Secção Autónoma de Ciências

da Saúde

[Ano]
2009/2010

Introdução
Purificação de DNA plasmídico por lise alcalina:
Minipreparação de DNA

LBM2 – Procedimento 2

Grupo 2
Rafaela Silva Nº Mec 45653
Luísa Bastos Nº Mec 45895
Emanuel Fernandes Nº Mec 46035
Celina Sampaio Nº Mec 46100

ANA
EMANUEL
[Escolha a data]2º Ano | Ciências Biomédicas
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Introdução

Partindo de uma cultura de bactérias transformadas, é possível proceder à extracção e

purificação do DNA plasmídico que contém o fragmento de interesse (insert), sendo que
existem diferentes técnicas para o realizar.
Uma das técnicas mais conhecidas de extracção e purificação de DNA plasmídico é a
lise alcalina, que se baseia na desnaturação selectiva do DNA cromossomal, numa solução
alcalina (pH 12.0-12.5), seguida da sua precipitação, o que permite separá-lo do DNA
plasmídico [3].
A cultura de bactérias deve ser preparada através da inoculação de meio LB (contendo
um antibiótico apropriado) com uma colónia de bactérias transformada. O crescimento da
cultura em meio líquido é vantajoso, pois, ao contrário do que acontece nos meios sólidos, a
manipulação é mais fácil e prática. Para assegurar o crescimento, a cultura deve ser mantida a
37ºC, overnight, com agitação vigorosa, para um arejamento eficaz.
No início do processo, é necessário retirar o sobrenadante (meio LB com antibiótico, em
que as bactérias cresceram). Para tal, recorre-se a centrifugação, formando-se um pellet
composto pelas bactérias transformadas.
Quando o pellet está bem seco, adiciona-se 100μL de solução I (glucose, Tris-Cl e
EDTA). Esta solução serve para ressuspender as células. Contudo, a glucose permite manter a
osmolaridade do meio. Quanto ao Tris-Cl [1], enquanto tampão, permite a manutenção do pH
do meio. Por fim, o EDTA, por ser um quelante, tem a capacidade de sequestrar iões por
complexação, destabilizando as membranas das bactérias. Também inibe as DNases que podiam
degradar o DNA.
Uma vez formada a suspensão de bactérias, esta é tratada com 200μL de solução II
(NaOH e SDS). É esta solução que provoca a lise, pois o SDS, por ser um detergente,
desencadeia a ruptura das bicamadas fosfolipídicas, enquanto o NaOH, por ser uma base forte,
eleva grandemente o pH do meio, desnaturando as biomoléculas. A desnaturação das proteínas
membranares contribui para a degradação das membranas. No entanto, o aspecto mais relevante
é a desnaturação do DNA cromossomal (de cadeia linear), desnaturação essa que não se verifica
no DNA plasmídico circular [3].
Após a lise, adicionam-se 150μL de solução III (ácido acético glacial e acetato de
potássio). O ácido acético causa a neutralização do meio, ocorrendo a renaturação do DNA
cromossomal, que agrega (precipita) formando uma rede insolúvel [3]. Quanto aos iões acetato
e potássio, ao interagirem com as moléculas de água, vão promover a precipitação dos
complexos proteína-SDS e do RNA de elevado peso molecular [3]. Assim, por centrifugação,
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eliminam-se proteínas, DNA cromossomal e o RNA de elevado peso molecular. As soluções

usadas são arrefecidas em gelo para evitar o crescimento de contaminantes e possível
degradação enzimática, devido à libertação do conteúdo celular.
Descartado o pellet, procede-se ao tratamento do sobrenadante (contendo o DNA
plasmídico e pequenos RNAs) com etanol. O etanol é usado para precipitar o DNA plasmídico,
pois este composto, que é menos polar que a água, quando se encontra em elevada
concentração, acaba por interferir com as esferas de hidratação que se formam em torno dos
grupos carregados do DNA e que possibilitam a sua estabilização em solução aquosa. Desta
forma, as interacções entre os fosfatos e os grupos positivos intensificam-se, ocorrendo a
precipitação do DNA. Os iões acetato e potássio, anteriormente adicionados, também
contribuem de certa forma para esta precipitação, pois têm que ser hidratados, interferindo
também na hidratação do DNA. À medida que o pellet vai ficando menos hidratado, denota-se
uma diminuição do seu tamanho.
Após a evaporação do etanol, o pellet desidratado e composto por DNA plasmídico e
pequenos RNAs remanescentes é solubilizado em 50μL de água contendo RNase A, que digere
as moléculas de RNA existentes, terminando a purificação.

As proteínas estão estreitamente ligadas ao DNA, pelo que quando o DNA é isolado dos
organismos, a sua completa remoção nem sempre é possível. Desta forma, é frequente a
contaminação por proteínas. Posto isto, para aferição da pureza e concentração do DNA
presente na solução, basta recorrer à medição da densidade óptica utilizando radiação
ultravioleta, num espectrofotómetro. O DNA e o RNA absorvem intensamente radiação com
λ=260nm, devido às bases púricas e pirimídicas. Por oposição, as proteínas absorvem sobretudo
na gama dos 280nm, como resultado da presença de aminoácidos aromáticos como o triptofano
e a tirosina, e os fenóis na gama dos 270nm [1], [2]. Perante estas características de absorção, o
cálculo da razão DO(260nm)/DO(280nm) permite avaliar a pureza do DNA, que surge quando
o quociente é 1.8. Isto acontece uma vez que, para o DNA, a densidade óptica a 260nm tende a
ser aproximadamente o dobro da densidade a 280nm, pelo que o quociente é próximo de 2,
quando o DNA é puro. Uma razão A260/A280 entre 1.7 e 2.0 geralmente representa uma amostra
de DNA de pureza entre 70% e 95%.
Perante contaminação por proteínas e fenóis, o valor do denominador aumenta,
tornando a razão menor que 1.8. Contaminação por RNA eleva o numerador, elevando o
resultado do quociente (para valores maiores do que 2).
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Para cálculos de concentração, basta aplicar a Lei de Lambert-Beer (λ=260nm). As

cuvettes utilizadas devem ser de quartzo e não plástico, pois a radiação usada é UV, pelo que
cuvettes de plástico podem ser degradadas ou interferir no procedimento experimental [1].
No presente relatório, relativo à actividade experimental “Purificação de DNA
plasmídico por lise alcalina – Minipreparação de DNA”, são apresentados os resultados obtidos
na purificação de DNA pelo processo acima descrito. O objectivo principal é a obtenção de
amostras puras de plasmídio X e Y, para futura elaboração dos seus mapas de restrição.

Objectivos
- Isolamento de DNA plasmídico a partir de culturas bacterianas por lise alcalina (extracção e
purificação de DNA).
- Determinação da concentração e pureza do DNA extraído.

Procedimentos
A actividade prática foi realizada de acordo com o previsto no protocolo do
Procedimento 2 do Guia de Estudante 2009/2010. Contudo, este sofreu pequenas alterações. Em
primeiro lugar, aquando da transferência do sobrenadante contendo DNA plasmídico e
pequenos RNA’s (passo 10 do protocolo), não bastou uma simples decantação, tendo sido
utilizada a micropipeta como meio auxiliar para a completa extracção do sobrenadante, evitando
assim contaminação por partículas do pellet. As partículas que ainda assim contaminaram o
sobrenadante extraído foram removidas com auxílio de uma ponta de micropipeta.
Relativamente ao passo 17, foi efectuado um acréscimo. De facto, após dissolver o DNA em 50
µl de H2O contendo RNase A, a 20 µg/ml, e vortexar gentilmente durante alguns segundos, foi
necessário aguardar durante dez minutos, para posteriormente se efectuar um short-spin, depois
do qual foi também necessário aguardar cinco minutos, passo esse que não se encontrava
contemplado no protocolo acima mencionado.
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Resultados Obtidos

Tabela 1 – Resultados obtidos na análise das amostras ao espectrofotómetro. Para cada elemento do
grupo são indicados dois microtubos, estando estes numerados. Aos tubos que apresentam o número 2
corresponde um factor de diluição de 500 e aos que apresentam o número 3 corresponde um factor de 300
(ver passo 18 do protocolo). As concentrações de DNA plasmídico Y são expressas em mg/mL para
facilitar a apresentação dos resultados, tendo sido calculadas a partir das várias DO(260nm). A razão
DO(260nm)/DO(280nm) foi utilizada para estimar a pureza.

Concentração
de DNA
Elemento do DO(260nm)/
Tubo DO(260 nm) plasmídico Y DO(280 nm)
grupo DO(280nm)
na amostra
(mg/mL)
2 0.0882 2.205 0.0482 1.8377
Emanuel
3 0.2520 2.520 0.1300 1.9380
2 0.1253 3.133 0.0657 1.9073
Rafaela
3 0.3588 3.588 0.1830 1.9608
2 0.0075 0.188 0.039 1.9741
Luísa
3 0.0215 0.215 0.0104 2.0534
2 0.1424 3.560 0.0682 2.0096
Celina
3 0.0865 0.865 0.0457 1.8940

Tabela 2 – Médias para a concentração de DNA plasmídico Y (mg/mL) da amostra purificada e

para as razões DO(260nm)/DO(280nm). Os valores foram obtidos através da média aritmética dos
valores correspondentes obtidos na Tabela 1. Uma das médias de concentração está entre parênteses, pois
não é muito conclusiva. Com efeito, os valores correspondentes da Tabela 1, usados no cálculo dessa
média, são bastante discordantes. No entanto, dado só terem sido efectuadas duas únicas medições, não é
possível excluir um dos valores.

Concentração DO(260nm)/
Elemento do média de DNA DO(280nm)
grupo plasmídico Y na (média)
amostra
(mg/mL)

Emanuel
2.3625 1.8878

Rafaela
3.3605 1.9341

Luísa 0.2015 2.0138

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Celina
(2.2125) 1.9518

Fenótipos das amostras

- Amostra inicial produzida por inoculação de meio LB (contendo Kanamicina®) –
coloração amarelada, mas clara, e aspecto homogéneo
- Amostra inicial, após centrifugação – coloração idêntica à anterior, mas mais límpida e
contendo um pellet (passo 4 do protocolo)
- Amostra produzida por ressuspensão do pellet de células em solução I – coloração
amarelada, baça e homogénea (passo 7 do protocolo)
- Amostra após adição de solução II – translúcida e límpida, contendo pequenas suspensões de
textura viscosa (passo 8 do protocolo)
- Amostra, após adição de solução III – aspecto ainda mais transparente, contendo suspensões
filamentosas esbranquiçadas (passo 9 do protocolo)

Discussão de resultados

No que diz respeito aos fenótipos das amostras (ver “Resultados Obtidos”), é de referir
que antes da lise, estas apresentavam um aspecto maioritariamente amarelado, baço e
homogéneo, devido às células em suspensão. Com a adição da solução II, a amostras ficaram
translúcidas, com suspensões viscosas. Isto acontece, exactamente devido à lise das bactérias,
sendo que as suspensões viscosas correspondem ao DNA cromossomal libertado, que desnatura
devido ao NaOH. Por fim, com a adição da solução III, dado que ocorre a renaturação e
precipitação do DNA cromossomal, bem como a precipitação de outras biomoléculas, as
amostras tornaram-se límpida, sendo visíveis os filamentos de DNA que sofreu agregação.

Para cálculo da concentração das amostras purificadas de DNA plasmídico Y, utilizou-

se o valor da densidade óptica a 260nm, pois é o comprimento de onda para o qual a absorção é
máxima para os ácidos nucleicos. Sabe-se também que uma unidade de densidade óptica
corresponde a 50 µ g por mL de DNA de cadeia dupla, pelo que esta relação foi utilizada no

cálculo. Os resultados obtidos relativos às concentrações encontram-se evidenciados na Tabela

1. Perante as concentrações obtidas, várias considerações devem ser feitas. Em primeiro lugar, é
observável que os valores obtidos são relativamente elevados, da ordem dos 2 a 3 mg/mL.
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Apenas são excepção os resultados da amostra da Luísa e da Celina. Relativamente à situação

da Luísa, denota-se que, apesar da concordância dos valores, estes são consideralmente baixos
(ver Tabela 1). Porém, dada a pureza média da amostra (2,0138) (ver Tabela 2), pode-se
conjecturar que não se tratou de um problema ao nível da purificação, mas sim previamente na
inoculação e crescimento da cultura. O mais provável é que tenha ocorrido perfuração do agar, o
que terá obstruído a ponta da micropipeta, impossibilitando um bom crescimento das bactérias.
Por outro lado, ainda na inoculação, pode ter sido removida uma quantidade insuficiente de
colónia. No que diz respeito aos resultados da Celina, pelo contrário, o primeiro valor de
concentração é bastante elevado e completamente discordante do segundo (ver Tabela 1). Neste
caso, o mais provável é que tenham ocorrido erros não ao nível da extracção e purificação, mas
sim na preparação da segunda diluição para análise espectrofotométrica.
Relativamente à pureza, observa-se que a razão DO(260nm)/DO(280nm) se
encontra entre 1.8 e 2.0, o que significa que as amostras de DNA apresentam uma
pureza entre 70% e 95%. Contudo, numa análise mais atenta dos resultados da Tabela 2,
denota-se que a maioria dos valores tendem para ser superiores a 1.9, excepto no caso
do Emanuel, no qual o valor é um pouco mais baixo, pelo que a amostra será um pouco
mais pura. Os valores relativamente superiores a 1.8, devem ser resultado de erros e
imprecisões na execução do procedimento, sobretudo motivados por falta de
experiência. Contudo, não é fácil prever a contaminação existente, pois os valores não
são significativamente superiores a 2. Logo, não se deverá assumir imediatamente
contaminação com RNA. Ainda assim, esta ideia não é de todo improvável ou
infundada, dado que a RNase A utilizada era relativamente antiga.

Conclusão
Após a realização desta actividade experimental, pode-se afirmar que foram cumpridos
os objectivos estipulados.
Com efeito, o grupo conseguiu aprofundar os seus conhecimentos acerca do método de
extracção de DNA plasmídico por lise alcalina, quer em termos práticos, quer no que diz
respeito aos fundamentos teóricos em que este se baseia, concretamente a precipitação selectiva
do DNA cromossomal em soluções de pH entre 12.0 e 12.5.

Quanto aos valores de pureza estimados, é de referir que as razões

DO(260nm)/DO(280nm) se encontram entre 1.8 e 2 para os vários elementos do grupo, o que
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situa os valores de pureza entre 70% e 95%, aproximadamente, para as diferentes amostras
purificadas.

Bibliografia

[1] Farrell, S. O. and L. E. Taylor Experimentes in Biochemestry: A Hands-On Approach,

second edition, Thomson Brooks/Cole.

[2] Nelson D., et al., Lehninger Principles of Biochemistry, 4ª Edição, Freeman and company,
2005.

[3] Birnboim H. C. and Doly J. 1979. A rapid alkaline procedure for screening recombinant
plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.