Livro - Ciencias - Biologicas - Ensino de Microbiologia Através de Experimentos Práticos PDF

Ciências Biológicas
Ensino de Microbiologia através de experimentos prá�cos

F
iel a sua missão de interiorizar o ensino superior no estado Ceará, a UECE,
como uma ins�tuição que par�cipa do Sistema Universidade Aberta do
Brasil, vem ampliando a oferta de cursos de graduação e pós-graduação
na modalidade de educação a distância, e gerando experiências e possibili-
dades inovadoras com uso das novas plataformas tecnológicas decorren-
tes da popularização da internet, funcionamento do cinturão digital e
massificação dos computadores pessoais.
Comprome�da com a formação de professores em todos os níveis e
a qualificação dos servidores públicos para bem servir ao Estado, Ensino de Microbiologia
os cursos da UAB/UECE atendem aos padrões de qualidade
estabelecidos pelos norma�vos legais do Governo Fede- através de experimentos prá�cos
ral e se ar�culam com as demandas de desenvolvi-
mento das regiões do Ceará.
Germana Costa Paixão

Lydia Dayanne Maia Pantoja
Universidade Estadual do Ceará - Universidade Aberta do Brasil

Charles Ielpo Mourão
Claúdia Suellen Ferro de Oliveira
Geografia
12
História
Educação
Física
ISBN 978-85-78266-19-6
Ciências Artes
9 788578 266 1 96
Química Biológicas Plás�cas Computação Física Matemá�ca Pedagogia
Ensino de Microbiologia
através de experimentos práticos

Geografia
2ª edição
Fortaleza - Ceará 9
12
História
2015
Educação
Física
Ciências Artes
Química Biológicas Plásticas Computação Física Matemática Pedagogia
Copyright © 2015. Todos os direitos reservados desta edição à UAB/UECE. Nenhuma parte deste material poderá
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Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Lúcia Oliveira – CRB - v3/304
Bibliotecária
E59 Ensino de microbiologia : através de experimentos práticos /

Germana Costa Paixão...[et al.]. - 2. ed. - Fortaleza:
EdUECE, 2015.
148p. : il. - (Ciências biológicas)
ISBN: 978-85-7826-619-6
1. Microbiologia. 2 . Microbiologia - Estudo e ensino . I.
Paixão, Germana Costa. II. Título. III. Série.
CDD: 579
Editora da Universidade Estadual do Ceará – EdUECE

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Secretaria de Apoio às Tecnologias Educacionais
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Sumário
Apresentação..................................................................................................... 5
Capítulo 1 – Normas de Biossegurança em Laboratórios
de Microbiologia................................................................................................ 7
Introdução.............................................................................................................. 9
1. Definições........................................................................................................ 10
2. Níveis de Biossegurança................................................................................ 10
3. Boas Práticas Laboratoriais (BPL)................................................................. 14
Capítulo 2 – Vidraçarias e Equipamentos................................................... 19
Introdução............................................................................................................ 21
1. Lavagem de vidrarias...................................................................................... 22
2. Secagem da vidraria....................................................................................... 23
3. Preparo e montagem do material.................................................................. 23
Capítulo 3 – Técnica de Coloração de Gram e Visualização
de Bactérias...................................................................................................... 27
Introdução............................................................................................................ 29
1. Tipos de coloração.......................................................................................... 30
2. Coloração de Gram......................................................................................... 30
Capítulo 4 – Preparo de meios de cultura................................................... 37
Introdução............................................................................................................ 39
1. Classificação dos meios de cultura............................................................... 40
2. Preparo de meio de cultura............................................................................ 42
Capítulo 5 – Técnicas de semeadura primária........................................... 47
Introdução............................................................................................................ 49
1. Técnicas de Semeadura Primária................................................................. 50
Capítulo 6 – Visualização do Crescimento Bacteriano
e Provas Químicas.......................................................................................... 55
Introdução............................................................................................................ 58
1. Características macroscópicas das colônias bacterianas........................... 59
2. Provas bioquímicas......................................................................................... 61
Capítulo 7 – Eficácia do calor no crescimento microbiano..................... 67
Introdução............................................................................................................ 72
1. Métodos de controle físicos............................................................................ 72
Capítulo 8 – Eficácia de Desinfetantes Sobre
Micro-organismos in vitro.................................................................... 77
Introdução........................................................................................................... 80
1. Escolha do agente químico........................................................................... 80
2. Agentes químicos........................................................................................... 81
Capítulo 9 – Anti-sepsia de Mãos: Experimento de Price......................... 85

Introdução............................................................................................................ 88
1. O Experimento de Price................................................................................. 89
Capítulo 10 – Antibiograma/teste de susceptibilidade
a antimicrobianas............................................................................................ 93
Introdução........................................................................................................... 96
Capítulo 11 – Microbiota da Água................................................................. 99
Introdução.........................................................................................................101
1. Microbiota da água.......................................................................................102
2. Análise microbiológica da água...................................................................103
Capítulo 12 – Microbiota do Solo................................................................ 109
Introdução.......................................................................................................... 112
1. Formação dos solos..................................................................................... 113
2. Solo e suas interações microbianas............................................................ 113
3. Diversidade microbiana................................................................................ 114
Capítulo 13 – Microbiota do Corpo Humano............................................ 117
Introdução.........................................................................................................120
1. A Microbiota Humana: desenvolvimento e interações...............................120
2. Funções da Microbiota.................................................................................121
3. Microbiota Normal do Corpo........................................................................121
Capítulo 14 – Micro-organismo em Processos Biotecnológicos.......... 124
Introdução.........................................................................................................127
1. Utilização dos micro-organismos................................................................128
Capítulo 15 – Análise Macro e Micromorfológica dos Fungos.............. 133
Introdução..........................................................................................................136
1. Macromorfologia dos fungos........................................................................136
2. Micromorfologia dos fungos.........................................................................137
3. Quadro de identificação fúngica..................................................................139
Capítulo 16 – Microbiota do Ar.................................................................... 141
Introdução..........................................................................................................143
1. Quem são os fungos anemófilos?...............................................................145
2. Técnicas para análise do ar.........................................................................145
3. Legislação.....................................................................................................146
Sobre os autores........................................................................................... 148
Apresentação
A presente obra é resultado da compilação de aulas práticas que foram minis-

tradas aos cursos de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Ceará,
nas modalidades presencial e a distância, ao longo da última década. Com o
passar dos anos essas atividades práticas foram sendo modificadas, amplia-
das e aprimoradas.
A obra está dividida em 16 capítulos que, somados, perfazem seu objetivo
didático e pedagógico. São abordadas noções de biossegurança, apresentação
de vidrarias e equipamentos de uso na rotina, noções sobre coloração, meios de
cultura, semeaduras, provas bioquímicas, generalidades sobre ação do calor,
desinfetantes, anti-sepsia e antibiograma, abordagem ampla sobre a microbiota
(água, solo, ar) e a biotecnologia. Em todas as atividades procurou-se abordar
técnicas fáceis de serem realizadas com o objetivo de sedimentar conceitos bá-
sicos e despertar o interesse do leitor pelo fascinante mundo da Microbiologia.
O texto foi escrito de forma clara e concisa visando ser receptivo e atra-
ente ao leitor. Embora o livro se destine a pessoas com uma base científica
em formação, seu texto não é fácil, já que a própria Microbiologia não é as-
sunto que se aprende sem esforço. Assim, o leitor será intelectualmente de-
safiado a aprender novos conceitos e técnicas a cada experimento proposto.
Não pretendemos apresentar manual de referência, mas tão somente
nos propomos a socializar nossas vivências, colaborando para a democrati-
zação do ensino da Microbiologia, desmistificando o aparato de complexidade
que, por vezes, estigmatiza o estudo sistematizado dos seres diminutos.
Esperamos que os leitores busquem se aprofundar nas maravilhas des-
se universo paralelo, aprendendo a respeitar esses seres e a conviver com
eles de maneira harmônica e simbiótica.
Registramos nossa gratidão a todos os monitores e bolsistas do Labo-
ratório de Microbiologia (LAMIC), do Curso de Ciências Biológicas da UECE,
em especial Marcela Saldanha, Sâmia Lima, Manuela Couto, Miriam Martins,
Michael Rocha, Cecília Costa, Chistiane Coura, Emanuele Silva, Roberta
Rizzo, Kandarpa Gallas, Lívia Galdino e Edlâny Pinho que nos ajudaram a
construir o caminho que estamos trilhando e como nós, respeitam e admiram
a ciência de Louis Pasteur.
Os autores
Capítulo 1
Normas de Biossegurança em
Laboratórios de Microbiologia
Ensino de Microbiologia 9
Objetivos
l Apresentar a história da biossegurança no mundo e no Brasil
l Mostrar algumas definições para biossegurança

l Explicar os Níveis de Biossegurança
l Apresentar as normas de conduta em laboratórios de Microbiologia
l Demostrar os símbolos utilizados em laboratórios.
Introdução
A lógica da construção do conceito de Biossegurança teve seu início na dé-
cada de 1970 na reunião de Asilomar na Califórnia, onde a comunidade cien-
tífica discutiu sobre os impactos da engenharia genética na sociedade. Esta
reunião, segundo Goldim (1997), “é um marco na história da ética aplicada à
pesquisa, pois foi a primeira vez que se debateu os aspectos de proteção aos
pesquisadores e demais profissionais envolvidos nas áreas onde se realiza o
projeto de pesquisa”. A partir daí o termo biossegurança, vem, ao longo dos
anos, sofrendo alterações.
Ainda na década de 1970 o foco de atenção voltava-se para a saúde do
trabalhador frente aos riscos biológicos no ambiente ocupacional. De acordo
com a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2004) a definição de biossegu-
rança tratava-se de “práticas preventivas para o trabalho em contenção a nível
laboratorial, com agentes patogênicos para o homem”.
Já na década de 1980, a própria OMS (WHO, 2004) incorporou a essa
definição os chamados riscos periféricos presentes em ambientes laborato-
riais que trabalhavam com agentes patogênicos para o homem, como os ris-
cos químicos, físicos, radioativos e ergonômicos.
Nos anos 1990, verifica-se que a definição de biossegurança sofre mu-
danças significativas. Em seminário realizado no Instituto Pasteur em Paris
(INSERM, 1991), observa-se a inclusão de temas como ética em pesquisa,
meio ambiente, animais e processos envolvendo tecnologia de DNA recombi-
nante, em programas de biossegurança.
10 Paixão, G. C. Pantoja, L. D. M. Mourão, C. I. Oliveira, C. S. F.
1. Definições
A biossegurança é um processo funcional e operacional de fundamental im-
portância em serviços de saúde, uma vez que aborda medidas de controle
de infecções para a proteção da equipe de assistência e usuários em saúde,
reduzindo os riscos à saúde e acidentes ocupacionais, bem como exerce um
papel fundamental na promoção da consciência sanitária e preservação do
meio ambiente, já que estipula normas sobre a manipulação e descarte de
resíduos químicos, tóxicos e infectantes.
Uma definição baseada na cultura da engenharia de segurança e da me-
dicina do trabalho é encontrada em Costa (1998), onde aparece como “conjun-
to de medidas técnicas, administrativas, educacionais, médicas e psicológicas,
empregadas para prevenir acidentes em ambientes biotecnológicos”.
Teixeira; Valle, 1996 dizem que “a biossegurança é o conjunto de ações
voltadas para a prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às
atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e pres-
tação de serviços, visando à saúde do homem, dos animais, a preservação do
meio ambiente e a qualidade dos resultados.” Este foco de atenção retorna ao
ambiente ocupacional e amplia-se para a proteção ambiental e a qualidade.
A biossegurança é um processo progressivo, deve ser sempre atuali-
zado, supervisionado e sujeito à exigências de respostas imediatas ao surgi-
mento de micro-organismos mais resistentes e agressivos identificados pelas
notificações epidemiológicas.
2. Níveis de Biossegurança
Existem quatro níveis de biossegurança: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, crescen-
tes no maior grau de contenção e complexidade do nível de proteção. O nível
de biossegurança de um experimento será determinado segundo o organismo
de maior risco envolvido.
O nível de Biossegurança 1 (NB-1) é adequado ao trabalho que en-
volva agentes bem caracterizados e conhecidos por não provocarem do-
ença em seres humanos sadios e que possuam mínimo risco ao pessoal
do laboratório e ao meio ambiente. Esse nível se aplica aos laboratórios de
ensino básico, onde são manipulados os micro-organismos pertencentes a
Classe de Risco 1, por exemplo o Bacillus subtilis. Não é requerido nenhum
tipo de desenho especial das instalações. O laboratório não está separado
das demais dependências da edificação. O trabalho é conduzido, em geral,
em bancada, com adoção das boas práticas laboratoriais (BPL). Equipa-
mentos específicos de proteção ou características especiais de construção
não são geralmente usados ou exigidos. O pessoal do laboratório deve ter
treinamento específico nos procedimentos realizados na bancada e devem

ser supervisionados por um profissional treinado em Biossegurança e com
conhecimentos específicos da área.
Figura 1 – Típico laboratório NB1

Fonte: WHO, 2004.
O nível de Biossegurança 2 (NB-2) é semelhante ao nível de Biosse-

gurança 1, sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir. É
adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado para as pesso-
as e para o meio ambiente, classificados como micro-organismos da Classe
de Risco 2 (seus representantes incluem a maioria das bactérias: S. aureus,
E. coli, Salmonella sp., Shigella sp., Fungos: Aspergillus e Penicillium e Vírus:
Rotavírus e Adenovírus). Esse nível aplica-se as laboratórios clínicos ou hos-
pitalares de níveis primários de diagnóstico.
Difere do NB-1 nos seguintes aspectos:
1. o pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no manejo de
agentes patogênicos e deve ser supervisionado por profissionais competentes;
2. o acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos opera-
cionais;
3. precauções extremas serão tomadas em relação a objetos perfurocortantes
infectados;
4. determinados procedimentos nos quais exista possibilidade de formação
de aerossóis e borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de
segurança biológica ou outros equipamentos de contenção física.

Fonte: WHO, 2004.
O nível de Biossegurança 3 (NB-3) possui semelhanças com os nível

de Biossegurança 1 e 2, sendo acrescentado de algumas especificidades.
O laboratório de nível de Biossegurança 3, ou de contenção, destina-
se ao trabalho com agentes de risco biológico da classe 3, ou seja, micro-
-organismos que acarretam elevado risco individual e baixo risco para a co-
munidade, como por exemplo o Vírus da Encefalite equina venezuelana e
Mycobacterium tuberculosis. É aplicável para laboratórios clínicos, de diag-
nóstico, ensino e pesquisa ou de produção onde o trabalho com agentes exó-
ticos possam causar doenças sérias ou potencialmente fatais, como resultado
de exposição por inalação. A equipe profissional deve possuir treinamento es-
pecífico no manejo de agentes patogênicos, potencialmente letais, devendo
ser supervisionada por profissional altamente capacitado e que possua vasta
experiência com estes agentes.

Fonte: WHO, 2004.
O nível de Biossegurança 4 (NB-4) possui semelhanças quanto aos

procedimentos e práticas estabelecidas ao NB-3, porém só deve operar com
técnicos especializados e treinados em procedimentos de Biossegurança.
O NB-4 é indicado para o trabalho que envolva agentes exóticos e pe-
rigosos que exponham o indivíduo a um alto risco de contaminação de infec-
ções que podem ser fatais, além de apresentarem potencial elevado de trans-
missão por aerossóis. Manipula-se micro-organismos da classe de risco 4, por
exemplo o Vírus Marburg e o Vírus Ebola.
Recomenda-se que os laboratórios de nível de Biossegurança 4, ou
de contenção máxima, só funcionem sob o controle direto das autoridades
sanitárias, além disso, dada a grande complexidade do trabalho, a equipe do
laboratório deverá ter treinamento específico e completo direcionado para a
manipulação de agentes infecciosos extremamente perigosos. É necessária a
elaboração de manual de trabalho pormenorizado; este deve ser testado pre-
viamente através de exercícios de treinamento. O acesso ao laboratório deve
ser rigorosamente controlado por sistemas automatizados. A instalação labo-
ratorial deve estar localizada em uma edificação separada ou em uma área
controlada dentro do edifício, que seja totalmente isolada de todas as outras.
Figura 4 – Funcionários em laboratório NB4

Fonte: http://qwickstep.com/search/biosafety-level-4.html
3. Boas Práticas Laboratoriais (BPL)

Boas Práticas de Laboratório (BPL) é um sistema da qualidade relativo ao
processo organizacional e às condições sob as quais estudos não-clínicos
referentes a saúde e meio ambiente são planejados, realizados, monitorados,
registrados, arquivados e relatados.
3.1 Medidas e Equipamentos de Proteção Individual e Coletiva

(EPI’s e EPC’s)
Equipamentos de proteção individual (EPI’s)
Equipamentos de Proteção Individual ou EPI’s são quaisquer meios
ou dispositivos destinados a ser utilizados por uma pessoa contra possíveis
riscos ameaçadores da sua saúde ou segurança durante o exercício de uma
determinada atividade. Os principais EPI’s são:
l Avental ou jaleco de algodão, de mangas compridas e punho retrátil;
l Máscara com filtro apropriado;

l Luvas de proteção;
l Protetor facial;
l Pipetador automático;
l Pêra de borracha;
l Óculos de proteção.
Equipamentos de proteção coletiva (EPC’s)
Equipamentos de Proteção Coletiva, ou EPC’s, são equipamentos
utilizados para proteção, enquanto um grupo de pessoas realiza determinada
atividade, ou exercício. Os principais EPC’s são:
l Extintores de incêndio;
l Chuveiro de Segurança;
l Lava olhos;
l Pia para lavagem das mãos;
l Cabine de Segurança Biológica;
l Capelas de Exaustão;
l Caixa de primeiros socorros;
l Recipientes especiais para transporte de material.
3.2 Normas de conduta em laboratório de Microbiologia

1. O uso de jaleco, calça comprida e sapato fechado são obrigatórios;
2. Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com rea-
gentes e equipamentos;
3. Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois do uso;
4. Lavar as mãos, com água e sabão, ao iniciar o experimento, ao sair do la-
boratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento
nas mãos procurar não tocar no material e usar obrigatoriamente luvas;
5. Identificar as amostras biológicas, bem como todo o material a ser utiliza-
do nos experimentos antes de iniciar as análises;
6. Utilizar exclusivamente material estéril;
7. No caso de derramamento de material contaminado, proceder imediata-
mente a desinfecção das superfícies com álcool a 70% ou formol a 10% e
antissepsia dos tecidos vivos com solução iodada a 2%. O mesmo proce-
dimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes.
8. Não comer, beber, se maquiar ou fumar no laboratório;
9. Manter canetas, dedos e outros objetos longe da boca;
10. Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho;
12. Avisar ao Professor e/ou ao Monitor em caso de contaminação acidental;
13. Depositar todo material utilizado em recipiente de descarte adequado, ja-
mais os deixando sobre a bancada;
14. Flambar alças, agulhas e pinças metálicas antes e após o uso;
15. Após a leitura das placas cultivadas, colocá-las em recipiente próprio
para descarte;
16. Ao acender o bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou
substâncias inflamáveis por perto. Não deixar papel sobre as bancadas;
16. Trabalha sempre com a chama do bico de Bunsen entre você e o mate-
rial biológico;
17. O laboratório é um local de trabalho que exige calma e tranquilidade, por-

tanto converse apenas o necessário para a compreensão dos assuntos
inerentes a cada aula prática.
3.3 Sinalização de Laboratório
Atividades de avaliação
1. Pesquise sobre a rede de laboratórios com nível de segurança NB-3 existen-
tes na região do Nordeste. Existe algum no Ceará? Se sim, defina seu perfil.
2. Quais as diferenças entre os Níveis de Biossegurança em laboratórios?
Cite pelo menos duas diferenças de cada nível.
3. Qual a principal diferença entre um equipamento de proteção individual
(EPI) e um equipamento de proteção coletiva (EPC)? Cite pelo menos 3
exemplos de cada.
4. Paula foi sequestrada por razões desconhecidas, dias depois quando foi
libertada, em seu depoimento para a polícia, Paula informou que estava
vendada, mas conseguiu ver uma placa de proibido comer ou beber, outra
com um rosto com máscara, ela lembra também de uma placa azul com
uma espécie de camisa longa e uma placa com uma caveira. Se você fos-
se ajudar a polícia, qual o provável local para esse cativeiro? Por que?
5. Uma jornalista visitou o laboratório de Microbiologia de uma Faculdade,
nessa visita ela passou o dia no laboratório e anotou tudo que viu. Segue
um trecho do artigo que ela publicou em um jornal local: “...em tal labora-
tório todos usavam jalecos, calça e sapatos fechados, as mulheres anda-

vam sempre muito bonitas com os cabelos soltos e brincos extravagantes,
as bancadas eram limpas após cada experimento, o material utilizado era
sempre estéril, não era permitido comer, beber ou fumar no ambiente, as
alças e agulhas eram flambadas após o uso e finalmente, não era utiliza-
do lamparina ou bico de Bunsen durante as experiências...”. Após a leitura
desse artigo, indique as normas de conduta que estavam erradas nesse
laboratório e qual seria a forma correta.
Leitura
http://www.ctnbio.gov.br/index.php/content/view/148.html
http://www.biosseguranca.com/home.htm
http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/lab_virtual/csb.html
http://www.ibilce.unesp.br/instituicao/comissoes/biosseguranca/index.html
Referências
COSTA, M. A. F. Biossegurança e Qualidade: uma necessidade de inte-
gração. Revista Biotecnologia, ano I, número 4, jan/fev., p.32-32, 1998.
GOLDIM, J. R. Conferência de Asilomar. 1997. Http://www.ufrgs.br/HCPA/
gppg/asilomar.htm
INSERM. Les Risques Biologiques en Laboratoire de Recherche. Paris:
Institut Pasteur, 1991.
TEIXEIRA, P.; VALLE, S. Biossegurança: uma abordagem multidiscipli-
nar. Rio de Janeiro: Ed. Fiocruz, 1996.
WHO. Laboratory Biosafety Manual. Geneva: 3 ed., 2004.
Capítulo 2
Vidrarias e Equipamentos
Objetivos
l Mostrar as vidrarias, utensílios e equipamentos comumente encontrados em
um laboratório de Microbiologia.
l Demonstrar os procedimentos adequados para lavagem, secagem e prepa-
ro das vidrarias utilizadas nas aulas práticas.
Materiais utilizados na aula prática

l Vidrarias diversas (pipetas, tubos de ensaio, placas de Petri etc);
l Papel madeira, algodão, fita adesiva e caneta.
Introdução
Comumente em nossas vidas acadêmicas, visitamos laboratórios dos mais
diversos tipos, mas nessa aula, nosso foco será o laboratório de Microbiologia.
Para os que não são familiarizados com o mesmo, esse tipo de laboratório
trabalha com diversos micro-organismos, patogênicos ou não, para as mais
diferentes finalidades, sendo geralmente amplos e bem estruturados.
As vidrarias clássicas, como béquer, tubos de ensaio, pipetas, entre ou-
tros, são essenciais em qualquer laboratório. Sendo importante saber a utili-
dade das vidrarias, e com ela, o seu grau de exatidão. Aferir o volume em um
balão volumétrico ou proveta é muito mais fácil e preciso quando comparado
a um béquer, por exemplo.
Alguns utensílios também são utilizados, como a alça bacteriológica e
pisseta, sendo também importantes para a realização das atividades de rotina.
Na tabela 1, estão listadas algumas vidrarias e utensílios utilizados em um
laboratório de Microbiologia.
Nos laboratórios que manipulam micro-organismos é necessário que
estes possuam alguns equipamentos essenciais para o cultivo, estudo e ma-
nutenção dos mesmos, tais como: estufa, autoclave e dependendo do tipo de
pesquisa, o mesmo pode ter também equipamentos mais sofisticados, como
termocicladores e espectrofotômetros, muito usados em pesquisas na área
de biologia molecular de micro-organismos. Na tabela 2, estão listados os prin-
cipais equipamentos.
1. Lavagem de vidrarias
Todas as vidrarias utilizadas em um laboratório devem ser lavadas inicialmente
com água e sabão neutro. Em algumas ocasiões, se faz o uso de soluções quí-
micas, como as soluções sulfocrômica, potassa alcoólica e a sulfonítrica. Co-
mumente ainda se usa a solução sulfocrômica, apesar de comprovadamente
levar ao desenvolvimento de câncer, além de causar impactos ambientais.
Tabela 1
1
O Balão de Erlenmeyer Vidrarias e utensílios utilizados em um laboratório de Microbiologia
(em alemão: Erlenmeyer Vidrarias Utensílios
kolben) é um frasco em Béquer Agulha de platina
balão, usado como recipiente
Bastão de vidro Alça bacteriológica
no laboratório, inventado
pelo químico alemão Emil Kitassato Bisturi
Erlenmeyer. Balão volumétrico Caçapas de plástico
Erlenmeyer1 Estantes para tubos de ensaio
2
Placas de Petri: o nome
foi dado a este instrumento Pipetas Garfo de platina
de laboratório em honra ao Pistilo e almofariz Lamparina
bacteriologista alemão J.R. Placa de Petri2 Lâminas de corte
Petri (1852-1921) que a Proveta Pêra
inventou em 1877 quando
Tubos de ensaio Pisseta
trabalhava como assistente
de Robert Koch.
Tabela 2
3
O agitador magnético Equipamentos encontrados em um laboratório de Microbiologia
promove agitação através Equipamentos Equipamentos
de um campo magnético Agitador magnético3 Estufa Bacteriológica
formado por um imã acoplado Autoclave Estufa de Esterilização
à um pequeno motor e um
Balança analítica e/ou semi-analítica Estufas de Secagem
bastão magnético.
Bico de Bunsen Geladeira
Bomba de vácuo Manta aquecedora
Cabines de Segurança Biológica Microondas
Centrífuga Microscópio
Contador de Colônias pHmetro
Espectrofotômetro Termociclador
Esta solução deve ficar em contato com a vidraria a ser lavada por um
período de tempo variável em função do grau de contaminação do mesmo.
Assim, vidrarias relativamente limpas necessitam apenas de alguns minutos,
enquanto que, se houver resíduos, talvez seja necessário deixar toda uma
noite. Devido sua intensa ação corrosiva, é de boa prática colocar o frasco
de solução em bandeja de vidro, chumbo ou revestida com chumbo, e em
seguida, lavar com água destilada.
Outro ponto importante na rotina de um laboratório de Microbiologia é

saber quando, onde e como descartar materiais contaminados, bem como as-
segurar que todos os itens necessários à pesquisa ou rotina sejam esterilizados.
Tubos de ensaio e/ou placas de Petri contendo amostras biológicas de-
vem ser sempre esterilizados, visando matar os micro-organismos presentes
antes da limpeza. O melhor método para esterilizar culturas é autoclavar a
121 ºC por 30 minutos. Depois que os tubos e/ou placas forem esvaziados,
devem ser escovados com sabão neutro e água corrente, e lavados com
água destilada.
Em laboratórios que não possuem autoclave, o descarte de micro-
organismos pode ser feito colocando-se o material em contato com formol
a 10% por aproximadamente 24 horas, garantindo então, que as culturas
presentes nos tubos ou placas sejam mortas.
2. Secagem da vidraria
A vidraria lavada deverá ser colocada em estufa de secagem a 70 ºC e poste-
riormente deve ser devidamente montada para esterilização.
Pode-se optar pela secagem natural. Neste caso a vidraria lavada deve
ser colocada em bandejas e deixada à temperatura ambiente até a completa
evaporação de água.
3. Preparo e montagem do material

A montagem do material consiste na preparação do mesmo para a esteriliza-
ção, evitando sua contaminação após o processo. Por exemplo:
l Placas de Petri: devem ser montadas e embrulhadas em papel madeira e
barbante e/ou fita adesiva, identificando-se a data, quantidade, tamanho das
placas, e ocasionalmente, o nome do responsável pela montagem.
l Tubos: tubos de repique (aqueles onde são isolados os micro-organismos)
devem ser devidamente tampados, porém as tampas não devem ficar muito
apertadas (tubos rosqueados). Tubos de ensaio e de hemólise (não ros-
queados) devem ser vedados com tampões de algodão. Após montados,
devem ser embrulhados em papel madeira e devidamente identificados.
Os tampões devem penetrar 2 a 3 cm no interior dos tubos e permanece-
rem bem ajustados, pois permitem a entrada do ar e retêm os micro-organismos.
l Pipetas: a montagem de pipetas pode ser feita a partir de um dos dois
procedimentos: colocação em recipientes metálicos com a parte de aspirar
para cima ou enrolados individualmente em papel manteiga, com algodão
inserido em sua extremidade.
1. Supondo que um dos seus colegas de laboratório seja surdo e mudo, e que vo-
cês precisam limpar determinadas vidrarias, desenhe duas vidrarias para que
esse colega possa entendê-lo. Aproveite para citar a função dessas vidrarias.
2. Pedrinho estava lavando vidrarias em seu laboratório, após colocá-las na
estufa, ele as embalou, identificou e levou a autoclave, no dia seguinte le-
vou uma tremenda bronca do chefe do laboratório, pois ele tinha autoclava-
do algumas vidrarias que não deveria. Explique quais as prováveis vidrarias
que Pedrinho autoclavou errado e porque não poderiam ser autoclavadas.
3. Mariana precisava medir um determinado volume de água para preparar
um meio de cultura. Para isso, usou um béquer, e após realizar todas as
etapas percebeu que o meio não estava na consistência correta. Diante do
exposto, qual o provável erro cometido por Mariana? Explique qual deveria
ter sido o procedimento correto.
4. A solução sulfocrômica tem sido substituída por outras soluções na lava-
gem de vidrarias. Discorra sobre os riscos da utilização dessa solução para
a saúde humana, assim como a ocorrência de impactos ambientais em
decorrência de sua utilização.
5. Quais os tipos de estufas usadas em um laboratório de microbiologia? Fale
das características e da função de cada uma.
MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKERT, J. Microbiologia de Brock.

12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.
RIBEIRO, M.C., SOARES, M.M.S.R. Microbiologia Prática. 1. ed. São Paulo:
Atheneu, 2002.
TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. 10. ed. Porto Ale-
gre: Artmed , 2012.
RUIZ - LACAZ, R. Manual prático de Microbiologia básica. São Paulo:
Edusp, 2000.
SILVA FILHO, G.N.S., OLIVEIRA, V.L. Microbiologia - Manual de aulas prá-
ticas. Florianópolis: Ed. da UFSC, 2004.
PAIXÃO, G.C., LUCENA, E.M.P., MEDEIROS, J.B.L., BONILLA, O.H. Práti-
ca de Biologia: da origem da vida à Biotecnonlogia. Fortaleza: Secretaria de
Educação, 2009.
Capítulo 3
Técnica de Coloração de Gram e
visualização de Bactérias
Objetivos
l Aprender a confeccionar esfregaços e fazer sua fixação.
l Identificar e executar as etapas da coloração de Gram.

l Reconhecer as principais formas e arranjos bacterianos.
l Classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram.

l Microscópio óptico
l Óleo de imersão
l Frasco conta-gotas
l Lâminas de vidro
l Depósito de descarte com hipoclorito de sódio
l Papel absorvente
l Pisseta
l Água reagente para laboratórios clínicos
l Álcool
l Lugol
l Corante Cristal Violeta
l Corante Fucsina
4
Para armazenar
os corantes, utiliza-se
Introdução recipientes de cor âmbar
Como a maioria dos micro-organismos parece quase incolor quando os vi- escuro, pois, de forma
geral, as substâncias
sualizamos ao microscópio óptico, frequentemente precisamos prepará-los
corantes sofrem ação da
para observação. Uma das formas pela qual isto pode ser feito é através da luz, produzindo alterações
coloração. O processo de coloração consiste em preparações aquosas ou variadas. Os corantes
orgânicas de corantes ou grupos de corantes que conferem uma variedade devem ser colocados
em frascos de 1 litro e
de cores aos micro-organismos quando visualizados ao microscópio, enfati-
distribuídos em frascos de
zando certas estruturas da espécie em estudo. menor capacidade, para uso
Quase todos os corantes4 biologicamente úteis são derivados de alca- diário. Sempre que forem
reabastecidos os frascos
trão da hulha. A estrutura química fundamental de muitos deles é o anel ben-
de uso, filtre o corante. Este
zeno. Os corantes geralmente são compostos por anéis de benzeno unidos procedimento evitará os
por ligações químicas bem definidas (cromóforos), relacionados com a produ- inconvenientes advindos da
ção de cor. Em termos amplos, os corantes são chamados ácidos ou básicos, precipitação do corante.
ou seja, os corantes básicos tingem estruturas ácidas, como a cromatina nu-

clear das células; os corantes ácidos reagem com substâncias básicas, como
as estruturas citoplasmáticas.
Violeta de genciana, verde malaquita, azul de metileno e fucsina são
exemplos de corantes básicos. Enquanto eosina, safranina e nigrosina são
exemplos de corantes ácidos. Ambos os tipos são utilizados para a visualiza-
ção de bactérias (TORTORA et al., 2004).
Como armazenar Assim, para aplicar corantes ácidos ou básicos, os microbiologistas
os corantes?
usam basicamente três tipos de técnicas de coloração:
Utiliza-se recipientes de
cor âmbar escuro, pois, de a) Coloração simples
forma geral, as substâncias
b) Coloração diferencial
corantes sofrem ação da
luz, produzindo alterações c) Coloração especial
variadas. Os corantes
devem ser colocados
em frascos de 1 litro e
1. Tipos de coloração
distribuídos em frascos de 1.1 Coloração simples
menor capacidade, para uso
diário. Sempre que forem Utilizada para destacar o microrganismo como um todo, enfatizando a forma
reabastecidos os frascos celular e as estruturas básicas. Esse tipo de coloração consiste em uma so-
de uso, filtre o corante. Este lução aquosa ou alcoólica de um único corante, como, por exemplo, azul de
procedimento evitará os
inconvenientes advindos da metileno, violeta de genciana, fucsina, entre outros.
precipitação do corante.
1.2 Coloração diferencial
Utilizada para diferenciar e identificar determinados micro-organismos, esse
tipo de coloração interage de modo distinto com diferentes tipos de bactérias.
1.3 Coloração especial

Utilizada para evidenciar estruturas como cápsulas, endósporos e flagelos,
sendo muito útil para auxiliar na identificação de determinados micro-organis-
mos dotados dessas microestruturas.
2. Coloração de Gram
2.1 Histórico
A técnica de coloração de Gram foi descrita inicialmente pelo médico bacte-
riologista e farmacologista dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em
1884. Ele desenvolveu esta técnica enquanto pesquisava uma maneira para
demonstrar a bactéria Streptococcus pneumoniae em tecido pulmonar de pa-
cientes que morreram de pneumonia (PELCZAR et al., 1996).
2.2 Definição e mecanismo simplificado

A coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial utilizada para
distinguir bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
O mecanismo da técnica consiste, basicamente, em:
l Aplicação de um corante primário, que irá corar todas as bactérias da amostra.
l Aplicação de um mordente, fixando ainda mais o corante aplicado anteriormente.
l Aplicaçãode uma solução descorante, que irá retirar o corante primário de

alguns micro-organismos, deixando-os descorados.
l Aplicação de um contracorante, o qual irá corar as bactérias que estão inco-
lores, ou seja, as que foram descoradas, enquanto que as bactérias coradas

com o corante primário não irão reter o contracorante, permanecendo cora-
das com a coloração inicial.
2.3 Classificação
O mecanismo de ação da coloração de Gram baseia-se nas diferenças da es-
trutura da parede celular das bactérias, diferenciando-as em Gram (+) e Gram
(-), de acordo com a reação aos vários reagentes utilizados. A composição quí-
mica da parede celular é usada para diferenciar os principais tipos de bactérias.
A parede celular bacteriana promove rigidez estrutural, confere forma
à célula e cria uma barreira física contra o ambiente externo. O componente
rígido da parede celular da maioria das espécies de bactérias é constituído de
glicopeptídeo (peptideoglicano). A estrutura do peptideoglicano é formada por
um esqueleto de resíduos de carboidratos formados por unidades alternadas
de N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico.
2.3.1 Bactérias Gram-positivas

A parede celular de uma bactéria Gram-positiva típica é composta por muitas
camadas de peptideoglicano e contém ácidos teicóicos, que consistem pri-
mariamente de um álcool (como glicerol ou ribitol) e fosfato.
Existem duas classes de ácidos teicóicos: os ácidos teicóicos da parede,
que estão ligados a camada de peptideoglicano, e os ácidos lipoteicóicos, que
atravessam a camada de peptideoglicano e ligam-se à membrana plasmática.
Quando coradas pela técnica de Gram, as bactérias Gram (+) coram-se
com tons de púrpura, adquirindo um aspecto roxo. Devido a sua extensa ca-
mada de peptideoglicano, elas não perdem as partículas de corante que estão
aderidas a sua parede celular ao serem tratadas com uma solução descoloran-
te (TORTORA et al., 2004).
2.3.2 Bactérias Gram-negativas

A parede celular de uma bactéria Gram-negativa consiste em apenas uma ou
algumas camadas de peptideoglicano e uma membrana externa constituída
de lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídeos, a qual apresenta proteínas
transmembranas, as porinas, que formam canais que permitem a passagem
de moléculas. O peptideoglicano ligado a lipoproteínas situa-se no espaço pe-
riplásmico, um espaço entre a membrana externa e a membrana plasmática.
Ao serem coradas pelo método de Gram, as bactérias Gram (-) coram-se
em púrpura, porém, a aplicação do descolorante rompe a camada externa de
lipopolissacarídeo, o que permite a retirada das partículas do corante primário
através da fina camada de peptideoglicano. Em seguida, a aplicação de um
contracorante, como a safranina, permite que sejam novamente coradas, pos-
sibilitando a visualização ao microscópio óptico (TORTORA et al., 2004).
2.3.3 Bactérias Gram Variáveis

As bactérias Gram variáveis, também conhecidas como Gram lábeis, são
aquelas que podem se apresentar tanto Gram (+) como Gram (-). O resultado
da coloração de Gram, evidenciando bactérias Gram variáveis, muitas vezes
está relacionado com o estado fisiológico da célula.
Geralmente as culturas jovens respondem melhor à diferenciação tinto-
rial. As culturas velhas de Gram (+) podem se apresentar como Gram variável,
pela perda da capacidade de retenção do corante (SOARES et al., 1987).
2.3.4 Bactérias Não Reativas 5

Para preparar essa solução,
São aquelas que não se coram através da técnica de coloração de Gram. Isso pese 4,5 gramas de iodeto
de potássio. Transfira o
se deve a diversos fatores, tais como: iodeto de potássio para um
l Ausência de parede celular. Por exemplo, bactérias do gênero Mycoplasma. béquer contendo 450 ml
de água destilada. Com
l Composição química peculiar da parede celular. Por exemplo, as bactérias o auxílio de um bastão de
que possuem uma grande quantidade de lipídeos na parede celular, como vidro, misture até a completa
as dos gêneros Nocardia e Mycobacterium. dissolução. Em seguida,
pese 3 gramas de iodo
l Parede celular muito fina. Por exemplo, bactérias do gênero Treponema.
metálico e junte à solução de
iodeto de potássio. Continue
2.4 Reagentes utilizados misturando até a completa
dissolução. Armazene em
Corante Cristal Violeta: Corante primário utilizado para evidenciar todas as frasco de vidro escuro,
células bacterianas presentes na amostra, corando-as com tons de púrpura. previamente lavado, seco e
rotulado.
Lugol5: Mordente à base de iodo, utilizado para intensificar a ação do corante
primário. 6
O diferenciador (agente
descolorante) há 100
Álcool/Acetona: Agente descorante utilizado para diferenciação da bactérias anos era uma mistura de
Gram (+) (que ao serem tratadas com ele sofrem uma desidratação na parede solventes. Hoje se usa
celular com consequente retração dos poros, o que impede a saída das par- apenas o álcool etílico (99,5º
Gay Lussac). Este é mais
tículas do corante primário) e bactérias Gram (-) (que sofrem um rompimento
seguro do que o álcool
da membrana externa em consequência da dissolução dos lipídeos presentes, acetona, que requeria grande
acarretando a retirada do corante através da fina camada de peptideoglicano). habilidade do operador
para que não ocorresse a
Corante Fucsina/Safranina: Contracorantes utilizados para corar bactérias hiperdescoloração. Além do
Gram (-), pois estas ficam incolores após o tratamento com o agente descorante6. que, não permitia uma boa
reprodutibilidade da técnica.
2.5 Processo de coloração

1. Inicialmente se prepara um esfregaço:
O mesmo pode ser proveniente de um espécime biológico (por exemplo:
amostras clínicas, água, solo etc) ou de uma colônia.
No esfregaço confeccionado a partir de um espécime biológico, um filme
delgado da amostra deve ser passado sobre a lâmina de microscopia, utili-
zando uma alça de platina flambada.
Enquanto, para preparar um esfregaço a partir de uma colônia, devem-se
seguir os seguintes passos:
l Coleta-se as colônias bacterianas de uma cultura pura com a alça de plati-
na, previamente flambada, e transfere-se para um tubo de ensaio contendo
7
As bactérias que solução salina isotônica;
permanecem coradas com
l Mergulha-se uma alça de platina flambada no inóculo bacteriano e espalha-
o corante primário são
classificadas com Gram (+). se o conteúdo em uma lâmina de microscopia (esfregaço).
O mecanismo que envolve a 2. Após a confecção do esfregaço, o mesmo pode ser fixado através de
permanência do corante na
duas formas:
sua parede está relacionado
à espessura da sua camada Passando a lâmina com o material biológico através do bico de Bunsen, 3
de peptideoglicano, pois a 4 vezes, com o lado do esfregaço voltado para cima;
ao ser tratada com álcool,
a camada superficial de Recobrindo a lâmina com álcool por 1’.
peptideoglicano se resseca 3. O esfregaço bacteriano, previamente fixado, deve ser recoberto por um
rapidamente, o que causa
corante primário7 básico, normalmente o cristal violeta de genciana. Esse
a retração dos poros. Com
isso, o complexo molecular corante irá corar todas as células presentes na amostra.
do corante primário com 4. Após 1 minuto, lava-se a lâmina com água destilada, desprezando-se o
o mordente é retido nas
excesso de corante.
camadas inferiores da parede
celular, o que faz a mesma 5. Em seguida, aplica-se o mordente, lugol, que irá intensificar a ação do pri-
permanecer corada. meiro corante utilizado, formando um complexo molecular (complexo vio-
leta-iodo) maior que a molécula de cristal violeta que penetrou na parece
8
No entanto, as bactérias
classificadas como Gram (-) celular da bactéria, dificultando, assim, a retirada do corante da mesma.
possuem uma membrana 6. Após 1 minuto, prossegue-se com uma nova lavagem com água destila-
externa composta de,
da. Nesta etapa, todas as células bacterianas presentes na amostra esta-
entre outros compostos,
lipopolissacarídeos, que rão coradas em tons de púrpura.
irão reagir com o álcool, 7. Posteriormente, cobre-se a lâmina com um agente descolorante, álcool-
provocando o rompimento da acetona ou álcool 70%, que irá descorar algumas bactérias e outras não,
membrana externa. Assim,
o álcool consegue retirar considerando presença de bactérias Gram (+) e Gram (-)8 na amostra.
as partículas de corante 8. Logo em seguida, procede-se outra lavagem com água destilada para re-
presentes na fina camada de tirar o álcool.
peptideoglicano que compõe
a parede celular destas
bactérias.
9. Aplica-se a fucsina (contra-corante) por 30 segundos. Este irá corar as

Gram (-), que estão incolores, e não reagirá com as Gram (+), pois a retra-
ção dos poros da camada superficial de peptideoglicano impede a entra-
da de um novo corante.tudo bem
10. Realiza-se a última lavagem com água destilada para tirar o excesso de
contra-corante e deixa-se secar.
Figura 7 – Streptococcus spp . Figura 8 – Escherichia coli .

Fonte: (www.bigmedicine.ca/sachavais. Fonte: www.suite101.com/view_image.
htm) cfm/180490
Forma: Coco Forma: Bastonete

Arranjo: Estreptococo Cor: Vermelha
Cor: Púrpura Classificação: Gram negativa
Classificação: Gram positiva
1. Faça um desenho esquemático do que foi visualizado na prática e descre-
va, analisando a morfologia e a reação tintorial.
2. Qual a utilidade prática da coloração de Gram para o microbiologista e
como ela pode ser útil no diagnóstico e tratamento de doenças?
3. Faça um desenho esquemático evidenciando as diferenças morfológicas
entre as paredes celulares de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
4. Discorra sobre a reação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas à
ação da lisozima e das penicilinas.
5. Explique o motivo das bactérias do gênero Mycobacterium não se corarem
pelo método de Gram. Aproveite para descrever quais os procedimentos
utilizados para a visualização desse gênero.
Leitura
http://www.fop.unicamp.br/microbiologia/aulas/morfologia_citologia_bacteria-
na.pdf
http://www.forp.usp.br/restauradora/calcio/citolog.htm
http://br.geocities.com/pri_biologiaonline/estrutura_celula_bacteriana.html
http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia/morfologia1/morfologia1.html
http://www.dec.ufcg.edu.br/biografias/HansChr1.html
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/ 115_03gram.pdf
http://www.egasmoniz.edu.pt/ficheiros/alunos/anos_anteriores/microbiologia/
pratica/CAPITULO02.pdf
Referências
MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M ., PARKERT, J. Microbiologia de Brock.
PELCZAR, J. P., CHAN, E. C. S., KRIEG, N. R. Microbiologia Conceitos e
aplicações. Volume 1. 2. ed. São Paulo: Makron Books,1996.
RIBEIRO, M. C., SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática. 1. São Paulo:
Atheneu, 2002.
SOARES, J. B.; CASIMIRO, A. R. C; ALBUQUERQUE, L. M. B. Microbiolo-
gia Básica. 1. ed. Fortaleza: Edições UFC, 1987.
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. Microbiologia. 10. ed. Porto
Alegre: Artmed , 2012.
Capítulo 4
Preparo de meios de cultura
Objetivos
l Conhecer a classificação dos meios de cultura.
l Identificar as etapas de preparo dos meios de cultura.
l Descrever os fatores que podem interferir na preparação dos meios de cultura.

l Fita de pH;
l Balança semi-analítica;
l Tampão de algodão;
l Lamparina e fósforo;
l Caneta para identificação de vidrarias;
l Meio de cultura - pó desidratado;
l Erlemeyer;
l Béquer para pesagem do pó desidratado;
l Água destilada;
l Espátula.
Procedimentos da aula prática

l Executar as etapas para confecção de meios de cultura sólido e líquido.
Introdução
O cultivo dos micro-organismos em condições laboratoriais é pré-requisito
para seu estudo adequado. Para que isso possa ser realizado é necessário o
conhecimento de suas exigências nutricionais e dos fatores físicos e/ou am-
bientais requeridos.
Assim, os meios de cultivo, também chamados meios de cultura são
utilizados com o propósito de fornecer as condições nutricionais mínimas para
o cultivo artificial de micro-organismos.
Os meios de cultura devem conter todas as substâncias exigidas pe-
los micro-organismos para o seu crescimento e multiplicação. Para que os
micro-organismos possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva de-
vem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio
(peptonas) e outras fontes de energia. São também necessários alguns sais
inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento.
Certos micro-organismos crescem na maioria dos meios de culturas

(como a Escherichia coli), outros necessitam de meios especiais, por isso são
chamados de fastidiosos (como as bactérias do gênero Streptococcus que
necessitam de meios contendo sangue em sua composição), e existem ain-
da aqueles que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já
desenvolvido (como o Treponema pallidum). Os meios de cultura devem ser
utilizados para os seguintes propósitos:
l Promover o crescimento e isolamento de micro-organismos;
l Pesquisar as características bioquímicas;
l Conhecer as necessidades nutritivas;
l Estudar as morfologias das colônias;
l Pesquisar o perfil de susceptibilidade dos micro-organismos às drogas an-
timicrobianas.
1. Classificação dos meios de cultura

Os meios são classificados quanto à consistência, função, composição,
natureza e pH.
1.1 Quanto à consistência

A consistência de um meio está diretamente relacionada com a presença
e a concentração de um agente solidificante, como o ágar. Baseando-se
nisso, os meios podem ser classificados como:
Líquidos: Não possuem agentes solidificantes em sua composição. São uti-
lizados principalmente para promover crescimento da cultura, replicação da
amostra, provas bioquímicas e estudos de fermentação. Também são chama-
dos de caldo. Ex.: Caldo Tioglicolato e BHI Caldo.
Semi-sólidos: Possuem baixa concentração de ágar, em torno de 0,075% a
0,5%. Esse tipo de meio permite verificar a motilidade dos micro-organismos,
crescimento em tensões variadas de oxigênio ou estocagem. Ex.: Meio SIM
(sulfeto indol motilidade).
Sólidos: Possuem agente solidificante em uma concentração aproximada de
0,5% a 2% (ou mais comumente 15 g/L de ágar). A principal característica
desse tipo de meio é permitir o isolamento dos micro-organismos presentes
na amostra, além de possibilitar uma análise mais delicada da morfologia da
colônia. Ex: Ágar Batata Dextrose.
O que é o ágar?
O ágar é um hidrocolóide extraído de algas marinhas vermelhas da classe Ro-
dophyta (Ahnfeltia spp., Gracilaria spp. e Gelidium spp.) largamente utilizado na
indústria alimentícia e farmacêutica. Dentre as suas principais propriedades,
as temperaturas de fusão (94 ºC) e solidificação (42 ºC) são bem definidas.
Assim, o mesmo é adicionado ao meio de cultura líquido para torná-lo sólido.
Salienta-se que o ágar é apenas um agente solidificante, nunca sendo
adicionado ao meio de cultura como nutriente, pois, em geral, não consegue
ser utilizado pelos micro-organismos.
1.2 Quanto à função

Os meios podem ser utilizados com diversos propósitos, como por exemplo,
promover o crescimento e/ou o isolamento dos micro-organismos, conhecer
as necessidades nutritivas dos mesmos, pesquisar características bioquími-
cas e o perfil de susceptibilidade a antibióticos, entre outros. Eles podem ser
classificados em:
Seletivos: Favorecem o crescimento do organismo de interesse impedindo o
crescimento de outros micro-organismos. Ex.: ágar MacConkey.
Diferenciais: Possibilitam identificar a presença dos micro-organismos de
interesse, pois provoca reações características nos mesmos, funcionan-
do, assim, como meios de identificação presuntiva. O ágar sangue, por
exemplo, é frequentemente utilizado para a identificação de bactérias
com padrões hemolíticos (que destroem células sanguíneas pela ação
de hemolisinas), como Streptococcus pyogenes.
Enriquecimento: Utilizados quando o microrganismo de interesse está em
baixo número na amostra, estimulando o crescimento dos mesmos e possi-
bilitando sua detecção. Outra função desses meios é a de nutrir organismos
fastidiosos, ou ainda recuperar uma cepa, promovendo seu rápido cresci-
mento. Geralmente são meios basais adicionados de produtos biológicos
ricos em nutrientes, como soro, sangue ou ovo. São exemplos os meios BHI
(infusão de cérebro e coração), ágar sangue e ágar chocolate.
Redutores: Utilizados no cultivo de micro-organismos anaeróbicos, contêm
substâncias em sua composição que são capazes de reagir com oxigênio
dissolvido no mesmo e eliminá-lo. Um dos reagentes utilizados para esse
fim é o tioglicolato de sódio.
Transporte: servem para o transporte de uma dada amostra biológica que se
deseja isolar micro-organismos. São importantes por manterem a viabilida-
de das amostras, porém evitam que haja multiplicação de micro-organis-
mos durante aproximadamente 72 horas. O meio de Stuart é um exemplo
clássico, muito usado por laboratórios de análise microbiológica.
1.3 Quanto à composição

Sintético ou Quimicamente definido: é quando sua composição e concen-
tração de cada um dos seus componentes é conhecida. São compostos por
produtos químicos bem definidos, e quando dissolvidos em água destilada,
formam uma solução nutritiva devidamente tamponada.
Complexo: a composição química pode conter variações, sendo compostos
por uma variedade de substâncias de origem animal (carne, peptona, bile
bovina), vegetal (ceras, extratos vegetais) ou microbiana (extrato de levedu-
ra). São exemplos o ágar Lactrimel e ágar BHI.
1.4 Quanto à natureza

Animados: São constituídos de células vivas, como, por exemplo, tecidos ou
ovos embrionários.
Inanimados: Possuem apenas moléculas inorgânicas em sua composição,
podendo ser classificados como naturais, ou seja, constituídos por substân-
cias provenientes da natureza, ou sintéticos, quando formado por substâncias
químicas produzidas em laboratório.
1.5 Quanto ao pH
Tamponado: Para que não haja variação de pH, em consequência da
eliminação de metabólitos ao meio, alguns meios são acrescidos de tam-
pões. Um exemplo é o meio RPMI, que ao ser preparado apresenta pH em
torno de 7,9, sendo tamponado com MOPS [ácido 3-(N-morfolino propano
sulfônico)], para atingir pH 7.
Não tamponado: Não são acrescidos de tampões, embora alguns constituin-
tes como a peptona e os aminoácidos possam funcionar como tais.
2. Preparo de meio de cultura

A maioria dos meios de cultura usada num laboratório de Microbiologia é dis-
ponível em forma de pós desidratados (figura 2), os quais contêm todos os
componentes desejados, sendo necessário somente a adição de água para
posterior esterilização. Os meios de cultura estão constantemente sendo
desenvolvidos ou atualizados visando otimizar e facilitar a identificação dos
micro-organismos.
Os meios de cultura são preparados e armazenados seguindo rigoroso
controle de qualidade. Entretanto, para que sejam mantidas todas as suas
propriedades nutricionais, garantida a esterilidade até o momento de sua utili-
zação e o crescimento dos micro-organismos desejados, é necessário proce-
der cada etapa de seu preparo criteriosamente. A seguir encontram-se lista-
das as etapas do preparo do meio de cultura desidratado:
l Pesagem do pó, geralmente orientada pelo próprio fabricante e condiciona-

da à quantidade final de meio necessária;
l Diluição do pó em quantidade adequada de água destilada;
l Distribuição em tubos ou placas para posterior autoclavação ou realiza-se a
autoclavação em uma outra vidraria, como um Erlenmeyer, e então, proce-

de-se à distribuição em tubos ou placas previamente esterilizados;
l Análise e possível correção do pH;
l Distribuição do meio em tubos ou placas, caso este não tenha sido autocla-
vado nos mesmos.
l Armazenamento do meio em condições adequadas que permitam a manu-
tenção das suas propriedades nutricionais e a garantia da sua esterilidade
até o momento da utilização.
Inoculando um micro-organismo em um meio de cultura que possua
todos os requisitos nutritivos necessários e fatores ambientais favorecidos o
microrganismo inicia seu desenvolvimento neste meio, passando pelas diver-
sas fases da curva de crescimento, desde a fase de latência, logarítmica, es-
tacionária, até a fase da morte (figura 1).
Figura 1 – Padrão típico de crescimento de uma cultura bacteriana em um siste-

ma fechado.
Fonte: www.ucg.br
Figura 2 – Diversos meios de cultura.

Fonte: www.hiedia.com
1. Esquematize as etapas de preparo de um dos meios utilizados na aula prá-
tica e faça a classificação desse meio quanto aos cinco critérios descritos
na introdução desta aula.
2. Durante o preparo de um meio de cultura, um microbiologista ausentou-se
do laboratório, deixando o meio de cultura preparado em cima da bancada.
Ele assim o fez, pois sabia que, ao voltar, iria autoclavar o mesmo, ou seja,
embora o tenha deixado exposto, o processo de autoclavação iria eliminar
qualquer microrganismo presente. O modo de proceder do microbiologista
está correto? Justifique claramente citando, pelo menos, dois aspectos.
3. Explique a diferença entre os meios de cultura ágar sangue e ágar chocola-
te, por que é preferível usar sangue de carneiro ao invés de sangue huma-
no em meio ágar sangue, e por que o meio de cultura Mac Conkey é dito
seletivo diferenciador e o ágar Sangue é dito enriquecedor diferenciador?
4. Observe a receita de um meio de cultura descrito por Dahmen em 1943:
“Cozinhar 500 gramas de carne sem tendões nem gordura em um litro de
água durante 2 horas e meia. Filtrar. Adicionar peptona e sal. Cozinhar du-
rante outras duas horas. Distribuir em tubos ou balões e esterilizar por três
dias consecutivos”. A partir dessa descrição:
l Classifique esse meio quanto a composição, função, consistência e natureza.
l Discuta sobre qual técnica de esterilização o autor está se referindo no
seu relato.
5. Cite e explique duas metodologias que podem ser utilizadas quando um

micro-organismos não consegue crescer em meios de cultura artificial.
Leitura
www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_4_2004.pdf
www.microbiologia.ufba.br/aulas/MEIOS%2520DE%2520CULTURA.doc+me
io+semi+s%C3%B3lido+agar&cd=5&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br
www.ucg.br/ACAD_WEB/professor/siteDocente/admin/arquivosUpload/3909/
material/MEIOS%20DE%20CULTURA.pdf
www.mbiolog.com.br/micro_macconkey.asp
www.mbiolog.com.br/micro_sabouraud.asp
www.biocendobrasil.com.br/meio_MacConkey.asp
www.biocendobrasil.com.br/placa_AgarSangue.asp
Referências
RIBEIRO, M. C., SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática. 1. ed. São
Paulo: Atheneu, 2002.
Capítulo 5
Técnicas de semeadura primária
Objetivo
l Identificar e executar as etapas de técnicas de semeadura em meios sóli-
dos; semi-solídos e líquidos.

l Bico de Bunsen ou lamparina, fósforo
l Cepas bacterianas
l Caneta para identificação de vidrarias
l Meio de cultura sólido, semi-sólido e líquido
l Alça de platina e Swab
l Solução salina estéril ou caldo BHI

l Estante para tubo de ensaio
l Estufa bacteriológica
l Placa de Petri ou tubo de ensaio

l Executar as etapas das seguintes técnicas de semeadura:
l em meios sólidos
l em meios líquidos
l em meios semi-sólidos
Introdução
Os micro-organismos na natureza normalmente existem em cultura mistas,
com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente. Para determi-
nar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura,
ou seja, todas as células na população são idênticas no sentido de que elas
se originaram de uma mesma célula parental.
Em laboratório, os micro-organismos são cultivados ou desenvolvidos
em material nutriente denominado meio de cultura. O material a ser analisado
é semeado no meio de cultura e o processo de inoculação pode ser feito me-
diante técnicas de semeadura.
1. Técnicas de Semeadura Primária

Após a escolha do meio de cultura, o próximo passo que conduzirá ao cultivo in
vitro de um microrganismo é a escolha da técnica de inoculação ou semeadura.
Essas técnicas variam de acordo com o material biológico a ser anali-
sado, tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras
devem ser seguidas nas inoculações:
l A agulha, o garfo e a alça de níquel-cromo (ou de platina) devem ser esteriliza-
dos por flambagem antes e após qualquer cultivo, ou seja, devem ser aqueci-
dos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen. Havendo sempre
o cuidado de esfriá-las antes de introduzí-las na amostra a ser semeada;
l Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou
rasgar meios de cultura sólidos, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias
neste setor do meio, além de alterar as condições de crescimento bacteriano;
l Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de
Bunsen ou da lamparina, ou ainda em fluxo laminar;
l A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada e antes da
colocação da tampa. A tampa dos tubos deve ser mantida segura pelo dedo
mínimo da mão que manipula a alça durante a inoculação;
l As tampas dos tubos e placas nunca devem ficar sobre as bancadas du-
rante os processos de manipulação. Este ato facilita uma possível contami-
nação dos tubos ou placas, consequentemente, das amostras.
1.1 Técnicas de Semeadura Primária em meios sólidos

l Técnica de Esgotamento ou em Quadrantes
A maioria dos materiais infecciosos e espécimes biológicos (amos-
tras de solo, água e alimentos), apresentam grande variedade de micro-or-
ganismos. Quando amostras destes materiais são semeadas na superfície
de meios de cultura sólidos, várias colônias desenvolver-se-ão, originadas de
cópias exatas de uma única célula. Normalmente as colônias microbianas
podem apresentar características morfológicas diferentes permitindo distin-
guir os micro-organismos. Para isto, a distribuição uniforme das bactérias é
essencial para permitir a visualização das colônias individualizadas na placa.
O trabalho bacteriológico normalmente necessita de culturas puras para
a realização de análises. O método mais comumente utilizado para tanto é o
método de semeadura por esgotamento.
Técnica:
l Identificar a placa de Petri na base (fundo);
l Flambar a alça de platina;
l Introduzir a alça esterilizada no tubo contendo a amostra a ser analisada;
l Dispensar o conteúdo da alça e fazer o espalhamento do material na placa
com meio de cultura (ver figura 1);
l Flambar novamente a alça de platina, deixando-a pronta para novo uso.
O sucesso desta técnica está em:
l Grande número de estrias;
l Não perfurar o meio;
l Não voltar alça sobre a estria já inoculada;
l Selecionar pequena quantidade de material para semear.
Figura 1 – Técnica de esgotamento. Adaptado de http://www.fop.unicamp.br/
l Técnica Quantitativa
Esta técnica é utilizada para isolar e quantificar as colônias de micro- 9
A alça não deve ser
organismos. É essencial que se use um inóculo conhecido através do uso de recarregada no momento da
troca da direção das estrias
uma alça de platina9 calibrada. de inoculação.
l Técnica:
l Identificar a placa de Petri na base;
l Flambar a alça de platina;
l Introduzir a alça esterilizada perpendicularmente na amostra previamente
homogeneizada;
l Dispensar o conteúdo da alça e fazer o espalhamento do material na placa
com meio de cultura (ver figura 2).
l Flambar novamente a alça de platina, deixando-a pronta para novo uso.
O sucesso desta técnica está em:

l Não perfurar o meio;
l Não voltar à alça de platina sobre a estria ;
l Selecionar apenas pequena quantidade de material para semear.
Figura 2 – Técnica quantitativa. Adaptado de www.fop.unicamp.br/
l Técnica em Tapete
Esta técnica é utilizada para que o crescimento bacteriano ocorra em
abundância e sem individualização de colônias. É usado principalmente para
a confecção de antibiograma.
Técnica:
l Identificar a placa de Petri na base;
l Mergulhar um swab estéril no inóculo;
Como fazer a manutenção l Remover o excesso de inóculo comprimindo o swab na parede do tubo;
das cepas-padrão? l Semear na superfície do ágar apropriado em diferentes direções.
Para manter as cepas
bacterianas do controle O swab, inicialmente, é passado na periferia do ágar dando uma volta
de qualidade em seu de 360°, sendo depois friccionado sobre toda a superfície do meio de cultura,
laboratório, você deverá girando a placa em um ângulo de 60° após cada aplicação para que ocorra
repicá-las, a cada 15
dias, em ágar nutriente. crescimento em toda a superfície do meio de cultura.
O controle da pureza das O sucesso desta técnica repousa em:
cepas bacterianas deverá
ser realizado a cada 2
l Swab sem excesso de inóculo;
meses. As cepas deverão l Não perfurar o meio;
ser repicadas em placas
(método do esgotamento
l Semear todo o meio uniformemente.
por estrias) e identificadas
segundo procedimentos l Técnica em Ágar Inclinado
microbiológicos tradicionais. Técnica muito utilizada para o isolamento de micro-organismos e reali-
zação de testes bioquímicos.
l Técnica:
l Mergulhar a alça de platina flambada na cultura bateriana e/ou inóculo que
lhe é apresentado;
l Encostar levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba
fazendo estrias na superfície do ágar, conforme figura 3:
Figura 3 – Técnica em ágar

inclinado. Adaptado de
http://www.fop.unicamp.br/
1.2 Técnicas de Semeadura Primária em meios semi-sólidos

Este tipo de meio de cultura é utilizado quando se quer determinar de forma
indireta a motilidade. Para tanto, o meio de cultura deve conter uma baixa
concentração de ágar.
l Técnica:
l Inocular a agulha de platina em linha reta no meio de cultura;
l Em seguida, deve-se incubar a 37 ºC por 18 a 24 h na estufa bacterioló-
gica (figura 4).
Figura 4A – Bactéria semeada em ágar SIM. No

tubo à direita só se detecta crescimento na estria
de inoculação (bactéria imóvel); no tubo à es-
querda percebe-se crescimento difuso (bactéria
móvel).
Fonte: KONEMAN et al., 2001
1.3 Técnicas de Semeadura Primária em meios líquidos

Os meios líquidos são usados quando não existe a necessidade da contagem
de células microbianas e/ou quando a quantidade de micro-organismos da
amostra é pequena e deseja-se estimular o crescimento.
l Técnica:
l Inocular uma alça de platina flambada, contendo o material a ser semeado,
Importante: Sempre deixe
no tubo de ensaio contendo o meio de cultura líquido (figura 5); o material próximo à chama
l Agitar o tubo, incubar e observar o crescimento bacteriano para evitar contaminação
externa.
Figura 4B – Técnica de semeadura em meio líquido. Bactéria semeada em caldo BHI.

Notar que o tudo da direita está turvo, evidenciando intenso crescimento bacteriano.
Fonte: KONEMAN et al., 2001. Com adaptações.
1. Esquematize os resultados das técnicas realizadas em aula prática.
2. A inoculação de uma amostra por uma determinada técnica de semeadura
depende de diversos fatores. Supondo que você tenha uma amostra a ser
semeada, porém em quantidade muito pequena. Qual o procedimento mais
adequado para semear a mesma? Por quê?
3. Explique como se analisa o resultado obtido nos crescimentos dos meios
semi-sólido e líquido?
4. Durante uma aula prática de microbiologia, uma aluna, ao executar a técnica
de esgotamento, perfurou um meio sólido em placa com a alça de platina.
Quais as possíveis consequências desse descuido? Explique claramente.
5. Um aluno de iniciação cientifica suspeita que um de seus tubos de ensaios
contendo amostras de sua pesquisa foi contaminado. Seu orientador disse
que deveria passar para outro meio de cultura para verificar. Qual o tipo de
meio de cultura (sólido, líquido, semi-sólido) e qual a técnica de semeadura
primária ele deve utilizar? Explique.
Referências
RIBEIRO, M. C., SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática. 1. Ed. Athe-
neu, 2002.
http://www.fop.unicamp.br/microbiologia/aulas/isolamento.pdf
Capítulo 6
Visualização do Crescimento
Bacteriano e Provas Bioquímicas
Objetivos
l Verificar a presença ou ausência de crescimento bacteriano em diferentes
meios de cultura.
l Diferenciar o crescimento bacteriano nos meio de cultura sólidos, líquidos e
semi-sólidos.
l Identificar as principais características das culturas bacterianas;
l Caracterizar e diferenciar as colônias de acordo com as características ma-
croscópicas.
l Identificar e executar os testes bioquímicos para detecção das enzimas ca-
talase e coagulase.
l Relacionar as características enzimáticas do micro-organismo com a iden-
tificação da sua espécie.

l Bico de Bunsen ou lamparina
l Cepas bacterianas em placa de Petri e em tubos de ensaio
l Alça de platina
l Lâminas de microscopia limpas

l Peróxido de hidrogênio (água oxigenada 10 volumes)
l Plasma
l Solução salina estéril.

l Após a etapa de incubação, as placas de Petri e os tubos de ensaio devem ser
examinados para verificar se existe crescimento de algum microrganismo;

l Ao identificar macroscopicamente as colônias, selecionar as que estive-
rem isoladas e analisá-las quanto às características morfológicas;
l Realizar provas bioquímicas indicadas para cada grupo microbiano.
Introdução
Os micro-organismos necessitam tanto de condições nutricionais como de
fatores ambientais específicos, tais como temperatura, pH e concentração de
ar adequada para que ocorra seu crescimento in vitro.
Nesse sentido após a inoculação de espécimes clínicos e/ou biológicos
nos meios de cultura e sua posterior incubação em estufas bacteriológicas, ini-
cia-se o desenvolvimento dos micro-organismos.
Nas bactérias o processo ocorre por fissão binária, onde a célula sofre
aumento gradual, seguido de partição equitativa, originando duas células. O
crescimento de micro-organismos em um recipiente fechado permite a cons-
trução de uma curva de crescimento típica conforme a figura 1.
O início e o término de cada uma das fases são mediados por reações
químicas e fisiológicas desencadeadas pelo aumento da população inicial,
outro fator que também influencia a mudança dessas fases é o nutriente.
Essa curva pode ser dividida em várias fases distintas e denominadas:
Figura 1 – Curva de crescimento microbiano.

Fonte: www.unb.br/ib/cel/microbiologia/
Fase Lag ou de adaptação: Caracterizada por intensa atividade metabólica,

porém com pouca ou nenhuma divisão celular.
Fase Log ou Exponencial: Esta fase é o período de maior atividade meta-
bólica. A reprodução ocorre de forma intensa e o tempo de geração assume
um valor constante, originando a formação de um grupamento de bactérias da
mesma espécie, que é denominado colônia. Esta pode ser visualizada sem
o auxílio do microscópio, e pode auxiliar nas identificações preliminares dos
micro-organismos.
Fase Estacionária ou de equilíbrio: Após a fase Log, o crescimento micro-

biano sofre decréscimo, havendo então equilíbrio entre o número de novas
colônias e as que morrem. Sugere-se que isso se deve a diversos fatores,
como escassez de nutrientes ou acúmulo de metabólitos.
Fase de Morte Celular ou de declínio: Neste período, o número de células
mortas excede o de células novas, ou seja, a população sofre decréscimo que
pode se estender até que toda a população morra ou somente até diminuir
significativamente o número de indivíduos (TORTORA et al., 2004).
1. Características macroscópicas das colônias bacterianas

O isolamento e a identificação de bactérias provenientes do ambiente, pes-
soas ou alimentos contaminados é uma prática de rotina em laboratórios e
indústrias pelo mundo a fora.
Essa identificação começa com o isolamento dessas bactérias em cul-
turas puras, utilizando placas ou tubos, sendo baseada primeiramente em ca-
racterísticas macroscópicas, como o tamanho da colônia, a forma, os bordos,
o odor e a pigmentação produzida pela bactéria.
Junto com as características macroscópicas temos também as carac-
terísticas bioquímicas, sorológicas e imunológicas que auxiliam na correta
identificação do micro-organismo.
As características que os micro-organismos apresentam ao crescer nos
meios de cultura são expressões fenotípicas do material genético e, portanto,
muito úteis na sua identificação, embora muitas vezes sejam consideradas de
importância secundária e utilizadas apenas na identificação preliminar, sendo
necessário provas complementares.
Também, devemos lembrar que as características morfológicas da uma
mesma espécie podem variar fenotipicamente dependendo do meio de cul-
tura no qual a mesma encontra-se semeada, o que muitas vezes pode in-
viabilizar sua identificação. Por isso não se devem ser utilizadas como única
parâmetro de identificação.
Finalmente, antes de se determinar as características macroscópicas
de uma colônia, é preciso ter certeza de que a colônia está pura, isto é, sem
outros micro-organismos presentes. Como cada espécie possui um tipo mor-
fológico diferente (forma, tamanho, borda, elevação), em um meio de cultura,
quando observadas apenas colônias de características iguais, provavelmente
estamos diante de uma cultura pura; já vários tipos de colônias em uma mes-
ma placa, caracterizam uma cultura mista.
1.1 Avaliação das colônias bacterianas

A avaliação das características macroscópicas é feita por meio de inspeção
visual, num local com boa luminosidade, suspendendo a placa de Petri em
uma mão e observando a superfície do meio de cultura em busca do cresci-
mento bacteriano. As principais características macroscópicas que devem ser
observadas são:
Tamanho: Bordos:
a) Pequena: diâmetro (d) < 1 mm. a) Lisos regulares
Ex: Streptococcus spp. b) Irregulares
b) Média: 1< d < 4 mm c) Dentados
c) Grande: d > 4 mm. d) Com prolongamento
Ex: Staphylococcus spp.
Odor:
Densidade: a) Água sanitária: Haemophilus in-
a) Opaco. Ex: Enterococcus spp. fluenzae e Shigella spp.
b) Transparente b) Fermento de pão: Klebsiella
pneumoniae
c) Translúcido
c) Vinagre: Escherichia coli
Consistência:
d) Queijo: Staphylococcus aureus
a) Brilhante. Ex: Haemophilus spp.
e) Terra: Streptomyces sp. e Nocar-
b) Cremoso. Ex: Staphylococcus aureus dia spp.
c) Seco. Ex: bacilos difteróides f) Peixe: Acinetobacter spp.
d) Mucóide: Ex: Klebsiella spp. g) Caramelo: Enterococcus spp.
Forma: h) Uva: Pseudomonas aeuroginosa
a) Ponto Produção de pigmento no meio:
b) Circular a) Cor verde: Pseudomonas aerugi-
c) Filamentosa nosa
d) Irregular b) Cor vermelha: Serratia marcens-
e) Rizoidal cens
f) Fuso
Padrões hemolíticos (em meio Ágar Sangue):
a) Beta-hemolíticos: produzem a beta-hemolisina que causa a lise total das he-
mácias, promove o aparecimento de uma zona clara ao redor das colônias.
b) Alfa-hemolíticos: produzem uma substância denominada alfa-hemolisina
que reduz a hemoglobina à metahemoglobina, causando, assim, apenas
hemólise parcial; esta redução resulta no aparecimento de uma zona es-
verdeada ao redor das colônias.
c) Gama-hemolíticos: as bactérias não têm nenhum efeito aparente sobre

as células vermelhas do sangue do meio, assim, fala-se em ausência de
hemólise; o meio permanece integro ao redor das colônias.
Padrões difundíveis:
a) Difunde no meio
b) Não difunde no meio
Figura 2 – Exemplo de morfologia das colônias
2. Provas bioquímicas
Após realizadas as etapas de identificação presuntiva das colônias presentes
na placa, o passo seguinte para a identificação de uma bactéria é dado pelo
estudo do seu perfil bioquímico. Para que seja dada essa continuidade é cru-
cial a utilização de culturas puras, pois a presença de outro microrganismo
pode mascarar o resultado.
Podemos realizar uma série de testes, optando por aquele que nos pa-
rece mais adequado.
Por exemplo, pesquisar aspectos enzimáticos fundamentais para o me-
tabolismo de alguns gêneros e espécies de bactérias, tais como a presença
ou ausência das enzimas urease, DNAse, catalase, coagulase, endonuclea-
se, bem como resistência a antibióticos como a novobiocina, e capacidade de
fermentação de diversos açucares como o manitol.
Para identificação de Staphylococcus spp. os primeiros testes a serem
realizados são catalase e coagulase.
2.1 Prova da catalase

É um teste de identificação primária utilizado para diferenciar os cocos Gram
(+) dos gêneros Staphylococcus, Streptococcus e Enterococcus.
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio
(H2O2) em água e oxigênio. Trata-se de uma hemoproteína com estrutura si-
milar à hemoglobina. A não ser pelos estreptococos, a maioria das bactérias

aeróbias e anaeróbias facultativas decompõem o H2O2 através de peroxida-
ses semelhantes à catalase.
O peróxido de hidrogênio é formado como um dos produtos finais de
oxidação do metabolismo aeróbio dos carboidratos. O acúmulo é letal para
as bactérias.
A catalase converte o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, se-
gundo a seguinte reação:
Catalase
H2O2 H2O + O2
Figura 3 – Teste da catalase em

Staphylococcus aureus
Fonte: http://student.ccbcmd.edu/
Metodologia
1. Com o auxílio da alça de platina flambada, transferir um fragmento da colô-
nia para a superfície de uma lâmina limpa e identificada;
2. Adicionar um pouco de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) sobre o
fragmento da colônia que encontra-se na superfície da lâmina ou direta-
mente sobre as colônias crescidas no meio de cultura.
3. Aguardar alguns segundos e interpretar os resultados.
Resultado
O rápido aparecimento e produção sustentada de bolhas de gás ou eferves-
cência constituem uma reação positiva. Como algumas bactérias possuem
outras enzimas que não a catalase e que podem decompor o peróxido de
hidrogênio, a observação de umas poucas bolhas pequenas após 20 ou 30
segundos não é considerada como resultado positivo.
2.2 Prova da coagulase

A coagulase é uma enzima de composição química desconhecida, com ati-
vidade similar à protrombina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina,
resultando na formação de um coágulo visível. Acredita-se que, in vivo, a co-
agulase produza uma barreira de fibrina no local da infecção estafilocócica,
dificultando a atividade de drogas anti-microbianas.
A prova da coagulase é utilizada para identificar Staphylococcus aureus

e diferenciá-la de outras espécies do gênero.
A coagulase é encontrada sob duas formas, livre e conjugada, que pos-
suem diferentes propriedades e requerem o uso de diferentes procedimentos
de ensaio para detecção.
Coagulase conjugada: prova realizada em lâmina, simples e rápida. A coagu-
lase conjugada, também conhecida com fator de aglutinação, encontra-se
unida à parede celular bacteriana e não está presente nos filtrados de culti-
vos. Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio),
formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a
forma de grumos visíveis (figura 4).
Coagulase livre: prova realizada em tubo; A coagulase livre é uma substância
similar à trombina e está presente nos filtrados de cultivos. Quando uma
suspensão em plasma do micro-organismo produtor de coagulase é prepa-
rada em tubo de ensaio forma-se um coágulo visível, resultante da reação
da coagulase com uma substância do soro (fator de reação com a coagula-
se), um complexo que, por sua vez, reage com o fibrinogênio para produzir
o coágulo de fibrina.
Figura 4 – Teste coagulase negativo (A) e

positivo (B).
Fonte: http://ssmmid.org/staphylococci/
Metodologia: de detecção da coagulase conjugada

1. Colocar uma gota de soro fisiológico ou de solução salina sobre uma lâmina
limpa e corretamente identificada;
2. Com o auxílio de uma alça platina flambada, transferir um fragmento da
colônia para a superfície da lâmina;
4. Dissolver completamente o fragmento da colônia no soro fisiológico estéril
ou na solução salina, até formar uma solução bem leitosa e homogênea;
5. Colocar ao lado do homogenato um pouco de plasma e misturar os dois fa-
zendo movimentos rotatórios na lâmina até a junção completa de ambos.
Resultado:
A reação positiva deve ser detectada em 10 a 15 segundos, após a mistura do
plasma com a suspensão, pela formação de um precipitado branco e aglutina-
ção dos micro-organismos da suspensão. A prova é considerada negativa se
não for observada aglutinação ao término de 2 minutos. As cepas coagulase-
-positivas podem ser informadas como Staphylococcus aureus. Esta
prova é considerada presuntiva, já que algumas cepas de S. aureus podem
não produzir a coagulase (cerca de 97% dos S. aureus são coagulase positi-
vos) e outras que produzem lentamente.
2.3 Fermentação de açucares

Os padrões de reação a esse teste fazem parte integrante de muitos esquemas
de identificação de enterobactérias e também servem como valioso controle de
qualidade para a confirmação das reações observadas em outros meios.
O meio de cultura ágar Tríplice-Açúcar-Ferro (TSI) é especialmente útil
na identificação de bacilos Gram (-) presentes em meios de isolamento primá-
rio. Utilizado na diferenciação de enterobactérias (todas fermentam a glicose)
dos BGNNFG (não fermentam a glicose) e também auxilia na diferenciação
de vários membros de enterobactérias. Este meio possui os açúcares (glico-
se, lactose e sacarose) e sulfato ferroso.
Através desse teste, podemos analisar a capacidade da bactéria em
fermentar ou não esses açúcares, além da propriedade em produzir H2S e
gás de glicose.
Procedimentos
1. Semear a bactéria na superfície do ágar TSI;
2. Incubar o tubo a 35 – 37 °C por 18 a 24h na estufa bacteriológica;
3. Analisar as alterações ocorridas no meio de cultura (figura 5).
Resultados
ÁPICE BASE INTERPRETAÇÃO
Alcalino Alcalina Ausência de fermentação dos carboidratos. Característica das bactérias não-fermentado-
(vermelho) (vermelho) ras, como P. aeruginosa.
Alcalino Ácida Glicose fermentada. Lactose e sacarose não fermentadas. Características de bactérias não
(vermelho) (amarela) fermentadoras de lactose, tais como Shigella.
Alcalino Glicose fermentada. Lactose e sacarose não fermentada; Produção de H2S. Características
Negra
(vermelho) de algumas espécies tais como Salmonella.
Ácido Ácida Glicose, sacarose e lactose fermentadas. Características de coliformes fermentadores de
(amarelo) (amarela) lactose, tais como E. coli.
Figura 5 – Possíveis resultados do teste de fermen-

tação de açúcar.
Fonte: KONEMAN et al., 2001.
1. Classifique uma colônia de sua placa de Petri quanto aos critérios apre-
sentados na aula prática e descreva os resultados das provas bioquímicas
executadas no laboratório.
2. Um aluno foi pedir uma nova correção de sua prova, pois não entendia o
que tinha errado. O mesmo escreveu a seguinte afirmativa na prova: Não é
necessário isolar as colônias bacterianas para identificá-las, uma vez que
mesmo em cultura mista podemos visualizar as características macroscó-
picas e estas são as únicas utilizadas para identificar uma bactéria. Supon-
do que você seja o professor, explique o que o aluno errou, corrigindo-o,
aproveitando para explicar a utilidade de isolar uma colônia bacteriana an-
tes de identificá-la.
3. A consistência e a forma das colônias de determinadas espécies bacteria-
nas é diretamente relacionada à presença de algumas estruturas citológi-
cas. Assim, caracteristicamente cepas de Klebsiella pneumoniae possuem
consistência mucóide, enquanto que espécies de Proteus spp. desenvol-
vem colônias com formato de ondas ou nuvens. Descubra quais são as
estruturas presentes nessas bactérias que são responsáveis por esses
achados macromorfológicos típicos.
4. Quais os principais testes bioquímicos necessários para identificação de
enterobactérias? Descreva o princípio de 2 deles.
5. Discorra sobre as diferenças entre os meios TSI e KIA e cite seus principais usos.
Leitura
Site do instituto de Química de São Carlos
www.iqsc.usp.br:8181/iqsc/ensino/graduacao/disc_online/bacharel/microbio-
logia/crescimento-microbiano.ppt
http://www.microbelibrary.org/images/Johnson/HTMLpages/Catalase-Portu-
guese.htm
www.ccih.med.br/mod_5_2004.pdf
http://www.vetmed.wisc.edu/pbs/courses/bact/labmanual/c1coagulase.html
http://biosci.usc.edu/courses/2002-fall/bisc300.html
http://medic.med.uth.tmc.edu/path/coag.htm
Referências
RIBEIRO, M. C., SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática. 1 ed. São
TORTORA, G. J., FUNKE, B.R., CASE, C. L. Microbiologia. 10. ed. Porto
Capítulo 7
Eficácia do calor no
crescimento microbiano
Objetivos
l Observar o efeito do calor sobre os micro-organismos.
l Demonstrar que alguns micro-organismos são mais resistentes ao calor que
outros.
l Conhecer os equipamentos utilizados no processo de esterilização.
Materiais utilizados na prática

l Placas com meio de cultura
l Tubos de ensaio com inóculo bacteriano
l Alça bacteriológica e pinça metálica
l Manta Aquecedora
l Autoclave
l Estufa de bacteriológica
l Teste de esterilidade
l Canetas para identificação

l Dividir o fundo da placa de Petri contendo ágar-nutriente em 4 partes, iden-
tificar (nome da equipe) e marcar (0, 5, 10 e A);
l Espaço 0: Semear a cultura do micro-organismo com alça de platina no ¼
correspondente ao tempo = 0 na placa;
l Espaço 5: Colocar o tubo em banho-maria fervente durante 5 minutos. Reti-
rar e semear com alça de platina no ¼ correspondente (tempo = 5 minutos);
l Espaço 10: Colocar novamente o tubo no banho-maria, aguardar mais 5 mi-
nutos, retirar e semear com a alça de platino cont.¼ correspondente (tempo
= 10 minutos);
l Espaço A: Um tubo com o inóculo bacteriano terá sido submetido ao pro-
cesso de autoclavação por 15 minutos e disponibilizado na bancada para
cada equipe. Posteriormente, os alunos irão semear no espaço A.
•• Incubar a placa e o tubo de ensaio a 37 ºC durante 48 horas.
Saiba mais
Como realizar a autoclavagem?
• Inicialmente deve-se verificar o nível da água no interior da autoclave, o qual deverá
estar cobrindo a resistência elétrica (a troca de água do equipamento deve ser reali-
zada semanalmente).
• Acondicionar o material a ser autoclavado no cesto de amianto e fechar bem a tampa
da autoclave apertando diametralmente os parafusos ou rosetas, de modo a fechar
hermeticamente.
• Abrir totalmente a torneira de remoção de ar e vapor (válvula de escape) e ligar o
equipamento à rede elétrica. Quando o vapor começar a sair pela válvula de escape,
esperar 5 minutos para que haja remoção de todo ar residual e, em seguida, fechar a
válvula de escape.
• O manômetro começará a subir registrando o aumento da pressão. Quando a pressão
atingir 15 Ib/pol2 (1 atm) correspondendo a 121 °C, inicia-se o processo de esteriliza-
ção. Regula-se o dispositivo de aquecimento de modo que a temperatura permaneça
constante, juntamente com a pressão, o que se sabe pela estabilidade do ponteiro do
manômetro, cronometrando-se o tempo adequado para a esterilização (15 – 30 minu-
tos). Decorrido o tempo marcado, desligar o equipamento da rede elétrica, aguardan-
do que a pressão e a temperatura zerem espontaneamente.
• Retirar todo o material da autoclave, verificando a efetividade da esterilização através
de teste de esterilidade, e acondicionar o material esterilizado em locais adequados
para que não ocorra contaminação.
Introdução
Até agora estudamos assuntos relacionados com a visualização de micro-or-
ganismos e sua nutrição. Ou seja, descobrimos como identificá-los e fazê-los
crescer. Nesta aula e na seguinte, discutiremos os métodos mais usados no
controle dos micro-organismos.
O controle científico microbiano existe há pouco mais de um século, po-
rém, desde a antiguidade o homem desenvolve técnicas para conter o avanço
de bactérias e fungos em um dado material. Esse controle corresponde a um
dos principais objetivos dos microbiologistas experimentais e clínicos, bem
como uma batalha diária nos lares, hospitais, restaurantes e qualquer outro
local onde a higienização seja necessária.
Os métodos físicos incluem uso de calor, filtração, baixas temperatu-
ras, ressecamento, pressão osmótica, radiação, entre outros. O mais antigo e
conhecido agente de destruição de micro-organismos é o calor, e é sobre ele
que trataremos nessa aula.
A principal forma de controle do crescimento bacteriano corresponde à
esterilização, que geralmente se dá pelo emprego de métodos físicos como o
vapor e calor seco.
Para uma boa esterilização deve-se conhecer primeiro os métodos

existentes, assim como as melhores situações para sua utilização. Diversos
fatores afetam a eficiência dos vários procedimentos de esterilização. Obser-
var bem a metodologia, e realizá-la com bastante critério ajudará à obtenção
de uma esterilização eficaz.
1. Métodos de controle físicos

Métodos físicos são frequentemente utilizados para promover a descontami-
nação microbiana, a desinfecção e a esterilização. Os métodos-padrão em-
pregados para destruir ou remover micro-organismos indesejáveis correspon-
dem ao calor, a radiação e a filtração.
1.1 Calor úmido

12
Segundo Madigan
Autoclavação: A autoclavação é um tipo de esterilização12 que utiliza o va- (2010) ESTERILIZAÇÃO
por sob pressão a altas temperaturas para atingir seu objetivo. O procedi- é o processo de remoção
mento usual consiste em aquecer o vapor a uma pressão de 1,1 kg/cm3 (1 ou morte de todos os
atm), o que gera uma temperatura de 121 ºC. Nessa temperatura, o tempo organismos vivos e seus
vírus, de um meio de cultura.
necessário para promover uma esterilização é de 15 min. Observe que não é
a pressão que mata os micro-organismos, mas a alta temperatura que pode
ser atingida pelo vapor sob alta pressão.
A autoclavação pode ser realizada em meios de cultura, soluções, equi-
pamentos de transfusão e numerosos itens de que suportem altas temperatu-
ras e pressões, e não deve ser utilizada para óleos, pós, vidrarias calibradas,
como pipetas e balões volumétricos e artigos com fio de corte.
Tindalização: Certos meios de cultura e drogas químicas não podem ser
aquecidos além de 100 ºC sem serem afetados de maneiras adversas. Se,
contudo, suportarem a temperatura do vapor fluente é possível esterilizá-los
por esterilização fracionada. O processo envolve o aquecimento do material a 13
A eficiência do processo
100 ºC em três dias sucessivos, com períodos de incubação durante as fases de esterilização depende de
de incubação e, nas subsequentes exposições ao calor, às células vegetati- alguns fatores:
vas serão destruídas. • Os materiais devem ser
limpos antes do processo,
sendo adequadamente
1.2 Calor seco embalados.
• O tempo deve ser contado
Este método é reservado somente aos materiais sensíveis ao calor úmido. a partir do momento em que
Guarda suas vantagens na capacidade de penetração do calor e na não cor- a temperatura de 121 °C é
rosão dos metais e dos instrumentos cortantes, sendo, porém, um método atingida.
• A distribuição do material no
que exige tempo de exposição para alcançar seus objetivos, por oxidação dos interior da autoclave deve
componentes celulares. garantir que o vapor atinja
todo o material por igual.
Flambagem: Aquece-se até o rubro o material, principalmente fios de platina

e pinças, na chama do bico de Bunsen ou lamparina. A utilização do Bico de
Bunsen é essencial, pois visa à diminuição de micro-organismos no campo de
trabalho através do calor. Para isso, ele apresenta uma regulagem que torna
possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Micro-
biologia, deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura
e não forma fuligem. Uma chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é im-
portante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente,
já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são:
14
É imprescindível o controle
de qualidade nos processos l Zona neutra (zona fria, não sendo adequada para a flambagem);
de esterilização. Como se
l Zona redutora e Zona oxidante (zonas onde ocorre a combustão e, portanto,
trata de um processo que
inclui diversas variáveis devem ser usadas para a flambagem).
(tempo, temperatura, limpeza
prévia, conhecimento da
pessoa responsável pelo
processo etc), se qualquer
destas variáveis for
negligenciada, o processo
não será efetivo e o risco de
contaminação é eminente.
O controle deve ser realizado
através de métodos químicos
e bacteriológicos. Os Figura 1 – Zonas da chama
métodos químicos utilizam de um bico de Bunsen
uma fita especial que mostra,
através da mudança de cor, Estufa / Forno de Pasteur: Este tipo de esterilização é realizado a tempera-
se a temperatura desejada
foi atingida. Os métodos turas de 140 ºC a 180 ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em
bacteriológicos utilizam a estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente, em
bactéria chamada Bacillus temperatura suficientemente alta, leva a desnaturação e oxidação das prote-
stearothermophilus, que por ínas do micro-organismo, resultando na sua morte. A utilização do calor seco
ser produtora de esporos, é
uma eficiente indicadora da leva mais tempo que o calor úmido, sendo indicado para esterilizar vidrarias, e
qualidade do processo. instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor
da autoclave, além de materiais impermeáveis, como ceras, pomadas e óleos.
Para ser eficiente, este processo depende de:
l Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do
material;
l Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente emba-
lados;
l A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa
não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de
2 cm entre as caixas;
l O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do

material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida
novamente.
Figura 2 – Estufa de esterilização e secagem
Em um laboratório de Microbiologia, podem existir três tipos de estufa:

estufa bacteriológica, estufa de esterilização e estufa de secagem (figura 2 e 3).
A diferença básica repousa no controle da temperatura. Nas estufas bacterioló-
gicas e de esterilização a temperatura é controlada, já na estufa de secagem, a
temperatura não precisa ser controlada.
15
Radiação Ionizante
Vantagens:
Figura 3 – Estufa Bacteriológica
• Alto poder de penetração;
1.3 Radiação • Atravessa embalagens de
papelão, papel ou plástico;
A esterilização por radiação é um método que utiliza elementos, que penetram • O material que se esteriliza
na célula bacteriana alterando seu DNA de uma forma que impede sua proli- não sofre danos físicos ou
outros que podem ocorrer
feração. Existem dois tipos de esterilização por radiação: Radiação Ionizante15
nos demais processos.
e Radiação Não-ionizante. Desvantagens:
• Custo elevado;
Radiação Ionizonte: A radiação ionizante é um método de esteriliza- • Necessidade de pessoal
ção que utiliza a baixa temperatura, podendo ser utilizado em materiais especializado;
• Necessidade de controle
termosensíveis.A ação antimicrobiana dessa radiação se dá através de alte- médico constante para o
ração da composição molecular das células, modificando seu DNA, sofren- pessoal que trabalha.
do as células perda ou adição de cargas elétricas.
Existem fatores ambientais, físicos e alguns compostos que influenciam

na resposta celular à radiação, aumentando ou diminuindo sua sensibilidade
a esta. Há também micro-organismos que são mais resistentes, como os es-
poros bacterianos. As leveduras e fungos filamentosos têm resistência consi-
derada média e as bactérias Gram-negativas têm baixa resistência.
16
Aplicações da radiação Para fins de esterilização industrial as fontes de raios beta e gama são
não-ionizante: as utilizadas. A radiação beta é utilizada para a esterilização de plásticos de
A radiação ultravioleta não
baixa espessura e a radiação gama é utilizada, especialmente, em artigos
pode ser utilizada como
processo de esterilização. descartáveis produzidos em larga escala (fios de sutura, luvas e outros).
Fatores como matéria Radiação Não-ionizonte: As radiações não ionizantes, a luz ultravioleta, são
orgânica, comprimento de
aquelas menos energéticas. A luz ultravioleta compreende a porção do es-
onda, tipo de material, tipo de
microrganismo intensidade pectro luminoso que vai de 150 a 3900 A, porém o comprimento de onda que
da radiação interferem na sua possui maior atividade bactericida está ao redor de 2650 A.
ação germicida.
Além disso, a radiação não A luz solar tem poder microbicida em algumas condições, pois a energia
ionizante não tem poder de radiante da luz do sol é composta basicamente de luz ultravioleta e na super-
penetração, age apenas fície terrestre o comprimento de onda desta varia de 2870 a 3900 Å, as de
sobre a superfície onde comprimento mais baixo são filtradas pela camada de ozônio, pelas nuvens
os raios incidem e não
atravessam tecidos, líquidos, e pela fumaça.
vidros, nem matéria orgânica. A radiação não ionizante16 é absorvida por várias partes celulares, mas
Alguns autores relatam ainda o maior dano ocorre nos ácidos nucléicos, que sofrem alteração de suas piri-
que o vírus HIV tem alta
resistência à luz ultravioleta. midinas. Formam-se dímeros de pirimidina e se estes permanecem (não ocor-
re reativação), a réplica do DNA pode ser inibida ou podem ocorrer mutações.
Após uma exposição à radiação não ionizante, uma suspensão bacte-
riana terá ainda uma pequena parte de células viáveis, ou seja, capazes de
formar colônias. Se a suspensão bacteriana após ser exposta à luz ultravio-
leta, for timina do DNA, recuperando sua estrutura normal; então células que
foram aparentemente lesadas sofrem uma reativação à luz visível, esta reati-
vação, porém nunca atinge 100% das células (APECIH, 1998).
Leitura
http://www.hospvirt.org.br/enfermagem/port/calor.html
http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=365
http://www.ceet.hpg.ig.com.br/Treinamentos/treinamentovolks.htm
http://www.cogumelohobby.bravehost.com/esterilizacao.htm
http://www.unig.br/manual_odonto2.htm
Referências
JORGE, A. O. C. Microbiologia - Atividades Práticas. 2 ed. São Paulo : Livra-
ria Santos Editora LTDA, 2008.
Capítulo 8
Eficácia de Desinfetantes Sobre
Micro-organismos in vitro
Objetivos
l Verificar a ação dos desinfetantes sobre os micro-organismos.
l Listar condições sobre escolhas e desempenho de agentes químicos.

l Alça de platina
l Tubos de ensaio
l Cepa de diferentes microorganismos

l Tipos diferentes de desinfetantes
l Placas de Petri
l Pipetas
l Meio de cultura Ágar Batata Dextrose
l Solução salina estéril
l Caneta para identificação
l Estufa bacteriológica.

l Pipetar 0,5 mL da solução com o micro-organismo a ser utilizado (cada alu-
no deverá realizar o experiente com um microrganismo), e transferir para um
tubo de ensaio contendo solução salina e para outros três tubos contendo
diferentes marcas comerciais de desinfetantes;
l Aguardar 15 minutos;
l Dividir em 4 regiões o fundo da placa contendo o meio ágar batata dextrose

com caneta para vidro, e identificar as áreas dos desinfetantes correspon-
dentes;
l Semear com alça de platina a partir dos tubos com desinfetantes + micro-
organismos, para os ¼ correspondentes da placa;
l Incubar em estufa a 37 ºC, durante 48 horas.
Introdução
O controle científico do crescimento bacteriano começou somente há cerca de
100 anos. Na metade do século XIX, o médico húngaro Ignatz Semmelweiss
e o médico inglês Joseph Lister utilizaram essa ideia em algumas das primei-
ras práticas de controle microbiano para procedimentos médicos. Essas prá-
ticas incluíam a lavagem das mãos com cloreto de cal e técnicas de cirurgia
assépticas para impedir a contaminação microbiana das feridas cirúrgicas.
Os agentes químicos são usados para controlar o crescimento de mi-
cróbios em tecidos vivos e objetos inanimados, mas infelizmente são pou-
cos os que atuam como esterilizante, a maioria apenas reduz as populações
microbianas em níveis mais seguros ou removem dos objetos as formas
vegetativas dos patógenos, sendo um problema comum na desinfecção a
seleção de um agente.
Desinfetantes são substâncias ou produtos capazes de destruir, in-
discriminadamente, os micro-organismos de uma superfície, instrumento,
aparelhos, entre outros, sem entretanto, eliminar as formas esporuladas.
Vários tipos de desinfetantes são utilizados para a desinfecção de dife-
rentes itens do laboratório, ambulatório e consultórios (superfícies, instru-
mentos, chão, aparelhos, entre outros). Sua escolha deve ser feita cui-
dadosamente, pois um produto usado para uma finalidade pode não ser
igualmente efetivo para outra.
Os agentes químicos não apresentam todos a mesma capacidade para
a destruição dos micro-organismos de interesse médico, que incluem: bacté-
rias na forma vegetativa, vírus lipofílicos e hidrofílicos, fungos, Mycobacterium
tuberculosis e esporos bacterianos.
1. Escolha do agente químico

O agente químico deve ser escolhido conforme a finalidade de uso, o aten-
dimento aos critérios do agente ideal e o certificado do Ministério da Saúde.
Para que se consiga o melhor desempenho de um agente químico, é
necessário respeitar a concentração de uso, o tempo de ação e a validade
do produto.
1.1 Cuidados
Em função da toxicidade dos agentes químicos, que é tanto maior quanto
mais eficiente ele for. Sua manipulação deve ser feita utilizando o EPI (equipa-
mento de proteção individual) adequado, e seu armazenamento deve ser feito
em local arejado, fresco e ao abrigo da luz.
2. Agentes químicos
Entre os agentes químicos estão o álcool, compostos biclorados, halogênios,
e com poder esterilizante os aldeídos e o óxido de etileno.
2.1 Álcool
São utilizados o álcool etílico e isopropílico, com ação bactericida rápida, eli-
minando também o bacilo da tuberculose, os fungos e os vírus. Não age, po-
rém, contra os esporos bacterianos. Sua concentração ótima dá-se entre 60
e 90% por volume, sua atividade caindo muito com concentração abaixo de
50%. Suas propriedades são atribuídas ao fato de causarem desnaturação
das proteínas quando na presença de água. Os alcoóis não devem ser usa-
dos em materiais constituídos de borracha e certos tipos de plásticos, poden-
do danificá-los. Evaporam de forma rápida, dificultando exposição prolonga-
da, a não ser por imersão do material a ser desinfetado.
2.2 Compostos biclorados

Geralmente utiliza-se os hipocloritos de sódio ou cálcio, apresentando um am-
plo campo de atividade antimicrobiana, com baixo custo e ação rápida. Os
fatores que levam à sua decomposição, interferindo em suas propriedades,
são: temperatura, concentração, presença de luz e pH. Acredita-se que estes
produtos agem por inibição de algumas reações enzimáticas chave dentro
das células, por desnaturação de proteína e por inativação do ácido nucléico.
São ativos contra bacilo da tuberculose, vírus e fungos.
2.3. Halogênios
Os halogênios, particularmente o iodo e o cloro, são agentes microbianos efi-
cazes. O iodo (I2) é um dos anti-sépticos mais antigos, sendo eficiente contra
todos os tipos de bactérias, muitos endósporos, vários fungos e alguns vírus,
tendo um modo de ação exato ainda desconhecido.
O cloro (Cl2) tem sua ação germicida causada pelo ácido hipocloroso
(HOCl), sendo um forte agente oxidante impedindo boa parte do sistema en-
zimático celular.
Uma forma líquida de gás cloro comprimido é usada para desinfetar
a água potável municipal, a água de piscinas e esgoto. Outro composto do
cloro, o hipoclorito de sódio (NaCl) é usando como desinfetante doméstico e
alvejante, e como desinfetante em fábricas de processamento de laticínios e
alimentos, e em sistemas de hemodiálise.
2.4 Aldeídos
São utilizados o glutaraldeído e o formaldeído. O primeiro é um dialdeído,
que pode se apresentar pronto para o uso, mas em pH ácido, necessita
de ativação pelo bicarbonato de sódio para exibir atividade esterilizante.
Ele age alterando o ácido desoxirribonucléico e o ribonucléico, bem como
a síntese protéica dos micro-organismos, sendo mais comumente usado
como desinfetante de alto nível para equipamentos médicos, como endos-
cópios, transdutores, equipamento de anestesia, de terapia respiratória e
de hemodiálise.
O segundo, o formaldeído é um dos mais comuns produtos químicos
de uso atual. É o aldeído mais simples, de fórmula molecular H2CO e nome
oficial metanol.
É usado como desinfetante ou esterilizante nas formas gasosa ou líqui-
da. É comumente encontrado como formalina, sendo esta sua diluição aquo-
sa a 37%. A formalina é bactericida potente, fungicida, agindo também contra
vírus, bacilos da tuberculose e esporos bacterianos. Tem seu uso limitado por
se tratar de um composto cancerígeno. Age alcalinizando determinados gru-
pos das proteínas e das purinas.
É indicado para a descontaminação, desinfecção de instrumentos se-
mi-críticos, superfícies, e para a limpeza e desinfecção de paredes, pisos,
superfícies fixas, em locais de alto risco.
A exposição de curta duração pode ser fatal, entretanto, o limiar de odor
é suficientemente baixo para que a irritação dos olhos, membranas e muco-
sas ocorra antes deste nível ser alcançado. Exposições de longa duração a
baixas concentrações de formaldeído podem causar dificuldade respiratória,
enfisema e a sensibilização. O formaldeído em concentrações acima do limite
é classificado como carcinogênico humano e tem sido relacionado principal-
mente com câncer de pulmões e nasal, com possível relação também com
câncer no cérebro e leucemia.
2.5 Óxido de etileno

O óxido de etileno (C2H4O) é um gás incolor à temperatura ambiente e al-
tamente inflamável. Em sua forma líquida é miscível com água, solventes
orgânicos comuns, borracha e plástico. Para que possa ser utilizado o mesmo
é misturado com gases inertes, que o tornam não-inflamável e não-explosivo.
O óxido de etileno reage com a parte sulfídrica da proteína do sítio ativo
no núcleo do microrganismo, impedindo assim sua reprodução.
A esterilização por óxido de etileno, como os demais métodos, exige
limpeza prévia do material, sendo esta rigorosa. O acondicionamento dos pro-
dutos também é questão importante e deve ser adequado ao tipo de esterili-

zação e ao artigo. A esterilização é realizada em equipamento semelhante a
uma autoclave e o ciclo compreende várias fases.
O óxido de etileno é irritante da pele e mucosas, provoca distúrbios ge-
néticos e neurológicos. É um método, portanto, que apresenta riscos ocupa-
cionais. Existem alguns relatos de exposições agudas de humanos a altas
concentrações de óxido de etileno, onde foram observadas reações como
náusea, vômitos e diarréia.
1. Faça um desenho esquemático da placa de Petri destacando a pigmenta-
ção e a forma das colônias bacterianas.
2. Pesquise por que os biofilmes agem como uma barreira à ação dos desinfe-
tantes, e como os tensoativos podem amenizar a barreira desses biofilmes,
facilitando a ação dos desinfetantes.
3. Floriswhaldo é um homem versátil, que busca diversas formas para traba-
lhar e ganhar dinheiro. Certo dia decidiu entrar no ramo de fabricação de
desinfetantes e água sanitária. Sem muito dinheiro para comprar a matéria
prima, decidiu preparar a fórmula da água sanitária com metade da concen-
tração de hipoclorito de sódio indicada pelo fornecedor. Ao sair pelas ruas
para vender seus produtos, uma dona de casa perguntou-lhe se seu produ-
to era de qualidade e matava todos os micróbios da sua casa. Floriswhaldo
garantiu que sim. Indique quais as possíveis falhas de limpeza que a água
sanitária diluída irá causar, e sabendo que a dona de casa usará a água
sanitária também para a limpeza de frutas e verduras, quais riscos à saúde
a mesma e sua família estará correndo?
4. Diferencie os seguintes termos: desinfecção, esterilização, anti-sepsia
e degermação.
5. Pesquise o porquê de alguns gêneros bacterianos como Mycobacterium,
Pseudomonas e Bacillus serem frequentemente resistentes aos desinfetantes.
Leitura
http://www.cih.com.br/desinfetantes.htm
http://www.inmetro.gov.br/consumidor/produtos/agua_sanitaria.asp
www.forp.usp.br/restauradora/biosseguranca/temas/temas_files/desinfec-
cao.pdf
http://www.racine.com.br/default.asp?UrlSite=conteudo.asp&idpagina=906&I
dNavegacao=220&IdPortal=6&IdFerramenta=1
www.valicamp.com.br/loja/images/LinhaVeja.jpg
Referências
JORGE, A. O. C. Microbiologia - Atividades Práticas. 2 ed. São Paulo : Livra-
ria Santos Editora LTDA, 2008.
RIBEIRO, M. C., SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática. 1 ed. São
Capítulo 9
Anti-sepsia de Mãos:
Experimento de Price
Objetivos
l Verificar a microbiota da pele.
l Observar a eficácia de lavagem das mãos e do uso de um anti-séptico na
redução dos micro-organismos da pele.

l Placa de Petri de 150 mm com ágar Batata
l Alça de platina
l Caneta permanente
l 3 swabs estéreis
l Tubos de ensaio contendo 10 mL de solução salina esterilizada
l Frasco contendo detergente

l Frasco contendo álcool iodado

l Dividir o fundo da placa de Petri contendo ágar batata ou ágar columbia em
3 partes com a caneta permanente e identificar a placa;
l Umedecer um swab em salina estéril e esfregar sobre a palma da mão. A
seguir, semear 1/3 da placa de ágar nutriente com o swab identificando
“mãos sem lavar”;
l Lavar as mãos com detergente (sabão), vigorosamente em todas as superfí-
cies, durante 5 minutos (utilizar escovas). A seguir pegar outro swab e repe-
tir o procedimento anterior, semeando no segundo 1/3 da placa e identificar
como “mãos lavadas”;
l Realizar anti-sepsia das mãos pré-lavadas no procedimento anterior, com
álcool iodado (durante 1 minuto). A seguir utilizando outro swab estéril repe-
tir o procedimento anterior e semear na terceira parte do meio de cultura,
identificando esta parte como “mãos com anti-sepsia”.
l Incubar a placa a 37 ºC durante 48 horas, observando o crescimento de
colônias nas três partes da placa.
Introdução
17
Lavagem X Antissepsia A higienização das mãos17 é reconhecida, mundialmente, como uma me-
de mãos dida primária muito importante no controle de infecções hospitalares. His-
Lavagem comum: Remoção toricamente foi comprovada sua importância pelo médico húngaro Ignatz
de sujidade e flora transitória
Antissepsia: Remoção e
Semmelweiss e merecido atenção das revistas científicas mais relevantes
destruição de flora transitória sobre infecções hospitalares.
Antissepsia – preparo Semmelweiss, um dos pioneiros em controle de infecção hospitalar, re-
cirurgico: Remoção,
destruição da flora
duziu as taxas de infecções puerperais através da determinação do ato de
transitória e redução da flora lavagem das mãos com solução germicida, após as necrópsias e antes do
permanente atendimento a partos, em 1848.
Anti-sepsia é a destruição dos patógenos em tecido vivo, utilizando-se
principalmente antimicrobianos químicos (anti-sépticos)18.
P. B. Price (1938), em seu clássico estudo sobre a quantificação da mi-
crobiota da pele, dividiu as bactérias isoladas das mãos em duas categorias:
transitória e residente.
A microbiota transitória, que coloniza a camada superficial da pele, so-
18
A escolha de um anti- brevive por curto período de tempo e é passível de remoção pela higienização
séptico é baseado na análise simples das mãos, como a Escherichia coli.
dos seguintes aspectos:
• Modo de ação Há outros micro-organismos que são persistentemente isolados da pele
• Espectro de ação da maioria das pessoas, formando a microbiota residente. São os de mais
• Rapidez de ação difícil remoção, sendo necessária uma fricção vigorosa durante a lavagem
• Persistência
• Segurança e toxicidade das mãos. Exemplos: Staphylococcus coagulase-negativos, Corynebacterium
• Inativação por matéria e Propionibacterium, entre outros.
orgânica Diversos compostos têm sido usados como anti-sépticos, entre eles os
• Disponibilidade do produto
bifenóis, biguanidas (clorexidina), halogênios (iodo), metais pesados (prata),
álcool e agentes de superfície.
Os agentes de superfície (tensoativos ou surfactantes), mais especifica-
damente o sabão, tem pouco valor como anti-séptico, mas tem a importante
função de remoção mecânica dos micróbios através do ato de esfregação.
A pele normalmente contém células mortas, pó, suor seco, micróbios e
secreções oleosas. O sabão rompe o filme oleoso em gotículas pequenas,
um processo denominado emulsificação, e juntamente com a água removem
o óleo emulsificado e resíduos, fazendo-os flutuar para longe à medida que a
pele é lavada.
1. O Experimento de Price
Price (1938), realizando pesquisas bacteriológicas criteriosas, verificou a efi-
ciência do método de desinfecção das mãos geralmente usados pelos cirurgi-
ões em seu estudo sobre a quantificação da microbiota da pele.
As principais conclusões de seu estudo foram:
l Escovar as mãos com água e sabão reduz a microbiota bacteriana de 50%
a cada 6 minutos, sendo necessário escová-las durante 2 a 3 horas para
obter uma desinfecção satisfatória;
l Álcool a 77 °GL, e melhor ainda, álcool iodado a 2%, mostram-se de grande efi-
cácia, produzindo em 1 minuto o mesmo que água e sabão em 6 a 10 minutos;
l Esfregando-se o álcool com pano áspero, o efeito desinfetante é melhor do
que pela simples imersão.
l Na figura 1, podemos observar os resultados esperados do experimento
de Price após a incubação da placa de Petri contendo meio nutriente e se-
meada com micro-organismos depois da realização dos procedimento de
anti-sepsia das mãos.
Figura 1 – Resultados esperados do experimento de Price após a incubação. A –

mãos sem lavar; B – mãos lavadas com sabão neutro; C – mãos lavadas com sabão
neutro e posteriormente utilização do álcool iodado.
Lavagem das mãos para profissionais da saúde:

l Remover todas as jóias e adornos;
l Molhar completamente e ensaboar com sabão líquido as mãos e antebraços;
l Escovar em movimentos rotatórios durante 3 minutos as mãos, unhas e an-

tebraços, não esquecendo das áreas interdigitais entre os dedos;
l Lavar profusamente em água;

l Repetir o ensaboamento e lavagem por mais duas vezes, sem usar escovas;
l Enxugar com toalha de papel branca, primeiramente as mãos e depois
os antebraços.
l Calçar luvas estéreis e sempre que houver suspeita de contaminação das
luvas, lavar com álcool iodado a 2%.
Figura 2 – Movimentos indicados para a correta lavagem das mãos.

Fonte: www.scribd.com/doc/22474744/Lavagem-e-Antissepsia-de-Maos-Tecnica
1. Faça um desenho esquemático da placa de Petri comparando os resulta-
dos obtidos na aula prática após a incubação com os resultados originais
do experimento de Price.
2. Leia atentamente o quadrinho a seguir sobre recomendações para evitar a
gripe A (H1N1) e responda:
a) Por que não se deve utilizar álcool em concentração de 100 °GL como
anti-séptico ou desinfetante? Qual o modo de ação do álcool contra os
micro-organismos?
b) Por que não é ideal lavar constantemente as mãos?
3. No dia 5 de maio é comemorado o Dia Mundial de Higienização das Mãos.
Pesquise como se deu a criação dessa data e cite duas campanhas ou
atividades que são promovidas anualmente nesse dia.
4. Escolha dois compostos químicos utilizados como anti-sépticos e explique
seu mecanismo de ação, uso preferencial e para qual grupo de micro-orga-
nismos tem bons efeitos.
5. Durante a aula foi discutido quais os movimentos adequados que devem
ser realizados durante a lavagem das mãos, pois sabe-se que os micro-or-
ganismos têm preferências por certas regiões. Pesquise três micro-organis-
mos e suas respectivas áreas de preferência para proliferação nas mãos.
Sites
http://www.cih.com.br/maos.htm#l12
http://www.ebah.com.br/seguranca-do-paciente-higienizacao-das-
maos-pdf-a35956.html
http://lproweb.procempa.com.br/pmpa/prefpoa/cgvs/usu_doc/higienizacao_
maos.pdf
Referências
JORGE, A. O. C. Microbiologia – Atividades Práticas. 2 ed. São Paulo: Li-
vraria Santos Editora LTDA, 2008.
OKURA, M. H., KENDE, J. C. Microbiologia – Roteiros de aulas práticas.
Tecmedd Editora, 2008.
Capítulo 10
Antibiograma/teste de
susceptibilidade a
antimicrobianas
Objetivos
l Descrever a técnica de antibiograma.
l Fazer a leitura dos resultados do antimicrobiama.

l Discos de antibióticos19
l Pinças
l Inóculo
l Lamparina ou Bico de Bunsen
l Pinças
l Placas com meio de cultura
l Swab.

l Produzir o inóculo da bactéria teste comparando-a com a escala de Mac Farland.
l Mergulhar um swab estéril no inóculo.

l Remover o excesso de inóculo comprimindo o swab na parede interna do tubo.
l Semear na superfície do ágar, usando a técnica de semeadura em tapete.

l Deixar a placa semeada por 5’, à temperatura ambiente, para que o inóculo
19
Os discos de antibióticos
não devem ser removidos do
seja completamente absorvido pelo meio de cultura antes de aplicar os dis-
lugar após seu contato com
cos de drogas antimicrobianas. a superfície do ágar, já que a
l Selecionar os antimicrobianos testados de acordo com a espécie isolada e difusão é imediata.
Não se deve exagerar
asrecomendações do C.L.S.I.
na quantidade de discos
l Colocar, com o auxílio de uma pinça estéril os discos de antibióticos de colocados na placa, a fim de
maneira uniforme. evitar halos confluentes entre
os diversos antimicrobianos
l Pressionar cuidadosamente com auxílio de uma pinça cada disco sobre a e consequentemente
superfície do ágar. dificuldades na leitura.
l Inverter as placas e incubá-las em estufa bacteriológica a 37 °C de 18 a 24h.
l Medir cuidadosamente com auxílio de uma régua, o diâmetro dos halos de
inibição completa do crescimento ao redor de cada disco, considerando-se
o milímetro mais próximo; o diâmetro do disco é incluído nessa medição.
Anotar os resultados e interpretar os resultados através da tabela padrão.
Introdução
Vimos nas aulas anteriores que convivemos diariamente com micro-organis-
mos e que alguns deles podem ser patogênicos e causar doença. Portanto, é
preciso conhecê-los e saber a qual antibiótico são resistentes, e qual pode ser
utilizado para combatê-los, para isso, a técnica de antibiograma é essencial.
Por definição, antibiograma é uma prova de susceptibilidade aos an-
timicrobianos utilizada para alguns grupos de bactérias sendo utilizado para
orientar um tratamento clínico, realizar algum tipo de investigação epidemioló-
gica e testes com novos antimicrobianos, ou ainda quando existem problemas
com resistência de bactérias a antibióticos.
É importante salientar que a grande maioria dos antibióticos são produ-
zidos principalmente por três gêneros de micro-organismos. São eles:
Gênero Antibióticos
Penicillium sp. Penicilina e Griseofluvina
Bacillus sp. Bacitracina e Poliminia
Streptomyces sp. Cloranfenicol, Eritromicina, Estreptomicina e Tetraciclina
A técnica mais utilizada para este teste é a difusão do antimicrobiano.

Nessa técnica, uma suspensão padronizada do micro-organismo em teste é
espalhada na superfície do meio de cultura. O antimicrobiano, impregnado
em um disco de papel filtro é colocado sobre o meio de cultura inoculado. Em
seguida a placa é levada a estufa bacteriológica e finalmente é feita a leitura
dos resultados.
Os discos de antimicrobianos nos dirá se a bactéria que está sendo testada
é resistente, sensível ou intermediária a determinados antibióticos. Essa carac-
terística é determinada medindo-se o diâmetro do halo e comparando a tabela
utualizada anualmente pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).
Os resultados obtidos são padrões de resistência ou sensibilidade de
uma bactéria específica a vários antimicrobianos. Imagine a árdua tarefa que
seria determinar isso sem uma referência. Logo se torna de vital importância a
tabela padronizada que possui uma lista dos antibióticos, determinando qual o
diâmetro do halo para considerar sua eficiência, mostrando se o microrganis-
mo estudado é sensível ou resistente a determinado antibiótico.
Figura 1 – Visualização da formação de halos em torno dos discos.

Fonte: http://www.vetfacil.com
1 – Formação do halo com crescimento bacteriano, caracterizando resistência;

2 – Ilustração de uma não formação de halo;
3 – Um halo se sobrepondo em outro. Nesse caso, deve-se medir o raio do halo e multiplicar por 2.
1. Faça um desenho esquemático do resultado do antibiograma realizado du-
rante a aula prática. Descreva os resultados, indicando se a bactéria seme-
ada foi sensível, intermediária ou resistente para cada antibiótico testado.
2. O perfil de susceptibilidade também pode ser utilizado como característica de
diferenciação de espécies em um mesmo gênero. Pesquise sobre o teste da
optoquina e da novobiocina, definindo para qual gênero bacteriano cada um
desses testes é utilizado e o critério para diferenciação das espécies.
3. Os plasmídios são elementos bacterianos extra-cromossomiais que podem
codificar informações de resistência antimicrobiana. Pesquise sobre a con-
jugação bacteriana, descrevendo em detalhes como as bactérias podem
adquirir resistência a antimicrobianos através desse mecanismo. Quais os
principais grupos bacterianos que realizam processos de conjugação?
4. Pesquise sobre a escala de Mac Farland e sua importância para a padroni-
zação de um antibiograma.
5. Explique qual a utilidade clínica do teste de antibiograma, e quando ele
é recomendado.
Sites
http://www.portaldoagronegocio.com.br/conteudo.php?id=23740
Referências
MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M., PARKERT, J. Microbiologia de Brock.
Atheneu, 2002.
Capítulo 11
Microbiota da Água
Objetivos
l Conhecer a microbiota da água.
l Aplicar métodos tradicionais e modernos da análise microbiológica da água.

l Caldo Lauril Triptose
l Caldo Bile Verde Brilhante
l Substrato cromogênico (COLILERT®)
l Tubos de ensaio
l Tubos de Durhan
l Pipeta
l Alça de platina
l Bico de Bunsen.
l Aplicar o Método dos Tubos Múltiplos
Teste presuntivo: Caldo Lauril Triptose (resultado em 48 h);

Teste confirmativo: Caldo Bile Verde Brilhante 2% (resultado em 24 h).
l Aplicar o Método do Substrato Cromogênico
01 Substrato cromogênico → à 100 mL de amostra (resultado em 24 h).

20
A abundância de água
Introdução no planeta causa uma
falsa sensação de recurso
Três quartos da superfície da Terra são recobertos por água20. Tratando-se de
inesgotável. Segundo
quase 1,5 bilhão de km3 de água em todo o planeta, distribuídos em oceanos, especialistas em meio
rios, lagos, lençóis subterrâneos e geleiras. ambiente, 95,1% da água
é salgada, sendo imprópria
A água consumida pelos seres humanos é a água considerada potável.
para consumo humano.
Infelizmente, a maior parte da água dos continentes está contaminada e não Dos 4,9% restantes, 4,7%
pode ser ingerida diretamente. As pessoas utilizam a água não apenas para estão na forma de geleiras
beber, mas também para se desfazer de todo tipo de material e sujeira. As ou regiões subterrâneas de
difícil acesso, e somente
águas contaminadas com numerosas substâncias recebem o nome de águas
os 0,147% estão aptos
residuais. Se as águas residuais forem para os rios e mares, as substâncias para o consumo em lagos,
que elas transportam se acumulam e aumentam a contaminação geral des- nascentes e em lençóis
ses ambientes, trazendo graves riscos para a sobrevivência dos organismos. subterrâneos.
Limpar e tratar a água são processos bastante caros e complexos, que

ajudam a eliminar contaminantes e micro-organismos potencialmente pato-
gênicos. Entretanto alguns micro-organismos realizam o principal papel no
tratamento do esgoto, degradando parte do material orgânico presente e de-
compondo outras substâncias químicas indesejáveis.
Existem vários elementos contaminantes da água. Alguns dos mais im-
portantes e graves são:
Os contaminantes orgânicos: são biodegradáveis e provêm da agricultura,
como adubos, restos de seres vivos, e das atividades domésticas, tais como
excrementos e sabões. Se acumulados em excesso, produzem a eutrofiza-
ção das águas.
Os contaminantes biológicos: são todos aqueles micro-organismos capa-
zes de provocar doenças, tais como a hepatite, a cólera e a gastroenterite.
A água é contaminada pelos excrementos dos doentes e o contágio ocorre
quando essa água é consumida.
Os contaminantes químicos: os mais perigosos são os resíduos tóxicos,
como os pesticidas do tipo DDT (chamados organoclorados), porque eles
tendem a se acumular no corpo dos seres vivos. Os metais pesados (chum-
bo, mercúrio) utilizados em certos processos industriais são também perigo-
sos por se acumularem nos organismos.
1. Microbiota da água
Os micro-organismos encontrados em um ambiente aquático são, de certa
forma, determinados pelas condições físicas e químicas que prevalecem na-
quele ambiente, tais como temperatura, pressão, luminosidade, pH, nutrientes.
A coleção de vida microbiológica que flutua e se movimenta na região
superficial dos pântanos, lagos e oceanos é denominada plâncton, subdividi-
do em fitoplâncton (algas planctônicas e cianobactérias) e zooplâncton (crus-
táceos minúsculos, larvas de animais de diferentes filos, muitos protistas he-
terotróficos e bactérias).
No ambiente aquático podemos encontrar grande quantidade de or-
ganismos patogênicos e não-patogênicos ao homem. Os principais micro-
organismos patogênicos veiculados pela água estão citados na tabela 1.
Tabela 1
Principais micro-organismos patogênicos veiculados pela água
Micro-organismos Exemplos Doenças
Shigella dysenteriae Disenteria Bacilar
Escherichia coli Gastroenterites
Bactérias Leptospira sp. Leptospirose
Salmonella typhi Febre Tifóide
Vibrio cholerae Cólera
Microcystis sp.
Carcinoma
Cianobactérias Anabaena sp.
Dermatites
Cylindrospermopsis sp.
Candida albicans
Fungos Dermatites
C. tropicalis
Protozoários Entamoeba histolytica Disenteria amebiana
Ascaris lumbricoides Ascaridíase
Helmintos
Schistosoma mansoni Esquistossomose
Poliomielite
Poliomielite
Hepatite A
Vírus Hepatite infecciosa
Rotavirus
Gastroenterites
Adenovirus
2. Análise microbiológica da água

Para se ter uma água de boa qualidade é necessário que haja o monitoramen-
to da qualidade e isso pode ocorrer através de vários tipos de análises, dentre
elas a análise microbiológica.
A Portaria nº 518, de 25 de março de 2004 do Ministério da Saúde esta-
belece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância
da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.
Entre os organismos identificados em análises microbiológicas, destacam-se:
Bactérias heterotróficas: bactérias capazes de produzir unidades formado-
ras de colônias (UFC), na presença de compostos orgânicos contidos em
meio de cultura apropriada, sob condições pré-estabelecidas de incubação
(35,0 ± 0,5 ºC por 48 horas). Neste grupo encontramos alguns gêneros de
bactérias bastante conhecidos como: Pseudomonas, Clostridium, Desulfovi-
brio, Serratia e Mycobacterium.
Coliformes totais (bactérias do grupo coliforme): bacilos Gram-negativos,
aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-ne-
gativos, capazes de se desenvolver na presença de sais biliares ou agentes
tensoativos. Fermentam a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35,0
± 0,5 ºC em 24-48 e podem apresentar atividade da enzima ß -galactosidase.
A maioria das bactérias do grupo coliforme pertence aos gêneros Es-
cherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vários outros gêne-
ros e espécies pertençam ao grupo.
Coliformes termotolerantes: subgrupo das bactérias do grupo coliforme que

fermentam a lactose a 44,5 ± 0,2 ºC em 24 horas, tendo como principal
representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal. Essa bac-
téria, além de lactose, também fermenta manitol com produção de ácido e
gás, produz indol a partir do triptofano, e é oxidase negativa. Não hidroliza a
uréia e apresenta atividade das enzimas ß galactosidase e ß-glucoronidase,
sendo considerada o mais específico indicador de contaminação fecal re-
cente e de eventual presença de organismos patogênicos.
Cianobactérias: micro-organismos procarióticos autotróficos, capazes de
ocorrer em qualquer manancial superficial especialmente naqueles com
elevados níveis de nutrientes (nitrogênio e fósforo), podendo produzir toxi-
nas com efeitos adversos à saúde.
2.1 Técnicas de análise microbiológica

A análise de coliformes totais e/ou termotolerantes (Escherichia coli) em água
e alimentos pode ser realizada através dos seguintes métodos:
l Método do número mais provável (MNP);
l Método substrato cromogênico;
l Método da membrana de filtração.
A análise e contagem das bactérias heterotróficas podem ser realizadas
através dos seguintes métodos:
l Semeadura em profundidade ou "Pour plate";
l “Simplate”;
l Técnica de esgotamento.
A análise e contagem de cianobactérias são feitas diretamente da

amostra com auxílio de microscópios ópticos e de testes de toxidade para
detecção de cianotoxinas.
21
Características do
Indicador ideal de qualidade 2.1.1 Método do Número Mais Provável
microbiológica:
A técnica do Número Mais Provável (NMP) é um meio de estimar a densida-
• Não ser patogênico;
• Densidade populacional de de micro-organismos viáveis em águas e alimentos, sendo sua principal
diretamente relacionada utilização a pesquisa de coliformes. É bastante usada para isolamento e/ou
com o grau de enumeração de enterococos, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Sal-
contaminação;
monella sp., entre outros.
• Maior sobrevida que a dos
patogênicos; A estimativa do NMP é obtida pela preparação de diluições decimais de
• Ausência em água potável; uma amostra e transferência a partir desta de alíquotas a uma serie de 3 a 5
• Fácil detecção e
tubos por diluição contendo 10 ml de meio de cultura com tubos de Durham.
recuperação laboratorial;
• Manipulação segura.
O NMP pode ser calculado para diferentes séries de inoculações atra-

vés de tabelas apropriados de NMP, também chamadas tabelas de Hoskins.
Essa técnica consiste em 3 etapas:
l Teste presuntivo
l Teste confirmativo
l Teste completo
Teste Presuntivo
Inocular os tubos de caldo lactose em número de 15 (5 para cada série) sendo
as alíquotas das amostras adicionadas em cada série, respectivamente: 10
mL, 1 mL e 0,1 mL. Em seguida incubar os tubos na estufa a 35 ºC.
Após a incubação por 48 horas, deve se remover os tubos da estufa
e fazer a leitura dos resultados que consiste em verificar o aspecto de cada
tubo, conforme o seguinte critério:
Critérios Interpretação
Crescimento com produção de gás Presença de organismos fermentadores de lactose, possivelmente coliformes.
Crescimento sem produção de gás Ausência de coliformes.
Figura 1 – Presença de gás dentro do tubo de

Durham.
Teste Confirmativo
Os tubos positivos devem ser repicados em tubos com caldo bile verde
brilhante 2% (incubação por 24 horas a 35 ºC) e em Caldo EC (incubação por
24 horas a 44,5 ºC).
Após o período de incubação deve-se remover os tubos da estufa e

proceder à leitura dos resultados que consiste em verificar o aspecto de cada
tubo, conforme o seguinte critério:
l Caldo bile verde brilhante a 2%:
Critérios Critérios
Crescimento com produção de gás: Presença de coliformes totais.
Crescimento sem produção de gás : Ausência de coliformes totais.
l Caldo EC:
Critérios Critérios
Crescimento com produção de gás Presença de coliformes termotolerantes.
Crescimento sem produção de gás: Ausência de coliformes termotolerantes.
Teste Completo
As amostras positivas para coliformes totais são submetidas ao cultivo em
meio eosina azul de metileno. Caso haja formação de colônias característi-
cas, essas colônias são repicadas para um meio ágar nutriente e após perío-
do de crescimento, realiza-se o teste da coloração de Gram, para comprovar
a presença de coliformes.
2.1.2 Método Substrato Cromogênico

A técnica do substrato cromogênico é o método mais moderno e rápido para
detecção de coliformes totais, além de ser específico para E. coli (coliforme
termotolerante). Através dessa análise podem-se obter resultados qualitativos
e quantitativos da amostra.
O procedimento é realizado adicionando-se o substrato cromogênico
a 100 mL da amostra. Em seguida a amostra é incubada por 18 a 24 horas
em uma estufa a 35 ºC. Após esse período, retira-se o frasco com o substrato
cromogênico da estufa e procede-se a leitura dos resultados que consiste em
verificar o aspecto de cada frasco, conforme o seguinte critério:
Critérios (COLILERT®) Critérios (COLILERT®)
Incolor Ausência de coliformes totais e E. coli
Amarelo Presença de coliformes totais
Amarelo e com
Presença de Coliformes Totais e E. coli
fluorescência
Amarelo e sem
Presença de Coliformes totais e ausência de E. coli
fluorescência
Figura 2 – Método do colilert. técnica de análise da água através de substrato cromogênico
2.1.3 Método da Membrana Filtrante

A técnica da membrana filtrante consiste em passar volumes da amostra atra-
vés de uma membrana com poros suficientemente pequenos para reter as
bactérias. A membrana, então, é colocada sobre um meio de cultura seletivo
com ágar numa placa de Petri, sendo incubada na estufa, a 35 °C por 24
horas, procedendo-se a determinação de coliformes a partir da contagem de
colônias típicas.
É utilizada para testar grandes volumes de água (águas salinas mas não
águas residuárias), e suas vantagens consistem em produzir resultados mais rá-
pidos que a técnica dos tubos múltiplos, sendo mais precisa e menos laboriosa.
Sites
www.webciencia.com/21_agua.htm
www.decomposicao.vilabol.uol.com.br/frames.htm
www.dms.ufsc.br/mip5131/arquivos/3149_9a%2520aula-
-Microbiologia%2520da%2520agua.ppt+micro-
-organismos+aquaticos&hl=pt-BR&ct=clnk&cd=10&gl=br
www.qaonline.iqsc.usp.br:8180/FCKeditor/UserFiles/File/
Marcia%2520Nitschke/Microbiologiadaagua.pdf+mICROBIOTA+DA+%C3%
81GUA&hl=pt-BR&ct=clnk&cd=3&gl=br
http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/1469_00.htm
Referências
SOARES, J. B.; CASIMIRO, A. R. S.; ALBUQUERQUE, L. M. B. Microbiolo-
gia basica. Fortaleza/CE : EUFC, 1991.
SILVA FILHO, G. N., OLIVEIRA, V. L. Microbiologia - Manual de aulas práti-
cas 2ª Ed. Florianópolis: Editora da UFSC, 2007.
Capítulo 12
Microbiota do Solo
Objetivos
l Aprender a manipular amostras de solo em laboratório de Microbiologia;
l Conhecer a microbiota dos solos secos e úmidos;

l Quantificar o número de micro-organismos presentes em diferentes solos.

l Amostras de solo seco e solo úmido
l Meios de cultura ágar Batata

l Água reagente para laboratório clínico estéril
l Solução salina fisiológica estéril
l Placas de Petri de 150 mm
l Béquer
l Tubos de ensaio
l Tubos Falcon® 50 mL
l Bastão de vidro
l Lâminas para microscopia óptica
l Micropipetador
l Pipeta
l Balança semi-analítica ou analítica
l Álcool
l Alça de platina
l Corantes (coloração de Gram)

l Microscópio óptico.
Procedimentos da aula prática 22

Constituintes do Solo
••Minerais (sílica, Fe, Al, Mn,
A metodologia será dividida em duas etapas, que corresponderão à caracteriza- Mg, Na, N...);
ção e o cultivo de micro-organismos presentes no solo22. Inicialmente, deve-se ••Matéria orgânica (de origens
coletar 20 g de solo oriundo de ambiente seco e 20 g de solo oriundo de am- vegetal, animal e microbiana);
biente úmido, de modo a comparar a microbiota presente nas duas amostras. ••Água e gases (CO2, O2, etc...).
Caracterização de bactérias pela Coloração de Gram

l Pesar 1 g de solo em um béquer esterilizado e transferir para um tubo de ensaio;
l Adicionar 5 mL de água destilada;
l Homogeneizar a solução com um bastão de vidro, deixando o material se-

dimentar por 5 minutos;
l Transferir uma gota do sobrenadante para uma lâmina de vidro e realizar a
coloração de Gram, observando em microscópio óptico.
Cultivo de micro-organismos da microbiota do solo
l Pesar 5 g do solo e transferir para um tubo Falcon® de 50 mL;
l Adicionar 40 mL de solução fisiológica esterilizada;
l Homogeneizar a solução manualmente por 3 min.;

l Deixar o tubo em repouso por 5 min;
l Retirar 0,1 mL do sobrenadante e semear em placas de Petri de 150 mm
contendo ágar Batata;
l Inverter as placas e incubar à temperatura de 25-30 ºC por até 5 dias, acom-
panhando o crescimento diariamente;
l Verificar a variedade dos micro-organismos presentes em cada placa e ano-
tar os resultados.
Introdução
Ao considerar os ambientes terrestres, nossa atenção se dirige ao solo e as
plantas. Na formação do solo são produzidas interações complexas entre o
material original, a topografia do terreno, o clima e os seres vivos
O solo, além de ser o principal substrato para a agricultura, é suporte
para estradas, fornece materiais para a construção civil, e é utilizado como
depósito de lixo. É também nos solos que se realiza a maior parte da ciclagem
de nutrientes da qual o planeta Terra depende para se manter vivo.
A biodiversidade de solos tem um papel fundamental na regulação dos
processos biogeoquímicos formadores e mantedores dos ecossistemas. Den-
tre estes, incluem-se: a formação e estruturação de solos; a decomposição da
matéria orgânica; a ciclagem de nutrientes e a formação dos gases compo-
nentes da atmosfera terrestre.
O solo constitui um sistema muito dinâmico e organizado e representa um
excelente meio para a sobrevivência de uma variedade de micro-organismos re-
presentada por componentes macro e microscópicos. O solo é constituído por
uma grande quantidade de micro-organismos – bactérias, fungos, algas, protozo-
ários e vírus, os quais são responsáveis pela decomposição da matéria orgânica
do solo em matéria inorgânica simples que servem de alimento para as plantas.
Os solos podem ser classificados em dois grandes grupos: solos orgâni-

cos que contêm mais de 20% de matéria orgânica (nos casos de textura gros-
seira), ou mais de 30% (nos casos de textura média ou fina) em espessura
superior a 30 cm, ou solos minerais que são os mais vulgares.
1. Formação dos solos

Os solos se formam como uma combinação de processos físicos, químicos e
biológicos. O gelo, o desgelo e outros processos físicos originam a formação
de fissuras nas rochas. Nessas fissuras se formam os solos primitivos, sobre
os quais podem se desenvolver plantas superiores. As raízes das plantas
vão penetrando na fissura e aumentam a fragmentação das rochas, e suas
excreções vão causando o desenvolvimento de uma rizosfera (solo que ro-
deia as raízes das plantas). Quando as plantas morrem seus restos passam
a fazer parte do solo e se convertem em nutrientes para um desenvolvimento
microbiano mais extenso.
2. Solo e suas interações microbianas

O crescimento microbiano mais importante acontece na superfície das par-
tículas do solo, normalmente na rizosfera, região onde o solo e as raízes
das plantas entram em contato (figura 1). O número de micro-organismos na
raiz e à sua volta é muito maior do que no solo livre. Atualmente, técnicas de
microscopia eletrônica permitem que os microbiologistas observem os micro-
-organismos diretamente na superfície das raízes.
Figura 1 – Região do solo na qual encontramos o

maior número de microrganismo (rizosfera).
Fonte: www.biotecnologia-rizosfera-ceu.com
Um dos principais fatores que influenciam a atividade bacteriana é a dispo-

nibilidade de água, a qual apresenta grande variabilidade, e sua presença depen-
de muito da composição do solo, da chuva, da drenagem e da cobertura vegetal.
O estado nutricional do solo é outro fator que influencia a atividade mi-
crobiana, a maior parte destas se conduz sobre as superfícies ricas em ma-
téria orgânica. Em alguns solos o carbono não é o nutriente limitante, sendo
a disponibilidade de nutrientes inorgânicos, tais como o fósforo e o nitrogênio,
os limitantes da atividade microbiana.
3. Diversidade microbiana
O solo típico tem bilhões de organismos, principalmente os microscópi-
cos. Mas a quantidade de micro-organismos declina rapidamente com o au-
mento da profundidade, como mostrado na tabela 1.
Tabela 1
Micro-organismos por grama de um solo típico de jardim em várias profundidades
Profundidade (cm) Bactérias Fungos Algas
3-8 9.750.000 119.000 25.000
20-25 2.179.000 50.000 5.000
35-40 570.000 14.000 500
65-75 11.000 6.000 100
135-145 1.400 3.000 -
Fonte: Tortora et al., 2005.
3.1 Bactérias
Especula-se que são conhecidos apenas 1% das bactérias de solos. O nú-
mero de espécies de bactérias de solos descrita na leitura vem crescendo
nos últimos anos em virtude do desenvolvimento de ferramentas de biologia
molecular que possibilitam a análise de sequências de DNA a partir de mate-
rial genômico estraído diretamente do solo. As novas técnicas evidenciaram
a enorme diversidade genética de bactérias presentes apenas em 1g de solo.
Estima-se que em 1g de solo ocorram entre 20 a 40 mil espécies bacterians.
As bactérias desempenham papel importante na decomposicão de re-
síduos orgânicos e na formação do húmus, e incluem organismos que parti-
cipam do ciclo do nitrogênio (nutrificação). Alguns exemplos são as bactérias
dos gêneros Rhizobuim e Azotobacter.
As bactérias são, em geral, bastante exigentes em cálcio e properam
especialmente em solos de reação levemente ácida a levemente alcalina. Ou-
tros gêneros bacterianos encontrados no solo: Bacillus, Clostridium, Athrobac-
ter, Pseudomonas, Nitrobacter, Nocardia, Streptomyces e Micromonospora.
23
Onde estudar no Brasil?
UNIVERSIDADE FEDERAL
DE VIÇOSA
(Pós-graduação em
Microbiologia Agrícola)
Algumas linhas de pesquisa
são: fixação biológica de N2;
associações micorrízicas;
qualidade microbiológica de
alimentos; bactérias láticas
e probióticos; microbiologia
Figura 2 – Microscopia eletrônica do dos processos fermentativos
de produtos agroindustriais;
gênero bacteriano Arthrobacter
fungos produtores de
encontrado no solo.
Fonte: http://www.musee-afrappier.qc.ca enzimas de interesse
industrial; biologia molecular
3.2 Fungos de fungos de interesse
industrial e metabolismo
Estima-se que apenas 5% dos fungos existentes nos solos tenham sido descritos. de carboidratos em micro-
organismos.
Os fungos envolvem-se em inúmeras relações mutualistas, comensais e
Fonte: http://www.ufv.br/dmb/
competitivas com outros organismos do solo. Muito progresso tem sido feito com cpmicrag.htm
relação à catalogação de fungos superiores, que formam sistemas de repro-
dução macroscópicos (cogumelos). Já os micorrízicos, que formam relações
mutualistas com plantas, foram muito pouco estudados. Os fungos micorrízicos
arbusculares são comuns em todo o mundo, porém apenas as espécies asso-
ciadas a plantas de interesse agrícola foram estudadas de maneira adequada.
Os fungos podem atingir no solo uma massa total superior à das bacté-
rias. São em geral menos exigentes em cálcio e mais tolerantes da acidez do
que as bactérias. Ex.: Penicillium sp., Mucor sp., Rhizopus sp., Fusarium sp.,
Cladosporium sp., Aspergillus sp. e Trichoderma sp.
Figura 3 – Microscopias eletrônicas dos

gêneros fúngicos Penicillium e Rhizopus,
respectivamente, encontrados no solo.
Fonte: http://www.facmed.unam.mx
3.3 Protozoários
Estima-se que apenas 10% dos protozoários do solo são conhecidos. Eles são,
juntamente com os nematóides, os principais predadores de micro-organismos
dos ecossistemas terrestres. Alterações na diversidade de protozoários pode-
riam ser relacionadas a mudanças nos processos ecológicos do ecossistema.
1. Faça desenhos da lâmina e da placa visualizadas na aula prática descre-
vendo os resultados.
2. Em um congresso de microbiologia, um estudante, ao apresentar um traba-
lho, afirmou que quanto maior a profundidade, menor vai ser a densidade
microbiana. Você concorda com o aluno? Explique.
3. Quais as vantagens dos fungos que vivem em simbiose com raízes de plantas
superiores? Pesquise dois gêneros fúngicos sapróbios de interesse médico.
4. Cite dois ciclos biogeoquímicos, salientando sua importância e os micro-
organismos envolvidos.
5. Conceitue rizosfera. Explique as principais funções desta região exemplifi-
cando os principais micro-organismos que lá habitam.
Leituras
SILVEIRA, A. P. D.; FREITAS, S .S. Microbiologia do solo e qualidade ambien-
tal. São Paulo: Instituto Agronômico, 2007.
Sites
http://www.bdt.fat.org.br/bacteria/
Referências
PELCZAR, M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia Conceitos e
SILVA FILHO, G. N.; OLIVEIRA, V. L. Microbiologia - Manual de aulas Práti-
cas. Florianópolis: Editora da UFSC, 2007.
LACAZ-RUIZ, R. Manual Prático de Microbiologia Básica. São Paulo: Edi-
tora USP, 2000.
Capítulo 13
Microbiota do Corpo Humano
Objetivos
l Trabalhar o conceito de Microbiota
l Conhecer os micro-organismos que fazem parte da Microbiota normal do

corpo humano.

l Amostras biológicas

l Lamparina ou Bico de Bunsen
l Swabs.
l Placas com meio de cultura.

Visualização da microbiota normal
l Dividir a placa em 4 quadrantes
1º quadrante: Dorso da língua
l Com auxílio de um swab umedecido em salina estéril, raspar delicadamente
o dorso da língua do voluntário;
l Estriar no meio de cultura;
2º quadrante: Lábios
l Beijar o meio de cultura
3º quadrante: Cabelo
l Com auxílio de um swab umedecido em salina estéril, raspar delicadamente
a região do coro cabeludo e cabelos.
4º quadrante: Narina
l Com auxílio de um swab umedecido em salina estéril, introduzir delicada-
mente na narina, fazer movimentos rotacionais por alguns segundos;
l Estriar no meio de cultura;
l Inverter as placas e incubá-las em estufa bacteriológica a 37 °C de 18 a 24 h;
l Observar o crescimento microbiano.
Introdução
Todo ser humano nasce livre de qualquer microrganismo. Porém, durante a
passagem pelo canal vaginal durante o parto, há o primeiro contato do recém
nascido com diversos micro-organismos oriundos da microbiota da mãe.
O termo MICROBIOTA é tido como o conjunto de micro-organismos
que estabelecem uma residência fixa ou temporária no corpo, mas que, em
condições normais, não produzem quaisquer doenças.
1. A Microbiota Humana: desenvolvimento e interações

A microbiota normal de um ser humano é formada basicamente por bactérias,
fungos (principalmente leveduras) e protozoários. No corpo humano há cer-
ca de 10 trilhões de células, divididas entre somáticas e reprodutivas e 100
trilhões de micro-organismos habitando regularmente diversos sítios, como
boca, pele, trato respiratório, entre outros. Diversas bactérias24 vivendo har-
monicamente na boca, cepas de leveduras do gênero Candida presentes na
vagina e protozoários habitantes do intestino como Trichomonas hominis são
exemplos clássicos da nossa microbiota.
O desenvolvimento da microbiota normal e como ela se desenvolve são
fatos interessantes. Um dos primeiros presentes que recebemos de nossa
mãe ao nascer são alguns micro-organismos que irão fazer parte da microbio-
24
Escherichia coli, está ta residente, iniciando pela pele. No interior do útero, o feto é isento de micro-
presente normalmente no
organismos, porém, imediatamente após o parto, seja ele natural ou cesaria-
intestino grosso, mas quando
passa a existir em outros na, bem como pela amamentação, a microbiota começa a se desenvolver,
órgãos como bexiga, pulmão, colonizando a pele, orofaringe, trato respiratório, gastrointestinal e por fim as
pode causar infecções do mucosas. Essa é a sequência de colonização dos micro-organismos.
trato urinário e respiratório,
A transmissão da microbiota é feita de duas maneiras, podendo ser de
respectivamente.
modo vertical, quando há a transmissão da mãe para a prole, ou horizon-
tal, quando é transmitida de indivíduo a indivíduo. O desenvolvimento desses
micro-organismos é dado por sucessões, ou seja, haverá o aparecimento de
várias gerações, desde segundos após o nascimento, até depois da morte,
quando os micro-organismos passam a ser saprófitas.
Existe uma contínua modificação da microbiota durante a vida, onde
fatores como idade, sexo, dieta, condições sanitárias, higiene pessoal e bem
estar físico afetam diretamente a colonização do corpo.
Uma vez tendo o microrganismo entrado em contato com seu hospe-
deiro, essa exposição poderá resultar em:
Colonização transitória: quando o contato se dará por curto período de tem-
po, de horas até, poucas semanas, e a eliminação se dará facilmente, seja
por métodos mecânicos (como a lavagem de mãos, por exemplo), ou atra-
vés da maquinaria imunológica corporal;
Colonização permanente: quando o micro-organismo passa a coexistir com

regularidade em determinada idade e superfície, sendo recomposta a sua
população rapidamente se perturbada;
Aparecimento de doença: quando o micro-organismo passa a causar al-
gum tipo de dano ao corpo, seja como um microrganismo patogênico,
seja por ter colonizado alguma outra parte do corpo da qual originalmente
não fazia parte.
Assim, os micro-organismos da microbiota podem existir como mutualis-
tas (quando protegem o hospedeiro sem causar-lhe danos, obtendo benefícios),
comensais (quando aparentemente não há benefícios ou malefícios a ambos) e
oportunistas (quando causam doenças em indivíduos imunossuprimidos).
2. Funções da Microbiota
A microbiota constitui um dos mecanismos de defesa mais eficazes do corpo,
além de participar de diversas outras atividades.
Na defesa, ela atua na interferência bacteriana, competindo com bacté-
rias patogênicas e estimulando o desenvolvimento das defesas imunológicas.
Há também o auxílio na fabricação e absorção de nutrientes, com a produção
de vitaminas do complexo B e vitamina K.
3. Microbiota Normal do Corpo

3.1 Microbiota da Pele
Os principais representantes são:
l Acinetobacter sp. l Micrococcus sp.
l Aerococcus sp. l Propionibacterium sp *
l Bacillus sp. l Staphylococcus sp.
l Clostridium perfringens l Streptococcus sp.
l Corynebacterium sp.
* Propionibacterium sp, muito conhecido por causar as tão famosas e inde-

sejáveis acnes.
3.2 Microbiota dos Olhos/Conjuntiva

l Estafilococos coagulase-negativos
l S. epidermidis
l Corynebacterium sp.
3.3 Microbiota da Boca

Os principais representantes da microbiota oral são:
l Streptococcus mutans
l Neisseria sp.
l Actinobacillus actinomycetemcomitans
l Fusobacterium nucleatum
l Treponema denticola
l Actinomyces viscosus
l Candida sp.
3.4 Microbiota do Trato Respiratório

l Actinomyces sp.
l Mycoplasma sp.
l Streptococcus sp. (inclusive S. pneumoniae)
l Staphylococcus sp.
l Neisseria meningitidis
l Haemophilus influenzae
l Candida sp.
l Entamoeba gingivalis
l Trichomonas tenax
3.5 Microbiota do Estômago, Esôfago e Intestino

A microbiota do trato gastrointestinal é bem diversificada. O esôfago, quando
sadio, é praticamente livre de micro-organismos, aparecendo apenas bactérias
transitórias oriundas da boca indo em direção ao estômago, que possui severas
condições ambientais provocadas pela acidez estomacal. O número de bac-
térias presentes no estômago é da ordem de 10 bactérias por mL de conteúdo
estomacal, número bem menor que o encontrado no bolo alimentar, que possui
cerca de 105 bactérias por grama. Espécies de Candida sp. e bactérias como
Lactobacillus sp., Streptococcus sp. e Helicobacter pylori são comumente en-
contradas no estômago. Esta última é conhecida por causar quadros de gastrite.
No intestino delgado encontramos inúmeras bactérias, fungos e parasi-
tas vivendo harmonicamente. O aumento do pH nesse trecho propicia melho-
res condições de sobrevivência, sendo encontradas cerca de 107 bac/mL no
duodeno e jejuno. Bactérias como Clostridium sp., Enterococcus sp., Peptos-
treptococcus sp., Streptococcus sp. e Prevotella sp.são comumente encontra-
das, bem como espécies de Candida sp.
No intestino grosso encontramos a maior microbiota do corpo humano,

composta por mais de 1011 bactérias por grama de conteúdo fecal, sendo a
maioria anaeróbias, correspondendo a até 70% do peso seco das fezes. A co-
nhecida flora intestinal participa de vários processos no corpo, como a síntese
de vitaminas K e do complexo B, além de competir com possíveis patógenos.
Bactérias como Bacteroides sp., Fusobacterium sp., Lactobacillus sp., entero-
bactérias, Bifidobacterium sp., Enterococcus sp. e Clostridium difficile, sendo
este último relavionados a um quadro de diarréia associada ao uso de antibió-
ticos, causada por toxinas liberadas por essa espécie. Além das bactérias ci-
tadas, é comum encontrarmos fungos do gênero Candida, e também parasitas
como Endolimax sp., Entamoeba coli, Entamoeba sp.e Trichomonas hominis.
3.6 Microbiota do Trato Genitourinário

Em condições normais, órgãos do trato urinário como rins, ureteres e bexiga
são estéreis. Na uretra anterior, na sua porção mais inicial, é comum haver
uma grande variedade de micro-organismos, inclusive bactérias de origem
fecal, devido à proximidade com o ânus, nas mulheres.
A microbiota da vagina é formada por uma população extremamente va-
riável, devido a variações de idade, pH, hábitos sexuais e fatores hormonais. O
uso contínuo de antibióticos pode levar ao aparecimento de infecções fúngicas
vaginais, causadas por fungos do gênero Candida, que também são compo-
nentes da microbiota. Também fazem parte da microbiota do trato genital bacté-
rias como Lactobacillus sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Ureaplasma
sp., Corynebacterium sp., Enterococcus sp. e Gardnerella vaginalis.
1. Faça um desenho esquemático da placa de Petri e explique os resulta-
dos obtidos.
2. Como a microbióta consegue modular o sistema imune?
3. Como alguns micro-organismos da microbiota normal podem se tornar
patógenos oportunistas? Qual a diferença entre colonização e doença.
Cite exemplos.
4. Como a microbióta natural pode oferecer proteção contra a invasão por
micro-organismos patogênicos?
5. Defina pré e probióticos.
Leituras
Projeto Micro-organismos. http://www.fam.br/micro-organismos/bacteriologia_
microbiologia_ _humana_pele_e_conjuntiva.htm
Referências
Atheneu, 2002.
Capítulo 14
Micro-organismos em
Processos Biotecnológicos
Objetivo
l Observar a presença de micro-organismos em produtos comerciais obtidos
pela atividade microbiana.

l Fermento para fabricação de pães;
l Iogurte e Bebida Fermentada (tipo Yakult®);
l Lâminas e Material para executar a técnica de coloração de Gram.
l Preparar esfregaços a partir de fermento, iogurte e bebida fermentada (tipo
Yakult®);
l Corar utilizando a coloração de Gram;
l Visualizar as lâminas em microscópio óptico.
Introdução
O termo Biotecnologia se refere a um conjunto de tecnologias utilizadas em di-
versos setores da economia e que têm em comum o uso de micro-organismos
vivos ou células e moléculas, para a produção de bens e serviços (SILVEIRA
et al., 2004). Mais resumidamente, segundo BUIATTI (2004), biotecnologias
são tecnologias em que são utilizados seres vivos como instrumentos para
mudar o mundo.
Há centenas de anos, a humanidade consome alimentos produzidos
pela ação de micro-organismos. Pão, vinho, queijo e iogurte são alguns exem-
plos de produtos derivados da atividade microbiana. No entanto, somente há
cerca de 100 anos, os cientistas demonstraram que os micro-organismos são
responsáveis por esses produtos.
25
As leveduras estão entre
os micro-organismos mais
Especialmente após a Primeira Guerra Mundial, os micro-organismos amplamente utilizados pela
passaram a ser reconhecidos e amplamente utilizados na produção de ali- indústria. Alem da importância
mentos, vacinas, antibióticos e vitaminas, além de substâncias químicas, na panificação e produção
de bebidas as leveduras
como o etanol, a acetona e o ácido cítrico. Eles são utilizados como verdadei- podem ser cultivadas
ras “fábricas” para produzir substâncias químicas de interesse humano, que visando a utilização como
outros organismos não conseguem produzir. complemento alimentar.
Os micro-organismos e, particularmente, suas enzimas, têm substituído

uma série de processos químicos envolvidos na fabricação de substâncias,
como, por exemplo, papel e tecido. As vantagens da utilização dos mesmos
incluem o fato de não ocorrer produção de resíduos tóxicos ou difíceis de lidar,
de os micro-organismos atuarem sob temperaturas e pressões normais, evitan-
do a necessidade de sistemas pressurizados, e por utilizarem fontes de amido
derivadas de matéria prima barata e abundante (TORTORA et al., 2012).
1. Utilização dos micro-organismos

1.1 Na indústria alimentícia
Alguns dos processos mais utilizados na indústria alimentícia que têm a partici-
pação de micro-organismos são a fermentação lática e a fermentação alcoólica.
Vários integrantes da família Lactobacteriaceae e do gênero Lactococ-
cus são utilizados na fermentação lática, produzindo o ácido lático que é im-
prescindível na fabricação de diversos laticínios como queijos e iogurtes.
Na fermentação alcoólica, os micro-organismos utilizados são, em ge-
ral, do gênero Saccharomyces, cuja espécie mais conhecida é a S. cerevise-
ae. Este tipo de fermentação está diretamente relacionado com a produção
de pães e de diversas bebidas como o vinho, a cerveja, a cachaça e o uísque.
1.2 Na indústria de cosméticos

A função do setor de Microbiologia em uma fábrica de cosméticos é monitorar
o teor microbiano de todos os sistemas envolvidos na produção e mantê-los
livres de contaminação. A carga microbiana das matérias-primas e a atividade
antimicrobiana dos conservantes devem ser sempre monitoradas.
Além do controle microbiano dos produtos fabricados, a Microbiologia
está inserida na indústria cosmética na síntese de determinados produtos
como o botox, produto do metabolismo da bactéria Clostridium botulinum cuja
principal ação é bloquear a liberação do neurotransmissor acetilcolina, respon-
sável pela contração muscular, secreção salivar e das glândulas sudoríparas.
1.3 Na medicina
A utilização de micro-organismos na medicina abrange diversos setores. Para
indústria farmacêutica, por exemplo, eles contribuem com o desenvolvimento
de novos medicamentos. Um dos exemplos clássicos é o do fungo Penicillium
spp., descoberto pelo médico e bacteriologista escocês Alexander Fleming
enquanto observava uma cultura de bactérias do gênero Staphylococcus spp..
O isolamento da penicilina foi de importância crucial para o desenvolvimento
de diversas drogas antimicrobianas. Durante a Segunda Guerra Mundial, ela

foi responsável por salvar a vida de milhões de soldados feridos que haviam
contraído algum tipo de infecção.
Outro exemplo a ser citado é o da produção de insulina por bactérias.
A partir do isolamento do RNAm do gene que codifica a insulina, obtém-se
um cDNA que é inserido num plasmídeo e, por sua vez, é inserido em uma
bactéria. A bactéria mais comumente utilizada é a Escherichia coli, justamente
pelo fato de ser o micro-organismo sobre o qual mais se tem conhecimento.
Estas bactérias reproduzem-se em elevadas quantidades e produzem eleva-
do número de proteínas que, depois de extraídas e purificadas, podem ser
administradas aos pacientes que necessitam destas para manter o nível de
glicose no sangue.
1.4 No Bioterrorismo
O bioterrorismo é caracterizado pela liberação intencional de produtos quí-
micos ou agentes infecciosos prejudiciais à saúde e ao meio ambiente. Os
avanços nas pesquisas acerca de diversos micro-organismos com potencial
bioterrorista têm provocado um alerta mundial quanto aos riscos envolvidos
em possível ataque com agentes biológicos. A União Européia vêm estabe-
lecendo uma parceria com diversos países e com a Organização Mundial da
Saúde, visando a prevenção e possível reação em âmbito mundial frente à
ameaça potencial que o bioterrorismo representa.
Um exemplo de micro-organismo com grande potencial bioterrorista é o
Bacillus anthracis, o qual provoca uma infecção conhecida como antraz. Essa
bactéria está normalmente presente em animais como o gado bovino e outros
animais herbívoros, embora também possa aparecer em pessoas expostas
a animais infectados ou a seus produtos, podendo ser contraída através da
ingestão da carne desses animais ou do simples manuseio dos produtos in-
fectados, além da própria inalação. É a forma inalatória que é utilizada em
bioterrorismo, pois é de fácil dispersão. Estima-se que 10 kg de esporos em
condições ideais possam contaminar 100 mil pessoas em uma semana. Fe-
lizmente, é raro conseguir esporos em condições ideais, o que torna o antraz
uma arma biológica não muito fácil de ser utilizada.
1.5 Na engenharia genética

Um dos exemplos da multidisciplinaridade presente na Biotecnologia é o da
bactéria termófila Thermus aquaticus. Este microrganismo é de grande utilida-
de na engenharia genética, pois uma de suas enzimas, a DNA polimerase, é
capaz de sintetizar DNA a 72 °C, sendo a enzima de eleição para a maioria
das aplicações na reação em cadeia da polimerase (PCR).
A Taq DNA polimerase consiste numa cadeia polipeptídica simples, com

um peso molecular de aproximadamente 95 kD e com uma temperatura ótima
de atividade de 75 ºC. A enzima é obtida a partir de células de Escherichia coli
nas quais está clonado o gene poI de Thermus aquaticus.
1. Uma garrafa de vinho tinto “orgânico” (sem conservantes) parcialmente
consumida é novamente tampada e armazenada sob refrigeração. Ao pro-
var novamente o vinho, você percebe um novo sabor azedo característico,
que impossibilita seu consumo. Descreva o que pode ter acontecido com o
vinho e que processo microbiano ocorreu.
2. Pesquise sobre o tema: Micro-organismos X Indústria cervejeira.
3. Dona Maria estava tentando fazer uma receita de pão salgado, e viu que
teria que adicionar açúcar. Ajude Dona Maria e explique porque devemos
adicionar açúcar quando estamos preparando pão, mesmo no preparo de
pães salgados.
4. Recentemente foi publicado um artigo sobre uma bactéria com material genéti-
co completamente sintetizado a partir de informações de computador. Comen-
te sobre os possíveis riscos e benefícios dessa criação. (máximo 15 linhas).
Sites
http://www.saudenainternet.com.br/portal_saude/cuidado-com-
os-cosmeticos.php
http://pt.wikibooks.org/wiki/Engenharia_gen%C3%A9tica/As_DNA_polimera-
ses_Taq_e_Pfu
http://www.hottopos.com/regeq10/rafael.htm
http://www.anbio.org.br/pdf/2/mct_recursos_biologicos.pdf
http://www.redetec.org.br/inventabrasil/crescer.htm
http://www.unicamp.br/fea/lsfm/cursos/ta918_13.html
http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/ma002/capitulos/cap4.html
Referências
BUIATII, M. Biotecnologias: a engenharia genética entre biologia, ética e
mercado. São Paulo: Edições Loyola: Paulinas, 2004.
SILVEIRA, J. M. F. J., POZ, M. E. D., ASSAD, A. L. D. Biotecnologia e recur-
sos genéticos. Campinas: FINEP, 2004.
www.abc-cosmetologia.org.br/biblioteca/descr_revistas.php?id=35
www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/infantil/bioterrorismo.htm
www.pwp.netcabo.pt/sistema.imune/Producao_Insulina.htm
www.naturale.med.br/botox.htm
www.emglab.com.br/html/toxina_botulinica.html
http://ec.europa.eu/health-eu/my_environment/bio_terrorism/index_pt.htm
www.unificado.com.br/calendario/09/penicilina.htm
Capítulo 15
Análise macro e
micromorfológica dos Fungos
Objetivos
l Verificar o crescimento fúngico em meio de cultura;
l Definir e descrever as características macromorfológicas das colônias fúngicas;
l Diferenciar macroscopicamente os fungos filamentosos das leveduras;
l Conhecer e classificar as principais estruturas de ornamentação e frutificação;
l Diferenciar através de estruturas microscópicas alguns gêneros e/ou espé-
cies fúngicas.

l Caixa de lâminas com preparações fixas
l Colônias fúngicas desenvolvidas em ágar batata
Corante lactofenol azul-algodão
l Estantes para tubos de ensaio e lamparina
l Garfo de platina
l Lâminas, lamínulas e microscópio óptico
l Placas de Petri médias
l Pincel atômico para identificação.

l Esterilizar na lamparina a pinça e a lâmina de microscópio;
l Colocar 1 ou 2 gotas do corante lactofenol azul-algodão sobre uma lâmina
de microscopia limpa;
l Retirar um pequeno fragmento da colônia a ser estudada com o auxílio de
um garfo de platina, devidamente flambado, e colocar sobre a lâmina;
l Cobrir com uma lamínula esterilizada;
l Observar ao microscópio óptico na objetiva de 40X, procurando estruturas
reprodutivas e de ornamentação;
26
Características Introdução
morfológicas dos
fungos Leveduras Os fungos estão amplamente distribuídos na natureza, sendo encontrados em
• Macro: apresentam colônias quase todos os lugares do planeta Terra; alguns (fungos saprófitas) vivem na
de aspecto glabroso,
matéria orgânica, na água e no solo, e outros (fungos parasitas) vivem na su-
às vezes, intensamente
mucóides, apresentando perfície ou no interior de animais e vegetais (BURTON; ENGELKIRK, 2005).
uma variação de tons que Alguns são prejudiciais, enquanto outros são benéficos. Nos últimos
vai do branco ao creme,
anos, a incidência de infecções causadas por fungos nos seres humanos tem
algumas podem apresentar
matizes diferenciados do aumentado, como as infecções hospitalares em indivíduos com sistema imu-
salmão ao preto. nológico comprometido. Além disso, os fungos podem produzir micotoxinas
• Micro: numerosas (aflotoxinas) que contaminam alimentos (principalmente grãos e sementes)
estruturas redondas ou
e podem também produzir doenças em vegetais, prejudicando plantações
ovaladas, unicelulares,
algumas apresentando (JORGE, 2008).
brotamento, denominadas Por outro lado, alguns fungos filamentosos e leveduras26 são benéficos
blastoconídios.
para o homem, auxiliando na indústria alimentícia, através da fabricação de
• Diagnóstico laboratorial:
semeaduras secundárias queijos, cervejas, vinhos e outros alimentos, e na industria farmacêutica, atra-
em meios mais específicos, vés da produção de antibióticos (JORGE, 2008).
técnica do microcultivo,
provas bioquímicas e
enzimáticas. 1. Macromorfologia dos fungos
A cultura de um micro-organismo refere-se à capacidade que este tem de
crescer em meios nutritivos especiais, sendo evidenciado macroscopicamen-
te pela formação de uma unidade estrutural, denominada de colônia.
A caracterização de uma colônia fúngica consiste na análise de um
conjunto de características subjetivas, de expressão fenotípica, encontradas
em uma espécie. Não raro, tais características deixam de manifestar-se e
apontam em direção a uma espécie fúngica, não correlacionada aos achados
microscópicos e clínicos.
Devemos lembrar que os fungos são organismos que apresentam um
pleomorfismo acentuado, o que pode inviabilizar sua identificação. Dessa
forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colônia fúngica possa
sugerir, indicar e, muitas vezes, até acertar o caminho da identificação, não
se deve, contudo, considerá-la como a única ou a principal forma de iden-
tificação fúngica. Visto que quando usada como único critério pode levar o
micologista a diagnósticos pouco precisos ou incorretos.
1.1 Caracterização das colônias

As colônias de um determinado micro-organismo geralmente apresentam
morfologias típicas, quando estes são semeados em meios de cultura com a
mesma composição química. No entanto, antes de determinar as caracterís-
ticas macroscópicas de uma colônia, é preciso certificar-se de que a colônia
está pura, isto é, sem outros micro-organismos presentes.

As colônias fúngicas são constituídas de 4 zonas concêntricas:
27
Fungos Filamentosos
• Macro: apresentam colônias
com imensa diversidade
de relevos, texturas e
pigmentações.
• Micro: constituídos por um
conjunto de estruturas
Figura 1 – Colônia de Penicillium sp., evidenciando as zonas de uma colônia fúngica. tubulares, denominadas
de hifas, que, quando
I: Zona Periférica; II: Zona de Crescimento; III: Zona de Frutificação; IV: Zona Central.
agrupadas, denominam-se
Fonte: http://cpralmun.educa.aragon.es/wq/microbio/images/penici.jpg
de micélio.
• Diagnóstico laboratorial:
Na observação das características macroscópicas dos fungos27, devem- semeaduras secundárias
se observar os seguintes aspectos: em meios mais específicos,
técnica do microcultivo,
Tamanho: a colônia pode apresentar-se com tamanho bastante variável; provas nutricionais.
Bordos: na periferia das colônias fúngicas, podem ser observadas muitos de-
senhos, além do mais, também se observa uma variação da coloração destes
em relação ao centro;
Textura: classificação em diversos tipos, por exemplo: colônias algodonosas,
furfuráceas, penugentas, arenosas, veludosas, glabrosas, entre outros.
Relevo ou Topografia: as colônias podem apresentar-se como: colônias
cerebriformes, rugosas, apiculadas, crateriformes, entre outras.
Pigmentação: deve-se levar em consideração o pigmento no verso e no re-
verso da colônia e o se o mesmo é difusível no meio de cultura.
2. Micromorfologia dos fungos

Conforme visto anteriormente, o conjunto das estruturas fúngicas pode ser
observado a olho nu, como é o caso da colônia fúngica; entretanto, para vi-
sualizar suas microestruturas faz-se necessário a utilização das técnicas de
microscopia, visto que nesses achados repousam os fundamentos da classi-
ficação taxonômica dos fungos.
2.1 Achados à microscopia óptica que caracterizam

primariamente os fungos
A forma primária de observação dos fungos em viabilidade biológica, isto é, capa-
zes de assimilar nutrientes e de se reproduzir, é denominada de forma vegetativa.
Essa forma caracteriza-se por uma grande variedade de apresentações
estruturais, que vão desde uma forma unicelular, conhecida como leveduras,
a formas filamentosas e complexas, sendo estas últimas as mais abundantes
na natureza. A forma filamentosa é constituída de um conjunto de estruturas
denominadas de hifas, que, quando agrupadas, denominam-se micélio.
2.2 Achados à microscopia óptica que caracterizam

secundariamente os fungos
Chamamos de caracterização secundária a presença de estruturas passíveis
de serem encontradas em algumas espécies fúngicas, importantes na dife-
renciação para a classificação fúngica, conhecidas como:
l Estruturas de Frutificação
l Estruturas de Ornamentação
2.2.1 Estruturas de Frutificação

São células componentes das hifas que, em determinadas situações bioló-
gicas, sofrem modificação para dar origem a dois tipos celulares primários:
l Células Esporogênicas
l Células Conidiogênicas
Essas células em sua essência final têm a mesma função na estrutura
do fungo, isto é, originar estruturas responsáveis pela reprodução assexuada
dos fungos filamentosos, bem como dos fungos dimórficos que estão na fase
filamentosa. O quadro lista as principais diferenças estruturais entre as células
esporogênicas e conidiogênica.
Quadro 1
Diferenças entre células esporogênicas e conidiogênicas
Células Esporogênicas Células Conidiogênicas
Originam estruturas denominadas esporos, que se situam Originam estruturas denominadas conídios, não possuem
dentro de uma bolsa denominada esporângio. estrutura de envolvimento externo.
Formação pelo processo denominado esporogênese. Formação pelo processo denominado conidiogênese.
Gênero: Rhizopus sp. Gênero: Aspergillus sp.

2.2.2 Estruturas de Ornamentação

São estruturas auxiliares na identificação dos fungos28, apresentando-se em
grande variedade, não sendo propriamente específicas de uma ou outra espécie
fúngica; mesmo assim, são muito úteis no diagnóstico específico destes seres.
Não se conhece até o presente a função dessas estruturas para a bio-
logia dos fungos. Entretanto, para os micologistas, elas podem ser de grande
importância na identificação desses organismos.
Dependendo da morfologia com que se apresentam as estruturas de
ornamentação, são conhecidas por nomes diferenciados, tais como: órgão
pectinado, hifa em espiral, hifa em raquete, candelabro fávico, “cabeça de
prego”, acládio, etc.
3. Quadro de identificação fúngica 28

Como processar uma
O quadro 2, enumera os principais achados microscópicos que caracterizam amostra com suspeita
fúngica?
alguns fungos patogênicos para os animais e os vegetais.
• Coletar o espécime
Quadro 2 biológico, de acordo com as
Principais achados microscópicos usados na caracterização de alguns normas de biossegurança;
fungos patogênicos de plantas e animais • Realizar o exame direto,
Fungo Achado microscópico característico para tanto, adicionar ao
espécime biológico uma
Aspergillus flavus Cabeça aspergilar
solução clarificante (KOH);
Candida spp. Blastoconídios • Realizar a cultura, para
Epidermophyton floccosum Apenas macroconídios em cachos tanto, se deve semear o
Fusarium spp. Macroconídios curvados espécime biológico nos
Conidióforo com fiálides e conídios dispostos em cadeias de extensão variável, seguintes meios de cultura
Penicillium spp. de isolamento primário:
aspecto de um garfo
Rhizopus spp. Estolões, rizóides e esporos irregulares dentro de esporângios • Ágar Sabouraud (S/A);
• Ágar Sabouraud com
Scopulariopsis spp. Conídios em cadeia
Cloranfenicol (S/C)
Trichophyton mentagrophytes Microconídios em cacho e hifas em espiral (gavinhas) • Ágar Sabouraud com
Trichophyton rubrum Microconídios piriforme, dispostos em acládio Cloranfenicol e Cicloeximida
Trichophyton schoenleinii Hifas em candelabro e hifas em cabeça de prego (S/CC)
• Aguardar o crescimento
das colônias fúngicas (de
4 a 20 dias em média) e
em seguida, estudar os
Atividades de avaliação aspectos macroscópicos e

microscópicos das colônias.
1. Um aluno precisava coletar amostra de uma colônia fúngica para passar

para outro meio. Qual (is) zona(s) concêntrica(s) ele deveria coletar a amos-
tra? Explique.
2. Sabe-se que os fungos conseguem utilizar diferentes substratos para de-
senvolverem suas colônias, por exemplo, o rejunte entre azulejos, material
de construção, diferentes alimentos etc. Quais os fatores nutricionais e físi-

cos que influenciam no crescimento fúngico? Cite pelo menos dois exem-
plos de cada e explique.
3. Algumas leveduras, como a Candida albicans, durante sua evolução na
vida vegetativa, isto é, quando os ciclos biológicos de nutrição e reprodução
se encontram ativos, podem apresentar uma forma filamentosa verdadeira,
independente da temperatura. Dentro da micologia qual o nome desse fe-
nômeno? Explique por que isso acontece.
4. Durante muito tempo, os fungos foram considerados como vegetais e, so-
mente a partir de 1969, passaram a ser classificados em um reino à parte.
Pesquise quais as características utilizadas para classificar junto às plan-
tas, e as que levaram a essa divisão.
Sites
www.doctorfungus.org/search/query.asp
www.terravista.pt/bilene/5547/
www.microbiologia.vet.br/fungos.htm
Referências
BURTON, G. R. W.; ENGELKIRK, P. G. Microbiologia para as ciências da
saúde. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005.
JORGE, A. O. C. Microbiologia - Atividades Práticas. 2 ed. São Paulo: Li-
vraria Santos Editora LTDA, 2008.
LACAZ, C. S. et al. Tratado de Micologia Médica – Lacaz. São Paulo: Sar-
vier, 2002.
SIDRIM, J. J. C. et al. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâne-
os. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
Capítulo 16
Microbiota do ar
Objetivos
l Conhecer a microbiota do ar.
l Diferenciar a qualidade do ar de ambientes fechados e abertos.
l Definir fungos anemófilos.
l Discutir técnicas de análise do ar.
29
Produção de bioaerossóis
Materiais utilizados na aula prática O uso incorreto de
l Placas de Petri de 150 mm equipamento de laboratório
como pipetas, alças de
l Meio ágar Sabouraud ou ágar Batata inoculação, agulhas,
l Pincel para identificação e filme transparente (PVC). seringas, centrífugas e
homogeneizadores, pode
produzir grandes quantidades
Procedimentos da aula prática de aerossóis potencialmente
infectantes.
l Aplicar a técnica da sedimentação passiva em placas de Petri num ambien-
Exemplos de procedimentos
te fechado (sala de aula) e num ambiente aberto a ser analisado e expor por que produzem aerossóis:
20 minutos; • destampar frascos que
l Vedar as placas de Petri contendo as amostras com filme transparente e foram fechados com tampa
de pressão;
encaminhar ao Laboratório de Microbiologia;
• esvaziar seringas ou
l Incubar a placa de Petri à temperatura ambiente, por três dias;
eliminar o ar das seringas;
l Fazer a verificação de presença ou ausência de crescimento no meio seme- • quebrar frascos que
ado baseado em características macroscópicas de colônias fúngicas. contenham cultura de
micro-organismos;
• centrifugar tubos ou frascos
Introdução sem tampa adequada;
Equacionar o problema do desenvolvimento sustentável, ou seja, viver em
harmonia com as atividades humanas que vêm alterando o ambiente natural
de forma rápida, e praticamente, irreversível para muitos ecossistemas, se
constituindo num dos grandes desafios da ciência moderna. Sendo fato, que
o aumento da contaminação do ar, principalmente nos grandes centros urba-
nos, tem se tornado cada vez mais importante como fonte de agravo à saúde
do homem e dos demais seres vivos.
A Aerobiologia é a ciência que estuda os organismos biológicos presen-
tes no ar, os bioaerossóis29, que são definidos como partículas de origem bio-
lógica suspensas no ar, geradas natural ou artificialmente, que podem existir
na forma de uma única célula, aglomerados de micro-organismos viáveis ou
partículas não viáveis de vários tamanhos.
Podem formar bioaerossóis os vírus, bactérias, propágulos fúngicos,

cistos de protozoários, grãos de pólen, fragmentos de plantas e de insetos,
dentre outros.
Figura 1 – Esporos de fungos coletados do ar e fotografados utilizando-se um micros-

cópio eletrônico.
Fonte: www.robotdobrasil.com.br
A colonização do ar depende das condições do ambiente, de forma

que os micro-organismos variam em qualidade e quantidade, dependendo do
local analisado, existindo dois tipos de microbiota aérea: a microbiota aérea de
ambientes fechados e a de ambientes abertos.
Muitos bioaerossóis presentes em ambientes internos são originados
de ambientes externos, daí as concentrações de ambientes fechados serem
geralmente inferiores as de ambiente aberto. Caso este cenário seja rever-
tido, é provável, que haja uma fonte de bioaerossóis no ambiente fechado,
tais como materiais de construção úmidos, livros e roupas sem conservação,
entre outros.
Os efeitos na saúde humana, decorrentes da exposição a micro-orga-
nismos, podem depender não somente da respectiva concentração do ar,
como também da espécie, viabilidade, condições de crescimento e tamanho
do bioaerossol.
Várias infecções transmitidas pelo ar são causadas por fungos, denomi-
nados comumente de fungos anemófilos.
1. Quem são os fungos anemófilos? 30

Dentre as micoses
pulmonares conhecidas,
São fungos encontrados dispersos no ar na forma de propágulos (esporos, a aspergilose é a mais
conídios, artroconídios etc), que, em contato com animais ou plantas, podem frequente, representando
um grupo de doenças que
vir a causar doenças, como alergias, afecções respiratórias e micoses30. Es-
sendo provocadas pelo
ses propágulos são denominados de aeroalérgenos. mesmo agente etiológico
São principalmente as espécies pertencentes aos gêneros: Alternaria; – Aspergillus, têm uma
patogênese variável. Das
Aspergillus; Bipolaris; Cladosporium; Curvularia; Fusarium e Penicillium.
espécies conhecidas, o
Aspergillus fumigatus é o que
mais frequentemente se torna
patogênico para o homem. É
um microrganismo saprófito
das vias respiratórias,
estando a infecção mais
dependente da imunidade
do hospedeiro do que da
virulência ou da patogênese
do fungo.
Figura 2 – Colônias fúngicas do gênero

Penicillium sp.
Fonte: www.sci.muni.cz
Entretanto, dependendo do grau de exposição, outras espécies podem

também colonizar o ar.
De maneira geral os esporos ou fragmentos de hifas podem ser inala-
dos, ou podem entrar no corpo por meio de uma ferida ou uma lesão na pele.
Os organismos inalados normalmente causam infecções pulmonares, mas
ocasionalmente podem disseminar-se, espalhar-se pelo corpo e produzir uma
infecção generalizada ou sistêmica, que frequentemente é fatal.
31
O Laboratório de
2. Técnicas para análise do ar Microbiologia - LAMIC/
UECE monitora a qualidade
Apesar da necessidade de monitoramento dos níveis de bioaerossóis na ava- do ar das principais
liação dos riscos para a saúde, diferenças entre amostradores automáticos e bibliotecas públicas de
Fortaleza/CE. O projeto
técnicas de cultivo dificultam a comparação dos resultados. tem duração de 3 anos
Diferentes testes de impacto em meios de cultura estão disponíveis no e o objetivo de identificar
mercado, a saber: e monitorar as espécies
fúngicas mais frequentes
l Técnica da Sedimentação Passiva em Placas de Petri; no ar ambiente e em livros,
l Coletores do Tipo Crivo (aparelhos de impacto sólido); buscando correlacioná-
las com a degradação de
l Coletores do Tipo Fenda (aparelhos de impacto líquido); obras literárias e ocorrência
l Análise de filtros de membrana. de micoses e problemas
respiratórias.
3. Legislação
No Brasil, o Conselho Nacional do Meio Ambiente, por meio da Resolução n°
3, de junho de 1990, estabelece os padrões de qualidade do ar nos ambientes
externos que, ultrapassados, poderão afetar a saúde, a segurança e o bem-es-
tar da população (CONAMA, 1990). Porém para os níveis de contaminantes
32
A limpeza periódica do ar-
condicionado, cortinas, biológicos do ar de interiores32, que variam enormemente em função do tempo
tapetes e do ambiente e espaço, não existem métodos e padrões amplamente aceitos no país.
são pontos fundamentais
Ressalta-se ainda a publicação de uma Orientação Técnica elaborada
para evitar as doenças
respiratórias. por Grupo Técnico Assessor, sobre Padrões Referenciais de Qualidade do Ar
Interior, em ambientes climatizados artificialmente de uso público e coletivo,
cujo valor máximo recomendável é < 750 ufc/m3, sendo inaceitável a presen-
ça de fungos patogênicos nesse tipo de ambiente (Resolução n. 176, 24 de
outubro e 2000).
1. Esquematize os resultados da aula prática, descrevendo os aspectos ma-
cromorfológicos das colônias fúngicas presente na placa de Petri. Fale so-
bre a qualidade do ar ambiente analisado por sua equipe.
2. A que se refere a “Síndrome dos Edifícios Doentes”? Trace um paralelo
entre alergias respiratórias e padrões de qualidade do ar.
3. Investigue sobre as principais técnicas para o exame microscópico das
colônias fúngicas cultivadas em meios de cultura (técnica da dissecação,
técnica da fita adesiva e técnica de cultivo em lâmina). Mostrando como
ocorrem seus procedimentos no laboratório.
4. Pesquise sobre a Resolução n. 176, de 24 de outubro de 2000. Aponte as-
pectos positivos e negativos.
5. Descreva, detalhadamente, como ocorre o controle da qualidade do ar em
um centro cirúrgico.
Sites
www.bdt.fat.org.br/sci?sci.dive.micr
www.fhomuv.com.br/tadeu/principios.ppt
www.mma.gov.br/biodiversidade/doc/microb1
www.bdt.fat.org.br/bacteria/
www.isao.bo.cnr.it/aerobio/ai/index.shtml
www.paaa.org/
www.pollenplus.com/
www.sci.utu.fi/biologia/aerobiologia
www.robotdobrasil.com.br
Referências
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução N° 3 de 18 de
junho, 1990. Padrões de qualidade do ar. Diário Oficial da União, 22/08/1990.
LACAZ, C. S. et al. Tratado de Micrologia Médica – Lacaz. São Paulo: Sar-
vier, 2002.
PANTOJA, L. D. M.; COUTO, M. S.; PAIXÃO, G. C. Diversidade de bioae-
rossóis presentes em ambientes urbanizados e preservados de um campus
universitário. O Biológico, v. 69, p. 41-47, 2007.
PANTOJA, L. D. M.; RIZZO, R. S.; CARVALHO, B. S.; CONDE, V. F.; GALAS,
K. S.; FONSECA, F. R. M.; PAIXAO, G. C.. Constituição da Micobiota Aérea
de Bibliotecas Públicas no município de Fortaleza, Estado do Ceará, Brasil.
Encontros Bibli: Revista Eletrônica de Biblioteconomia e Ciência da Infor-
mação, v. 17, p. 31-41, maio/ agosto, 2012.
Sobre os autores
Germana Costa Paixão: É Médica Veterinária formada pela Universidade Es-
tadual do Ceará/UECE e Mestre em Patologia pela Universidade Federal do
Ceará/UFC. É professora da UECE desde 2000, onde leciona a disciplina de
Microbiologia para os Cursos de Ciências Biológicas e Medicina. Também faz
parte do corpo docente do Curso de Enfermagem da Faculdade da Grande
Fortaleza- FAMETRO, ministrando as disciplinas de Microbiologia e Parasito-
logia. Coordena o Curso de Ciências Biológicas à distância da Universidade
Aberta do Brasil-UAB/UECE, desde 2008. Desenvolve pesquisas em Aeromi-
crobiologia e ensino de Microbiologia. É membro efetivo da Sociedade Brasi-
leira de Microbiologia/SBM.
Lydia Dayanne Maia Pantoja: É Bióloga (licenciada e bacharel) pela Univer-

sidade Estadual do Ceará/UECE, Mestre em Microbiologia Médica pela Uni-
versidade Federal do Ceará/UFC e Doutoranda do Programa de Pós-Gradua-
ção em Engenharia Civil (Saneamento Ambiental) pela Universidade Federal
do Ceará/UFC. Atuou como professora de Microbiologia e Parasitologia para
os cursos de Ciências Biológicas, Nutrição e Enfermagem da UECE. É tutora
à distância do curso de Ciências Biológicas da Universidade Aberta do Bra-
sil - UAB/UECE. Apresenta publicações científicas na área de microbiologia,
parasitologia, educação e meio ambiente.
Charles Ielpo Mourão: É Biólogo licenciado formado pela Universidade Esta-

dual do Ceará/UECE e Mestre em Ciências Médicas da Universidade Federal
do Ceará/UFC. Apresenta publicações na área de micologia, com ênfase em
variabilidade molecular, virulência e perfil antifúngico. Bem como, tem desta-
que na área de ensino em Microbiologia, tendo sido premiado pela Sociedade
Brasileira de Microbiologia por mérito científico.
Cláudia Suellen Ferro de Oliveira: É Bióloga (licenciada e bacharel) pela

Universidade Estadual do Ceará/UECE, Especialista em Microbiologia pela
Universidade Federal do Pará/ UFPA, Mestre em Doenças Tropicais pela Uni-
versidade Federal do Pará/UFPA e tem experiência principalmente nas áreas
de biologia geral, microbiologia, genética, imunologia e epidemiologia.
A não ser que indicado ao contrário a obra Ensino de Microbiologia através de experimentos práticos, disponível
em: http://educapes.capes.gov.br, está licenciada com uma licença Creative Commons Atribuição-Compartilha
Igual 4.0 Internacional (CC BY-SA 4.0). Mais informações em: <http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/
deed.pt_BR. Qualquer parte ou a totalidade do conteúdo desta publicação pode ser reproduzida ou compartilhada.
Obra sem fins lucrativos e com distribuição gratuita. O conteúdo do livro publicado é de inteira responsabilidade de
seus autores, não representando a posição oficial da EdUECE.
Ensino de Microbiologia através de experimentos prá�cos

F
iel a sua missão de interiorizar o ensino superior no estado Ceará, a UECE,
como uma ins�tuição que par�cipa do Sistema Universidade Aberta do
Brasil, vem ampliando a oferta de cursos de graduação e pós-graduação
na modalidade de educação a distância, e gerando experiências e possibili-
dades inovadoras com uso das novas plataformas tecnológicas decorren-
tes da popularização da internet, funcionamento do cinturão digital e
massificação dos computadores pessoais.
Comprome�da com a formação de professores em todos os níveis e
a qualificação dos servidores públicos para bem servir ao Estado, Ensino de Microbiologia
os cursos da UAB/UECE atendem aos padrões de qualidade
estabelecidos pelos norma�vos legais do Governo Fede- através de experimentos prá�cos
ral e se ar�culam com as demandas de desenvolvi-
mento das regiões do Ceará.

Universidade Estadual do Ceará - Universidade Aberta do Brasil

Geografia
12
História
Educação
Física
ISBN 978-85-78266-19-6
Ciências Artes
9 788578 266 1 96
Química Biológicas Plás�cas Computação Física Matemá�ca Pedagogia

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Germana Costa Paixão

Universidade Estadual do Ceará - Universidade Aberta do Brasil

Germana Costa Paixão

Presidenta da República Conselho Editorial

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

E59 Ensino de microbiologia : através de experimentos práticos /

Editora da Universidade Estadual do Ceará – EdUECE

Capítulo 9 – Anti-sepsia de Mãos: Experimento de Price......................... 85

A presente obra é resultado da compilação de aulas práticas que foram minis-

l Mostrar algumas definições para biossegurança

l Demostrar os símbolos utilizados em laboratórios.

treinamento específico nos procedimentos realizados na bancada e devem

Figura 1 – Típico laboratório NB1

O nível de Biossegurança 2 (NB-2) é semelhante ao nível de Biosse-

Figura 2 – Típico laboratório NB2

O nível de Biossegurança 3 (NB-3) possui semelhanças com os nível

Figura 3 – Típico laboratório NB2

O nível de Biossegurança 4 (NB-4) possui semelhanças quanto aos

Figura 4 – Funcionários em laboratório NB4

3. Boas Práticas Laboratoriais (BPL)

3.1 Medidas e Equipamentos de Proteção Individual e Coletiva

l Máscara com filtro apropriado;

3.2 Normas de conduta em laboratório de Microbiologia

17. O laboratório é um local de trabalho que exige calma e tranquilidade, por-

3.3 Sinalização de Laboratório

tório todos usavam jalecos, calça e sapatos fechados, as mulheres anda-

ro das vidrarias utilizadas nas aulas práticas.

Materiais utilizados na aula prática

Outro ponto importante na rotina de um laboratório de Microbiologia é

3. Preparo e montagem do material

MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKERT, J. Microbiologia de Brock.

l Identificar e executar as etapas da coloração de Gram.

Materiais utilizados na aula prática

ou seja, os corantes básicos tingem estruturas ácidas, como a cromatina nu-

1.3 Coloração especial

2.2 Definição e mecanismo simplificado

l Aplicação de um mordente, fixando ainda mais o corante aplicado anteriormente.

l Aplicaçãode uma solução descorante, que irá retirar o corante primário de

lores, ou seja, as que foram descoradas, enquanto que as bactérias coradas

2.3.1 Bactérias Gram-positivas

2.3.2 Bactérias Gram-negativas

2.3.3 Bactérias Gram Variáveis

2.3.4 Bactérias Não Reativas 5

2.5 Processo de coloração

9. Aplica-se a fucsina (contra-corante) por 30 segundos. Este irá corar as

Figura 7 – Streptococcus spp . Figura 8 – Escherichia coli .

Forma: Coco Forma: Bastonete

Materiais utilizados na aula prática

Procedimentos da aula prática

Certos micro-organismos crescem na maioria dos meios de culturas

1. Classificação dos meios de cultura

1.1 Quanto à consistência

1.2 Quanto à função

1.3 Quanto à composição

1.4 Quanto à natureza

2. Preparo de meio de cultura

l Pesagem do pó, geralmente orientada pelo próprio fabricante e condiciona-

autoclavação em uma outra vidraria, como um Erlenmeyer, e então, proce-

Figura 1 – Padrão típico de crescimento de uma cultura bacteriana em um siste-

Figura 2 – Diversos meios de cultura.

5. Cite e explique duas metodologias que podem ser utilizadas quando um