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GUIA DE

MICROBIOLOGIA
1 EDIO

ABDI
AGNCIA BRASILEIRA
DE DESENVOLVIMENTO
INDUSTRIAL

ABIHPEC
ASSOCIAO BRASILEIRA DA
INDSTRIA DE HIGIENE PESSOAL,
PERFUMARIA E COSMTICOS

SEBRAE
SERVIO BRASILEIRO DE APOIO S
MICRO E PEQUENAS EMPRESAS

1
2
GUIA DE
MICROBIOLOGIA
1 EDIO

CONTROLE MICROBIOLGICO NA INDSTRIA DE HIGIENE PESSOAL,


PERFUMARIA E COSMTICOS

PROCEDIMENTOS, PARMETROS, ORIENTAES E METODOLOGIAS ANALTICAS

2015

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APRESENTAO
O Programa de Desenvolvimento Setorial de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmeticos (PDS/HPPC),
coordenado pela Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos
(ABIHPEC), em parceria com a Agncia Brasileira de Desenvolvimento Industrial (ABDI) e o Servio
Brasileiro de Apoio s Micro e Pequenas Empresas (SEBRAE), apresenta o Guia de Microbiologia, nova
publicao do PDS/HPPC. O Guia faz parte de uma srie temtica, que visa disponibilizar para as indstrias
de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos (HPPC) um valioso suporte tcnico, estruturado sob a forma
de fascculos ou livretos, sobre temas pontuais referentes s etapas, procedimentos, controles e/ou aes
pertinentes ao processo produtivo.

O gerenciamento da qualidade microbiolgica uma etapa primordial para assegurar a qualidade do


produto final, assim como o controle de qualidade microbiolgica possui funo de extrema importncia,
na garantia da segurana e da qualidade dos produtos de HPPC.

A partir deste pensamento, a ABIHPEC coordena o Comit Brasileiro de Higiene Pessoal, Perfumaria e
Cosmticos ABNT/CB 57 e representa o Brasil em reunies internacionais do ISO/TC 217 Cosmetics no
grupo da ISO - International Organization for Standardization, que discute os trabalhos relacionados a
este tema por meio de sua Comisso de Estudo de Microbiologia, grupo aberto a participao de toda
a sociedade brasileira, em atendimento as regras da Associao Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT).

Este fascculo uma recomendao e disponibiliza um condensado de prticas e metodologias


especficas para o setor de HPPC quanto ao controle microbiolgico aplicvel a estes produtos, bem
como no que se refere ao ambiente produtivo, sistemas instalados, equipamentos, matrias-primas e
insumos utilizados, em especial para as micro e pequenas empresas.

Os critrios adotados e as prticas descritas neste guia, refletem as normas e os regulamentos tcnicos
vigentes, estabelecidos para o setor no mbito de seu controle microbiolgico observado o rigor
pertinente matria.

Nosso agradecimento ao grupo de profissionais de notrio saber, participantes da elaborao e reviso


desta ferramenta, cuja aplicabilidade e observao ao contedo por parte dos produtores e importadores
refletir em produtos disponveis no mercado com a conformidade requerida para uso seguro de seus
consumidores.

A contribuio dos tcnicos que atuam no setor foi fundamental para que o trabalho tivesse os critrios
necessrios e refletisse a responsabilidade e atitude do setor de HPPC.

O Guia no pretende esgotar o assunto e temos a expectativa que novas publicaes seguiro no futuro.

Joo Carlos Basilio | Presidente


Renata Teixeira do Amaral | Gerente de Assuntos Regulatrios

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COORDENAO TCNICA

Renata Amaral ABIHPEC

Juliana Souza ABIHPEC

APOIO GERENCIAL E COORDENAO DO PROJETO PDS

Eliene da Conceio - ABIHPEC

ELABORAO DO MANUAL

Artur Joo Gradim - AVISA

Marina Anjos - AVISA

GRUPO DE TRABALHO

Andrea Carotta - HYPERMARCAS

Carolina Cacais - AVISA

Danielle Cunha - JOHNSON & JOHNSON

Dbora Rodriguez - NATURA

Karla Constncio - LACQUA DI FIORI

Maria A. Marcondi - HYPERMARCAS

Silvia Yuko Eguchi - GRUPO INVESTIGA

Thamires Rodrigues - AVISA

Vera Lcia Siqueira - SANQUIMIUS

COLABORADORES

Flvia Montibeller OXITENO

Juliana Shiki MARY KAY

Karina Silva AMWAY

PARCEIROS NO PDS-HPPC

ABDI / ABIHPEC / SEBRAE

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LISTA DE SIGLAS

ABNT - Associao Brasileira de Normas Tcnicas

ANVISA - Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria

AW. - Atividade da gua ou water activity

ATCC - American Type Culture Collection

CADRI - Certificado de Movimentao de Resduos de Interesse Ambiental

CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental

FMEA - Anlise de modo e efeito de falha ou Failure Mode and Effects Analysis

INMETRO - Instituto Nacional de Metrilogia, Qualidade e Tecnologia

ISO - International Organization for Standardization

HPPC - Higiene Pessoal Perfumaria e Cosmticos

INCQS - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade

NBRC - NITE Biological Research Center

NCTC - National Colletion of Type Cultures

OGMs - Organismos geneticamente modificados

REBLAS - Rede Brasileira de Laboratrios Analticos em Sude

SDA - Sabouraud dextrose agar

TSA - Tryptic soy agar

UFC - Unidade formadoras de colnia ou colony forming unit

USP - Farmacopia Americana ou United State Pharmacopeia

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SUMRIO

APRESENTAO.........................................................................................5
1 INTRODUO...........................................................................................12
2 MICROBIOLOGIA......................................................................................13
2.1 FORMULAO......................................................................................................................................................... 13

2.1.1 Formulando para no contaminar .............................................................................................................13

2.2 BIOSSEGURANA EM LABORATRIOS.................................................................................................13

3 CONTROLE MICROBIOLGICO DE PRODUTOS DE HPPC.......................17


3.1 MARCO REGULATRIO (RDC 481/99 E GENERALIDADES APLICVEIS)..................................................17

3.2 PRODUTOS E SUSCEPTIBILIDADE..........................................................................................................18

3.2.1 AW - Atividade da gua..............................................................................................................................18

3.2.2 pH..................................................................................................................................................................18

3.2.3 Teor Alcolico...............................................................................................................................................19

3.3 MATRIAS-PRIMAS.................................................................................................................................19

3.3.1 gua..............................................................................................................................................................19

3.3.1.1 Parmetros Microbiolgicos.........................................................................................................20

3.3.1.2 gua potvel..................................................................................................................................20

3.3.1.3 Portaria MS n 2914/11..................................................................................................................21

3.3.1.4 Processos de Purificao...............................................................................................................21

3.3.1.5 Validao.......................................................................................................................................24

3.3.1.6 Uso racional e sustentvel............................................................................................................24

3.3.2 Matrias-primas de origem animal/vegetal/mineral.................................................................................25

3.3.3 Matrias-primas de origem sinttica..........................................................................................................25

3.4 MATRIAS-PRIMAS DE AO CONSERVANTE......................................................................................25

3.5 EMBALAGEM..........................................................................................................................................34

4 GESTO DA QUALIDADE.........................................................................35
4.1 CONTROLE DE QUALIDADE DOS EQUIPAMENTOS..............................................................................36

4.2 CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIO DE CULTURA, REAGENTES E KITS COMERCIAIS......................36

4.3 CONTROLE DE QUALIDADE DE COLABORADORES.............................................................................37

4.4 GARANTIA DA QUALIDADE...................................................................................................................38

4.4.1 Ensaio de Proficincia..................................................................................................................................38

4.4.2 Conceitos Qualificao e Validao...........................................................................................................38

8
4.4.3 Incerteza de Medio..................................................................................................................................39

4.4.4 Auditorias Internas.......................................................................................................................................39

4.4.5 Controle de Registros..................................................................................................................................40

4.4.6 Relatrio de Ensaio......................................................................................................................................41

5 LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA.......................................................42
5.1 BOAS PRTICAS DE LABORATRIO......................................................................................................42

5.1.1 Pessoal...........................................................................................................................................................42

5.1.2 Instalaes Prediais......................................................................................................................................42

5.1.2.1 Fluxo das atividades......................................................................................................................43

5.1.2.2 Materiais e Tipos...........................................................................................................................43

5.1.2.3 Armazenagem...............................................................................................................................44

5.1.2.4 Higienizao (limpeza) e Sanitizao...........................................................................................44

5.1.3 Equipamentos...............................................................................................................................................44

5.1.3.1 Tipos...............................................................................................................................................44

5.1.3.2 Qualificao/Calibrao/Aferio................................................................................................45

5.1.3.3 Manuteno Preventiva e Corretiva.............................................................................................45

5.2 CEPAS.....................................................................................................................................................46

5.2.1 Identificao de Microrganismos................................................................................................................46

5.2.1.1 Colorao de Gram.......................................................................................................................46

5.2.1.2 Colorao de Wirtz-conklin..........................................................................................................47

5.2.1.3 Kits de Identificao......................................................................................................................47

5.2.2 Manuteno de cepas..................................................................................................................................47

5.2.3 Controle de gerao....................................................................................................................................52

5.2.4 Validade........................................................................................................................................................53

6 CONTROLE E PREPARO DE MATERIAIS PARA ANLISE..........................54


6.1 PREPARO DE MATERIAIS E DE AMOSTRAS PARA ANLISE MICROBIOLGICA...................................54

6.1.1 Meios de cultura e solues........................................................................................................................54

6.1.1.1 Pesagem de meios de cultura......................................................................................................56

6.1.1.2 pH...................................................................................................................................................57

6.1.1.3 Tipos de esterilizao...................................................................................................................57

6.1.1.4 Validade.........................................................................................................................................57

6.1.1.5 Promoo de crescimento / esterilidade....................................................................................58

6.1.1.6 Armazenagem...............................................................................................................................59

6.1.2 Amostras para anlise microbiolgica.......................................................................................................60

6.1.2.1 Assepsia.........................................................................................................................................60

9
6.1.2.2 Pesagem........................................................................................................................................60

6.1.2.3 Definio nmero de amostras....................................................................................................60

6.2 INATIVAO DE SISTEMAS ANTIMICROBIANOS...................................................................................61

7 MTODOS MICROBIOLGICOS...............................................................62
7.1 PLAQUEAMENTO...................................................................................................................................62

7.2 CONTAGEM DE MESFILOS AERBIOS TOTAIS...................................................................................62

7.2.1 Tempo e Temperatura timas de Incubao............................................................................................63

7.2.2 Leituras / clculos.........................................................................................................................................63

7.3 PESQUISA DE PATGENOS E IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS..............................................63

7.3.1 Coliformes Totais e Fecais (Escherichia coli);.............................................................................................63

7.3.2 Pseudomonas aeruginosa...........................................................................................................................65

7.3.3 Staphylococcus aureus.................................................................................................................................66

7.3.4 Clostrdios sulfito redutores........................................................................................................................67

7.4 TESTE DE DESAFIO DA EFICCIA DO SISTEMA CONSERVANTE (CHALLENGE TEST)..........................68

7.4.1 Nvel de Inculo............................................................................................................................................69

7.4.2 Microrganismos a serem inoculados .........................................................................................................70

7.4.3 Volume de microrganismo por amostra.....................................................................................................71

7.4.4 Homogeneizao e armazenagem das amostras inoculadas..................................................................72

7.4.5 Validao do neutralizante utilizado no teste............................................................................................72

7.4.6 Temperatura e tempo de incubao..........................................................................................................73

7.4.7 Perodos de teste.........................................................................................................................................74

7.4.8 Critrio de aceitao (Log de reduo por categoria de produtos)........................................................74

7.4.9 Leituras / Clculos........................................................................................................................................75

7.5 HALO DE INIBIO ...............................................................................................................................75

7.5.1 Seleo do meio de cultura e microrganismo a ser utilizado..................................................................75

7.5.2 Difuso em gar ..........................................................................................................................................76

7.5.3 Leitura............................................................................................................................................................77

7.5.4 Critrio de aceitao....................................................................................................................................77

7.6 REDUO LOGARTIMICA ....................................................................................................................78

7.7 ATIVIDADE ANTISSPTICA.....................................................................................................................78

7.7.1 Preparao dos microrganismos-teste.......................................................................................................79

7.7.2 Toxicidade e Eficcia do Neutralizante......................................................................................................79

7.7.2.1 Avaliao da toxicidade do Neutralizante..................................................................................79

7.7.2.2 Eficcia da Neutralizao..............................................................................................................80

7.7.3 Avaliao da Atividade Antimicrobiana da amostra.................................................................................81

10
7.7.4 Anlise de Resultados..................................................................................................................................82

8 CONTROLE MICROBIOLGICO NO AMBIENTE INDUSTRIAL..................83


8.1 CLASSIFICAO DE RISCO/SUCEPTIBILIDADE A CONTAMINAO MICROBIOLGICA

DE MATERIAIS E REAS ........................................................................................................................83

8.1.1 Definio dos pontos (alto/mdio e baixo risco).......................................................................................83

8.1.2 Frequncia de testes....................................................................................................................................84

8.1.3 Anlise dos dados........................................................................................................................................84

8.2 AMOSTRAGEM (TCNICA/TIPO)............................................................................................................85

8.2.1 Amostragem de ambientes: ar (esttico e dinmico)...............................................................................86

8.2.2 Superfcies e Equipamentos (rodac/ swab)................................................................................................86

8.2.3 Pessoal (swab/rodac)....................................................................................................................................87

8.2.4 Matrias-primas- reteno (referncias regulatrias)................................................................................88

8.2.5 Outros insumos de processo (panos, escovas, esponjas).........................................................................89

9 LIMPEZA E SANITIZAO........................................................................90
9.1 DEFINIO CRITICIDADE (PIOR CASO POR AGRUPAMENTO DE PRODUTO/

EQUIPAMENTO/UTENSLIOS/PISO)........................................................................................................90

9.2 QUALIFICAO DOS EQUIPAMENTOS.................................................................................................93

9.2.1 Agentes de limpeza, sanitizantes e sua concentrao.............................................................................93

9.2.2 Frequncia e tempo de contato.................................................................................................................97

9.3 VALIDAO DO PROCESSO DE LIMPEZA E SANITIZAO..................................................................97

10 RESDUOS / DESCARTES DE MATERIAIS..................................................99


10.1 PROCEDIMENTOS PARA DESCARTE DE MATERIAIS COM RISCO BIOLGICO.....................................99

10.2 DESCONTAMINAO............................................................................................................................99

10.3 IDENTIFICAES DAS REAS COM RISCO MICROBIOLGICO - .......................................................100

10.4 DERRAMAMENTO DE MATERIAIS CONTAMINADOS..........................................................................100

11 CONSIDERAES FINAIS.......................................................................101

12 GLOSSRIO............................................................................................102

13 BIBLIOGRAFIA.........................................................................................104

11
1 INTRODUO

Esta publicao destina-se aos profissionais que trabalham com produtos de higiene pessoal, perfumaria
e cosmticos nas reas de fabricao, qualidade e reas indiretamente relacionadas estas. Ainda que
a unidade no conte com instalaes laboratoriais para anlises microbiolgicas, a compreenso do
contedo deste guia servir como suporte para que contratao de servio de terceiros seja mais criteriosa,
tanto no momento de escolha das anlises requeridas e dos prestadores de servio, como tambm no
planejamento de amostragem e interpretao dos resultados analticos obtidos.

Tcnicos analistas em geral, formuladores de produtos e demais profissionais de pesquisa e


desenvolvimento, operadores de fbrica como tambm compradores, pessoal de Marketing e no apenas
os profissionais microbiologistas compem o pblico-alvo deste trabalho.

Podero ainda encontrar suporte tcnico para o seu dia-a-dia, professores, alunos e interessados em
ingressar na atraente rea de HPPC.

Conforme a legislao brasileira vigente e harmonizada no Mercosul, exigida a apresentao dos dados
de Anlises Microbiolgicas, no ato da regularizao do produto. E nas inspees, exigida a apresentao
dos dados de controle de qualidade dos lotes, dos mtodos de ensaio e dos registros das anlises.

Este Guia tem por objetivo apresentar aos profissionais e ao segmento da rea de Microbiologia uma
abordagem sobre os procedimentos, parmetros e anlises microbiolgicas em produtos acabados e
matrias-primas para HPPC.

12
2 MICROBIOLOGIA
2.1 FORMULAO

2.1.1 Formulando para no contaminar

Assegurar a qualidade microbiolgica dos produtos um desafio que deve se iniciar na fase de pesquisa e
desenvolvimento. Os qumicos formuladores geralmente do pouca importncia para o fato de que certas
frmulas so mais facilmente preservadas da contaminao por microrganismos do que outras. Observar
os aspectos fsico-qumicos destas frmulas e identificar os fatores que as tornam menos susceptveis
sobrevivncia e ao crescimento de fungos e bactrias pode determinar uma nova tcnica de formular o
sistema conservante do produto; pode transformar o jeito de se criar frmulas.

Relegar para o final do trabalho a escolha dos conservantes, tratando-os como simples coadjuvantes um
mtodo que no condiz com as tendncias de minimizao do uso de conservantes. A criao de produtos
autoconservantes atende demanda de um segmento crescente de consumidores que preferem usar
produtos cada vez mais seguros, exime o projeto de complicaes regulatrias, alm de reduzir custos.
Simplesmente retirar os conservantes da frmula no a soluo.

Algumas das tendncias da nova formulao de produtos so: o ajuste da atividade de gua e do pH;
a utilizao de agentes antioxidantes, tensoativos e quelantes; a aplicao de determinadas fragrncias
e de extratos naturais e outros mecanismos para fazer uso de propriedades antimicrobianas ou de
componentes de frmula que so multifuncionais e no so regulamentados como conservantes. A opo
por embalagens no-contaminantes do tipo dose nica ou dispensers tambm uma ttica para minimizar
ou zerar o uso de conservantes (Kabara; Orth, 1997).

preciso enfatizar que a fabricao de produtos autoconservantes possvel em operaes que adotam
boas prticas de fabricao e que contam com instalaes e equipamentos favorveis ao controle
microbiolgico.

Assim, o futuro da qualidade microbiolgica de produtos de HPPC desafiante no apenas para


microbiologistas e gestores da qualidade, mas primeiramente para os formuladores e demais profissionais
que atuam em tecnologias de inovao.

2.2 BIOSSEGURANA EM LABORATRIOS

Biossegurana refere-se ao conjunto de medidas voltadas para a preveno, controle, minimizao


ou eliminao dos riscos presentes nas atividades de pesquisa, produo, ensino, desenvolvimento

13
tecnolgico e prestao de servios que podem comprometer a sade de seres humanos, animais,
ambientes e/ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.

Partindo-se do princpio de que a preveno de acidentes responsabilidade de todos, e considerando-


se a natureza dos servios efetuados em laboratrios de microbiologia, os profissionais devem se informar
e estar aptos a cumprir as normas estabelecidas. Portanto, os treinamentos e reciclagens devem ser
programados para assegurar que todos os profissionais participem. Se ocorrerem acidentes, estes devem
ser comunicados e devidamente monitorados.

Cada laboratrio deve dispor de um manual de biossegurana que identifique os riscos e especifique as
prticas e os procedimentos que minimizem ou eliminem estes riscos. Deve dispor dos equipamentos de
proteo individual e de proteo coletiva necessria s operaes.

Os materiais contaminados por agentes biolgicos devem ser tratados e dispostos corretamente. Estes
podem ser: bactrias, fungos, alm das amostras biolgicas, no frequentemente encontradas em
laboratrios de produtos de HPPC.

Conforme o grau de patogenicidade, os agentes biolgicos so entendidos segundo a classificao de


risco a seguir (BRASIL, 2006):

Classe de risco 1: baixo risco para o indivduo e para a coletividade, com baixa probabilidade de

causar doena ao ser humano.

Classe de risco 2: risco individual moderado para o indivduo e com baixa probabilidade de

disseminao para a coletividade. Podem causar doenas ao ser humano, entretanto, existem

meios eficazes de profilaxia e/ou tratamento.

Classe de risco 3: risco elevado para o indivduo e com probabilidade moderada de disseminao

para a coletividade. Podem causar doenas e infeces graves ao ser humano, entretanto nem

sempre existem meios eficazes de profilaxia e/ou tratamento.

Classe de risco 4: risco elevado para o indivduo e com probabilidade elevada de disseminao

para a coletividade. Apresenta grande poder de transmissibilidade de um indivduo a outro.

Podem causar doenas graves ao ser humano, ainda no existem meios eficazes para a sua

profilaxia ou seu tratamento.

Os laboratrios para controle microbiolgico de produtos de HPPC, geralmente se enquadram na classe


de risco 2.

Com relao ao descarte de resduos gerados no laboratrio, deve ser observado o cumprimento da
Poltica Nacional de Resduos Slidos (PNRS), Lei N 12.305 de 2 de Agosto de 2010, que define os

14
termos: resduos de servios de sade e os rejeitos, estes como sendo os resduos slidos que, depois de
esgotadas todas as possibilidades de tratamento e recuperao por processos tecnolgicos disponveis e
economicamente viveis, no apresentem outra possibilidade que no a disposio final ambientalmente
adequada.

As Boas Prticas de Laboratrio, que devem estar descritas num manual, podem ser resumidas conforme
segue.

1. Restringir o acesso de pessoas ao laboratrio; somente os indivduos autorizados podem


ingressar nos ambientes laboratoriais;
2. Observar os princpios bsicos de higiene, entre eles: manter as mos limpas e unhas aparadas;
sempre lavar as mos antes e aps procedimentos (manuseio de materiais biolgicos viveis; uso
das luvas; antes de sair do laboratrio; antes e aps a ingesto dos alimentos e bebidas, etc.). Se
no existirem pias no local, deve-se dispor de lquidos anti-spticos para limpeza das mos;
3. Proibir: a ingesto e/ou o preparo de alimentos e bebidas, fumar, mascar chicletes, manipular
lentes de contato, utilizao de cosmticos e perfumes, armazenamento de alimentos para
consumo nas reas de manipulao de agentes biolgicos e qumicos. Em todos os laboratrios
deve haver uma rea designada como refeitrio;
4. Pipetar com a boca expressamente proibido e jamais se deve colocar na boca objetos de uso
no laboratrio (canetas, lpis, borrachas, pipetas, entre outros);
5. Utilizar calados de proteo: fechados, confortveis, com solado liso e antiderrapante;
6. Usar as luvas de procedimentos durante e somente atividades laboratoriais e evitar tocar em
objetos de uso comum;
7. Trajar roupas de proteo durante as atividades laboratoriais, tais como: jalecos, aventais,
macaces, entre outros. Essas vestimentas no devem ser usadas em outros ambientes fora do
laboratrio, como: escritrio, biblioteca, salas de estar e refeitrios;
8. Evitar o uso de qualquer tipo de acessrio/adorno durante as atividades laboratoriais;
9. Manter os artigos de uso pessoal fora das reas designadas s atividades laboratoriais;
10. Organizar os procedimentos operacionais padres (POP) para o manuseio dos equipamentos e
tcnicas empregadas nos laboratrios;
11. Garantir que a limpeza dos laboratrios (bancadas, pisos, equipamentos, instrumentos e
demais superfcies) seja realizada regularmente antes e imediatamente aps o trmino das
atividades laboratoriais. Em caso de derramamentos, dependendo do tipo e quantidade de
material biolgico disseminado, pode-se empregar para a descontaminao do local lcool 70%
ou soluo de hipoclorito de sdio, preferencialmente, 10%, deixando agir por 30 minutos e
removendo com papel absorvente em seguida;

12. Assegurar que os resduos biolgicos sejam descontaminados antes de serem descartados;

13. Manusear, transportar e armazenar materiais (biolgicos, qumicos e vidrarias) de forma segura

15
para evitar qualquer tipo de acidente. O manuseio de produtos qumicos volteis, metais,

cidos e bases fortes, entre outros, necessita ser realizado em capela de segurana qumica.

As substncias inflamveis precisam ser manipuladas com extremo cuidado, evitando-se

proximidade de equipamentos e fontes geradoras de calor;

14. Usar os EPIs adequados durante o manuseio de produtos qumicos;

15. Identificar adequadamente todos os produtos qumicos e frascos com solues e reagentes, os

quais devem conter a indicao do produto, condies de armazenamento, prazo de validade,

toxidade do produto e outros;

16. Acondicionar os resduos biolgicos e qumicos em recipientes adequados, em condies

seguras e encaminh-los ao servio de descartes de resduos dos laboratrios para receberem o

seu destino final;

17. Aplicar/fixar a sinalizao adequada nos laboratrios, incluindo o smbolo internacional de "Risco

Biolgico" na entrada dos laboratrios;

18. Instituir um programa de controle de roedores e vetores;

19. Evitar que tcnicos trabalhem sozinhos e jornadas de trabalho prolongadas;

20. Providenciar treinamento e superviso aos profissionais iniciantes;

21. Disponibilizar kits de primeiros socorros e promover a capacitao dos usurios em segurana e
emergncia.

16
3 CONTROLE MICROBIOLGICO DE PRODUTOS DE HPPC
3.1 MARCO REGULATRIO (RDC 481/99 E GENERALIDADES APLICVEIS)

Os produtos de HPPC sujeitos ao controle microbiolgico foram divididos em 02 subgrupos (Tipo I e Tipo
II), de acordo com a faixa etria e local de aplicao, conforme tabela a seguir:

Tabela 01: Parmetros de controle microbiolgico para produtos de HPPC -


(RDC n 481, 23 de setembro de 1999 da ANVISA)

rea de Aplicao Limites de


e Faixa Etria Aceitabilidade

a) Contagem de microrganismos mesfilos


aerbicos totais, no mais que 10 UFC/g
ou mL.

Produtos para Limite Mximo de 5x10 UFC/g ou mL;


uso infantil
b) Ausncia de Pseudomas aeruginosa
Produtos para em 1g ou mL;
TIPO I rea dos olhos
c) Ausncia de Staphylococcus aureus em
Produtos que 1g ou mL;
entram em contato
com mucosas d) Ausncia de Coliformes Totais e fecais
em 1g ou mL;

e) Ausncia de Clostrdios sulfito redutores


em 1g.

a) Contagem de microrganismos mesfilos


aerbicos totais, no mais que 10 UFC/g
ou mL.

Limite Mximo de 5x10 UFC/g ou mL;

Demais b) Ausncia de Pseudomas aeruginosa


produtos em 1g ou mL;
TIPO II susceptiveis
contaminao c) Ausncia de Staphylococcus aureus em
microbiolgica 1g ou mL;

d) Ausncia de Coliformes Totais e fecais


em 1g ou mL;

e) Ausncia de Clostrdios sulfito redutores


em 1g.

17
3.2 PRODUTOS E SUSCEPTIBILIDADE

Uma srie de caractersticas do produto precisam ser avaliadas quando se realiza uma anlise de risco
microbiolgico, para determinar se esse produto deve ser submetido s normas internacionais publicadas
para produtos de HPPC ou outros mtodos relevantes. Estas caractersticas incluem a composio do
produto, as condies de produo, embalagem e uma combinao destes fatores.

Determinadas caractersticas fsico-qumicas contribuem para a no proliferao de microrganismos


indesejveis ao produto cosmtico. Fatores subletais iro aumentar a hostilidade do ambiente e a fase de
latncia. Se o ambiente suficientemente hostil, a fase lag (fase de adaptao metablica) vai estender-
se ao infinito e, portanto, causar a morte celular. A combinao de vrios fatores letais ir causar a morte
celular mais rpida. Os seguintes fatores devem ser considerados para determinar se os produtos de
HPPC apresentar um ambiente hostil dos microrganismos.

3.2.1 AW - Atividade da gua

gua um dos fatores mais importantes que controlam a taxa de crescimento de um microrganismo.
No o teor de umidade total que determina o potencial para o crescimento, mas a gua disponvel na
formulao. O metabolismo e reproduo de microrganismos exigem a presena de gua numa forma
disponvel. A forma mais eficaz de medio de gua na formulao do produto a atividade da gua aw.
A atividade de gua definida conforme a frmula abaixo:

p n2
aw = =
p0 n1 + n2
Onde:

p a presso de vapor da soluo;

p0 a presso de vapor da gua pura;

n1 o nmero de mols do soluto;

n2 o nmero de mols de gua.

3.2.2 pH

Determinados tipos de produtos, com valores de pH extremos (maior que 10 e abaixo de 3) no exigem testes
microbiolgicos, tanto teste de desafio (Challenge test) como teste do produto final. Em todos os outros
valores de pH (3,0 pH 10,0) uma combinao de pH e outros fatores fsico-qumicos tem de ser avaliada
para determinar o risco potencial. Dados para apoiar a concluso de que o risco microbiolgico baixo precisa
ser gerado, seja atravs de desing experimental ou histrico do produto.

18
3.2.3 Teor Alcolico

Produtos que contenham teor de lcool acima de 20% em massa por volume no exigem testes microbiolgicos
(teste de desafio e teste do produto final) abaixo desse teor, outros fatores fsico-qumicos precisam ser avaliados
para determinar o risco potencial. Para definir-se que o risco microbiolgico baixo so necessrios dados, que
podem ser obtidos tanto atravs de testes como histrico do produto.

3.3 MATRIAS-PRIMAS

As matrias-primas usadas em produtos de HPPC normalmente so incuas para a sade, com raras
excees, logo suas quantidades devero ser estritamente controladas. O uso industrial de substncias
qumicas est sujeito a normas de rgos reguladores, no Brasil os produtos de HPPC precisam ser
registrados na ANVISA, Nos Estados Unidos o controlador o FDA (Food and Drug Administration), rgo
governamental cujas normas so frequentemente adotadas por outros pases. Essas normas so baseadas
em estudos de cada substncia com respeito a sua toxicidade para o homem, animais e meio ambiente, a
curto e longo prazo, determinando quais so as substncias incuas e definindo limites para sua utilizao
na produo de produtos de HPPC.

As matrias-primas so classificadas como excipientes ou princpios ativos. Excipiente todo aquele


ingrediente inerte adicionado a uma formulao que lhe confere consistncia para que a formulao possa
ser aplicada, manipulada e embalada apropriadamente. Os excipientes so essenciais na produo de
produtos HPPC porque proporcionam diferentes veculos de aplicao, com distintos tamanhos, volumes
e caractersticas. Existem mais de 8.000 excipientes aprovados pelo FDA para uso em produtos HPPC.

Os princpios ativos so substncias que efetivamente atuam e promovem modificaes sobre a regio
em que o cosmtico ser aplicado e cuja as quantidades preciso ser controladas em virtude dos limites
aceitveis de aplicao, da sua toxicidade, das consequncias de dose excessivas, de possveis efeitos
colaterais e da possibilidade de sensibilizao e reaes alrgicas.

Pigmentos, solues, corantes orgnicos e fragrncias so grupos especiais de matrias-primas, pois


apesar de serem inertes e no modificarem muito o local de aplicao, sua quantidade necessita ser muito
bem controlada.

3.3.1 gua

A gua a matria-prima de maior volume na fabricao de um produto de HPPC. Ela utilizada no


processo de fabricao como veculo ou como matria-prima, alm disso, a gua utilizada na limpeza e
sanitizao de equipamentos e instalaes.

19
3.3.1.1 Parmetros Microbiolgicos

Conforme a RDC n 48, 25 de outubro de 2013 da ANVISA, os sistemas de gua devem ser monitorados
segundo uma periodicidade que garanta que o sistema produza uma gua de qualidade aceitvel. Os pontos
de coleta de gua devem ser representativos abrangendo reas crticas. A frequncia deve ser determinada
baseada nos dados da validao do sistema.

A sugesto de limite microbiolgico em gua de processo : mximo de 100 UFC/ mL de contagem de


bactrias mesfilas aerbicas totais, ausncia de Pseudomonas aeruginosa e Coliformes totais e fecais em
100 mL.

3.3.1.2 gua potvel

Dentro de todas as matrias-primas, a gua a mais amplamente utilizada na formulao e fabricao de


produtos de HPPC. Alm de usada como solvente de componentes (corantes, aditivos, etc.) a gua constitui
parte significativa da maioria dos produtos de HPPC.

Alm da incorporao no produto final, uma grande quantidade de gua de qualidade superior (gua potvel
e tambm gua purificada) utilizada em operaes de limpeza e sanitizao de equipamentos e utenslios,
para garantir a qualidade do produto final.

A presena na gua de impurezas como clcio, magnsio, ferro e alumnio originam a lenta formao de
resduos invisveis, frequentemente agravada pela precipitao dos componentes menos solveis da
composio de perfumes. Se houver a presena de compostos orgnicos fenlicos, tais como antioxidantes
e estabilizadores de ultravioleta, podem-se ter alteraes de cor devido reao destes com traos de
metais, formando compostos corantes (WILKINSON; MOORE, 1990).

No caso de emulses a presena de grandes concentraes de ons inorgnicos, tais como magnsio e
zinco, pode conduzir a separao de fases, por interferir no equilbrio de cargas estticas responsveis pelo
funcionamento adequado de certos tensoativos da formulao. A presena destes ons em cremes, loes e
shampoos pode levar a alterao de viscosidade.

Outro aspecto importante a presena de contaminantes microbiolgicos. Se houver a proliferao de


microrganismos no cosmtico, o resultado ser a inutilizao do produto devido ao desenvolvimento de
odores desagradveis, colnias visveis de bactrias, mofo ou fungos e, no caso de emulses, a separao
de fases. A tudo isso se soma o mais grave que o risco potencial sade do consumidor. (WILKINSON;
MOORE, 1990).

A portaria MS n 2914 de 2011 do Ministrio da Sade estabelece os procedimentos e responsabilidades


relativas ao controle e vigilncia da qualidade da gua para o consumo humano e seu padro de potabilidade,

20
porm para o uso na indstria de produtos de HPPC, gua com caractersticas especficas deve ser empregada
em alguns processos.

3.3.1.3 Portaria MS n 2914/11

Estabelece parmetros fsico-qumicos, microbiolgicos e radioativos da gua para consumo humano.

Tabela 02: Parmetros microbiolgicos gua Potvel

Microrganismos Parmetros

Contagem Heterotrficas At 500 UFC/mL

Coliformes Totais Ausncia em 100 mL

Escherichia coli Ausncia em 100 mL

3.3.1.4 Processos de Purificao

O processo de purificao da gua baseado na eliminao de impurezas fsico-qumicas, biolgicas e


microbianas at se obterem nveis preestabelecidos em compndios oficiais.

Os materiais que entram em contato com a gua, incluindo a tubulao, vlvulas, os lacres, os diafragmas e
os instrumentos, necessitam ser selecionados para atender aos requisitos bsicos, dentre os quais podem
ser citados:

Compatibilidade: todos os materiais utilizados necessitam ser compatveis com a

temperatura e as substncias qumicas utilizadas pelo sistema ou dentro dele;

Preveno de vazamento: nenhum dos materiais que entram em contato com a gua pode

apresentar vazamentos;

Resistncia corroso: para evitar falha do sistema e contaminao da gua, os materiais

selecionados necessitam ser apropriados e todos os vedantes e componentes devem ser

compatveis com a tubulao utilizada;

Acabamento interno liso: devem ser utilizadas superfcies internas lisas que ajudem a evitar

21
asperezas e fissuras no sistema de gua;

Soldagem: os materiais selecionados para o sistema necessitam ser facilmente soldveis,

de forma controlada;

Desenho de flanges ou juntas: quando so utilizados flanges ou juntas, eles devem ser

projetados para atender a critrios higinicos sanitrios. Devem ser realizadas verificaes

para garantir que os lacres corretos sejam usados e que estejam encaixados e ajustados

corretamente;

Documentao: todas as informaes referentes aos componentes do sistema como

os procedimentos de limpeza, sanitizao e manuteno devem ser plenamente

documentados;

O sistema deve permitir a realizao da amostragem no ponto de uso bem como o de

entrada e sada do sistema de tratamento da gua. Recomenda-se realizar um controle

microbiolgico atravs de anlises peridicas.

Essa gua deve possuir os seguintes parmetros:

Tabela 03: Parmetros de qualidade para utilizao de gua purificada

Parmetro Critrio de Qualidade

pH 5~7

Condutividade 0,6~4,7 S/cm a 20C

Contagem bacteriolgica <100 UFC/100mL

COT <500 ppb

Para obteno de gua com esse padro de qualidade os seguintes tratamentos so possveis, partindo-
se da gua potvel disponvel:

Sistemas de troca inica;

Sistemas de osmose reversa;

Sistemas de destilao;

22
Troca Inica por passagem em leito de resinas

De todos esses mtodos o que mais utilizado o de troca inica devido ao seu menor custo de
implantao e operao.

Nesse processo a gua potvel aps passar por sistemas de filtrao em leito de areia para retirar slidos em
suspenso e tambm em leito de carvo ativado, para remoo do cloro livre, como medida de proteo
das resinas. Em seguida a gua passa por leitos de resina, onde ocorre a remoo de ctions Ca++, K++, Na+,
Mg++, substitudos por ction hidrognio (H+). Depois a gua passa por leitos de resina aninica, onde ocorre
a substituio dos nios SO4-2, NO3-, Cl-, HCO3-, HSiO3-, por nion hidroxila (OH-) (CUNHA, 1991).

A regenerao das resinas catinicas deve ser realizada com cido sulfrico ou clordrico (mais empregado)
e a regenerao das resinas aninicas com soluo de hidrxido de sdio.

Emprega-se atualmente, com frequncia, uma combinao das resinas catinicas e aninicas em um mesmo
leito, chamando ento de sistema de leito misto. Esse arranjo particularmente interessante para as guas
brasileiras que em geral, possuem baixa salinidade se comparadas s guas de outros pases. Isso torna mais
econmico o processo devido ao menor nmero de componentes e equipamentos.

Osmose reversa

Outro processo de produo de gua purificada utilizada a tecnologia de osmose reversa. Nesse processo
a gua potvel aps tratamento prvio passa sob presso tangencialmente por um conjunto de elementos
de membranas semipermeveis, que permite que a gua permeie atravs da membrana deixando na
corrente original os ons e outras impurezas indesejveis.

O desempenho de osmose reversa depende dos seguintes fatores (SCHNEIDER; TSUTIYA, 2001).

Temperatura: a rejeio de sais diminui com o aumento de temperatura.

Presso: a rejeio aumenta com o aumento da presso.

pH: a rejeio relativamente constante na faixa de pH de operao.

Concentrao de sais: a qualidade do permeado diminui com o aumento da concentrao

de sais na gua de alimentao.

Rendimento: a qualidade do permeado diminui com o aumento do rendimento da

membrana.

O processo de osmose reversa permite diversas configuraes, que envolvem a possibilidade de


recirculao, o que aumenta a produo de gua, e a utilizao de duplo passe, melhorando a sua

23
eficincia do ponto de vista de separao de sais, porm diminuindo a sua vazo de produo.

As membranas atualmente utilizadas podem ser acondicionadas em sistemas modulares que podem ser
multiplicados conforme necessidade.

A gua potvel que alimenta o sistema de osmose reversa necessita ser pr tratada para que esteja livre
de impurezas e de cloro que podem danificar ou reduzir a vida til das membranas. O sistema de pr
tratamento bem como o prprio conjunto de mdulos de membranas necessitam de um bom controle de
limpeza e tambm de sanitizao peridica (SCHNEIDER; TSUTIYA, 2001).

Destilao

O terceiro processo para purificao de gua, a destilao, o mais empregado na indstria cosmtica para
obteno de gua estril em pequenas quantidades. Como meio de obteno de grandes quantidades
de gua purificada a destilao apresenta custo elevado, em decorrncia da energia envolvida. Alm da
energia consumida para o sistema de evaporao necessrio igualmente um sistema de refrigerao para
condensar o vapor para fase lquida. Tudo isso faz com que seja um sistema no utilizado nas operaes
industriais, porm pode ser utilizado em laboratrios de microbiologia.

3.3.1.5 Validao

A evidncia documentada requerida no processo de validao resulta na gerao de uma srie de


documentos que espelha o grau de confiabilidade do sistema. O documento bsico inicial o protocolo
de validao. Nele se inclui a definio clara do processo a validar, os objetivos da validao, o pessoal
responsvel, os procedimentos e mtodos empregados, as anlises fsico-qumicas e microbiolgicas a
serem realizadas, a periodicidade, a indicao dos pontos de amostras e os critrios de aceitao. Outros
documentos so requeridos no processo de validao, visando comprovar a qualificao de pessoal
envolvido: os materiais empregados, a aferio e calibrao de instrumentos, procedimentos operacionais
e registro das operaes, todos relacionados e condensados num relatrio final.

3.3.1.6 Uso racional e sustentvel

Quando se fala em uso racional e sustentvel da gua, a ateno deve ser direcionada para a forma
de utilizao deste recurso. Neste caso, a reduo do consumo um dos objetivos principais que deve
ser buscado com todo esforo, devendo ser consideradas as seguintes aes (MATSUMURA; MIETZWA,
2008):

eliminar perdas fsicas: identificar vazamentos em tubulaes (vlvulas, conexes, etc.).

implantar melhorias na operao: colocao de hidrmetros para melhorar o controle

24
de consumo, substituio de equipamentos por outros mais econmicos, verificar a

possibilidade de usar resfriamento a ar.

corrigir operaes inadequadas: com o controle de consumo verificar se purgas em torres

de resfriamento ou camisas de aquecimento, por exemplo, esto dentro do que esperado

para esses processos e se est havendo desperdcios.

evitar o uso de gua de melhor qualidade para aplicaes onde esta no necessria.

importante, ento o conhecimento dos processos e equipamentos para que uma avaliao criteriosa
e aes de caa aos desperdcios possam ser conduzidas com sucesso. Muitas vezes necessria
a busca de novas tecnologias que possibilitem a substituio de equipamentos por outros de melhor
desempenho em termos de consumo de gua ou mesmo a instalao de dispositivos para reduo do
consumo (MIERZWA; HESPANHOL, 2005).

A utilizao de processos de produo e de sistemas de lavagem com baixo consumo de gua deve ser
estimulada desde a fase de projeto. Como por exemplo, gua de determinados processos como lavagem
de filtros e de decantadores pode ser recuperada e reutilizada em outros processos, desde que atendam
aos parmetros de qualidade para estes.

As aes devem tambm ter foco no pessoal operacional, na medida em que melhor capacitao leva execuo
de tarefas com regularidade e dentro de padres pr-estabelecidos para as mesmas. Assim, treinamentos e
campanhas de conscientizao contra o desperdcio devem ser realizados regularmente (MIERZWA,2005).

3.3.2 Matrias-primas de origem animal/vegetal/mineral

Como sugesto de limite microbiolgico em matrias-primas de origem sinttica de no mximo 500


UFC/g ou mL para microrganismos mesfilos aerbios totais.

3.3.3 Matrias-primas de origem sinttica

Como sugesto de limite microbiolgico em matrias-primas de origem sinttica de no mximo 500 UFC/g
ou mL para microrganismos mesfilos aerbios totais. Ausncia de patgenos em 1 g ou mL (Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella sp, coliformes totais e fecais, Clostridium sp (exclusivamente
para ps).

3.4 MATRIAS-PRIMAS DE AO CONSERVANTE

So substncias que so adicionadas como ingrediente aos produtos de HPPC com a finalidade de inibir
o crescimento de microrganismos durante sua fabricao e estocagem, ou para proteger os produtos da

25
contaminao inadvertida durante o uso.

Outras substncias utilizadas na frmula dos produtos de HPPC podem ter propriedades antimicrobianas,
podendo por esse fato, contribuir para a conservao desses produtos, como por exemplo, muitos leos
essenciais e alguns lcoois.

desejvel que um conservante apresente:

Amplo espectro de ao;

Estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura;

Compatibilidade com ingredientes da frmula;

Compatibilidade com embalagem;

No interferncia com caractersticas do produto;

No inocuidade ao consumidor e ao ambiente;

Aprovao das agncias reguladoras (RDC n 29, 01 de junho de 2012 da ANVISA);

Tabela 04: Lista de substncias de ao conservante permitidas para


produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfumes

Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
a) 2,5% (cido)
Produtos que se
enxguem, exceto
cido benzico (nmero os produtos para
CAS 65-85-0) e respectivo higiene bucal
Proibido em sistema
sal de sdio
pulverizveis (como
b) 1,7% (cido)
1 aerossis e sprays) quando a
(nmero CAS 532-32-1) (*) Produtos de
concentrao for maior que
higiene bucal
0,5%.
(BENZOIC ACID, SODIUM
BENZOATE) c) 0,5% (cido)

Produtos que no
se enxguem
Sais de cido benzoico
no includos no nmero 0,5% (expresso
2
de ordem 1 e estres de como cido)
cido benzico
cido propinico e seus
sais 2,0% (expresso
3
como cido)
(PROPIONIC ACID & salts)

26
Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
Para produtos de uso adulto:
No usar em crianas.
cido saliclico e seus Proibido para produtos para
Para produtos destinados ao
sais (*) 0,5% (expresso crianas com menos de 3
4 pblico infantil: No usar
como cido anos de idade, com exceo
em crianas menores de 3
(SALICYLIC ACID & salts) dos shampoos.
anos de idade (exceto para
shampoos).
cido srbico e seus sais
0,6% (expresso
5
como cido)
(SORBIC ACID & salts)
Sorbato de 0,6% (expresso
6
Trietanolamina (*) como cido)
Bifenil -2-ol (o-fenilfenol)
e seus sais
0,2% (expresso
7
como fenol)
(O-PHENYLPHENOL &
salts)
Piritionato de zinco (*) a) 1,0% produtos
Somente em produtos
capilares
enxaguveis.
8 (nmero CAS 13463-41-7)
Proibido em produtos de
b) 0,5% outros
higiene bucal.
(ZINC PYRITHIONE) produtos
Sulfitos e Bisulfitos
inorgnicos (*)
0,2% (expresso
9
como SO livre)
(AMMONIUM SULFITE &
BISULFITE, etc.)
1,1,1- Tricloro- 2-
metilpropanol- 2 Proibido em sistemas
10 (clorobutanol) 0,5% pulverizveis (como aerossis Contm clorobutanol.
e sprays).
(CHLOROBUTANOL)
a) 0,4% (expresso
cido 4- hidroxibenzico,
como cido
seus sais e steres
individual)
11 (4- HIDROXYBENZOIC
b) 0,8% (expresso
ACID, salts & esters:
como cido) para
METHYLPARABEN,
misturas de sais e
PROPILPARABEN, etc)
steres
cido dehidroactico e
seus sais Proibido em sistemas
0,6% (expresso
12 pulverizveis (como aerossis
como cido)
(DEHYDROACETIC ACID e sprays).
& salts)
cido frmico e seu sal
sdico
0,5% (expresso
13
como cido)
(FORMIC ACID & sodim
salt)
3,3- Dibromo-
4,4hexametileno-
dioxidibenzamidina e seus
sais (incluindo isotionato)
14 0,1%
(dibromohexamidina)

(DIBROMOHEXAMIDINE
& salts)

27
Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
0,007% (de Hg).
Se misturado com
Tiosalicilato de outros compostos
Somente para maquiagem
etilmercurio sdico mercuriais o
15 e demaquilante para a rea Contm timerosal.
total de Hg no
dos olhos.
(THIMEROSAL) pode ser maior
que 0,007% no
produto final
Fenilmercrio e seus sais 0,007% (de Hg).
(incluindo borato) Se misturado com
outros compostos
Somente para maquiagem
(PHENYLMERCURIC & mercuriais o Contm compostos
16 e demaquilante para a rea
salts) total de Hg no fenilmercuriais.
dos olhos.
pode ser maior
PHENYL MERCURIC que 0,007% no
BORATE (*) produto final
cido undecanico- 10-
eno, (undecilnico), seus
sais, steres, aminas e
0,2 % (expresso
17 sulfosuccinato (*)
como cido)
(UNDECYLENIC ACID &
SALTS)
Amino- 5 bis (etil-
2-hexil)-1,3 metil-5-
18 0,1%
perhidropirimidina
(HEXETIDINE)
5- Bromo-5-nitro-1,3 Somente para produtos
19 dioxano (5-BROMO-5- 0,1% que se enxguem. Evitar
NITRO-1,3-DIOXANE) formao de nitrosaminas.
2-Bromo-2-nitropropano-
1,3-diol (Bronopol)
Evitar formao de
20 (2-BROMO-2- 0,1%
nitrosaminas.
NITROPROPANE-1,3-
DIOL)
Critrio de pureza:
3,3,4,4-Tetracloro-
3,4,4- Triclorocarbanilida azobenzeno menor que
(*) 1ppm
21 0,2%
(TRICHLOROCARBAN) 3,3,4,4-Tetracloro-
azoxibenzeno menor que
1ppm
p-cloro-metacresol (*) Proibido em produtos
22 0,2% destinados a entrar em
(p-CHLORO-m-CRESOL) contato com mucosas.
p-cloro-metaxilenol
23 0,5%
(CHLOROXYLENOL)
Imidazolidinil ureia
24 0,6%
(IMIDAZOLIDINYL UREA)
Cloridrato de
polihexametileno
biguanida
25 0,3%
(POLYAMINOPROPYL
BIGUANIDE)

28
Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
2-fenoxietanol
26 1,0%
(PHENOXYETHANOL)
Proibido em produtos
27 6- Clorotimol 0,1%
infantis.
Cloreto de 1-(3-cloroalil)-
3,5,7- triazo-1-
28 azoniadamantano 0,2%

(QUATERNIUM 15)
1-(4-clorofenoxi)-1-(1-
imidazolil)-3,3-dimetil-2-
29 butanona 0,5%

(CLIMBAZOLE)
1,3-Dimetilol-5,5-
dimetilhidantona
30 0,6%
(DMDM HYDANTOIN)

31 2-Feniletanol 0,5%

lcool benzlico (*)


32 1,0%
(BENZYL ALCOHOL)
1-Hidroxi-4-metil-6-(2,4,4- a) 1,0% para
trimetilpentil)-2- produtos que se
piridona e seus sais enxagum
33 de monoetanolamina
(Octopirox) (*) b) 0,5% para
produtos que no
(PIROCTONE OLAMINE) se enxagum
4-Isopropil-m-cresol
34 0,1%
(O-CYMEN-5-OL)
Mistura de 5-cloro-2-me-
til-4-isotiazolina-3-ona 0,0015% (de
e 2-metil-4-isotiazolina- uma mistura na
-3-ona com cloreto de proporo 3:1
magnsio e nitrato de de 5-cloro-2-
35
magnsio (3:1) methyl-isothiazol-
3(2H)-one e 2-
(METHYLISOTHIAZOLI- methylisothiazol-
NONE + METHYL CHLO- 3(2H)-one)
RO ISOTIAZOLINONE)

2-Benzil-4-Clorofenol
36 0,2%
(CHLOROPHENE)

2-Cloroacetamida
37 0,3% Contm cloroacetamida.
(CHLOROACETAMIDE)

Bis-(clorofenildiquanida)-
1,6-hexano: acetato,
gluconato e cloridrato
0,3% (expresso
38 como
(CHLORHEXIDINE
clorohexidina)
DIACETATE, DI-
GLUCONATE DI-
HYDROCHLORIDE)

29
Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
1-Fenoxi-2-propanol (*)
Somente para produtos que
39 1,0%
(PHENOXYISO- se enxguem.
PROPANOL)

4,4-Dimetil-1,3-
oxazolidina
pH do produto acabado no
40 0,1%
deve ser menor do que 6.
(DIMETHYL
OXAZOLIDINE)
N-(hidroximetil)-N-
(dihidroximetil-1,3-dioxo-
2,5-imidazolidinil-4)-
N(hidroximetil)
41 0,5%
urea

(DIAZOLIDINYL UREA)
Contm glutaraldedo
Glutaraldedo Proibido em sistemas
(somente para concentraes
42 0,1% pulverizveis (como aerossis
superiores a 0,05% no
(GLUTARAL) e sprays).
produto acabado).
5-Etil-3,7-dioxo-1-
azobiciclo(3.3.0)octano Proibido em produtos para
43 0,3% higiene bucal e que entram
(7-ETHYLBICYCLO em contato com mucosa.
OXAZOLIDINE)

6,6-dibromo-4,4-dicloro-
2,2-metilenodifenol
44 0,1%
(BROMOCHLOROPHENE)

lcool
2,4-Diclorobenzlico
45 0,15%
(DICHLOROBENZYL
ALCOHOL)
Tricloro-2,4,4hidrxi-
2difenileter (*)
46 0,3%
(TRICLOSAN)

Hexametilenotetramina
47 0,15%
(METHENAMINE)

Brometo e Cloreto
48 de Alquil (C12-C22) 0,1%
Trimetilamnio (*)

1,6-Di-(4-amidinofenoxi)-
n-hexano e seus sais
(incluindo isotionato e
49 0,1%
p-hidroxibenzoato)

(HEXAMIDINE & salts)


3-(p-clorofenoxi)-propano-
1,2-diol
50 0,3%
CHLORPHENESIN)

30
Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
Hidroximetil amino-
acetato de sdio
51 0,5%
(SODIUM
HYDROXYMETHYL
GLYCINATE)

20% AgCl (p/p) em TiO.


Cloreto de prata Proibido em produtos para
depositado em dixido 0,004% crianas com menos de 3
52 de titnio (calculado como anos de idade, em produtos
cloreto de prata) para higiene bucal e em
(SILVER CHLORIDE) produtos para a rea dos
olhos e lbios.

Cloreto, Brometo e
Sacarinato de Aquil
(C8-C18)
0,1%
(calculado como
53 dimetilbenzilamnio (*) Evitar contato com os olhos.
cloreto de
benzalcnio)
(BENZALKONIUM
BROMIDE, CHLORIDE,
SACCHARINATE)

Benzilhemiformal Somente para produtos que


54 0,15%
(BENZYLHEMIFORMAL) se enxguem.

No utilizar em produtos de
higiene bucal e nos produtos
para os lbios.
a) Para produtos de uso
a) No utilizar em produtos adulto: No usar em
destinados a crianas com crianas.
idade inferior a 3 anos,
com exceo dos produtos Para produtos destinados
a) 0,02% Produtos
de banho/shower gis e ao pblico infantil: No
que se enxguem
shampoos. usar em crianas menores
3-Iodo-2- de 3 anos de idade. (essa
b) 0,01% Produtos
propinilbutilcarbamato b) No utilizar em loes advertncia no se aplica aos
que no se
e cremes corporais que produtos de banho/shower
enxguem, exceto
55 (nmero CAS 55406-53-6) se apliquem em grandes gis e shampoos)
em desodorantes/
extenses corporais;
antitranspirantes
(IODOPROPINYL b) Para produtos de uso
BUTYCARBAMATE) - No utilizar em produtos adulto: No usar em
c) 0,0075%
para crianas com idade crianas. Para produtos
desodorantes/
inferior a 3 anos. destinados ao pblico
antitranspirantes
infantil: No usar em
c) No utilizar em loes crianas menores de 3 anos
e cremes corporais que de idade.
se apliquem em grandes
extenses corporais; c) No usar em crianas.

- No usar em produtos para


crianas.

Cloreto de Diisobutil
Fenoxietoxietil-dimetil-
benzilamnio Proibido em produtos sem
56 0,1%
enxgue para higiene bucal.
(BENZETHONIUM
CHLORIDE)

31
Mxima
N Condies de Uso
Substncia Concentrao Limitaes
ORD e Advertncias
Autorizada
2-metil-4-isotiazolina-3-
ona
57 0,01%
(METHYLISOTHI-
AZOLINONE)

Nota: Os conservantes com smbolo (*) tambm podem ser usados para outros fins especficos devendo ser respeitadas as
condies e os limites de concentraes estabelecidos em outras listas quando houver.

Tabela 05: Espectro de ao dos conservantes

Bactria Gram Bactria Gram


Agente conservante Leveduras Bolores
positiva negativa

cido benzoico e sais +++ ++ + +

cido srbico ++ ++ +++ ++

lcool benzlico +++ + + +

Bronopol ++ +++ + +

Cetrimida +++ ++* ++ +

Cresol ++ + + +

Cloreto benzalcnio +++ ++* ++ +

Clorexidina +++ +++* ++ +

Clorobutanol +++ +++ ++ +

Clorocresol +++ ++ + +

Etanol +++ +++ ++ ++

Fenol ++ + + +

Fenoxietanol ++ +++ + +

Parabenos ++ +* ++ ++

Legenda: +++ ativo; ++ moderadamente ativo; + fracamente ativo * pouco ativo contra Pseudomonas sp
Fonte: Guide to microbiological in pharmaceuticals.

32
Tabela 06: Matrias-primas: classificao de risco e frequncia
de anlise (ORTH)

Frequncia de
Classificao ---- Grau
Caractersticas / Exemplos amostragem e
Relativo de Risco
anlise

0 UFC/ g
No permitem crescimento.
Sem necessidade
0 -------- Sem Risco pHs extremos, apresentam atividade microbicida.
de teste
Ex.: cidos, lcoois, lcalis

Nvel baixo de contagem, mas no permitem o crescimento.


Geralmente < 100 UFC/g. Fonte pobre de nutrientes, atividade
Testar uma vez
1 ----- Risco Mnimo hdrica reduzida, atividade antimicrobiana.
para
ou Leve
os registros
Ex.: lipdeos anidros, leos minerais, petrolatum, steres e cido
esterico, essncias e preservativos

Risco baixo de contaminao, geralmente < 1000 UFC/g. Em


presena de gua podem apresentar crescimento microbiano.
2 ---------- Baixo Risco
Uma vez
Ex.: glicerina, propilenoglicol e sorbitol 83% ao ano
< 1.000 UFC/g
Podem conter baixo nvel de microrganismos e podem permitir o
crescimento se diludos em gua.

Risco moderado de contaminao. Podem permitir o crescimento


3 ----- Risco Moderado microbiano se for usado um sistema preservante adequado.

< 10.000 UFC/g e Representa a maioria das matrias-primas: estabilizantes de A cada lote
ausncia espuma, protenas, gis, espessantes, colgeno em p, goma
de patgenos xantana, amido, extratos de plantas em p, lauril sulfato de amnio
a 28%, concentrado de aloe, DEA, gis, aminocidos, gomas.

Tem a potencialidade de permitir o crescimento.


A cada dia
4 -------- Risco Alto
de uso
Ex.: gua desmineralizada.

33
Tabela 07: Matrias-primas: classificao de risco (CTFA)

Classificao ----
Caractersticas / Exemplos
Grau Relativo de Risco

A ------------- Hostis No permitem o crescimento microbiano e podem inibi-lo.

B ------------ Inertes Podem atuar como portador mas no permitem a proliferao.

C ----------- De Suporte Servem como substrato nutricional e permitem o crescimento.

D ---------- Preservados Foram adicionadas substncias microbianas para inibir o crescimento.

Tabela 08: Matrias-primas: classificao de risco (BASTARDO)

Classificao ----
Caractersticas / Exemplos
Grau Relativo de Risco

No permitem o crescimento.
3 -------------- Hostis
Ex: lcoois, glicerina, propilenoglicol e ceras.

Susceptveis, mas os microrganismos no podem se multiplicar.


2 -------------- Susceptveis
Origem mineral: talco, caolin e dixido de titnio.

1 ------------ 1000 UFC/g Materiais naturais e de origem sinttica.

3.5 EMBALAGEM

O processo de fabricao das embalagens trabalha com altas temperaturas, principalmente os plsticos,
com os sistemas de sopro e injeo.

A preocupao, no entanto, vem na sequncia da fabricao, isto , no processo de gravao,


decorao, pintura, montagem, acondicionamento - principalmente nas embalagens que o produto a ser
acondicionado for rico em nutrientes.

Diferente dos produtos acabados, nos quais existem normas e parmetros definidos pela ANVISA para
microbiologia, as embalagens ainda no os tm. Porm, o fato de no ter no significa que as indstrias
de produtos de HPPC no devam fazer anlises microbiolgicas nas embalagens.

34
4 GESTO DA QUALIDADE
O Laboratrio de Microbiologia terceirista deve possuir habilitao em vigilncia local de acordo com
a RDC N 11 de 16 de Fevereiro de 2012- Dispe sobre o funcionamento de laboratrios analticos que
realizam anlises em produtos sujeitos Vigilncia Sanitria e d outras providncias.

O Laboratrio de Microbiologia pode possuir Acreditao pelo INMETRO de acordo com ABNT NBR ISO/
IEC 17025:2005- Requisitos gerais para competncia de laboratrios de ensaio e calibrao e Habilitao
REBLAS. A Habilitao estabelecida pela RDC n 12, de 16 de fevereiro de 2012- Dispe sobre a Rede
Brasileira de Laboratrios Analticos em Sade (REBLAS).

Para um sistema de gesto da qualidade em laboratrio de microbiologia, deve-se incluir alm de uma
lista de itens especficos o bom julgamento e uma constante ateno aos detalhes.

Para o controle de qualidade deve-se estabelecer o padro mnimo e delinear as diversas etapas que
devem ser seguidas para o controle dirio e vigilncia de todas etapas do sistema.

As diretrizes para o sistema de gesto da qualidade devem constar em um manual, no qual estejam
detalhadas prticas tais como procedimentos para monitorar o funcionamento dos equipamentos, o
controle da reatividade dos meios e reagentes, os prazos de validade, os resultados de todos os testes,
etc.

Devem ser elaborados formulrios adequados para coletar dados, de modo que qualquer anormalidade
possa ser facilmente detectada. O encarregado tambm deve revisar todos os registros de controle
e verificar que sejam anotadas todas as incidncias fora do controle e as respectivas aes corretivas
tomadas.

Os laboratrios devem tambm dispor de uma lista de inspeo para realizar avaliaes pontuais dos
controles de qualidade um requerimento para credenciamento de laboratrios e/ou auditoria e
fiscalizao sanitria.

Para melhoria na qualidade dentro do laboratrio recomenda-se a elaborao de POPs, ou seja,


procedimentos que descrevem detalhadamente cada atividade realizada no laboratrio, desde a coleta
at a emisso do resultado final, incluindo utilizao de equipamentos, procedimentos tcnicos e inclusive
cuidados de biossegurana e condutas a serem adotadas em acidentes.

Os POPs tm como objetivo padronizar todas as aes para que diferentes tcnicos possam compreender
e executar, da mesma maneira, uma determinada tarefa, garantindo assim qualidade.

35
Esses POPs devem estar escritos de forma clara e completa possibilitando a compreenso e adeso de todos. Os POPs
devem estar disponveis em local de acesso e conhecido de todos os profissionais que atuam no ambiente laboratorial,
revisados e atualizados periodicamente e devem ser assinados pelo responsvel do laboratrio.

A poltica da qualidade deve estar definida no manual da qualidade e ser assinada pelo executivo-chefe,
onde so tomadas as decises sobre as polticas e os recursos do laboratrio.

A poltica da qualidade deve incluir:

a) O comprometimento do laboratrio com as boas prticas profissionais e com a qualidade dos

seus ensaios no atendimento aos seus clientes;

b) A declarao do laboratrio com respeito ao nvel de servio fornecido;

c) Os objetivos a serem alcanados com a implementao do sistema da qualidade;

d) Uma declarao de que todo o pessoal envolvido com as atividades de ensaio est familiarizado com a

documentao da qualidade e que implementa permanentemente suas polticas e procedimentos;

e) O comprometimento do laboratrio com atendimento aos requisitos dos regulamentos da

habilitao na vigilncia sanitria local- RDC N 11 de 2012 e NBR ISO/IEC 17025.

4.1 CONTROLE DE QUALIDADE DOS EQUIPAMENTOS

Em todos os laboratrios de microbiologia deve ser estabelecido um programa de manuteno preventiva


e calibrao para assegurar o funcionamento apropriado de todos os equipamentos eltricos ou mecnicos.
Os equipamentos devem ser controlados em intervalos de tempo pr-estabelecidos.

Os colaboradores do laboratrio devem realizar todos os controles e registrar conforme instrudos em


impressos ou manual de manuteno; isto permite a deteco imediata de desvios e portanto a adoo
de medidas corretivas apropriadas antes que comprometam os resultados.

As temperaturas dos equipamentos devem ser medidas diariamente com termmetros calibrados.
Qualquer leitura que resulte em valores fora dos limites de tolerncia definidos pelos controles de
qualidade, deve-se determinar a causa e corrigir o problema.

4.2 CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIO DE CULTURA, REAGENTES E KITS


COMERCIAIS

Embora aceito por auditores, inspetores de laboratrio os registros de qualidade documentados pelos
fabricantes de meios de cultura, recomenda-se um controle de qualidade peridico desses produtos pelo
laboratrio.

36
Os microrganismos empregados para o controle de qualidade devem ser mantidos no laboratrio por meio de
subcultivos de isolados recuperados como parte do trabalho de rotina ou microrganismo de referncia como os
da ATCC.

Cada lote de meios deve ser controlada com os quesitos mais exigentes para o crescimento ou para a
produo de atividade bioqumica. A disponibilidade de cepas do laboratrio pode ser necessria para
suplementar aquelas comercialmente disponveis.

Cada tubo de cultura, placa de meio e reagente deve ter uma etiqueta que identifique claramente o contedo e
as datas de preparo e vencimento. Cada lote de tubos e placas deve ser tambm controlada quanto esterilidade,
principalmente aqueles nos quais so adicionados suplementos aps a esterilizao.

As provas de esterilidade devem ser feitas visualmente e por meio de subcultivos. Determinados
meios seletivos, por exemplo, podem suprimir o crescimento visvel de bactrias, mas as clulas viveis
podem aparecer nos subcultivos. Os meios preparados devem ser visualmente avaliados para sinais de
deteriorao como descolorao, turvao, mudana de cor e desidratao.

Os kits comerciais devem ser examinados a cada entrega e a cada lote, conforme as recomendaes do
fabricante. Os componentes de um kit no devem ser utilizados com um kit de lote diferente, a no ser
quando especificado pelo fabricante.

A frequncia das provas de controle de qualidade dos produtos comerciais utilizados no laboratrio
deve ser determinada pelo responsvel imediato do laboratrio, conforme as instrues dos respectivos
fabricantes ou referncias em literatura.

4.3 CONTROLE DE QUALIDADE DE COLABORADORES

O controle de qualidade dos colaboradores requer um programa de educao permanente efetivo. O


treinamento deve ser prtico e ser uma atividade regular. Os colaboradores envolvidos com as atividades
do laboratrio devem ser estimulados a participar com frequncia em cursos, seminrios e similares, tanto
localmente quanto ao nvel nacional.

Os resultados dos procedimentos devem ser conferidos pelo responsvel designado quanto exatido,
reprodutibilidade e concordncia com os padres de controle de qualidade.

Todos os colaboradores envolvidos com atividades rotineiras do laboratrio de microbiologia, devem ter
acesso ao programa de ensaios de proficincia.

Reunies regulares para informar os colaboradores do laboratrio quanto s mudanas e sugestes de


melhorias nos procedimentos laboratoriais so recomendveis.

37
4.4 GARANTIA DA QUALIDADE

O laboratrio de microbiologia deve assegurar a confiabilidade dos servios laboratoriais prestados, por
meio de, no mnimo:

a) controle interno da qualidade;

b) controle externo da qualidade (ensaios de proficincia).

4.4.1 Ensaio de Proficincia

O desempenho dos exames de laboratrio de microbiologia realizado atravs de ensaios de proficincia.


Este programa consiste na avaliao de amostras por evento. H um nmero estabelecido de eventos
anuais de testes em cada rea de atividade. As amostras de proficincia devem ser analisadas pelos
colaboradores que habitualmente realizam as anlises em questo, de acordo com os procedimentos de
rotina. O laboratrio que no atender os requisitos dos ensaios de proficincia deve documentar a fonte
do problema, revisar o programa em vigor e tomar medidas corretivas.

4.4.2 Conceitos Qualificao e Validao

A Qualificao conjunto de aes realizadas para atestar e documentar que quaisquer instalaes,
sistemas e equipamentos esto propriamente instalados e/ou funcionam corretamente e levam aos
resultados esperados. A qualificao frequentemente uma parte da validao, mas as etapas individuais
de qualificao no constituem, sozinhas, uma validao de processo.

A validao constitui evidncia documentada que prov com alto grau de segurana, que um produto ou
processo especfico produzir consistentemente, atendendo suas especificaes pr-estabelecidas e atributos
de qualidade.

O laboratrio deve validar os mtodos no normalizados, mtodos desenvolvidos pelo prprio laboratrio,
mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidas, ampliaes e modificaes de
mtodos normalizados, com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados para o uso pretendido.

O laboratrio deve registrar os resultados obtidos e o procedimento utilizado para a validao.

A tcnica usada para a determinao do desempenho de um mtodo deve incluir:

a) Calibrao com o uso de padres e / ou materiais de referncia;


b) Comparaes com resultados obtidos por outros mtodos;

38
c) Comparaes interlaboratoriais
d) Avaliao sistemtica dos fatores que influenciam o resultado;
e) Avaliao da incerteza dos resultados com base no conhecimento cientfico dos princpios

tericos do mtodo e na experincia prtica.

A faixa e a exatido dos valores que podem ser obtidos por meio de mtodos validados devem ser
pertinentes s necessidades dos clientes, como:

a) Incerteza dos resultados;


b) Limites de deteco;
c) Seletividade do mtodo;
d) Linearidade;
e) Limite de repetitividade e/ ou reprodutibilidade;
f) Robustez contra influncias externas e/ ou sensibilidade cruzada contra interferncia da matriz da

amostra/ objeto de ensaio, conforme avaliadas para o uso pretendido.

4.4.3 Incerteza de Medio

Um laboratrio de ensaio deve ter procedimento para estimar a incerteza de medio de todas as
calibraes e tipos de calibraes quando realizar suas prprias calibraes.

Os laboratrios de ensaio devem ter procedimentos para clculo das incertezas de medio para os
mtodos de ensaio. Em casos que o mtodo de ensaio empea o clculo rigoroso metrologicamente
e estatisticamente vlido da incerteza de medio, o laboratrio deve identificar os componentes de
incerteza e estimar sua contribuio.

4.4.4 Auditorias Internas

O laboratrio deve realizar auditorias internas de suas atividades de acordo com um cronograma e procedimento
previamente estabelecidos para verificar se seus processos continuam a atender os requisitos do sistema da
qualidade, da Norma ISO/ IEC 17025 e dos requisitos de habilitao da REBLAS.

O gerente da qualidade responsvel pelo planejamento e organizao das auditorias. Estas devem ser realizadas
por pessoal treinado e qualificado e, se possvel, independente das atividades a serem auditadas.

As auditorias internas devem ser programadas de tal forma que cada aspecto do sistema da qualidade
seja examinado, pelo menos, uma vez por ano.

Os programas de auditorias internas devem cobrir todas as atividades do laboratrio, inclusive a realizao
de ensaios.

39
Quando a auditoria constatar dvidas sobre a efetividade das operaes ou correo ou validade dos
resultados de ensaios, o laboratrio deve tomar aes corretivas em tempo hbil e notificar, por escrito,
ao cliente, se for demonstrado que os resultados foram afetados.

Devem ser registradas a rea de atividade auditada, as constataes da auditoria e as aes corretivas
dela decorrentes.

As atividades de acompanhamento da auditoria devem verificar e registrar a implementao e a eficcia


das aes corretivas tomadas.

4.4.5 Controle de Registros

O laboratrio deve estabelecer e manter procedimentos para identificar, coletar, indexar, acessar, arquivar,
armazenar, manter e dispor os registros tcnicos e da qualidade de forma segura e com confidencialidade.

Os registros devem ser legveis, armazenados e preservados, facilmente recuperveis, em instalaes


adequadas para prevenir dano, deteriorao ou perda.

O laboratrio deve definir o tempo de reteno dos registros.

O sistema de registro deve ser referenciado de forma coordenada, de maneira que permita uma correlao
apropriada entre os diferentes elementos de um registro.

O laboratrio deve manter as observaes originais, clculos e dados derivados, registros de manuteno,
verificao e calibrao de instrumentos/ equipamentos, registros do pessoal tcnico e gerencial, cpia
dos relatrios de ensaios e qualquer outro registro de relevncia para o laboratrio.

Os registros devem incluir a identificao dos responsveis pela amostragem, pela realizao de cada
ensaio e pela verificao dos resultados.

Quando ocorrem erros nos registros, cada erro deve ser riscado, no devendo ser apagado, nem tornado
ilegvel, nem eliminado. O valor correto deve ser escrito ao lado. Todas as alteraes devem ser assinadas
ou rubricadas pela pessoa que fizer a correo.

A converso dos resultados das medies para o Sistema Internacional de Unidades (SI) deve ser realizada
somente aps a anotao ter sido feita na unidade na qual o instrumento foi calibrado.

Todos os registros impressos por computador ou calculadoras, inclusive os grficos, devem ser datados,
rubricados e anexados aos registros das medies.

40
4.4.6 Relatrio de Ensaio

O relatrio deve ser legvel, sem rasuras, escrito em lngua portuguesa, datado e assinado por profissional
de nvel superior legalmente habilitado.

O relatrio deve conter no mnimo os seguintes itens:

a) identificao do laboratrio;

b) endereo do laboratrio;

c) identificao do Responsvel Tcnico (RT);

d) n de registro do RT no respectivo conselho de classe profissional;

e) nome, endereo e registro de identificao do cliente no laboratrio;

f) data da coleta da amostra;

g) data de emisso do relatrio;

h) nome do produto e mtodo analtico;

i) resultado e unidade de medio;

j) valores de referncia, limitaes tcnicas da metodologia e dados para interpretao;

k) observaes pertinentes.

41
5 LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
5.1 BOAS PRTICAS DE LABORATRIO

Os Princpios das Boas Prticas de Laboratrio devem ser estabelecidos a fim de garantir a qualidade do
servio prestado pelo laboratrio microbiolgico.

5.1.1 Pessoal

Para execuo das responsabilidades atribudas ao laboratrio analtico microbiolgico, o pessoal deve ter
treinamento bsico em microbiologia e experincia pratica suficiente nas tcnicas aplicadas e em relao
aos microrganismos estudados.

O responsvel pela emisso dos resultados e laudos analticos deve possuir competncia (habilitao)
para interpretar com confiana os resultados obtidos.

5.1.2 Instalaes Prediais

Instalaes de ensaio englobam o espao operacional do laboratrio microbiolgico. Deve possuir


pelo menos: um espao para recebimento e processamento de amostras; um espao para preparo
dos consumveis (p.ex.: meios de cultura); um espao para realizao das anlises; e um espao para
descontaminao de material e descarte de amostras. recomendvel que o layout do laboratrio no
permita o cruzamento das reas a fim de evitar contaminao cruzada.

Imagem 01: Realizao da Anlise

Outras instalaes auxiliares podem ou no estar includas no


planejamento do laboratrio ao redor das instalaes de ensaio.
Incluem: espao de navegao (p.ex. corredores, entradas e
sadas, escadas); rea administrativa; vesturios; arquivos; entre
outros.

Dependendo da natureza dos ensaios realizados pelo laboratrio,


ser necessrio estabelecer restries de acesso s diferentes reas
do laboratrio. Quando aplicvel, informar todo o pessoal a respeito
de tais restries e colocar sinalizao apropriada nas imediaes.

Fonte: Avisa

42
5.1.2.1 Fluxo das atividades

Quando as amostras chegam ao laboratrio, devem ser devidamente recebidas e verificadas quanto
procedncia. Amostras com irregularidades devem ser avaliadas se podem ou no ser analisadas.

De qualquer forma, o estado da amostra deve ser registrado e Imagem 02: Preparo de
as amostras recebidas devem ser identificadas corretamente, Meios de Cultura
de acordo com procedimento do laboratrio. Registrar,
minimamente: data e hora do recebimento; estado da amostra;
dados da coleta (p.ex. data, local, assepsia).

Qualquer amostra que no for analisada de prontido deve


ser armazenada em condies que desfavoream qualquer
variao na populao microbiana. Tais condies devem ser
registradas e controladas.

Realizar a subamostragem de acordo com mtodos acreditados e


de forma que seja homognea em sua distribuio, considerando
a proliferao desigual de microrganismos.
Fonte: Avisa

Realizar as anlises de acordo com os procedimentos operacionais


padres institudos no laboratrio.

Aps a anlise deve ser feita a reteno e descarte das amostras. As amostras devem ser retidas, no
mnimo, at a obteno dos resultados e se necessrio reter a amostra durante o perodo estabelecido
pelo laboratrio.

5.1.2.2 Materiais e Tipos

Os materiais utilizados so reagentes com qualidade apropriada, microrganismos-controle positivos e negativos


rastreveis, meios de culturas nacionais ou internacionais reconhecidas, todos armazenados sob condies
apropriadas e validades controladas. Pode-se citar como alguns dos materiais do Laboratrio de Microbiologia:

gua deionizada: gua pura isenta de ons. Deve ser preparada para uso imediato apenas,

diminuindo assim a possibilidade de contaminao.

Meio de cultura: podem ser encontrados como slidos liofilizados prontos para preparo ou

como meios prontos para uso.

Cepas de referncia: so cepas de microrganismos utilizados como padres de referncia

na validao de meios e kits comerciais.

43
Tubos e Frascos de Plsticos Estreis

Placas de Petri de vidro ou plstico descartvel (mais comum entre 85 a 100 mm de dimetro)

Pipetas de vidro ou plstico descartvel (1 mL, 2 mL ou 10 mL)

5.1.2.3 Armazenagem

Todas as matrias-primas, consumveis, meios de cultura prontos para uso (conforme descrito pelo
fabricante), materiais de referncia e devem ser armazenados hermeticamente para garantir sua qualidade
no momento do uso (p.ex. abrigo da luz, da umidade, da temperatura).

Amostras devem ser analisadas o mais rpido possvel, aps a coleta. Quando isso no possvel ou
quando esto destinadas a ser analisadas posteriormente, devem ser transportadas e armazenadas em
condies que garantam a integridade e exatido do resultado analtico.

5.1.2.4 Higienizao (limpeza) e Sanitizao

O laboratrio deve ter um procedimento de limpeza regular e documentado, onde deve estar descrito a
frequncia e o tipo de sanitizante utilizado. Um procedimento de verificao tambm deve ser utilizado para
avaliar a eficcia da limpeza e sanitizao realizadas no laboratrio. Este sistema de limpeza engloba todas
as instalaes e equipamentos do laboratrio. Atentar-se a detalhes como a possibilidade de contaminao
cruzada durante a sanitizao e procedimentos especficos para o caso de derramamentos. Todo o EPI e
roupas especiais devem ser removidos antes da sada do laboratrio.

No permitido fumar, beber ou comer na rea de teste, assim como tambm no permitido colocar
alimentos para consumo pessoal nos refrigeradores do laboratrio.

5.1.3 Equipamentos

Todos os equipamentos devem ser devidamente instalados, qualificados e conservados de acordo com
as normas estabelecidas no laboratrio. Deve-se documentar toda limpeza, calibrao e manuteno dos
equipamentos, bem como monitoramento do seu uso.

5.1.3.1. Tipos

Laboratrios microbiolgicos devem estar equipados minimamente com:

Autoclave: utilizado para esterilizao de materiais e consumveis por aquecimento via


mida. Deve ser mantido em boas condies de conservao e limpeza e, quando possvel,
autoclavar materiais de naturezas diferentes separadamente.
Balanas: utilizar balanas analticas e ou semi-analticas (com verificao).

44
Banho-maria: Aplicvel para incubao de meios de cultura inoculados e testes temperatura-
dependente, assim como para aquecer meios de cultura do tipo gar sua forma lquida.
Contador de colnias: utilizado para contagem de colnias em placas de cultura.
Estufa de incubao: utilizada com o propsito nico de incubar os meios inoculados de
forma controlada. Deve estar equipada minimamente de termostato, termmetro e timer,
todos funcionais, devidamente calibrados e documentados com dados rastreveis.
Estufa de secagem: utilizado com o propsito de secagem de materiais. Deve estar
equipada minimamente de termostato e termmetro, todos funcionais e devidamente
calibrados.
Fluxo laminar: cabines fechadas com passagem de corrente de ar nas entradas, bloqueando
fisicamente a passagem de microrganismos. Utilizado com o propsito de proteger a
amostra de contaminao externa e de proteger o analista do material contido dentro da
cabine.
Freezer: quando no especificado, deve manter a temperatura interna a -18 C.
Geladeira: quando no especificado, deve manter a temperatura interna a 5 C 3 C.
pHmetro: potencimetro utilizado para medir potencial hidrogeninico (pH) de meios
aquosos e slidos. Deve ser capaz de medir valores com erro associado primeira casa
decimal ( 0,1) e deteco de variaes mnimas no pH.
Destilador: pode ser simples, de mltiplos efeitos e os de compresso de vapor.
Microscpio: um aparelho utilizado para visualizar estruturas com dimenses invisveis a
olho nu (0,1mm).
Micropipeta: vrias capacidades de 0,1 a 10 mL, utilizado para pipetagem de solues
lquidas.

5.1.3.2 Qualificao/Calibrao/Aferio

A calibrao e qualificao devem ser realizadas em todos os equipamentos que influenciam diretamente
no resultado dos ensaios. A frequncia das calibraes deve ser estipulada pelos responsveis do
laboratrio, mas deve ser minimamente suficiente para garantir as condies adequadas do uso dos
equipamentos. Podem ser utilizadas evidncias no histrico do equipamento ou recomendaes do
fornecedor no momento de decidir a frequncia e necessidade de calibrao. Todas as calibraes devem
ser devidamente registradas e documentadas.

5.1.3.3 Manuteno Preventiva e Corretiva

A manuteno de todos os equipamentos deve ser realizada periodicamente, de forma proporcional aos
fatores de desgaste dos mesmos (p.ex. frequncia de uso), que denominado manuteno preventiva.
Quando h falha no equipamento que impea sua utilizao no cotidiano do laboratrio, deve ser realizada
a manuteno corretiva. Todas as manutenes, independente da natureza, devem ser devidamente
registradas/documentadas.
45
5.2 CEPAS

5.2.1 Identificao de Microrganismos

Desde a descoberta dos microrganismos h alguns sculos, vm se buscando novas maneiras de identificar
as bactrias. Neste item sero abordados alguns mtodos que auxiliam na identificao de microrganismos.

5.2.1.1 Colorao de Gram

O mtodo de colorao de Gram permite diferenciar bactrias com diferentes estruturas de parede celular a
partir das coloraes que estas adquirem aps tratamento com agentes qumicos especficos.

O mtodo consiste em tratar sucessivamente um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com o Corante
Primrio (cristal violeta) seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas
quanto Gram-negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma
colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas.

Segue-se o tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a
poro lipdica das membranas externas das bactrias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo
removido, descorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das
bactrias Gram-positivas e provoca a contrao dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeveis
ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. Em seguida, a amostra
tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica.

Quando se observa no microscpio as bactrias que adquirem a colorao azul violeta so chamadas de
Gram-positivas e aquelas que adquirem a colorao vermelho so chamadas de Gram-negativas.

Imagem 03: Microscopia ptica de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas

Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-negativas

Fonte: Avisa

46
5.2.1.2 Colorao de Wirtz-conklin

A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e sada de materiais do esporo, mas
por sua impermeabilidade, geralmente refringente e de difcil colorao. A exposio prolongada ao
corante verde malaquita, associado ao aquecimento, permite a penetrao do corante e a colorao
do esporo por um verde intenso. Como contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras
estruturas em vermelho, facilitando a diferenciao dos esporos.

5.2.1.3 Kits de Identificao

Estes kits consistem na realizao de provas bioqumicas que auxiliam a identificao de bactrias.

5.2.2 Manuteno de cepas

Neste item sero abordados mtodos aplicados manuteno das cepas utilizadas em testes
microbiolgicos e como assegurar sua qualidade desde o recebimento, armazenamento, reconstituio,
crescimento, estocagem e controle de pureza para serem utilizadas nos mtodos microbiolgicos.

Culturas de referncia

As culturas de referncia consistem em microrganismos classificados por gnero e espcie, catalogados e


descritos de acordo com suas caractersticas e origem (ISO 11133-1:2000).

Devem ser adquiridos de Centro de Referncia como: ATCC (American Type Culture Collection), NCTC
(National Collection of Type Cultures), INCQS (Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade),
NBRC (NITE Biological Resource Center), NCIMB (National Collection of Industrial Bacteria), NCPF
(National Collection of Pathogenic Fungi), IMI (International Mycological Institute), UKNCC (United
Kingdom National Culture Collection), CIP (Collection de lInstitut Pasteur) e NCYC (National Collection of
Yeast Cultures).

Para a reconstituio das culturas de referncia recomendado seguir as instrues do fornecedor, que
determina meios de cultura e tempos de incubao ideais.

Preparo do microrganismo a partir do liofilizado (cultura de referncia):

Em fluxo laminar ou diante de bico de Bunsen, pipetar soluo salina estril para reidratar o liofilizado.
Em seguida, transferir o contedo para um tubo de ensaio contendo meio de cultura recomendado pelo
fornecedor. Esta primeira passagem (repique) refere- se a 1 Gerao. definida como uma gerao, cada
vez que o microrganismo transferido para um novo meio de cultura.

47
Do remanescente do frasco reconstitudo (aproximadamente 10 l), transferir com auxlio de um loop
descartvel ou ala de platina uma alquota para meio gar e/ou lquido indicado. Incubar em estufa
por tempo e temperatura determinados pelo fornecedor. Aps perodo de incubao realizar colorao
de Gram e testes confirmatrios (exemplo: coagulase, oxidase, catalase, kits comerciais, etc) a fim de
assegurar a pureza da cultura obtida.

Aps perodo de incubao da 1 Gerao e seu crescimento satisfatrio, repique novamente em agar
inclinado ou placa para obter a 2 Gerao.

O microrganismo preparado pode ser utilizado nos testes microbiolgicos a partir da 3, 4 e 5 geraes.
Com exceo de fungos filamentosos como, por exemplo, Aspergillus brasiliensis, que podem ser
utilizados a partir da 1 Gerao para a preparao de suspenso de esporos.

Aps a 5 Gerao o microrganismo no poder mais ser utilizado devendo ser descartado conforme
procedimento de descarte de resduos com risco microbiolgico.

Culturas estoque

As culturas estoque so consideradas as preparadas conforme indicao do fornecedor a partir de uma


cultura referncia (ISO 11133-1:2000).

O repique deve ser realizado em meio de cultura adequado e mantido sob-refrigerao (2 a 8 C),
devidamente identificada com nome do microrganismo, nmero de identificao (exemplo:ATCC 6538),
gerao a que se refere (2 G) , lote, data de preparao e validade

Exemplo:

Staphylococcus aureus
ATCC 6538 2 G
Lote 12345678-9
Data 01/01/ 2013
Validade 1 ms

Mensalmente, a cultura estoque mantida em tubo ou placa deve ser renovada, por repique em meio de
cultura adequado. Realizar controle das culturas repicadas mensalmente, conduzindo testes confirmatrios
de acordo com a caracterstica de cada microrganismo (exemplo colorao de Gram, coagulase, oxidase,
catalase, kits comerciais, etc). Todos os dados devem ser registrados, permitindo a sua rastreabilidade.

48
Cultura de trabalho

As culturas de trabalho so obtidas a partir de uma cultura estoque para serem utilizadas em testes
microbiolgicas quando aplicveis (ISO 11133-1:2000).

O repique deve ser realizado em meio de cultura adequado e mantido em estufa incubadora por tempo
e temperatura determinados pelo fornecedor conforme exemplo abaixo:

Tabela 09: Repique de cepas

Temperatura Tempo Meio de


Microrganismo
de Incubao de Incubao Cultura

Bactrias 30 - 35C 21 3 horas TSA *

Leveduras 20 - 25C 48 4 horas SDA **

Fungos filamentosos 20 - 25C 6 - 10 dias SDA **

Legenda: TSA* = meio de cultura Trypticase Soya Agar; SDA ** = meio de cultura Saboraud Dextrose Agar

Aps perodo de incubao as culturas podem ser utilizadas para conduo de testes microbiolgicos (teste
desafio de conservante, teste de fertilidade, validao de mtodo de testes microbiolgico, etc.).

Em casos especficos ou quando definido pela empresa pode- se utilizar nos testes microbiolgicos, alm
das culturas de trabalho, que partiram de uma cultura de referncia, culturas de microrganismos isolados
de produtos ou ambiente (Farmacopeia Brasileira 5 edio 2010).

recomendado anotar cada repique em ficha ou caderno a fim de controlar as geraes obtidas e garantir
a rastreabilidade do processo.

O descarte da cultura de trabalho feita aps o uso conforme procedimento de descarte de resduos com
risco microbiolgico de cada laboratrio no sendo necessrio o registro na ficha ou caderno.

49
Figura 01: Repique de Cepas de Referncia
CULTURA DE CULTURA
REFERNCIA ESTOQUE

IDENTIFICAO

1 GERAO

2 GERAO
CEPA
ATCC

3 GERAO

4 GERAO

5 GERAO
IDENTIFICAO
CEPA

CULTURA DE TRABALHO
2 A 8C

Criogenizao de cepas

De acordo com USP 37-NF 32 captulo 1117 pode-se realizar a criogenizao das culturas mantendo congelada
a temperatura de at -70 C. A partir desta tcnica as clulas so mantidas em seu estado vivel por um
perodo de tempo indefinido. Estas culturas criogenizadas podem ser usadas como cultura de trabalho.
importante ressaltar que uma vez retirado do Ultrafreezer, o cryovial (tubo), no pode ser novamente
congelado.

Preparao de Cryovials

Aps crescimento da cultura de 1 Gerao, lavar os tubos ou placas com soluo salina (bactrias e leveduras)
ou soluo salina acrescida de 0,05% de Tween 80 para fungos filamentosos, exemplo Aspergillus brasiliensis.

Para obter a 2 Gerao, repicar a suspenso acima com loop descartvel em tubo inclinado, placas ou
garrafa de Roux e incubar conforme tabela abaixo:

Tabela 10: Repique de Cepas

Temperatura Tempo Meio de


Microrganismo
de Incubao de Incubao Cultura

Bactria 30 - 35C 21 3 horas TSA

Leveduras 20 - 25C 48 4 horas SDA

A. brasiliensis 20 - 25C 6 - 10 dias SDA

Legenda: TSA* = meio de cultura Trypticase Soya Agar; SDA ** = meio de cultura Saboraud Dextrose Agar

50
Aps perodo de incubao determinado, lavar os repiques com meio de cultura TSB acrescido de 15%
glicerol (soluo crioprotetora) que evitar o rompimento das clulas durante o processo de congelamento.

Transferir no mesmo dia da preparao, aproximadamente de 1 a 2 ml (no mais que 2/3 do volume
do tubo) da suspenso para cryovials. Identificar cada cryovial com nome do microrganismo, nmero de
ATCC, data da preparao e data de expirao.

Realizar preparado em quarentena at que os testes estejam concludos. Se a pureza controle de pureza
e identificao da cultura de um dos cryovials preparados, e manter o restante da cultura for confirmada
(>90%), estocar em Ultrafreezer a temperatura de -70C. Caso a pureza da cultura no seja satisfatria
(<90%), todos os cryovials devem ser descartados conforme procedimento de descarte de resduos com
risco microbiolgico de cada laboratrio.

Descongelamento do Cryovial

Retirar o Cryovial do Ultrafreezer e coloc-lo em incubadora a 30-35C aproximadamente de 30 a 60


minutos ou at que descongele o contedo. No permitido congelar novamente uma vez descongelado
o cryovial.

Para a obteno das 3, 4 geraes proceder da mesma maneira citada acima, com exceo da 5 gerao
que s poder ser usada nos testes microbiolgicos e no poder utilizada no preparo de uma nova
gerao sendo ento descartada aps seu uso conforme procedimento de descarte de resduos com risco
microbiolgico de cada laboratrio.

Figura 02: Descongelamento de Cryovial

GARRAFA DE ROUX
2 GERAO
1 GERAO

AT C C

IDENTIFICAO
2 GERAO

2 GERAO

2 GERAO

2 GERAO

ESTOQUE
CEPA
-70 C
4 GERAO
3 GERAO

5 GERAO

CULTURA DE TRABALHO

51
Existem disponveis no mercado formas alternativas de culturas prontas para uso.

No entanto, estas culturas so fornecidas geralmente a partir de 3 gerao. Deve-se manter o mesmo
requisito quanto aos controles de pureza e gerao assim como aplicado s cepas obtidas de centro de
referncia.

5.2.3 Controle de gerao

Conforme descrito na USP 37-NF32 capitulo 1117, o nmero de repiques no deve ultrapassar a 5 gerao
para evitar subcultura excessiva o que pode levar a uma alterao fenotpica ou mutao, podendo assim
interferir diretamente nos resultados obtidos em testes microbiolgicos.

Para melhor controle dos repiques, recomenda-se documentar a data de abertura da cultura de referncia,
lote, meio de cultura, gerao, data de expirao e analista responsvel.

Figura 03: Modelo de registro de repique de cepas de referncia

MICRORGANISMO: ATCC:

LOTE: VALIDADE:

RECONSTITUIO CRIOGENIZAO

Data: Data: Validade:

Meio de cultura/Lote: Meio de cultura/Lote:

Gerao: Quantidade: Gerao: Quantidade:

Responsvel: Responsvel:

52
5.2.4. Validade

A data de validade de cada cepa liofilizada ou pronta para uso determinada pelo fornecedor e deve-se
seguir a recomendao contida em seu Certificado de Anlise.

Para culturas estoque a data de validade de um ms e para culturas de trabalho a data de validade
consiste em uma semana. Ambas devem ser mantidas refrigeradas de 2 a 8 C.

Para culturas criogenizadas, a data de validade torna-se indeterminada.

Para cada uma dessas apresentaes de cultura, observar suas caractersticas morfolgicas, pureza
e identificao atravs de testes confirmatrios adequados (colorao de Gram, coagulase, oxidase,
catalase, kits comerciais, etc). Caso alguma contaminao seja observada, a cultura deve ser descartada
conforme procedimento de descarte de resduos com risco microbiolgico de cada laboratrio. Todos os
dados devem ser registrados, permitindo a sua rastreabilidade.

53
6 CONTROLE E PREPARO DE MATERIAIS PARA
ANLISE
6.1 PREPARO DE MATERIAIS E DE AMOSTRAS PARA ANLISE
MICROBIOLGICA

6.1.1 Meios de cultura e solues

Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que fornecem os


nutrientes necessrios ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo
em vista a ampla diversidade metablica dos microrganismos, existem vrios tipos de meios de cultura
para satisfazerem as variadas exigncias nutricionais. Alm dos nutrientes preciso fornecer condies
ambientais favorveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, presso osmtica, umidade,
temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), dentre outras.

Os meios de cultura podem ser classificados quanto a sua:

A) Composio

B) Consistncia

C) Inteno de uso

D) Mtodo de preparo

A) COMPOSIO

a. Quimicamente definido constituintes definidos quimicamente. Exemplo: grau de

pureza.

b. Quimicamente incompleto composio qumica no completamente definida.

B) CONSISTNCIA

a. Meio lquido consiste em uma soluo aquosa de um ou mais constituintes. So

comumente conhecidos como caldos.

b. Meio slido ou semi-slido contm materiais solidificantes, como agar-agar ou

gelatina, em diferentes concentraes.

C) INTENO DE USO

a. Meio de transporte preserva e mantm a viabilidade dos microrganismos no perodo

entre a coleta da amostra e o processamento no laboratrio. Exemplo: Meio Stuart.

54
b. Meio de preservao preserva e mantm a viabilidade dos microrganismos por um

perodo de tempo prolongado e permite a recuperao aps este perodo. Exemplo:

Meio Cary Blair.

c. Meio de recuperao possibilita a recuperao dos microrganismos estressados ou

danificados e recupera sua capacidade de crescimento sem, necessariamente, promover

sua multiplicao. Exemplo: gua Peptonada Tamponada.

d. Meio de enriquecimento meio predominantemente lquido na qual, devido a sua

composio, proporciona condies favorveis multiplicao dos microrganismos.

Exemplo: Caldo Lactosado.

e. Meio de enriquecimento seletivo meio de enriquecimento na qual favorece a

multiplicao de microrganismos especficos, ao mesmo tempo, que inibe parcialmente

ou totalmente o crescimento de outros microrganismos. Exemplo: Caldo Tetrationato.

f. Meio de enriquecimento no-seletivo meio de enriquecimento na qual favorece o

crescimento da maioria dos microrganismos. Exemplo: Caldo Infuso de Crebro e

Corao.

g. Meio de isolamento meio slido ou semi-slido na qual favorece o crescimento de

microrganismos. Exemplo: Agar Casena-Soja.

h. Meio de isolamento seletivo meio de isolamento na qual favorece o crescimento de

microrganismos especficos, ao mesmo tempo, que inibe outros microrganismos.

Exemplo: Agar Baird-Parker.

i. Meio de isolamento no seletivo meio de isolamento na qual no inibe os

microrganismos seletivamente. Exemplo: Agar Nutriente.

j. Meio diferencial permite testar uma ou mais caractersticas fisiolgicas/bioqumicas

dos microrganismos para sua identificao. Exemplo: Agar Eosina Azul de Metileno.

k. Meio de identificao produz uma reao de identificao especfica na qual no

requer nenhum teste adicional de confirmao. Exemplo: Agar TSI.

l. Meio de mltiplas finalidades certos meios que podem atender diversas categorias.

Exemplo: Agar Sangue.

55
Tabela 11: Finalidade dos Meios de Cultura

MEIOS DE CULTURA

Tipo Finalidade

Crescimento de quimiotrficos e autotrficos e anlises


Quimicamente Definido
microbiolgicas.

Complexo Crescimento da maioria dos orgnicos quimio-heterotrficos.

Redutor Crescimento de anaerbios obrigatrios.

Impedir o crescimento de microrganismos no desejados e


Seletivo
favorecer o crescimento do organismo de interesse.

Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outros


Diferencial
organismos.

Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica


Enriquecimento importante de aumentar o nmero de bactria de interesse
tornando-a detectvel.

D) MTODO DE PREPARO

a. Meio pronto para uso fornecido em recipientes no formato pronto para uso.

b. Meio desidratado comercialmente disponvel meio no formato seco na qual no est pronto

para uso imediato. Exemplo p, grnulos. A re-hidratao formar um meio completo pronto

para uso ou um meio incompleto que necessita de componentes adicionados na hora do uso.

c. Meio formulado no laboratrio.

6.1.1.1 Pesagem de meios de cultura

O preparo correto do meio de cultura uma das etapas fundamentais no ensaio microbiolgico. Respeite
as Boas Prticas de Laboratrio e as instrues do fabricante para manusear meios desidratados e outros
componentes. Documente todos os dados relevantes, como peso, volume, pH, etc.

A gua utilizada deve ser isenta de substncias inibidoras ou que influenciem o crescimento dos
microrganismos.

A esterilizao dos meios de cultura e reagentes pode ser feita por calor mido (autoclave) ou filtrao.
Certos meios no precisam de esterilizao por autoclave, mas podem ser usados aps fervura. O controle
da eficcia da esterilizao essencial. Aps esterilizao, todos os meios devem ser monitorados, em
particular com respeito ao pH, colorao, esterilidade e consistncia.

56
6.1.1.2 pH

A maioria das bactrias cresce melhor dentro de variaes pequenas de pH sempre perto da neutralidade,
entre pH 6,5 e 7,5. Poucas bactrias so capazes de crescer em pH cido como pH 4,0. No entanto, algumas
bactrias denominadas acidfilas apresentam alto grau de tolerncia acidez.

Os fungos filamentosos e as leveduras podem crescer em variaes de pH maiores que as bactrias, porm,
os valores timos de pH para fungos so geralmente inferiores, entre 5 e 6.

As bactrias cultivadas em laboratrio com frequncia produzem cidos que podem acabar interferindo
no seu prprio crescimento. Para neutralizar esses cidos e para a manuteno do pH normalmente so
includos tampes qumicos nos meios de cultura. Portanto, os pHs dos meios de cultura variam de acordo
com o microrganismos a ser cultivado.

6.1.1.3 Tipos de esterilizao

Como se trata de um trabalho de muita preciso, a esterilizao de meios de cultura fundamental


dentro de todo o processo. O principal objetivo remover totalmente a capacidade reprodutiva de todos
microrganismos indesejveis para uma determinada anlise, deixando o meio de cultura propcio somente
para o objeto de estudo.

A esterilizao de um meio de cultura pode ser realizada aplicando-se calor mido ou calor seco, irradiao
a partir de raios gama ou raios-X, ou utilizando-se de determinados compostos qumicos em conjunto
com solues vaporizadas ou por filtrao. No caso de esterilizao por calor mido, o processo envolve a
desnaturao e coagulao de protenas e enzimas, assim como a fuso lipdica da membrana celular. Por
calor seco, a esterilizao ocorre por oxidao quando o meio de cultura exposto a altas temperaturas.

6.1.1.4 Validade

A validade dos meios de cultura variam de acordo com a composio e o fabricante, portanto importante
seguir a recomendao descrita no rtulo.

Para os meios de cultura estreis, parcialmente completos, nas quais componentes finais so adicionados
imediatamente antes do uso, devem ser mantidos sob refrigerao por at 3 meses ou a temperatura
ambiente por at 1 ms, para prevenir que sua composio seja modificada. Contudo, recomenda-se que o
meio que tenha suplementos seletivos sensveis adicionados, seja usado no dia do preparo. Meios slidos
contendo substncias quimicamente reativas e/ou sensveis no devem ser armazenados em grandes
quantidades para fuso.

57
Antes do uso ou do aquecimento adicional, recomenda-se que o meio de cultura atinja a temperatura
ambiente.

6.1.1.5 Promoo de crescimento / esterilidade

O teste de promoo de crescimento tem o objetivo de verificar se o lote de meio de cultura est apto
para utilizao:

Esterilidade: verifica se o lote do meio de cultura est estril,

Promoo de crescimento: verifica a capacidade que o meio de cultura tem em promover o

crescimento microbiano.

Esterilidade uma quantidade adequada de cada lote deve ser testada para contaminao microbiana,
atravs da incubao sob condies apropriadas, antes do uso ou em paralelo com o meio inoculado. Meios
seletivos podem apresentar alguns problemas, devido inibio de vrios microrganismos. A contaminao
pode no estar evidente visualmente, em forma de turbidez ou formao de colnia. Este problema pode
ser superado atravs da transferncia de uma poro do meio seletivo lquido para um meio no seletivo
ou fazendo um swab da superfcie da placa e incubando o swab em um meio no seletivo. Limites para a
porcentagem de placas ou tubos ou frascos com meio lquido contaminados, devem ser estabelecidos para
cada meio, ou especificados pelo fabricante.

Organismos teste Um conjunto de organismos teste deve conter microrganismos com caractersticas
estveis, representativas de sua espcie e que sejam confiveis para demonstrar o desempenho de
um meio preparado no laboratrio. Os organismos teste devem compreender as cepas que estejam
facilmente disponveis nas colees de cultura de referncia, porm cepas bem caracterizadas, isoladas
no laboratrio tambm podem ser includas.

Os organismos teste para cada meio pode incluir:

cepas positivas robustas com caractersticas tpicas;

cepas positivas que crescem fracamente (de uma natureza mais sensvel);

cepas no reativas bioquimicamente;

cepas inibidas completamente.

Para os meios que no contm indicadores ou agentes seletivos, o uso de uma cepa teste positiva simples,
adequado. Para os meios que contm indicadores ou agentes seletivos, devem ser utilizadas cepas que
demonstrem a funo do indicador e seletividade. Para os meios complexos, como os adicionados de
suplemento, cada lote deve ser verificado com as cepas que apresentem as caractersticas listadas acima.

58
Produtividade meios de cultura lquidos, semi-slidos e slidos devem ser inoculados com inculos
apropriados da cultura de trabalho dos organismos teste, utilizando um dispositivo adequado. Para
mtodos quantitativos a produtividade a relao entre a contagem total de colnias no meio de cultura
teste e contagem total de colnias no meio de cultura de referncia.

Seletividade Para a avaliao da seletividade em mtodos quantitativos, utilizando dispositivos adequados


e organismos teste definidos, um meio de cultura seletivo e um meio de referncia so inoculados com
inculos apropriados dos organismos teste. Seletividade a diferena entre a maior diluio, apresentando
crescimento acima de 10 colnias, no meio de referncia e a maior diluio, apresentando crescimento
comparvel, no meio teste.

Cuidado especial deve ser dado seleo das amostras e organismos a serem avaliados nestes testes. Se
organismos teste so utilizados na avaliao de meios no seletivos, os organismos escolhidos devem ser
to fastidiosos quanto queles para a qual o meio ser utilizado rotineiramente. Recomenda-se que mais
de um organismo teste seja utilizado para avaliar um determinado meio.

Para a avaliao de meios seletivos/diferenciais, devem ser escolhidos organismos que testem as
caractersticas seletivas/diferenciais e de produtividade do meio. Meios lquidos podem ser avaliados
utilizando organismos que devem crescer no meio e queles que devem ser reprimidos. Seguindo com
uma incubao adequada, as concentraes devem ser determinadas para cada organismo teste. Um
meio aceitvel deve apresentar altas concentraes do organismo esperado e baixas concentraes do
organismo reprimido. O desempenho de um novo lote deve ser similar ao lote controle. A avaliao de
um meio slido realizada de uma maneira parecida.

Microrganismos do grupo para qual o meio designado devem ser recuperados, quantitativamente,
quase comparado ao meio no seletivo. Organismos que devem ser reprimidos pelo meio, no podem se
desenvolver ou devem ser fortemente reduzidos, ao se comparar com a enumerao do meio no seletivo.

6.1.1.6 Armazenagem

De forma geral, os meios pontos devem ser armazenados temperatura entre 2 a 8C (geladeira). O efeito
nocivo comumente associado ao armazenamento a desidratao. Esta no ser problema em meios
lquidos e sim nos meios em placas, principalmente em laboratrios pequenos onde certos meios so
usados ocasionalmente. Estes meios em placas devem ser conservados em sacos plsticos, selados, para
minimizar a perda de umidade, e estocados em posio invertida. Todos os meios devem ser levados
temperatura ambiente antes do seu uso. Meios como gar padro, batata e outros, podem ser guardados
em volumes para serem adicionados em placa (15 ml). No momento da anlise sero fundidos, resfriados
e adicionados na placa contendo a amostra.

Os meios de cultura em p devem ser armazenados de acordo com as recomendaes do fabricante.

59
6.1.2 Amostras para anlise microbiolgica

O laboratrio deve verificar as condies dos produtos no recebimento e verificar a quantidade e estado
(vazamento e etc.).

Os produtos recebidos pelo laboratrio devem ser registrados em documentos que permitam que o
andamento da anlise possa ser monitorado atravs de relatrios ou dados brutos.

As informaes que devem ser registradas so:

nome do produto,

data de recebimento,

dados da amostragem (lote, data de fabricao e validade),

origem e pedido do solicitante,

tipo de anlise.

Estocar os produtos a serem analisados temperatura ambiente. No incubar ou refrigerar os produtos


antes ou depois das anlises.

6.1.2.1 Assepsia

Para evitar contaminao dos produtos, manusear de forma a evitar risco de contaminao. Para isto,
devem-se seguir tcnicas de assepsia, como por exemplo:

Sanitizar embalagem e a tampa para ser aberta adequadamente,

utilizar instrumento estril para abrir a embalagem,

utilizar instrumento estril para retirar a amostra do produto.

6.1.2.2 Pesagem

A preparao inicial e de amostras diludas, deve ser realizado em um intervalo entre o fim do preparo e o
momento que o inoculo entra em contato com o meio de cultura no deve exceder 45 min.

Registrar o volume ou massa que foi pesado da amostra.

6.1.2.3 Definio nmero de amostras

Transferir a amostra do produto para um recipiente adequado e realizar a diluio de acordo com o
procedimento estabelecido.

Registrar o fator de diluio.

60
6.2 INATIVAO DE SISTEMAS ANTIMICROBIANOS

Os procedimentos para inativao do sistema preservante devem ser validados, pois a amostra diluda no
pode inibir a multiplicao dos microrganismos, eventualmente presentes.

A inativao do sistema preservante realizada atravs da transferncia da concentrao aproximada de


10 de microrganismos viveis por 0,5 mL de diluente neutralizante para a placa de petri contendo 1 mL
da diluio 1:10 do produto (em duplicata). Adicionar 15 mL do meio de cultura adequado, esterilizado e
resfriado at cerca de 46C.

O crescimento parcial ou o no crescimento do microrganismo invalida o teste. Os microrganismos


sugeridos para a realizao do ensaio para comprovar a inativao do sistema preservante esto listados
abaixo:
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Candida albicans

Aspergillus brasiliensis

A concentrao inibitria mnima a concentrao mnima de preservante capaz de inibir o crescimento


de microrganismo.

Tabela 12: Principais Conservantes utilizados e seus inativantes.

Conservante Inativante

Parabenos 3% p/v polissorbato 80

Formaldedo 0,1% p/v histidina

Isotiazolinonas 12% p/v sulfitos

Dibromoglutaronitrila 12% p/v sulfitos

Imidazolidinil uria/Diazolidinil
0,5% histidina
uria/dm hidantona
3% p/v polissorbato 80
Piritionato de zinco
0,5% p/v cistidina/histeina
3% p/v polissorbato 80
Ipbc
0,5% p/v cistidina/histeina
2% p/v polissorbato 80
Fenoxietanol
0,3% p/v lecitina de soja

Outros fenis 3% p/v polissorbato 80

Sais quartenrios de amnia 0,3% p/v polissorbato 80 e


e tensoativos anfteros 0,3 p/v lecitina de soja

Fonte: Associao Brasileira de Microbiologia, 2008


61
7 MTODOS MICROBIOLGICOS
Neste captulo sero abordados mtodos de anlises microbiolgicas em produtos acabados e matrias-
primas utilizados em produtos de HPPC.

7.1 PLAQUEAMENTO

Existem 2 tipos de plaqueamento: plaqueamento em profundidade e plaqueamento por semeadura em


superfcie.

O plaqueamento por profundidade consiste em adicionar a amostra diluda, distribuir o meio de cultura
fundido em placa de Petri esterilizada at que se obtenha uma camada de no mnimo 3 mm a 4 mm
(por exemplo, para placa de 90 mm de dimetro, 15 mL a 20 mL de gar so normalmente requeridos)
homogeneizar rapidamente fazendo crculos com a placa. Aguardar o resfriamento e solidificao do gar,
colocando as placas de Petri em uma superfcie horizontal e temperatura ambiente.

O plaqueamento por semeadura em superfcie consiste em distribuir o meio de cultura fundido em placa
de Petri esterilizada at que se obtenha uma camada de no mnimo 3 mm a 4 mm (por exemplo, para placa
de 90 mm de dimetro, 15 mL a 20 mL de gar so normalmente requeridos). Aguardar o resfriamento
e solidificao do gar, adicionar a amostra diluda e semeia-se com o auxlio de um loop ou ala de
Drigalsky proporcionando completa absoro da amostra no Agar.

7.2 CONTAGEM DE MESFILOS AERBIOS TOTAIS

Mtodo de plaqueamento em profundidade.

Para a contagem total de microrganismos, usualmente, a preparao inicial a primeira diluio contada.
Se necessrio, diluies seriadas adicionais (por exemplo, diluio 1:10 podem ser aplicadas a partir da
preparao inicial. Adicionar 1mL da preparao inicial e/ou diluio da amostra preparada em placas
de Petri de 90 mm de dimetro. Verter 15 mL a 20 mL de Agar fundido (TSA - bactria e SDA fungos)
mantido em banho-maria por no mais que 48C. Misturar a preparao inicial e/ou diluio da amostra
diluda com o meio homogeneizado cuidadosamente por meio de movimentos rotativos ou inclinao de
forma suficiente para disperso. Aguardar a solidificao do meio de cultura sobre superfcie horizontal
em temperatura ambiente.

Mtodo plaqueamento por semeadura em superfcie

Adicionar de 15 mL a 20 mL de Agar fundido mantido (TSA- bactria e SDA fungos) em banho-maria por

62
no mais que 48C em placas de Petri de 90 mm de dimetro. Resfriar e solidificar. Semear na superfcie
do meio de cultura um volume determinado, no menos que 0,1 mL da preparao inicial e/ou diluio
da amostra preparada.

7.2.1 Tempo e Temperatura timas de Incubao

A menos que haja outra indicao, inverter a placa inoculada e coloc-la em incubadora regulada a 32,5
C 2,5C por 72 h 6h.

7.2.2 Leituras / clculos

Aps a incubao, contar as colnias em placa de Petri contendo de 30 a 300 colnias. O resultado do
nmero de colnias obtido (mdia aritmtica das duplicatas das diluies analisadas) deve ser multiplicado
pela diluio da respectiva placa, expressando os resultados em Unidades Formadoras de Colnias (UFC)
por grama ou mililitro. Se no houver nenhum crescimento nas placas inoculadas, o resultado ser expresso
em menor que 10, multiplicado pela recproca da menor diluio inoculada e validada.

7.3 PESQUISA DE PATGENOS E IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS

Microrganismos patognicos so aqueles capazes de causar doenas. A resoluo 481/99 da ANVISA


estabelece quais parmetros microbiolgicos devem ser controlados em produtos de higiene pessoal
perfumaria e cosmticos. Para os microrganismos patognicos recomenda-se a deteco de coliformes
totais e fecais (Escherichia coli), Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Clostrdios Sulfito
redutores (exclusivamente para talcos), sendo o critrio de aceitao de ausncia/g ou mL destes
patgenos no produto.

7.3.1 Coliformes Totais e Fecais (Escherichia coli);

Para o preparo da amostra utilizar materiais esterilizados, equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao
inicial dever ser realizada com agente solubilizante adequado, o tempo transcorrido entre o momento
da inoculao at que entre em contato com o caldo de enriquecimento e o fim do preparo no deve
exceder 45 minutos. O enriquecimento preparado a partir de uma amostra de no mnimo 1g ou 1 mL
adequadamente homogeneizado do produto a ser analisado, dispersado em no mnimo 9 mL de caldo
de enriquecimento.

Incubar a preparao inicial em caldo a 32,5 C 2,5C por no mnimo 20h (mximo 72h).

Estriar uma alquota do caldo de enriquecimento incubado utilizando ala estril sobre a superfcie de
meio Agar MacConkey, de modo a obter colnias isoladas.

63
Inverter as placas de Petri e incubar a 32,5 C 2,5C por no mnimo 24h (mximo 48h).

Observar a presena de colnias vermelho-tijolo.

Imagem 04: Escherichia coli em Agar MacConkey

Dar sequncia aos testes para colnias suspeitas isoladas no Agar

MacConkey. A presena de Escherichia coli pode ser confirmada

por outros testes adequados, cultura e testes bioqumicos.

Colorao de Gram
Observar presena de bastonetes Gram-negativos (bacilos)

Fonte: AVISA

Imagem 05: Escherichia coli Colorao de Gram

Crescimento em meio Agar Levine eosina azul de


metileno (gar EMB)

Inocular a superfcie do Agar Levine eosina - azul de


metileno com colnias suspeitas isoladas em Agar
MacConkey, a fim de que as colnias se desenvolvam.
Inverter as placas e incubar a 32,5 C 2,5C por no
mnimo 24h (mximo 48h).

Observar a caracterstica das colnias como brilho


Fonte: AVISA
metlico sobre a luz refletida e aparncia preto-azulado
sobre a luz transmitida.

64
Imagem 06: Escherichia coli em Agar Levine

Se a identificao das colnias confirmar a presena


dessa espcie, expressar o resultado como: Presena de
Escherichia coli na amostra.

Se no houver crescimento aps o enriquecimento e/


ou a identificao das colnias no confirmar a presena
dessa espcie, expressar o resultado como: Ausncia de
Escherichia coli na amostra.

7.3.2 Pseudomonas aeruginosa


Fonte: AVISA
Para o preparo da amostra utilizar materiais esterilizados,
equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao inicial dever ser realizada com agente solubilizante
adequado, o tempo transcorrido entre o momento da inoculao at que entre em contato com o caldo
de enriquecimento e o fim do preparo no deve exceder 45 minutos. O enriquecimento preparado
a partir de uma amostra de no mnimo 1g ou 1 mL adequadamente homogeneizado do produto a ser
analisado, dispersado em no mnimo 9 mL de caldo de enriquecimento.

Incubar a preparao inicial em caldo a 32,5 C 2,5C por no mnimo 20h (mximo 72h).

Estriar uma alquota do caldo de enriquecimento incubado utilizando ala estril sobre a superfcie de
meio Agar Cetrimide, de modo a obter colnias isoladas.

Inverter as placas de Petri e incubar a 32,5 C 2,5C por no mnimo 24h (mximo 48h).

Observar a presena de colnias pigmento amarelo - verde


(piocianina), com fluorescncia sob luz UV.

Imagem 07: Pseudomonas aeruginosa em Agar


Cetrimide

Dar sequncia aos testes para colnias suspeitas isoladas no


Agar Cetrimide. A presena de Pseudomonas aeruginosa
pode ser confirmada por outros testes adequados, cultura e
testes bioqumicos.

Colorao de Gram
Fonte: AVISA
Observar presena de bastonetes Gram-negativos.

65
Imagem 08: Pseudomonas aeruginosa
Colorao de Gram

Teste de oxidase

Observar teste positivo para oxidase

Cultura no meio Agar Pseudomonas para deteco de


piocianina

Inocular a superfcie do meio Agar para deteco de piocianina


com colnias suspeitas isoladas em Agar Cetrimide, a fim de que
Fonte: AVISA
as colnias se desenvolvam. Inverter as placas e incubar a 32,5
C 2,5C e observar o crescimento bacteriano aps 24h, 48h
e 72h. Pseudomonas aeruginosa formam colnias rodeadas por zona azul a verde devido formao de
piocianina ou uma zona vermelha a marrom escura devido produo de piorrubina.

Imagem 09: Pseudomonas aeruginosa em


Pseudomonas Agar P

Se a identificao das colnias confirmar a presena


dessa espcie, expressar o resultado como: Presena de
Pseudomonas aeruginosa na amostra.

Se no houver crescimento aps o enriquecimento e/


ou a identificao das colnias no confirmar a presena
dessa espcie, expressar o resultado como: Ausncia de
Pseudomonas aeruginosa na amostra.
Fonte: AVISA

7.3.3 Staphylococcus aureus

Para o preparo da amostra utilizar materiais esterilizados, equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao
inicial dever ser realizada com agente solubilizante adequado, o tempo transcorrido entre o momento
da inoculao at que entre em contato com o caldo de enriquecimento e o fim do preparo no deve
exceder 45 minutos. O enriquecimento preparado a partir de uma amostra de no mnimo 1g ou 1 mL
adequadamente homogeneizado do produto a ser analisado, dispersado em no mnimo 9 mL de caldo
de enriquecimento.

66
Incubar a preparao inicial em caldo a 32,5 C 2,5C por no mnimo 20h (mximo 72h).

Estriar uma alquota do caldo de enriquecimento incubado utilizando ala estril sobre a superfcie de
meio Agar Baird Parker, de modo a obter colnias isoladas.

Inverter as placas de Petri e incubar a 32,5 C 2,5C por no mnimo 24h (mximo 48h).

Observar a presena de colnias pretas, brilhantes, circundadas por zonas claras.

Dar sequncia aos testes para colnias suspeitas isoladas no


Agar Baird Parker. A presena de Staphylococcus aureus pode
ser confirmada por outros testes adequados e testes
bioqumicos.

Colorao de Gram Imagem 10: Staphylococcus


aureus - Colorao de Gram
Observar presena de cocos em cachos Gram-positivos.

Teste de Catalase

Observar teste positivo para catalase.

Teste de Coagulase

Observar resultado positivo para coagulase.


Fonte: AVISA
Se a identificao das colnias confirmar a presena dessa espcie,
expressar o resultado como: Presena de Staphylococcus aureus na
amostra.

Se no houver crescimento aps o enriquecimento e/ou a identificao das colnias no confirmar a presena
dessa espcie, expressar o resultado como: Ausncia de Staphylococcus aureus na amostra.

7.3.4 Clostrdios sulfito redutores

Para o preparo da amostra utilizar materiais esterilizados, equipamentos e tcnicas asspticas. A preparao
inicial dever ser realizada com agente solubilizante adequado, o tempo transcorrido entre o momento
da inoculao at que entre em contato com o caldo de enriquecimento e o fim do preparo no deve
exceder 45 minutos.

Separar duas parcelas de amostras iguais (10mL/ g) e aquecer apenas uma poro da amostra em banho-
maria a 80C durante 10 minutos resfriar rapidamente, para eliminao de organismos no esporulados e
formas vegetativas.

67
Misturar cada parte das pores e transferir 10ml/g para um recipiente contendo 90 mL do meio Reinforced
Medium for Clostridia para diluio. Incubar a amostra diluda em uma jarra de anaerobiose a 30-35 C
por 48 h. Aps incubao utilizando uma ala estril, estriar uma alquota do meio Reinforced Medium
for Clostridia de enriquecimento incubado sobre a superfcie da placa de Petri j preparada com meio
Columbia Agar de modo a obter colnias isoladas.

Imagem
11: Clostridium sp em
Agar Columbia
Incubar as placas de Petri em posio invertida em jarra de
anaerobiose a 30-35C por 48 a 72 horas.

Se a identificao das colnias confirmar a presena dessa


espcie, expressar o resultado como: Presena de Clostrdios
sulfito redutores na amostra.

Se no houver crescimento aps o enriquecimento e/ou a


identificao das colnias no confirmar a presena dessa
espcie, expressar o resultado como: Ausncia de Clostrdios
sulfito redutores na amostra.
Fonte: AVISA

7.4 TESTE DE DESAFIO DA EFICCIA DO SISTEMA CONSERVANTE


(CHALLENGE TEST)

O teste de eficcia do sistema conservante, tambm conhecido como Teste de Desafio Microbiolgico,
ou Challenge Test, tem como objetivo final determinar a resistncia de um produto ou material
contaminao microbiana, refletindo diretamente a eficcia do sistema conservante.

Atravs deste teste possvel verificar se a dosagem de conservante est adequada ao produto final, e
se o produto est apto a resistir s intempries na qual ser submetida, durante o perodo de validade do
produto.

Resumidamente, uma quantidade do material teste (produto) inoculada com uma determinada populao
de microrganismo padro. O produto contaminado com o microrganismo-teste incubado em condies
de temperatura adequados para o desenvolvimento do microrganismo utilizado. Em diferentes tempos de
incubao, uma alquota do produto contaminado retirada e a contagem microbiana realizada.

A eficcia do sistema conservante escolhido para um produto em desenvolvimento no pode ser previsto
com base somente na sua composio. Portanto, a formulao deve ser testada atravs de um desafio

68
microbiolgico. O mtodo utilizado no s deve ser validado, mas necessrio levar em considerao o
tipo do produto e a sua utilizao. Recentemente, os testes simulando o uso dos produtos de HPPC (in-use
tests) esto adquirindo importncia.

Um ponto muito importante sobre os testes de desafio microbiolgicos que, at o presente momento,
no h consenso num mtodo harmonizado, de forma global. A norma ISO 11930:2012 Cosmetics
Microbiology Evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic product, especfica para
produtos de HPPC, encontra-se em fase de discusso final, e possvel que venha a se tornar uma norma
harmonizada para este setor.

Diferentes mtodos oficiais e normativos apresentam pequenas variaes de procedimento, que sero
apresentadas a seguir.

Um levantamento realizado por Anon (1990) indicou que nos EUA, 78% utilizavam a metodologia CTFA
modificada. As modificaes mais frequentes envolvem o uso de microrganismos adicionais, desafios
mltiplos, aumento da concentrao de microrganismos inoculados e critrios mais rigorosos de aprovao.
Somente 3% utilizavam o mtodo conforme publicado. A metodologia USP estava adotada por 19% das
empresas, e a norma ASTM no havia sido adotada por nenhuma empresa.

A metodologia USP 37, est orientada conforme as 4 categorias dos produtos compendiais, sendo a que
mais aproxima da aplicao cosmtica e em domissanitrios a Categoria 2.

Categoria 1: Injetveis e parenterais, incluindo medicamentos estreis, nasais e oftlmicas.

Categoria 2: Produtos de uso tpico, em base aquosa, produtos no estreis e emulses,

incluindo as de aplicao em mucosas.

Categoria 3: Produtos orais, exceto anticidos, preparados com bases ou veculos aquosos.

Categoria 4: Anticidos preparados com base aquosa.

7.4.1 Nvel de Inculo

O inculo para o Challenge Test constitudo de uma suspenso, em soluo salina ou gua estril, das
clulas microbianas, preparada a partir de uma cultura ativa, de 24 48h em superfcie de gar (tubo
inclinado ou placas de Petri), do meio recomendado para cada microrganismo. A suspenso ajustada
para uma contagem de 108 ufc.mL-1 para as bactrias (Pseudomonas, Staphylococcus, etc.) e 107 ufc.mL-1,
para os fungos (Candida albicans, Aspergillus brasiliensis, etc.), usando tcnicas como a densidade ptica
(DO620 0,15 a 0,46 para suspenses celulares a 108ufc.mL-1), por turbidimetria, ou por comparao visual
com os tubos padres de McFarland.

69
Em qualquer teste, a suspenso de inculo quantificada atravs de diluio e plaqueamento para
determinar a quantidade inoculada, na ocasio de cada inoculao realizada.

O motivo pela qual se utiliza culturas crescidas sobre o gar, ao invs de caldo para evitar o arraste de meio
de cultura para os tubos teste, que pode interferir diretamente sobre os conservantes e antimicrobianos
presentes na amostra em teste, inclusive na forma de neutralizantes.

7.4.2 Microrganismos a serem inoculados

Os microrganismos-teste adotados para os testes de desafio seguem a linha dos microrganismos originais
determinados na Farmacopia USP. Como os microrganismos farmacopicos foram selecionados
primeiramente para teste de medicamentos, os microrganismos se restringiram a trs bactrias
(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli) e a dois fungos (Candida albicans
e Aspergillus brasiliensis). Outras metodologias, como os do CTFA e ASTM, ampliaram o escopo de
microrganismos, abrindo opes, para incluir os isolados in house, quer seja os de monitoramento
ambiental ou deteriorantes/contaminantes de processo, pois estas duas metodologias foram elaboradas
especificamente para cosmticos a base gua.

Tabela 13: Microrganismos-teste adotados nas vrias referncias e compndios.

ASTM
Microrganismo USP 37 FB 5 EP 7 ISO 11930
E640-06
Pseudomonas aeruginosa
X X X X X
ATCC 9027
Escherichia coli
X X X
ATCC 11229
Escherichia coli
X
ATCC 8739
Staphylococcus aureus
X X X X X
ATCC 6538
Enterobacter gergoviae
X
ATCC 33028
Burkholderia cepacia
X
ATCC 25416
Candida albicans
X X X X X
ATCC 10231
Aspergillus brasiliensis
X X X X X
ATCC 16404
Eupenicillium levitum
X
ATCC 10464
Microrganismos in-house
opcional
ou deteriorantes

USP37: United States Pharmacopeial Convention, Ed. 37


FB 5: Farmacopia Brasileira, 5 Edio
EP 7: European Pharmacopeia, 7th Edition

70
Tabela 14: Microrganismos-teste adotados pelo CTFA, com os critrios de seleo
dos microrganismos-teste

CTFA M-3: Cosmticos base gua e CTFA M-4: Cosmticos para rea dos olhos

Tipo de Microrganismo Cepas Quais Usar

Isolados in-house Opcional use cepas apropriadas Um ou mais

Staphylococcus aureus
Cocos Gram+ Ao menos um
Staplylococcus epidermidis

Klebsiella pneumoniae
Enterococcus cloacae
Bacilos Gram-fermentativos Escherichia coli Ao menos dois
Proteus sp.
Enterococcus georgoviae

Pseudomonas aeruginosa
Burkholderia cepacia
Pseudomonas
Pseudomonas putida
Bacilos Gram-no fermentativos aeruginosa, e
Pseudomonas fluorescens
outro adicional
Flavobacterium sp.
Acinetobacter sp.

Candida albicans
Leveduras Ao menos um
Candida parapsilosis

Aspergillus niger
Fungos Ao menos um
Penicillium luteum

Bacilos esporulados Bacillus subtilis Opcional

ISO 11930: International Standards Organization


ASTM E640-06 (reapproved 2012): Standard Test Method for Preservatives in Water-Containing Cosmetics.
ASTM International, USA
CTFA: Cosmetics, Toiletry and Fragrance Association

A seleo dos microrganismos utilizados para o teste de desafio microbiolgico determinada com base
em riscos e frequncia que participam do processo de deteriorao.

Um fator importante a ser considerado que tanto o CTFA quanto o ASTM preconizam desafio com
inculos mistos de bactrias, e de leveduras + fungos. A metodologia USP preconiza o uso de inculos
individuais, ou seja, cada microrganismo testado separadamente.

7.4.3 Volume de microrganismo por amostra

A quantidade de inculo depende da metodologia adotada. As quantidades variam de 20, 25, 50 e 100g
ou mL, alm daqueles que fazem o uso da embalagem final fechada. A determinao da quantidade
est principalmente relacionada s limitaes da embalagem fechada. Quando possvel, opta-se por

71
quantidades de 50 ou 100g ou mL, pois evita-se o ressecamento e a preservao das caractersticas do
produto durante a incubao de 28 dias.

Em todos os mtodos, o inculo de 1%, que proporciona uma diluio de 1/100 do inculo preparado.
Ou seja, se o inculo foi preparado na populao de 108 UFC/mL ou g, a quantidade de microrganismos
inicial do Challenge ser de 1/100 da populao do inculo, 106 UFC/mL ou g. Portanto a maioria dos
mtodos preconizam que o inculo seja diludo adequadamente, e semeado por plaqueamento para a
obteno da quantidade exata de microrganismo inoculado em cada teste, que a populao inicial.

Os nveis de contaminao inicial nos produtos, so aqueles que atinjam, pelo menos:

1x106 UFC de bactrias por grama de produto

1x105 UFC de leveduras por grama do produto

1x105 UFC de esporos de fungos por grama do produto

7.4.4 Homogeneizao e armazenagem das amostras inoculadas

A homogeneizao dos frascos deve ser de forma a fornecer uma distribuio uniforme dos microrganismos
nas amostras. Portanto, embora descrito como homogeneizar bem, esta etapa deve ser feita
manualmente, utilizando esptulas que melhor se adequem, de forma a atingir a amostra em todos os
cantos do frasco, assegurando uma boa homogeneizao.

7.4.5 Validao do neutralizante utilizado no teste

A validao do neutralizante de suma importncia no teste de desafio do sistema conservante Challenge


Test, pois se no for adequadamente neutralizado, o conservante continua agindo durante o perodo de
anlise microbiolgica, levando a contagens errneas ou mesmo ausncia de crescimento nas placas de
Petri, causando falsos resultados de eficcia antimicrobiana.

Resumidamente, a validao do neutralizante realizada em tubos de ensaio, colocando-se a mesma


alquota do microrganismo diludo em contato na soluo neutralizante assim como no neutralizante
acrescido do produto teste.

Estas duas condies testadas no devem resultar em diferena significativa de contagem entre si,
imediatamente aps contato (T0) ou mesmo aps decorrido um intervalo de tempo, geralmente de 10
a 15 minutos (T). Embora estas duas condies sejam as mais usadas para a validao da neutralizao,
recomenda-se a incluso de um tubo com diluente universal (Controle do Inoculo), e um tubo com o
produto contendo o antimicrobiano (Controle).

72
Alquotas so retiradas em dois momentos (no incio e aps um tempo de contato definido pelo mtodo),
diludas e semeadas em placas para contagem, segundo o protocolo estabelecido. A confirmao da
ausncia de declnio significativo na contagem entre o inoculo diludo no neutralizante e aquele diludo
em diluente universal indica que a neutralizao foi eficiente, e no afeta o inoculo.

Se as placas de controle do inoculo apresentarem crescimento normal e no for observado crescimento


nas placas das diluies mais baixas, esta uma clara indicao de que o neutralizante no adequado,
e outro deve ser selecionado.

A descrio passo-a-passo se encontra descrita na norma EN 1040 (ref.) e ASTM E-1054 (ref.)

7.4.6 Temperatura e tempo de incubao

Tabela 15: Condies para Preparo do Inculo

USP 37 CTFA ASTM 640-06

32,5 2,5C 30 a 37C 35 2C


Bactrias
18 a 24h 18 a 48h 24 a 48h

22,5 2,5C 25 a 35C 25 2C


Leveduras
44 a 52h 24 a 48h 48 a 72h

Fungos 22,5 2,5C 20 a 30C 25 2C


filamentosos 6 a 10 dias 7 a 28 dias 5 a 7 dias

Tabela 16: Condies dos parmetros para a anlise microbiolgica do teste

USP 37 CTFA ASTM 640-06

30 a 37C 35 2C
Bactrias 22,5 2,5C
24 a 48h 48 a 72h

25 a 35C
Leveduras 22,5 2,5C Opcional
48 a 72h

Fungos 20 a 30C
22,5 2,5C Opcional
filamentosos 3 a 7 dias

Fungos (leveduras + 25 2C
- -
fungos filamentosos) 3 a 5 dias

73
7.4.7 Perodos de teste

Os tempos de contato adotados para a anlise so:

USP 37: 7, 14 e 28 dias

CTFA: 0, 1-3, 7, 14, 21 e 28 dias. Se for introduzida a reinoculao, a contagem semanal retomada

por pelo menos 21 dias.

ASTM: 0, 7, 14, 21 e 28 dias, sendo o 21 dia considerado opcional, e mais contagens intermedirias

podem ser adicionadas.

7.4.8 Critrio de aceitao (Log de reduo por categoria de produtos)

Os critrios de comprovao da eficcia de preservantes (Challenge Test) segundo a USP depende da


categoria do produto, conforme citados no tem 6.5.

Tabela 17: Critrios de comprovao da eficcia do sistema conservante


para 3 diferentes normas.

Mtodo Grupo de Produtos Critrio

Produtos de Categoria 1: No menos que 1 Log de reduo em


7 dias, no menos que 3 Log de reduo em 14 dias
e sem aumento na contagem em 28 dias.

Produtos de Categoria 2: No menos que 2 Log de reduo


em 14 dias, e sem aumento na contagem de 28 dias.
Bactrias
Produtos de Categoria 3: No menos que 1 Log de reduo
USP em 14 dias, e sem aumento na contagem de 28 dias.

Produtos de Categoria 4: Sem aumento na contagem inicial


aps 14 e 28 dias.

Leveduras e Fungos
Sem aumento nos dias 7, 14 e 28
filamentosos

99,9% de reduo (3 Log) de bactrias em 7 dias, para cada desafio,


Bactrias
com reduo ou no-crescimento posterior, pelo tempo do teste.
CTFA
Leveduras e Fungos 90% de reduo em 7 dias, para cada desafio,
filamentosos com no crescimento posterior.

Bactrias e Reduo de 99,9% (3 Log) em 7 dias, para cada desafio,


Leveduras com no crescimento posterior.
ASTM
Pelo menos 90% de reduo (1 Log) em 7 dias, para cada desafio,
Fungos
sem crescimento posterior ao longo do teste.

74
7.4.9 Leituras / Clculos

As leituras das contagens so realizadas conforme metodologia de recuperao recomendada. Geralmente


as contagens so feitas em duplicata por diluio, computando como resultado a mdia aritmtica das
contagens obtidas em 2 placas, multiplicada pela respectiva diluio.

A reduo logartmica da populao microbiana expressa como:

RD = Log No Log Nx

Onde RD = Reduo Decimal, ou Reduo Logartmica, No a contagem inicial e Nx a contagem do


tempo x de contato.

Avaliao do resultado: nmero positivo indica a reduo decimal obtida, e um nmero negativo
indica crescimento microbiano. Os resultados devem ser analisados conforme os critrios de aceitao
apresentado no tem 6.5.8.

7.5 HALO DE INIBIO

A tcnica do halo de inibio uma forma relativamente simples de medir a existncia ou no de


atividade antimicrobiana. importante salientar que este mtodo no diferencia atividade microbicida da
microbiosttica, uma vez que a leitura realizada pelo tamanho do raio ou dimetro do halo, resultante da
ausncia de crescimento microbiano.

O mtodo farmacopico utilizado para o doseamento de antibiticos, utilizando as cepas especficas


para cada antibitico.

As metodologias para o doseamento de antibiticos encontram-se descritas em detalhes nas Normas


aprovadas do NCCLS/CLSI, Mtodo M2-A8 (disco-difuso) e Mtodo M7-A6 (macro e micro-diluio
em caldo), traduzidos, editados e disponibilizados na ntegra pela ANVISA (NCCLS 2003-a e 2003b). Em
01/01/2005, NCCLS (National Committee on Clinical Laboratory Standards) mudou oficialmente o seu
nome para CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). A ANVISA adquiriu os direitos autorais, na
Lngua Portuguesa, do manual do CLSI e suas atualizaes, por cinco anos. Esse manual de padronizao
do instituto norte-americano dividido em cinco mdulos e mensura a sensibilidade de agentes (bactrias
e microrganismos em geral) a diversos antimicrobianos.

7.5.1 Seleo do meio de cultura e microrganismo a ser utilizado

A seleo dos microrganismos-teste e os meios de cultura podem ser obtidos nos compndios (USP, FB,

75
BP, etc), assim como nas normas NCCLS/CLSI.

Porm, no caso de produtos de HPPC, os microrganismos mais relevantes aplicao e ao claim desejado
devem ser selecionados.

7.5.2 Difuso em gar

O mtodo de difuso em gar consiste na medida do halo de inibio formado, onde o microrganismo-
teste o visualizador desta inibio. Em princpio, o antimicrobiano se difunde atravs da superfcie do
meio de cultura contendo gar, inibindo ou mesmo matando os microrganismos presentes na rea.

Desenvolvido primeiramente para a aplicao clnica, na dosagem e seleo de antibiticos, conforme


citado anteriormente, o mtodo simples, e permite introduzir variaes, para adapt-los a diferentes
situaes.

Neste captulo estaremos focando a aplicao no-clnica, ou seja, produtos de HPPC, com conservantes
e ao antimicrobiana.

A difuso em gar realizada de duas formas distintas: com orifcio em Agar ou tcnica dos poos - Figura
04 ou com discos de papel - Figuras 05 e 06.

Figura 04: Mtodo de halo por disco difuso

SOBRECAMADA INOCULADA
MEIO DE CULTURA

Figura 05: Mtodo de halo por orifcios de gar

DISCOS DE ANTIBIOGRAMA

HALO DE INIBIO

MEIO DE CULTURA

76
Figura 06: Vista do topo - mtodo de halo por orifcios de gar

PENICILINDROS, QUE SO RETIRADOS APS O ENDURECIMENTO DO


AGAR. O FUNDO SELADO COM AGAR, E DEPOIS APROX. 100 A 130 L

DA SOLUO DEPOSITADA EM CADA POO.

Para outras aplicaes, em especial na rea cosmtica, o teste realizado utilizando-se um suporte, como
o papel de filtro cortado em crculos, de 40 a 50 mm de dimetro, esterilizados. Sobre este suporte, o
produto aplicado, mantendo-se a quantidade aplicada nos Branco e Controle. Neste caso, somente um
suporte utilizado em cada placa.

7.5.3 Leitura

A formao do halo de inibio, ausncia/presena de crescimento microbiano sobre o corpo de prova, e


as medidas do halo so anotadas.

No caso de antibiticos, a medida realizada pelo dimetro do halo, ou seja, de toda a zona inibitria.

No caso em que o tamanho do disco diferente, as regras do mtodo NCCLS devem ser ajustadas.

Ou seja, no h como mensurar quantitativamente a concentrao do conservante.

7.5.4 Critrio de aceitao

Considerar que no teste com produtos de HPPC, o tamanho do halo no muito relevante. Mas a
formao clara de um halo de inibio indica presena de atividade antimicrobiana, que pode ser somente
microbiosttico, mas tambm microbicida.

O tamanho do halo formado tem relao direta com a migrao do agente antimicrobiano atravs da
superfcie de gar. Mantendo uma varivel, e rigorosamente os demais parmetros do ensaio, possvel
correlacionar a varivel, como a concentrao do antimicrobiano.

77
7.6 REDUO LOGARTIMICA

A Reduo Logartmica o termo utilizado para descrever a metodologia quantitativa de reduo na


contagem microbiana resultante de atividade antimicrobiana. O mtodo tambm conhecido como Time
Kill, Decimal Reduction, Mtodo Reducional, Clculo do Valor D, etc.

O mtodo consiste basicamente em preparar uma suspenso de microrganismos (inculo), e inocular a


soluo antimicrobiana a ser testada. No momento do contato inicial deve ser acionado o cronmetro,
e h tempos especificados para cada finalidade, alquotas so retiradas e prontamente neutralizadas em
soluo/meio previamente definidos. Aps a neutralizao, a suspenso resultante diluda e semeada
em meio apropriado, para contagem dos sobreviventes N.

Em paralelo, so realizadas contagens do inculo, para clculo do No (populao inicial presumida).

7.7 ATIVIDADE ANTISSPTICA

O claim antissptico utilizado para produtos que devem matar os microrganismos sobre a pele e
mucosa, at nveis considerados seguros, num intervalo de tempo adequado. Nesta classe de produtos se
enquadram os sabonetes degermantes, antisspticos, produtos a base de lcool utilizado para antissepsia,
produtos higienizantes de uso domstico e hospitalar, produtos de higiene pessoal, enxaguatrio bucal,
entre outros.

O ensaio realizado para avaliar a reduo da populao microbiana proporcionada pelo produto teste
quando entra em contato com as bactrias. Vrios microrganismos podem ser testados, dependendo
da finalidade do produto teste, no entanto, os microrganismos comumente testados so: Sthapylococcu
aureus e Pseudomonas aeruginosa, sendo estes representantes das bactrias Gram positivas e Gram
negativas respectivamente.

Estes microrganismos tambm so os indicados na norma CEN 1040, para a avaliao bsica de um
produto antimicrobiano.

Em se tratando de microbiota da pele, o Staphylococcus epidermidis prevalente sobre Staphylococcu


aureus. Porm, o S. aureus um microrganismo-teste mais robusto que o S. epidermidis. A Pseudomonas
aeruginosa um microrganismo com maior resistncia erradicao que as demais bactrias Gram-
negativas comumente adotadas como organismo teste: Escherichia coli e Salmonella choleraesuis.

Outros microrganismos podem e devem ser testados, de acordo com o tipo de produto, sua abrangncia
e rigor requeridos. Isto , no podemos dizer que o produto seja esporicida se bactrias esporuladas
no foram testadas. Microrganismos especficos da mucosa bucal, como o Streptococcus pyogenes,

78
podem ser includos nas avaliaes de enxaguatrios bucais, assim como Candida albicans, para reforar
a atividade fungicida.

7.7.1 Preparao dos microrganismos-teste

A partir da cultura estoque preparada, os microrganismos-teste so repicados sobre a superfcie de gar


TSA e incubados a 35 2C por 24 horas. Este repique denominado R1.

A partir do crescimento obtido na R1, os microrganismos-teste novamente so novamente transferidos para


uma nova superfcie de gar TSA e so incubados a 35 2C por 24 horas. Este repique denominado R2.

As culturas geradas no R2 so utilizadas para os testes, incluindo os controles de toxicidade do neutralizante,


resistncia s condies ambientais e eficcia da neutralizao. A suspenso preparada de forma a
conter 104 a 105 UFC/mL. Uma vez confirmado o neutralizante conforme descrito acima, um novo R2
preparado para o teste.

Para a determinao da atividade antimicrobiana, utiliza-se uma suspenso de cada microrganismo-teste


na concentrao de 108-a 109 UFC/mL, para o caso de bactrias, e de 106 a 108 para o caso de leveduras e
fungos filamentosos.

7.7.2 Toxicidade e Eficcia do Neutralizante

O controle da existncia de qualquer atividade txica do neutralizante sobre o microrganismo-teste


necessrio para garantir que o neutralizante usado no ensaio no afeta a viabilidade dos microrganismos
sobreviventes do Time Kill. Da mesma forma, a eficcia do neutralizante deve ser observada. Nos testes
de Time Kill, imprescindvel que o antimicrobiano cesse a sua ao exatamente no tempo desejado.
Somente desta forma possvel mensurar a curva de morte, que a essncia do Time Kill.

7.7.2.1 Avaliao da toxicidade do Neutralizante

A toxicidade do neutralizante a ser utilizado no teste avaliada atravs de uma verificao especfica. O
inoculo de cada microrganismo adicionado ao neutralizante nas mesmas condies usadas no teste
da amostra, substituindo-se a quantidade de amostra por gua. Tradicionalmente, como os testes so
realizados em tubos contendo 10 mL de soluo, a proporo utilizada a seguinte:

Num tubo de ensaio contendo 8 mL de caldo neutralizante e 1mL de gua estril, adiciona-se

1mL da suspenso de inoculo contendo 104 a 105UFC/mL (populao inicial equivalente a 103 a

104UFC/mL);

79
Em outro tubo de ensaio, 9 mL de gua estril recebe 1mL do inoculo, como o Controle;

Estas misturas so homogeneizadas e mantidas a 35 2C por 5 minutos;

Aps a incubao, 0,1mL de cada mistura diluda em 9,9mL de caldo neutralizante e

homogeneizadas (populao presumida de 10 a 100 UFC/mL);

1 mL do contedo de cada tubo plaqueado, em duplicata, pela tcnica de pour plate em gar
TSA;

As placas so incubadas a 35 2C por 48 horas;

Aps incubao as quantidades de UFC obtidas so enumeradas.

A ausncia de toxicidade do neutralizante confirmada se a mdia das contagens obtidas nas placas de
neutralizantes for igual mdia das contagens do tubo Controle, ou seja, (Log10 0,5).

7.7.2.2 Eficcia da Neutralizao

A capacidade do caldo neutralizante usado no ensaio para inativar os efeitos do agente antimicrobiano
presente na amostra verificada da seguinte maneira:

Em 4,9 mL do produto teste adicionado 0,1 mL de gua estril;

Esta mistura homogeneizada e incubada em banho-maria a 35 2C por 2 minutos;

Aps a incubao, retirada uma alquota de 0,1mL e colocado em um tubo contendo 9,8 mL de

caldo neutralizante;

O tubo homogeneizado e mantido a 35 2C por 5 minutos;

Aps a incubao, adicionado 0,1 mL do inoculo contendo 104 a 105 UFC/mL;

Caso esta verificao for realizada ao mesmo tempo com o teste de toxicidade do neutralizante,

o Controle poder ser o mesmo para ambos os testes. Caso contrrio, adicionar o tubo Controle;

O tubo homogeneizado e mantido a 35 2C por 30 minutos;

80
Aps o tempo de contato, transferida uma alquota de 0,1 mL em 9,9 mL de gua estril;

1 mL do contedo do tubo foi plaqueado, em duplicata, por pour plate, com gar TSA;

As placas so incubadas a 35 2C por 48 horas;

Aps incubao as quantidades de UFC obtidas so enumeradas.

A eficcia da neutralizao confirmada se a mdia das contagens obtidas nas placas de neutralizantes
forem iguais mdia das contagens do tubo Controle, ou seja, (Log100,5).

7.7.3 Avaliao da Atividade Antimicrobiana da amostra

Resumidamente, as etapas de teste realizadas com as amostras so:

49 mL da amostra foram inoculadas com 1mL da suspenso padro de microrganismos-teste,

contendo 108 a 109 UFC/mL, que caracteriza uma suspenso densa de microrganismos. No caso

de fungos filamentosos e leveduras, a contagem de 106 a 107 UFC/mL;

A mesma quantidade de inoculo deve ser transferida para 49 mL de gua estril, sendo este o

controle do inoculo. A contagem desta amostra fornece a populao inicial do teste;

As amostras inoculadas so mantidas temperatura controlada de 35 2C. Aps a inoculao,

homogeneizar vigorosamente e retirar imediatamente uma alquota de 0,1 mL da amostra

inoculada, transferindo-a para um tubo contendo 8,8 mL de caldo neutralizante + 1,1 mL de

gua. Esta a amostra denominada de coleta no tempo imediato, (TI);

Ao atingir cada tempo de contato pr-determinado, sendo eles 1, 2, 3 e 5 minutos, so coletadas

as amostras referentes a cada um dos tempos de contato, procedendo-se de forma similar.

Diferentes tempos so utilizados, dependendo dos objetivos do teste;

Ao final da coleta do ltimo tempo, os tubos so incubados a 35 2C por 5 minutos;

Aps este perodo cada umas das amostras so submetidas diluio decimal, e plaqueadas por

pour plate em gar TSA;

As placas so incubadas a 35 2C por 48 horas;

81
Aps incubao, placas contendo at 300 colnias so selecionadas e quantificadas em UFC/mL

da amostra original.

7.7.4 Anlise de Resultados

O resultado do teste expresso atravs da reduo decimal da populao microbiana ocorrida ao longo
do tempo de contato do inculo com a amostra. A Reduo Decimal da populao microbiana calculada
atravs da seguinte frmula:

RD = log N0/NT Equao 01

Onde: RD a reduo decimal; N0 a contagem inicial do inculo; e NT a contagem obtida no tempo de


contato T com a amostra.

Uma vez obtida a RD, possvel e calculada a porcentagem de reduo obtida pelo contato do
microrganismo com a amostra atravs de Equao 2.

PR= (1-1/10RD)x100 Equao 2

Onde: PR e a porcentagem de reduo da populao microbiana; e RD e a reduo decimal obtida


calculada pela Equao 2.

Para fins cientficos, considera-se a Reduo Decimal como o parmetro correto para designar a reduo
de populao microbiana. Porm, ainda frequentemente encontramos dados expressos em % de reduo,
pois estes so mais compreensveis para a populao em geral. Desta forma, usa-se o seguinte critrio
para a converso:

RD = 1 equivale a 90% de reduo

RD = 2 equivale a 99% de reduo

RD = 3 equivale a 99,9% de reduo

RD = 4 equivale a 99,99% de reduo

RD = 5 equivale a 99,999% de reduo, e assim sucessivamente.

82
8 CONTROLE MICROBIOLGICO NO AMBIENTE
INDUSTRIAL
8.1 CLASSIFICAO DE RISCO/ SUCEPTIBILIDADE A CONTAMINAO
MICROBIOLGICA DE MATERIAIS E REAS.

Monitoramento ambiental ou Controle microbiano ambiental (CMA) a contagem de microrganismos


presentes na rea onde est sendo fabricado ou envasado o produto. Consiste na avaliao da
contaminao presente no ambiente de fabricao, envase e anlise dos produtos, assim como dos
procedimentos de limpeza e de sanitizao utilizados atravs da determinao da quantidade, tipo e
origem dos microrganismos encontrados, possibilitando a deteco de possveis focos de contaminao
e a adoo de medidas corretivas.

responsabilidade do Laboratrio de Controle de Qualidade Microbiolgico proceder a anlise ambiental,


pessoal e de equipamentos dos setores envolvidos na produo e envase de produtos de HPPC. A
periodicidade determinada pelo profissional responsvel pelo Laboratrio de Controle de Qualidade
Microbiolgica ficando tambm, a critrio deste profissional, a prvia comunicao da anlise ao Setor de
Produo ou a realizao de anlises surpresas.

8.1.1 Definio dos pontos (alto / mdio e baixo risco)

Nvel de risco alto ou alto risco (NRA):

Amostras coletadas de pontos do ambiente que entram em contato direto com os produtos ou matrias-
primas.

Exemplos: mos de operadores, bico de enchimento das mquinas, recipientes de envase,

pesagem, etc.

Nvel de risco mdio ou mdio risco (NRM):

Amostras coletadas de pontos prximos aos produtos ou matrias-primas, consideradas como de mdia
probabilidade de contaminao.

Exemplos: partes externas das mquinas, ambientes, superfcies, etc.

83
Nvel de risco baixo ou baixo risco (NRB):

Amostras coletadas de pontos distantes dos produtos ou matrias-primas, oferecendo baixa probabilidade
de contaminao.

Exemplos: paredes, portas, pisos, etc.

8.1.2 Frequncia de testes

A frequncia do monitoramento ambiental e os limites microbianos ambientais so determinados de


acordo com a avaliao de risco e um programa de monitoramento ambiental estabelecido. Cabe a cada
empresa especificar a frequncia e os limites deste monitoramento.

Tabela 18: Sugesto de Limites Microbianos Ambientais

Nvel Local Limite

Parte interna de mquinas 10-50 UFC / 25 cm


NRA
Mo de operador 50-100 UFC / 25 cm

Parte externa de mquinas e bancadas 100 UFC / 25 cm


NRM
Ambiente 100 UFC / placa

Portas e paredes 100 UFC / 25 cm


NRB
Pisos 300-500 UFC / 25 cm

ndices praticados por algumas empresas de HPPC (no se tem referncia destes ndices em literatura)

8.1.3 Anlise dos dados

O clculo do percentual de eficincia de limpeza e sanitizao das reas fabris so baseados na relao entre
o nmero de pontos satisfatrios e o nmero total de pontos amostrados, expressos em porcentagem.

% EFICINCIA = N de pontos satisfatrios x 100


N de pontos amostrados

Esta unidade (% Eficincia) usada para expressar de forma simples o desempenho da rea. Para uma
rea fabril ter bom desempenho, o percentual mnimo de eficincia dever ser de 80% para cada nvel de
risco.

84
8.2 AMOSTRAGEM (TCNICA/TIPO)

A qualidade construda em um produto quando o processo, as instalaes e os equipamentos utilizados


so desenhados de forma a minimizar ou eliminar os riscos potenciais de contaminao.

O monitoramento microbiolgico, independentemente do grau de sofisticao, no capaz de identificar


e quantificar todos os contaminantes microbianos presentes em ambientes controlados. No entanto,
o monitoramento de rotina deve fornecer informaes suficientes para determinar que o ambiente
controlado est operando dentro de um estado de controle adequado.

No plano de amostragem devem ser includos os locais onde produto exposto e os momentos em
que h atividades de manipulao do produto por operadores. Tambm devem ser considerados pontos
prximos aos locais em que produtos so expostos e onde so manipulados materiais ou superfcies que
entraro posteriormente em contato com o produto. Deve tambm ser feita uma anlise de risco de forma
a provar a correta escolha dos locais e a frequncia de monitoramento. De maneira geral, os meios de
cultura utilizados para o monitoramento ambiental so o TSA para bactria e SDA para fungos.

As placas de contato (RODAC) para superfcies de reas produtivas, de equipamentos, e de mos de


operadores so usadas para detectar contaminao por microrganismos nas imediaes da rea de
trabalho. A amostragem de operadores torna-se ainda mais relevante quando operaes manuais so
realizadas, e nestes casos, testes adicionais para deteco de contaminaes em outras superfcies dos
uniformes podem ser necessrios.

Placas de contato devem ser utilizadas para detectar microrganismos em superfcies que podem levar
contaminao do produto. Portanto, deve ser concebido um sistema de amostragem com base em
uma avaliao de risco, considerando o tipo de atividade realizada, para monitorar superfcies relevantes
onde microrganismos contaminantes podem ser encontrados. Estas superfcies podem incluir superfcies
de trabalho, de equipamentos, de paredes e de tetos de sistemas de fluxo unidirecional de ar. Amostras
coletadas em superfcies ainda molhadas com solues sanitizantes no devem ser consideradas vlidas.

Swabs ou outros materiais adsorventes umedecidos com gua estril ou outros diluentes podem ser
utilizados para amostrar superfcies irregulares ou de acesso difcil, tais como equipamento, agulhas de
enchimento, tubulaes e cantos. Eles so tambm teis para a amostragem de grandes reas depois de
procedimentos de limpeza ou de desinfeco. A recuperao dos microrganismos a partir de esfregaos
deve ser validada, incluindo o mtodo de amostragem escolhido, a adequao do lquido molhante
do swab, e a transferncia de microrganismos para o meio de crescimento. Os estudos de validao
devem comprovar uma recuperao superior a 50% de cada uma das cepas de microrganismos utilizados.
Ressalta-se que no h limites regulamentares estabelecidos para amostras de swab. Os lquidos utilizados
para recuperao dos microrganismos devem conter neutralizantes de desinfetantes, quando necessrio.

85
8.2.1 Amostragem de ambientes: ar (esttico e dinmico)

O monitoramento de rotina esttico (em reas sem operaes) recomendado para garantir que os
nveis de limpeza so mantidos quando a rea no estiver em uso por curtos perodos de tempo ou
para verificar a eficcia de procedimentos limpeza antes das operaes. Placas de sedimentao podem
detectar bactrias e fungos que se sedimentam na coluna de ar acima da placa. Embora a sensibilidade
da tcnica dependa do tamanho da placa, da velocidade de deposio de microrganismos, e das
propriedades de promoo do crescimento da placa escolhida, as placas de sedimentao so o nico
mtodo que proporciona o monitoramento contnuo de microrganismos em uma rea produtiva. Placas
de sedimentao devem ser alocadas em reas de alto risco de contaminao do produto. Elas devem ser
colocadas o mais prximo possvel do local onde as atividades so executadas, mas sem causar obstruo
de atividades ou contaminao pelas prprias placas. O tempo de exposio de placas individuais deve
ser determinado de acordo com dados obtidos em estudos de validao.

Sugesto de anlise microbiolgica de ar em ambientes produtivos:

A amostragem do ar consiste na exposio de placas de Petri, contendo meio de cultura adequado e


esterilizado em diferentes pontos da rea de teste, por um perodo de 30 minutos. Utilizar as placas de
Petri previamente preparadas com meio TSA para bactria e SDA para fungos. Selecionar os pontos a
serem amostrados. Rotular as placas com local e data. Abrir as placas expositivas (1 placa de TSA e 1 de
SDA) no local selecionado. Efetuar exposio durante 30 minutos. Para tempos de exposio superior ou
inferior a 30 minutos efetuar a correo conforme a frmula:

UFC/placa = Nmero total de colnias na placa x 30


Tempo de exposio em minutos

8.2.2 Superfcies e Equipamentos (rodac/ swab)

Amostra de superfcies planas e Equipamentos (Rodac)

Utilizar placas Rodac de TSA e SDA. Selecionar os locais a serem amostrados. Rotular as placas Rodac
especificando qual local est sendo analisado. Retirar a tampa da placa. Pressionar a superfcie do gar na
rea relacionada para o teste por cerca de 10 segundos. No deixar a placa deslizar, pois poder favorecer
o aparecimento de espalhamento de colnias dificultando a contagem. Evitar pressionar com fora, pois
poder acarretar deformaes no gar. Recolocar a tampa na placa. Limpar o local analisado com algodo
embebido em soluo sanitizante.

86
Amostra de superfcies no-planas e Equipamentos (Swab)

Utilizar tubos contendo soluo salina estril. Selecionar as superfcies a serem amostradas. Rotular os
tubos especificando qual superfcie ser analisada. Introduzir um swab estril no tubo contendo soluo
salina estril e umedec-lo.

Friccionar a mecha de algodo em dois sentidos, girando-a em uma superfcie de 5 X 5 cm ou 25 cm.


Friccionar com movimentos de 90 graus em relao a original, conforme o esquema abaixo. Introduzir
o swab estril no tubo de ensaio de soluo salina. Homogeneizar vigorosamente com um agitador de
tubos tipo vortex e deixar em repouso por 15 minutos. Retirar alquotas de 1 mL e transferir para placas
de Petri estreis previamente identificadas. Nas placas destinadas ao crescimento de fungos: adicionar
15 mL de gar base SDA, previamente fundido, a temperatura prxima a 45 C. Nas placas destinadas ao
crescimento de bactrias: adicionar 15 mL de TSA, previamente fundido, a temperatura prxima a 45 C.
Homogeneizar, fazendo um 8 ou um S com as placas, sobre a bancada, e em seguida deixar as placas
em repouso at completa solidificao do gar. Armazenar o tubo contendo o swab e a salina em balde
apropriado para descontaminao.

Figura 07: Tubo contendo o Swab e a salina em balde


apropriado para descontaminao.

5 CM 9 ML DE SALINA

8.2.3 Pessoal (swab/rodac)

Utilizar placas Rodac de TSA e SDA. Selecionar os colaboradores cujas mos sero analisadas. Rotular as
placas Rodac com nome, data, e atividade exercida pela pessoa, especificando qual mo ser analisada
(direita ou esquerda). Informar ao funcionrio a realizao do teste. Este deve abrir as mos, deixando a
palma voltada para cima. A mo dever ficar parada. Retirar a tampa da placa. Pressionar a superfcie do
gar na palma da mo do operador, e em seguida na ponta de cada um dos dedos. Cuidado para no

87
deixar a placa deslizar, pois poder favorecer o aparecimento de espalhamento de colnias dificultando a
contagem. Evitar pressionar com fora, pois poder acarretar deformaes no gar. Recolocar a tampa na
placa. O funcionrio dever lavar as mos e sanitiz-la aps a realizao do teste.

8.2.4 Matrias-primas-reteno (referncias regulatrias)

De acordo com a RDC 48 de 2013 as amostras de produtos acabados devem ser retidas nas embalagens
originais. Se for necessrio, em virtude da capacidade das apresentaes de venda, poder ser retido
produto fracionado em embalagem equivalente ao material de comercializao, a fim de facilitar o
armazenamento e a realizao dos ensaios. Em todos os casos as amostras devem ser armazenadas nas
condies especificadas, em quantidade suficiente para permitir, no mnimo, duas anlises completas.
Nos casos de produtos sujeitos contaminao microbiolgica, deve-se manter ao menos uma amostra
na sua embalagem original.

As amostras de reteno devem possuir rtulo contendo identificao, lote e data de validade.

As amostras de matrias-primas, quando aplicvel, devem ser retidas at o vencimento do seu prazo de
validade. As amostras de produtos acabados devem ser retidas por 1 (um) ano aps o vencimento do seu
prazo de validade.

Recomenda-se que as amostras sejam armazenadas temperatura ambiente e ao abrigo da luz, salvo
excees que devero ser armazenadas de acordo com especificaes prprias.

O acesso s amostras de reteno deve ser restrito aos funcionrios autorizados.

Sugesto de rotulagem para reteno de matria-prima:

NOME DA EMPRESA
AMOSTRA DE RETENO N ______

Produto: ________________________________________________________________________

Lote: __________________ Validade: __________________ Fornecedor: __________________

Amostragem: ____/____/____ Responsvel: _______________________

88
Sugesto de rotulagem para reteno de produto acabado:

NOME DA EMPRESA
AMOSTRA DE RETENO N ______

Produto: ________________________________________________________________________

Lote: ___________ Origem de Produo: ____________ Validade do Produto: ____________

Armazenar at: ____/____/____ Responsvel: _______________________

8.2.5 Outros insumos de processo (panos, escovas, esponjas)

Insumos de processo como esponjas, escovas e panos de limpeza ganham destaque, uma vez que podem
transferir quantidades significativas de microrganismos para superfcies dos equipamentos e utenslios
utilizados na fabricao de produtos de HPPC.

As esponjas normalmente ficam armazenadas em temperatura ambiente, dentro de recipientes contendo


gua, restos de produtos de HPPC e resduos de detergente, os quais podem favorecer a multiplicao
de microrganismos.

Por esses motivos, cuidados especiais necessitam ser tomados, a fim de diminuir a contaminao
microbiolgica destes insumos e alguns mtodos de desinfeco, como fervura por 5 minutos ou imerso
em hipoclorito de sdio a 200 ppm por 10 minutos, tm sido recomendados, a fim de encontrar aes
eficazes, acessveis e, ao mesmo tempo, fceis de serem aplicadas nas rotinas de trabalho.

O mtodo de deteco microbiana consiste em adicionar os insumos em gua salina peptonada


esterilizada a 0,1% com 0,1ml de tiossulfato de sdio 10% para neutralizar os resduos de detergente (na
base de 0,1ml/cm de superfcie externa do insumo). Posteriormente, comprimir manualmente com o
auxlio de uma bagueta estril para a retirada do lquido remanescente, o qual se constituiu na amostra a
ser analisada. Proceder a contagem e identificao de patgenos conforme mtodo tradicional.

89
9 LIMPEZA E SANITIZAO
Assegurar a qualidade microbiolgica de fabricao atravs de programas eficazes de limpeza e sanitizao
essencial para assegurar as boas prticas de fabricao, e do produto final.

Os procedimentos para a limpeza e sanitizao necessitam estar claramente descritos e validados, pois
eles so complementares, isto , o sucesso do controle microbiolgico depende da sinergia dos dois
processos. A escolha do melhor mtodo para cada uma destas etapas depende de cada instalao,
produtos, matrias-primas e o processo de fabricao em si.

Etapa 1: Limpeza

realizada de forma fsica, de modo a remover a sujidade, resduos e grande parte da contaminao,
atravs do uso de gua, detergente, e outros agentes de limpeza. O objetivo principal desta etapa
promover a remoo de maior parte da sujeira, constitudo basicamente de resduos e dejetos, que possa
estar ancoranda e abrigando os microrganismos. A remoo desta camada deixa a superfcie exposta para
a ao dos desinfetantes. Em superfcies de tanques, reatores e reservatrios que podem ser alcanadas,
o uso de jateamento por presso recomendada, por remover melhor as crostas e resduos alm de
economizar a gua de uso e dispensar a fase de escovamento.

Etapa 2: Enxgue

Geralmente realizada com gua purificada, est aos poucos sendo substituda por gua aquecida ou
vapor, j integrando a etapa de sanitizao. importante ressaltar que a qualidade da gua nesta etapa
de extrema importncia.

Etapa 3: Sanitizao e desinfeco

A sanitizao realizada aps a limpeza e enxgue, e tem como objetivo assegurar a reduo da
contaminao at nveis seguros. O grau de reduo definido pelo tipo de produto em fabricao.

9.1 DEFINIO CRITICIDADE (PIOR CASO POR AGRUPAMENTO DE


PRODUTO / EQUIPAMENTO / UTENSLIOS / PISO)

A estratgia para a preveno da contaminao microbiana na rea industrial e nos produtos deve-se fazer
uma investigao para determinar os principais vetores de microrganismos e pontos crticos do processo.
necessrio verificar quais so os pontos vulnerveis dentro de todo o processo, definir aes corretivas
e preventivas. necessrio incluir fornecedores de insumos e servios, melhorias do layout da fbrica,

90
treinamento de todos os colaboradores, dando importncia para tcnicas de higiene e conduo para as
operaes crticas.

A anlise de risco refere-se probabilidade da ocorrncia de determinada falha no processo e sua


severidade, identificando potenciais perigos ou pontos crticos de falhas no processo.

Os pontos crticos relacionados a cada etapa do processo devem ser identificados utilizando as informaes
do produto, processo de fabricao e experincia da equipe.

Os riscos devem ser eliminados ou reduzidos a nveis aceitveis para a segurana do produto. Para cada
risco, a equipe deve listar os fatores responsveis desde seu incio at o agravamento e determinar as
medidas preventivas a serem implementadas.

A identificao das causas de risco na qualidade de um produto tem como ferramenta o diagrama de
causa e efeito (diagrama de Ishikawa) e Pareto.

Figura 08: Diagrama de Ishikawa

MATERIAIS MTODOS COLABORADORES

EFEITO

EQUIPAMENTOS MEIO AMBIENTE MEDIDAS

Mtodo: toda a causa envolvendo o mtodo que estava sendo executado o trabalho;

Material: toda causa que envolve o material que estava sendo utilizado no trabalho;

Mo-de-obra: toda causa que envolve uma atitude do colaborador (ex: procedimento

inadequado, pressa, imprudncia, ato inseguro, etc.)

Mquina: toda causa envolvendo a mquina que estava sendo operada;

91
Medida: toda causa que envolve os instrumentos de medida, sua calibrao, a efetividade de

indicadores em mostrar as variaes de resultado, se o acompanhamento est sendo realizado,

se ocorre na frequncia necessria, etc.

Meio ambiente: toda causa que envolve o meio ambiente em si (poluio, calor, poeira, etc.) e, o

ambiente de trabalho (layout, falta de espao, dimensionamento inadequado dos equipamentos,

etc.).

Aps a identificao dos riscos, possvel prioriz-los por meio da avaliao da probabilidade, da
severidade e do potencial de sua deteco, empregando a anlise de modo e efeito de falha (Failure Mode
and Effects Analysis (FMEA)). O resultado conduz ao maior entendimento do processo e desenvolvimento
de estratgias de controle eficaz do risco.

A Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (Hazzard Analysis and Critical Control Points) (HACCP))
baseia-se em um sistema de segurana alimentar porm muitas indstrias de produtos de higiene pessoal,
perfumaria e cosmticos utilizam esta ferramenta pois consiste em analisar as diversas etapas de produo
de um produto, verificando os perigos sade dos consumidores.

O primeiro passo fundamental para o delineamento das aes a serem tomadas. Trata-se da coleta
e anlise de dados gerados pela auditoria da qualidade e pelas anlises do controle microbiolgico.
Isto permite gerar uma ampla discusso sobre as possveis causas dos resultados encontrados fora das
especificaes. Alm disto, facilita determinao do grau de atendimento das boas prticas. Os dados
obtidos, sempre que possvel, devem ser apresentados na forma de grficos e tabelas para a visualizao
de possveis tendncias. Ou seja, em uma anlise microbiolgica da gua purificada, durante trinta dias,
possvel visualizar as tendncias do sistema em relao a sua operacionalidade e a necessidade de
manuteno durante este perodo.

Um outro exemplo a determinao da carga microbiana contaminante de um ambiente, onde haja


exposio dos insumos ou produtos ao ar. Os microrganismos, mesmo sendo retirados do ambiente
diariamente, tornaro a contamin-lo. Portanto, um ponto crtico importante a qualificao do sistema
de filtrao do ar insuflado para o interior destes ambientes. A validao dos mtodos de limpeza e
sanitizao, utilizados nas superfcies das reas, dos equipamentos e utenslios, alm do treinamento
rigoroso do pessoal operacional, da mesma forma exigvel. O passo seguinte a elaborao de um
programa de controle dos pontos crticos de contaminao microbiana. Este programa deve contemplar
o pessoal, produtos qumicos de limpeza e desinfeco, local de trabalho, procedimentos operacionais,
procedimento de amostragem e anlise e demais fatores que influenciam na qualidade do produto final.
Toda a informao obtida at aqui, servir como base para os estudos de validao de limpeza e de
processo. Estes estudos so uma exigncia das boas prticas de fabricao e manipulao adotadas
em todos os pases, tendo por objetivo a comprovao documentada de que um processo ou mtodo
conduza de forma consistente e produtvel aos resultados esperados.

92
Tabela 19: Fatores de risco potencial e preventivos

Fator de Risco Fator Preventivo

Pessoal de Produo Procedimentos operacionais, Treinamentos, CQ

Matria-Prima Qualificao de fornecedores, Conservao, CQ

Embalagem primria Qualificao de fornecedores, Conservao, CQ

gua de processo Produo, Armazenagem, Distribuio, CQ, Validao do sistema

Ar comprimido Produo, Distribuio, CQ, Validao do sistema

Ar Ambiente Trocas com o ambiente, Filtrao, CQ, Validao do sistema

Equipamentos Qualificao dos desenhos e materiais sanitrios, QI, QO

Utenslios de produo Desenhos e materiais sanitrios

Utenslios de limpeza Desenhos e materiais sanitrios

Produtos de Limpeza Produo, Aplicao, CQ, Validao dos mtodos associados.

9.2 QUALIFICAO DOS EQUIPAMENTOS

9.2.1 Agentes de limpeza, sanitizantes e sua concentrao

Agentes de limpeza so produtos qumicos puros ou mistos (formulaes) que tm a finalidade de remover
as sujeiras e resduos, antes da etapa de desinfeco. Os produtos qumicos consistem de tensoativos,
cidos, bases, solventes, agentes de oxidao, entre outros.

93
Tabela 20: Principais produtos utilizados para a limpeza dos equipamentos
de processamento e enchimento

Tipo de Agente pH ativo Limpeza Sobre Exemplos

gua potvel
gua ND Sujeiras solveis em gua gua desmineralizada
PW, WFI

cidos fortes
Limpeza pesada, a remoo de cido clordrico
sais e incrustaes cido sulfrico
cido fosfrico
cidos minerais
0,2 a 5,5
moderados

Remoo de complexos metlicos, como cidos fracos


os resultados de corroso cido actico
cido ctrico

Tensoativos neutros,
Agentes neutros 5,5 a 8,5 Material oleoso, sujeira particulada incluindo os adjuvantes
(lcool, glicis, etc)

Hidrxido de amnio
Remoo de leo, gordura, graxa, precipitados,
Agentes Alcalinos 8,5 a 12,5 Fosfato de sdio
filmes e biofilmes
Carbonato de sdio

Remoo de gorduras, graxas e leos pesados. Hidrxido de sdio


Alcalinos
12,5 a 14 Biofilmes de Bactrias Gram negativas, Hidrxido de potssio
corrosivos
como o Pseudomonas sp (Alginatos) Silicato de sdio

94
Tabela 21: Principais saneantes utilizados e suas caractersticas

Saneante Ativos Antimicrobianos Caractersticas de Uso

Excelente atividade microbicida. Melhor atividade em


pH levemente acdico. A reatividade dos clorados
Hipocloritos de Sdio,
Clorados alta, apresentando elevada corrosividade, se no for
Clcio
adequadamente aplicadas. Solues diludas necessitam
ser aplicadas imediatamente, pois o cloro voltil.

Cloroisocianuratos, tambm chamados de cloros


orgnicos, possuem maior tempo de meia vida em
Cloroisocianuratos
Clorados soluo. A estabilidade um dos parmetros mais
de Sdio, Clcio
importantes, pois permite trabalhar com
baixas dosagens.

Solues estabilizadas de A estabilidade reduzida na presena de luz.


Perxidos de hidrognio perxidos, geralmente com H risco de exploso. Necessita de local adequado
35% de ativo para armazenamento.

Reao gera como subprodutos o cido actico e gua,


que devem ser removidos por enxgue.
cidos Peracticos Corrosividade moderada, principalmente com metais
Perxi-cidos
e Peroxiacticos mais moles, como alumnio, ferro, cobre e aos
galvanizados. Exploso pode ocorrer, dependendo da
concentraoe condies de armazenamento.

Atividade antimicrobiana de mdia intensidade,


lcool isoproplico
Alcois apresenta a vantagem dos lcoois serem volteis
e etlico
e no apresentar resduos.

Resduos gerados necessitam ser removidos, e no


recomendado para a parte interior de reatores
Fenis e derivados
Fenlicos e envasadoras. Muito utilizado no passado, o uso
clorados
foi reduzido por ser organoclorados, com elevada
toxicidade e de difcil tratamento nos efluentes.

A principal caracterstica do ativo a sua elevada


capacidade tensoativa, aliada no corrosividade.
Compostos de O quaternrio de amnio susceptvel contaminao
Tensoativos catinicos
quaternrio de amnio por bactrias do grupo das Pseudomonas, portanto
o seu controle imprescindvel. O procedimento de
remoo deve ser validado.

95
Tabela 22: Mtodos fsicos de sanitizao utilizando gua

Agente Caractersticas

Excelente para remoo de resduos, aliados propriedade antimicrobiana.


Como h resfriamento ao longo da tubulao, o controle da caldeira e
Linhas de Vapor
do tempo de expurgo do vapor devem ser avaliados por procedimento
validado. A linha deve ser resistente e adequada para receber o vapor.

A perda de temperatura ao longo do seu escoamento atravs da linha deve


gua quente ser avaliada. O mtodo no se adequa remoo de esporos e bactrias
(aprox. 80C) esporuladas. Pode causar condensamento de gua, que se torna foco de
contaminao.

Tabela 23: Classificao geral de antisspticos, desinfetantes e esporicidas

Grupo de Ativo Classificao Exemplos

Aldedos Esporicida 2% Glutaraldedo*

Desinfetante de uso geral,


Alcois 70% lcool Isoproplico, 70% lcool Etlico
antissptico, agente antiviral

Clorados Esporicida 0.5% Hipoclorito de Sdio

Fenlicos Desinfetante de uso geral 500 g por g Clorocresol, 500 g per g Cloroxilenol

Oznio Esporicida 8% Gas, em peso

Esterilizante da fase vapor,


Perxido 4 g por g vapor de H2O2, 10%25% soluo,
esporicida na fase lquida,
de hidrognio 3% em soluo antissptica
antissptico

Biguanidas
Agente antissptico 0.5% Gluconato de Clorhexidina
substitudas

cido Desinfetante de alto nvel.


0.2% cido Peractico
Peractico Esporicida

xido
Esterilizante da Fase Vapor 600 g por g xido de Etileno
de Etileno

Compostos de quaternrio Desinfetante de uso geral,


200 g por g Cloreto de Benzalconio
de amnio antissptico

- Propionolactona Esporicida 100 g por g -Propionolactone

*H restries quanto ao uso do Glutaraldedo, pela ANVISA, como esterilizante de materiais crticos (Clnicos e Cirrgicos),
principalmente pela resistncia apresentada s espcies resistentes de Micobactria de crescimento rpido.
96
9.2.2 Frequncia e tempo de contato

de praxe a limpeza e sanitizao serem realizadas entre lotes, produtos, e se for o caso, ao final do
expediente. Uma limpeza e sanitizao recomendvel no incio de cada expediente.

Ambos os parmetros: frequncia e tempo de contato devem ser previamente analisados e validados,
pois no h um protocolo definido, e cada instalao nica.

Recomenda-se o uso de anlises de risco, como o HACCP, para detectar os pontos crticos do processo
e como monitor-los. O histrico e manuteno dos nveis de contaminao dentro dos parmetros
estabelecidos necessitam indicar a frequncia e tempo necessrios.

9.3 VALIDAO DO PROCESSO DE LIMPEZA E SANITIZAO

A validao de limpeza consiste em realizar um processo de limpeza que garanta a higienizao (Limpeza
e sanitizao) do equipamento.

importante estabelecer que no existe um nico caminho para executar um processo de validao de
limpeza, e que o ponto comum a ser buscado a existncia de critrios, parmetros e metodologias que
sejam cientificamente justificveis e que demonstrem claramente que o procedimento de limpeza produz
resultados que esto de acordo com as especificaes pr-estabelecidas.

Para iniciar o estudo de validao de limpeza, inicia-se com a avaliao do prprio procedimento de
limpeza e assim devemos verificar itens importantes para que se inicie a validao:

a. Existncia de procedimentos de limpeza escritos, aprovados e com seus respectivos registros


de treinamento anexados. Somente os funcionrios treinados podem executar o processo de

limpeza.

b. O procedimento deve detalhar os pontos crticos do equipamento e a maneira como cada ponto

deste deve ser limpo.

c. No caso de limpeza manual, ideal que o procedimento detalhe os tempos, quantidade de

solvente utilizado, tipo de solventes, tipo de detergente e os mtodos empregados na limpeza,

ou seja, quantas vezes uma determinada rea deve ser esfregada, por quanto tempo e em que

sentido. Isso vital para que seja evitada a ocorrncia de subjetivismos entre os operadores.

d. O material utilizado na limpeza deve ser padronizado, o procedimento deve detalhar ou fazer

referncia metodologia de preparao do detergente, estabelecendo sua concentrao de

uso. A concentrao de uso do detergente e sua marca so imutveis aps a validao do

97
procedimento de limpeza, qualquer alterao nesses itens deve ser precedida de avaliao

atravs do controle de mudana, antes que o procedimento seja aplicado na rotina.

e. O procedimento deve definir por quanto tempo o equipamento pode permanecer sujo, antes

que a limpeza seja executada, pois a efetividade de um procedimento de limpeza inversamente

proporcional ao tempo que o mesmo permanece sujo, pois aumenta consideravelmente sua

dificuldade de limpeza. O tempo deve ser definido e o estudo de validao dever sempre ser

conduzido nesse prazo limite para assegurar que o procedimento eficaz em seu pior caso.

f. O procedimento deve definir por quanto tempo o equipamento pode permanecer limpo sem

que uma nova limpeza tenha que ser executada.

g. As validaes devero ser realizadas de acordo com o tipo de produto a ser limpo.

98
10 RESDUOS / DESCARTES DE MATERIAIS
10.1 PROCEDIMENTOS PARA DESCARTE DE MATERIAIS COM RISCO
BIOLGICO

O descarte correto dos materiais contaminados no pode afetar diretamente a qualidade dos ensaios.
Devem existir procedimentos para minimizar a possibilidade de contaminao dos materiais ou do
ambiente de ensaio.

Contudo, esta uma questo de boas prticas de laboratrio e deve obedecer aos regulamentos
ambientais ou de sade e segurana.

Aps o uso (cultura de microrganismos ou material em contato com microrganismos), o aparelho ou


materiais e os seus contedos devem ser tratados para a destruio de microrganismos, antes da limpeza
ou descarte qualquer que seja o microrganismo envolvido.

De acordo com a natureza dos materiais, desinfeco, esterilizao ou a incinerao de material descartvel
pode ser utilizado.

10.2 DESCONTAMINAO

Esterilizao por calor seco - A esterilizao por este processo deve ser a forno durante pelo menos 1h,
a 170C a 180C. Pode-se utilizar qualquer outra combinao de tempo e temperatura, se eles forem
validados. Os indicadores podem ser utilizados, a fim de garantir que foi conseguida a esterilizao.

Esterilizao por calor mido - A esterilizao por este processo deve ser de no mnimo 121C por pelo
menos 15 minutos, numa autoclave. Os indicadores podem ser utilizados, a fim de garantir que foi
conseguida a esterilizao.

Esterilizao por filtrao - esterilizao por filtrao pode ser realizada sob vcuo ou em condies
pressurizadas. Use membranas estreis e elementos de filtros com poros de dimetro de 0,22 g (alguns
casos podem ser utilizados o de 0,45 g). Esterilizar os diferentes componentes do aparelho de filtrao,
montado ou no, na autoclave durante 15 minutos a 121C. A montagem assptica deve ser efetuada
numa cmara de microbiolgica aps a autoclavagem.

A incinerao um tratamento aplicando o processo de combusto controlada, em altas temperaturas,


permitindo com isso a reduo do volume e massa dos resduos. Os resduos so transformados em gases,
calor e materiais inertes.

99
O laboratrio de Microbiologia deve possuir um CADRI (Certificado de Movimentao de Resduos de
Interesse Ambiental) um documento emitido pela CETESB (Companhia de Tecnologia de Saneamento
Ambiental) que aprova o encaminhamento de resduos de interesse ambiental a locais de reprocessamento,
armazenamento, tratamento ou disposio final.

Os tipos de resduos que exigem o CADRI encontram-se divididos em duas classes:

Resduos Classe I - Perigosos - Apresentam risco sade pblica ou ao ambiente, com caractersticas
como inflamabilidade, corrosividade, reatividade, toxicidade e patogenicidade.

Resduos Classe II A No Inertes - Podem ter propriedades como: biodegradabilidade, combustibilidade


ou solubilidade em gua. No se enquadram nas classificaes de resduos classe I - Perigosos ou de
resduos classe II B Inertes.

10.3 IDENTIFICAES DAS REAS COM RISCO MICROBIOLGICO

Classes Risco Biolgico

Os agentes de risco biolgicos humanos e animais so divididos em classes, de acordo com critrios de
patogenicidade. Ver seco 2.2

10.4 DERRAMAMENTO DE MATERIAIS CONTAMINADOS

No caso de derrame de material infeccioso ou potencialmente infeccioso, utilizar o seguinte processo de


limpeza:

1. Utilizar luvas e vesturio protetor, incluindo, se necessrio, proteo para a face e os olhos.

Se necessrio, isolar a rea com identificao visual.

2. Para no deixar espalhar, cobrir o derrame com toalhas de papel e soluo desinfetante. Deixar

agir por no mnimo 15 minutos.

Colocar o material em saco autoclavavel inclusive todo o material utilizado na limpeza e

os EPIs descartveis.

100
11 CONSIDERAES FINAIS

Encerrando esta nossa pequena viagem pela microbiologia do presente Guia: Controle Microbiolgico
na Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos, foram abordados os aspectos atuais da
microbiologia, de forma prtica e simples, com pinceladas do conhecimento e experincia dos autores,
e fica ainda uma questo por ser desvendada: E agora? Para onde seguimos?

As tcnicas microbiolgicas evoluram desde a poca de Robert Koch, em 1884, que foi o pioneiro no
cultivo de microrganismos. De l para c, a microbiologia tratada ainda baseada no cultivo, contagem,
isolamento e identificao. Esta forma de anlise ainda est muito presente nos mtodos atuais, normas e
leis, nossos principais alicerces para definir metodologias e parmetros microbiolgicos a serem adotados
ou seguidos.

Por outro lado, inquestionvel o avano da cincia, especialmente na informatizao e melhoramento


dos equipamentos.

At pouco tempo atrs, nem as placas de Petri eram descartveis. Hoje, por questes de riscos sade,
e principalmente para fazer melhor uso da mo-de-obra, as placas descartveis vieram para ficar, e junto
com elas, tubos, pipetas, alas, etc. As placas tambm se miniaturizaram e formas diferentes de pensar a
microbiologia vm surgindo muito rapidamente.

Mtodos microbiolgicos rpidos ou facilitados, totalmente automatizados ou semi-automatizados


esto a cada dia mais prximos, factveis e, financeiramente mais acessveis fazendo uso do crescimento
microbiano, ou de sua presena, anlise genmica, resposta qumica ou fsico-qumica, para citar alguns.

Acreditamos que nos prximos anos, os mtodos microbiolgicos j estejam modificados, de forma a
atingir os maiores anseios dos cientistas e do prprio corpo tcnico: repostas rpidas, confiveis e eficazes
sempre visando a segurana do consumidor.

101
12 GLOSSRIO

gar: Hidrocolide extrado de diversos gneros e espcies de algas marinhas vermelhas. Consistem
de agarose e agaropectina e so usados como meio de cultura para o crescimento microbiolgico
(Bactrias e fungos).

gua desmineralizada: gua que tem todos os sais minerais removidos por um sistema de resinas de
troca inicas.

Amostragem: a tcnica para obter uma amostra (parte) de um lote de um produto.

Antissptico: Substncias e produtos destinados a higienizao, desinfeco, aes com finalidade de


destruir e inibir a multiplicao e proliferao de microrganismos patognicos. Usualmente est associado
com substncias aplicadas na superfcie da pele e mucosas.

Atividade da gua: a relao do vapor de presso de um produto comparado ao vapor de presso


da gua pura. Esta relao utilizada para avaliar a susceptibilidade de uma matria-prima ou produto
contaminao microbiolgica.

Calibrao: Conjunto de operaes que estabelecem, sob condies especificadas, a relao entre os
valores indicados por um instrumento (calibrador) ou sistema de medio e os valores representados
por uma medida materializada ou um material de referncia, ou os correspondentes das grandezas
estabelecidas por padres.

Cepa: Microrganismo puro, que d origem a microrganismos similares.

Colnia: Crescimento visvel, macroscpico, de microrganismo em meio de cultura slido. Relacionado a


Unidade Formadoras de Colnias (UFC).

Concentrao Inibitria Mnima: Menor concentrao de um ativo necessrio para inibir o crescimento
de um determinado microrganismo.

Conservante: Agente qumico que previne o crescimento microbiolgico.

Esporos: Microrganismos em estado dormente, adaptados a sobreviver em condies ambientais


adversas.

102
Esterilizao: Eliminao e destruio da vida microbiolgica destes materiais. Para ser esterilizada
necessrio que seja submetida ao calor durante um determinado tempo, destruindo todas as bactrias,
seus esporos e fungos. Existem vrias tcnicas de esterilizao, que apresentam vantagens e desvantagens;
contudo, a tcnica usada mais regularmente a autoclavagem.

Gram-negativa: Bactria que retm a cor vermelha depois de usar o procedimento de Colorao de
Gram.

Gram-positiva: Bactria que retm a cor violeta depois de usar o procedimento de Colorao de Gram.

Meio de Cultura: Nutriente contendo gar lquido ou slido que permite o crescimento de microrganismos.

Qualificao: Conjunto de aes realizadas para estabelecer evidncias documentadas confiveis de que
um processo qualquer, executado em conformidade com especificaes pr-determinadas e com os
requisitos da Qualidade.

Rastreabilidade: um processo que permite a identificao e reproduo de todas as etapas da fabricao


de um produto, apresentando todos os documentos referentes aos processos de fabricao, limpeza e
anlises estarem registrados, documentados e arquivados.

Swab: Zaragatoa para coletar microrganismos em uma superfcie (bancadas e equipamentos) e transferi-
los para uma placa onde ser feita a anlise microbiolgica.

Validao: Ao conduzida para estabelecer e demonstrar que um processo, procedimento, instrumento,


aparato ou equipamento/material conduz necessria e efetivamente ao objetivo requerido.

103
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