. Aps completada a extrao, remove a amostra do recipiente e coloque o tubo coletor de ter sob o condensador. O becker
reposto e o ter destilado. Antes que o ter do becker seque, retire
do aquecimento e derrame o ter do tubo coletor em frasco apropriado. Complete a secagem do becker em estufa a 105C por 30 minutos.
Aps este tempo, retire o becker e o coloque em dessecador para esfriar
e posteriormente ser pesado. O peso da gordura extrada calculado
pela diferena do becker vindo do dessecador menos o becker vazio.
39

0,4219
1,0977
0,0232
144,0647
144,0415
03
2,1135
87,8888
2,4048
1,9314
0,8171
03

Copo +
Gordura
EE MS % EE MN %
Gordura
(g)
(g)
Peso Copo
(g)
Copo N
MS (g)
ASE%
ASA (g)
Tara +
ASA (g)
Amostra Tara (g)

Quadro 6 Determinao da Gordura ou Extrato Etreo

40

4. Avaliao da digestibilidade

in vitro da matria seca

Na anlise de forragens a digestibilidade
pode ser definida como sendo a quantidade de
nutrientes consumidos que no aparece nas fezes. A tcnica tenta reproduzir em laboratrio
o que acontece no animal, e consiste em deixar a amostra da forragem em contato com o
lquido ruminal (inculo) em tubo de ensaio ou
potes, para tentar reproduzir as condies que
predominam no rmen-retculo, com presena
de microorganismos, condio de anaerobiose,
temperatura de 39 C, capacidade tampo, pH
6,9. Procura repetir o que acontece in vivo,
aps 24 a 48 horas de digesto microbiana.
Recomenda-se que a dieta do animal doador seja a mesma da amostra que se quer analisar, disponibilidade de animais para coleta e
diversidade dos tipos de amostras.
Para se ter confiana nos resultados obtidos, costuma-se fazer anlises com uma amostra ndice, s quais se conhece os seus valores.
Caso haja algum resultado discrepante para a
amostra ndice, sinal de que algum problema
ocorreu invalidando os resultados obtidos com
as amostras analisadas.
Para a avaliao da digestibilidade in
vivo, tem-se a tcnica de uma ou duas etapas,
dependendo da riqueza em protena do material
a ser utilizado (TILLEY e TERRY, 1963).

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1a Etapa: para a avaliao da digestibilidade pese duas amostras

com peso em torno de 1 g de ASA, que foram colocadas em tubos prprios ou potes para ensaio de digestibilidade, adicionando-se aos tubos
40 ml de saliva artificial (soluo tampo de Mc Dougall), e 10 ml de
inculo de rmen. Passe CO2 sobre a superfcie do contedo dos tubos
para eliminar o O2 presente e imediatamente feche com rolhas de
borracha equipada com vlvula de Bunse. Incube os tubos por 48 h a
39 oC, em estufa de temperatura controlada sofrendo agitaes suaves
(3 a 4 vezes ao dia).
2a Etapa: Aps essas 48 h de digesto microbiana, retire os tubos da estufa adicionando aos mesmos 6 ml de cido clordrico 20 %
v/v, colocados (2 + 2 + 2 ml) para evitar a formao de bolhas de ar,
e adicione tambm 2 ml de soluo de pepsina a 5 % p/v. Coloque os
tubos (destampados) de volta estufa para nova incubao durante 48
h a 39 oC, fazendo agitaes ocasionais (3 a 4 vezes ao dia) como na 1a
etapa. A pepsina promove uma digesto na segunda etapa, desdobrando
a protena do substrato.
Finalmente, retire os tubos, fazendo a filtrao do resduo, quantitativamente, com a ajuda de gua em piseta, para cadinhos filtrantes
previamente pesados. Leve os cadinhos estufa a 105 oC, por uma noite, esfriando-os em dessecador e pesando-os.
recomendado a incluso de tubos controles brancos em cada
procedimento de anlise, afim de se conhecer a matria seca residual do
lquido de rmen utilizado.
A seguir, apresentada a frmula de como se calcula a digestibilidade in vitro da matria seca.
Clculo:
DIVMS = 100 x g/MS amostra - (g/MS residual - g/MS branco)
g/MS amostra

Os resultados esto no quadro 8.

41

4.1. Digestibilidade in vitro da matria seca (divms)

usando o instrumento daisy (in vitro true digestibility- ivtd)

4.1.1. Reagentes
soluo Tampo A:

g/litro

para 2 jarros
(2660 ml)

1. KH2PO4

10,0

26,600 g

2. MgSO4.7H2O

0,5

1,330 g

3. NaCl

0,5

1,330 g

4. CaCl2.2H2O

0,1

0,266 g

5. Uria (grau de reativo)

0,5

1,330 g

Soluo Tampo B:

g/litro

para 2 jarros

(532 ml)

6. Na2CO3

15,0

7,980 g

7. Na2S.9H2O

1,0

0,532 g

4.1.2. Procedimentos
4.1.2.1. Preparao das bolsas de filtro e amostras:

Um dia antes da incubao, pr-enxge as bolsas de filtro F 57

ou TNT (ver amostra) com acetona dentro de um recipiente de vidro
durante trs a cinco minutos, depois escoe a acetona e leve para secar
por completo durante dois minutos em estufa com ar seco (55 C). Retire e faa a marcao das bolsas com caneta permanente (no usar a de
retroprojetor) ou lpis preto e coloque na estufa de 105C at o outro
dia (uma noite). O enxge em acetona remove um surfactant que pode
inibir a digesto microbiana.
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No dia seguinte coloque as bolsas no dessecador (dentro do recipiente) por 40 minutos. Pese cada bolsa de filtro e registre o peso (W1),
uma a uma, sem toc-las antes da pesagem.Tare a balana e pese 0,25 g
de amostra (W2), de preferncia diretamente na bolsa de filtro.
Sele as bolsas e armazene-as adequadamente para que posteriormente (quando as solues tampes j estiverem preparadas) sejam colocadas no jarro do Fermentador Artificial de Rmen (DAISY).
So feitas at 25 bolsas por jarro (24 amostras + 1 branco), colocadas
equitativamente nos quatro jarros de digesto bem como dentro do jarro
ocupar os dois lados. Inclua uma bolsa lacrada vazia (branco) em cada
jarro que levar ao fator de correo (W4). As amostras so feitas em
duplicata sempre.
Quando a DAISY est comeando a ser utilizada (incio de operao) aconselhvel utilizar, alm do branco, duas bolsas lacradas
com um testemunha (padro conhecido, valores de digestibilidade tabelados), que dependendo do material a ser analisado pode ser: feno
de alfafa modo a 1 mm para volumosos, milho modo a 1 mm para
concentrados energticos e farelo de soja modo a 1 mm para concentrados proticos). Isto feito somente para fins de comparao (valor
conhecido com valor encontrado).
4.1.2.2. Preparao das Solues Tampes
(para cada 2 jarros da DAISY):
No dia da incubao (DAISY), prepare as solues tampes A e
B, separadamente. O ideal que enquanto uma pessoa prepara as solues, outra coleta e prepara o incuo (lquido ruminal). Enquanto feito
o preparo das solues, deve-se manter o copo do liquidificador, as provetas graduadas para o incuo e o funil tudo em banho-maria a 39C.
Anote os pesos de cada reagente em copos plsticos separados
(numere de um a sete os copinhos, um nmero por reagente, siga a

43

ordem da marcha). Utilize dois recipientes grandes (soluo total com

3,2 litros) para preparar as solues A e B separadas. Anote em cada
recipiente a soluo que ali ser feita. Adicione os reagentes lavando
os copinhos com gua destilada morna (39C), complete com gua destilada morna at 2660 ml para a soluo A e 532 ml para a B, depois
misture bem com o basto de vidro.
Misture bem as solues A e B (relao 1:5) e leve ao pHmetro
para aferir o pH da mistura, que dever ser 6,8 a 39C.
Adicione a soluo resultante (A+B) nos jarros (distribua uniformemente entre os dois jarros, com 1600 ml para cada jarro da soluo
A+B) e tambm nos outros dois jarros (outro preparo de solues). Coloque as bolsas com as amostras dentro dos jarros com a soluo A+B.
Se a DAISY no for utilizada totalmente (100 bolsas, ou menos de 4
jarros), acrescente no(s) jarro(s) sem amostras o mesmo peso em gua,
para que a mquina trabalhe a rotao adequadamente.
Ative os botes de aquecimento e rotao, permitindo que a temperatura nos jarros da DAISY atinja o equilbrio pelo menos 20 minutos
antes da incubao (incuo + CO2). Este tempo pode ser usado para o
preparo do incuo.
4.1.2.3. Coleta e Preparao do Lquido Ruminal

e Incubao
Observaes:
MANUTENO TEMPERATURA 39C
(MATERIAIS E INCUO)
INFUSO CONSTANTE DE CO2, NO BORBULHAR
O LQUIDO
DUAS PESSOAS (UM SE PREOCUPA S COM CO2)

Antes da coleta, aquea tudo com gua a 39 C (garrafa trmica

com gua a esta temperatura e recipiente de coleta aquecido). Prepare
a bomba de vcuo (tomada, mangueira do vcuo e mangueira coletora)
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e depois abra a fstula, introduzindo a mangueira coletora diretamente

na fase lquida do material ruminal. Ligue a bomba at sugar cerca de
2/3 da capacidade do recipiente coletor para que no entre lquido no
interior da bomba (perigo).
Retire a gua a 39C da garrafa trmica rapidamente e adicione o
lquido coletado, juntamente com infuso constante de CO2 antes, durante e depois dessa adio na garrafa, fechando-a gradativamente com
a adio de + CO2. Repita as operaes acima com cuidado at completar o contedo da(s) garrafa (s) trmica(s) ser necessrio cerca de
dois litros de lquido ruminal para cada utilizao completa da DAISY
(quatro jarros x 400 ml = 1600 ml).
Leve o material coletado na garrafa trmica rapidamente ao laboratrio onde j deve estar preparada e aquecida a soluo tampo A+B
com as amostras nos jarros.
Os materiais utilizados (liquidificador, funil, provetas) para preparar e medir o incuo devem estar no banho-maria a 39C. Esvazie
ento os contedos inteiros da(s) garrafa(s) trmica(s) no liquidificador
aquecido e com um pouco de CO2, acrescente rapidamente o CO2 e misture a uma velocidade alta durante 30 segundos. Espere um segundo
para esvaziar o liquidificador no funil (para diminuir espuma formada).
A ao de mistura serve para desalojar os micrbios que se prenderam nas fibras da massa do rmen e asseguram uma populao microbiana adequada para a anlise in vitro. Durante este tempo retire a
proveta e o funil do banho-maria e arrume com o tecido para a filtragem
(tecido da amostra dobrado ao meio, no reutilizar, somente um uso).
Filtre a quantidade inteira no tecido e aperte com as mos; se sobrar
lquido no liquidificador, infundir CO2 com ele quase fechado at terminar de filtrar e tambm na proveta onde est o incuo.
Mea 400 ml deste lquido filtrado (incuo) em cilindro graduado (proveta) aquecido e com CO2 e remova um jarro por vez da DAISY
45

ainda ligada (rotao e aquecimento), acrescentando este lquido e infundindo CO2 continuamente durante a colocao at fechar a tampa
de forma segura (cerca de trinta segundos com CO2). Coloque de volta
na mquina e repita o procedimento at o ltimo jarro, feche definitivamente a DAISY, abrindo-a ocasionalmente somente para checar rapidamente a rotao.
Incube durante 48 horas para determinar a DIVMS; a DAISY
manter uma temperatura de cerca 39,5C. Marque o horrio exato da
incubao para que as prximas etapas (adio da pepsina + HCl, retirada das amostras incubadas e pesagem final das bolsas), sejam feitas
neste mesmo horrio nos outros dias.
4.2. Segundo Estgio (Pepsina + HCl 6N)

Verifique se h disponibilidade do HCl 6N preparado. Cerca de

40 minutos a 1 hora antes do horrio marcado da incubao comece a
preparar toda a soluo de pepsina em meio cido a ser usada para os
quatro jarros.
Use quatro bqueres de 250 ml, um para cada jarro. Pese quatro
vezes 8 gramas de pepsina e dissolva em 35 ml de gua destilada misturando bem. Aquea moderadamente na chapa at ficar morno (dissoluo melhora, mas no deixe muito quente a temperatura para no
desnaturar a enzima).
De preferncia use o agitador magntico aps deixar morno.
Leve prximo ao pHmetro regulado cada bquer um a um e deixe os
outros na chapa (cuidado com temperatura). Pegue uma pipeta pequena
plstica para gotejar o HCl 6N. Ajuste o pH at 2,9 a 3,1, e se necessrio
acrescente gotas do cido com a pipeta, gota a gota, mensurando o pH
at atingir o adequado citado acima. Se o pH passar um pouco, goteje
soda custica moderadamente.
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Volte para a chapa e pegue o outro bquer, repetindo a operao

acima at fazer todas as quatro solues. Espere o horrio (o mesmo da
incubao) mantendo os bqueres na chapa morna e leve at a DAISY
todos eles, acrescentando a soluo nos jarros, um a um, e mantendo o
funcionamento da DAISY antes de retornar o jarro mquina agite-o
um pouco. Deixe por mais 24 horas na mquina.
No mesmo horrio do outro dia, pegue um recipiente para acomodar as bolsas e remova todos os jarros da DAISY, desligando-a.
Descarte o lquido e apie as bolsas, retirando-as dos jarros, e lave-as
at a gua ficar clara no recipiente. Remova o excesso de gua das bolsas e adicione acetona at cobri-las. Deixe por trs a cinco minutos na
acetona com um pesinho em cima.
Descarte a acetona e retire o excesso das bolsas. Leve o recipiente com as bolsas para a estufa a 55C por uns dois minutos e depois coloque na estufa a 105C por uma noite. No outro dia, no mesmo horrio
da incubao coloque o recipiente com as amostras no dessecador por
40 minutos (usar luva) e depois desse tempo retire sem tocar nas bolsas (usar a pina) e pese uma a uma, registrando os pesos finais (W3).
Descarte ou prepare as bolsas para serem reutilizadas (mais duas vezes
apenas, porm no aconselhvel).
4.3. Clculos
% DIVMN= 100 [(W3- (W1 x F)) x 100 / W2]
Onde:

peso da tara da bolsa (vazia)

W2 peso das amostras (mais ou menos 0,25 g)
W1

47

W3 peso da bolsa final aps 48 horas fermentando e 24 horas de

digesto com meio cido e pepsina

F correo da bolsa em branco (peso final da bolsa em branco
aps o processo todo/ W4) W4 peso da bolsa em branco antes da incubao (vazio)
Faa a relao para encontrar o valor em base de MS.
% DIVMS = 100 -((W3 -(W1 x F )) x 100 / (W2 x MS)

4.4. Procedimentos de coleta,

preparo e incubao do incuo

Figura 8 : Procedimentos de coleta, preparo e incubao do incuo

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I-1
I-2
I-3

B-1
B-2
B-3

N.
tubo
3
4

36,3802
47,2920
27,1539

33.8280
47.7156
26.6993

32,0335
31,5414

Tubo

Mdia do Branco = 0,0414

F. ndice
1
2
3
Mdia

Branco
1
2
3

Brac. r.
Brac. r.
Mdia

Amostra

1,0449
1,0328
1,1527

1,0536
1,0792

ASA (g)

MS (g)

94,84
94,84
94,84

0,9910
0,9795
1,0932

87,8888 0,9260
87,8888 0,9485

ASE (%)

Quadro 7 - Digestibilidade In Vitro da Matria Seca

36,8227
47,7399
27,6379

33.8822
47.7505
26.7344

Tubo +
resduo
32,4741
32,0012

0.4425
0.4479
0.4840

0.0542
0.0349
0.0351

0,4406
0,4598

Resduo

0.4011
0.4065
0.4426

Res. Branco
0,3992
0,4184

0.5899
0.5730
0.6506

0,5268
0,5301
0,5285

MS Digerida

59.53
58.50
59.51
59.13

56,89
55,89
56,39

MS (%)

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