UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

ESCOLA DE ENFERMAGEM E FARMÁCIA – ESENFAR

CURSO: FARMÁCIA

RESISTÊNCIA BACTERIANA
Jefferson Alexandre – Laísa Carolina – Yasmin Sarmento
 Pequeno histórico….
• 1928 – Alexander Fleming descobre a Penicilina.

Fleming – Primeiro a observar a resistência natural de microorganismos aos

antibióticos.

Bactérias do grupo coli-tifóide RESISTENTES

A descoberta da penincilina. Foto

tirada por Alexander Fleming.
Observou que a colônia do fungo
Penicilium acidentalmente
contaminou a placa e inibiu o
crescimento bacteriano nas suas
proximidades
Pequeno histórico….
• Década de 1940 – A era dos antibióticos. A penicilina é usada em grande escala
durante a Segunda Guerra Mundial e em infecções por Staphylococcus e
Streptococcus.

Abraham e Chain – Descobriram uma enzima capaz de bloquear a ação da

penicilina, denominada penicilinase.

• No fim dos anos 50 – A espécie Staphylococcus aureus adquire resistência

Pequeno histórico….
• Anos 60 e 70: Muitas cepas de bactérias adquirem resistência contra os
antibióticos.

O uso inadequado dos antibióticos foi um dos fatores que mais contribuiu. Ele acaba
por selecionar exemplares resistentes.

O processo é simples, mas perigoso: bactérias que sobrevivem aos antibióticos são as
resistentes, e vão gerar outras bactérias que também serão resistentes.
RESISTÊNCIA BACTERIANA
A capacidade que uma bactéria de uma determinada cepa bacteriana
pode apresentar ao se multiplicar em uma concentração antibiótica
superior àquela que inibe a maior parte das bactérias pertencentes a
essa mesma cepa.

Natural Adquirida

característica intrínseca de um
mutações nos próprios genes ou
microrganismo, que ocorre sem
uma exposição prévia ao pela aquisição dos genes de
resistência
antibiótico
Resistência Adquirida
Para adquirir resistência, a bactéria deve alterar seu DNA, material genético, que ocorre
de através de dois grandes mecanismos:
• Mutação num loci do cromossoma;
• Transferência horizontal de genes

Transferência
Mutação horizontal de
genes

Alteração na sequência de bases Aquisição de genes de resistência

do DNA sem aquisição de genes anteriormente presentes em outros
de outro microrganismo. microrganismos.
Resistência Adquirida
• PLASMÍDEOS
são pequenos segmentos de DNA circular com replicação independente,
presentes em bactérias.

Os plasmídeos possuem variadas funções de acordo com os seus tipos.

Resistência aos
Fertilidade Bacteriana
Antibióticos
Resistência Adquirida
MUTAÇÃO
• As mutações são alterações na estrutura dos genes.
• As mutações que ocorrem podem ser induzidas ou espontâneas.
• Envolve eliminação, substituição ou adição. Leva a alterações na composição de
aminoácidos de determinados peptídeos.
Resistência Adquirida
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
• ocorre quando um dado microrganismo recebe material genético de outro
microrganismo, passando a expressar a característica contida no gene
recentemente adquirido.
Resistência Adquirida
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
• Transformação
Este mecanismo foi descoberto em
Streptococcus pneumoniae, em 1928 por F.
Griffith, tendo sido mais tarde encontrado em
Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae,
Neisseria meningitidis, Bacillus subtilis e
Staphylococcus sp.
Resistência Adquirida
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
• Transdução
Exerce papel importante na transferência de
plasmídios R (resistência) entre S. aureus e
Streptococcus pyogenes.
Resistência Adquirida
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
• Conjugação
Nas bactérias Gram positivas,
como por exemplo Enterococcus
faecalis, a conjugação ocorre
mediada por plasmídeos e o
envolvimento de genes
cromossómicos
Resistência Adquirida
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
• Transposição
Há a dependência da presença na bactéria de segmentos curtos de DNA denominados
transpossons.

Transposons são regiões de DNA móveis, capazes de migrar de uma região do DNA
para outras regiões.
Resistência Adquirida
TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
• Transposição
Podem conter genes de resistência para um ou
mais antibióticos.

Um exemplo de Transposons é encontrado em

Enterococcus faecalis, e contém o gene que confere
resistência à tetraciclina.
Resistência natural A ausência de um
processo metabólico
Antibióticos
influenciável pelo
poliênicos
antibiótico; (Veiga, 1984)

Característica Existência de enzimas que

intrínseca dos apresentem a capacidade B. Lactamase
microrganismos de inativar o antibiótico;
(Veiga, 1984)

Presença de
particularidades inerentes
Ausência de
à morfologia bacteriana.
canais
(Veiga, 1984)
Resistência adquirida
• Alteração da
permeabilidade
• Alteração do local
de ação
• Bomba de efluxo
• Mecanismo
enzimático
• Proteção ou
bloqueio do sitio
alvo
• Formação de
biofilme
Alteração da permeabilidade

A permeabilidade da membrana celular é essencial para que o antibiótico tenha o efeito desejado,
quer seja bactericida quer bacteriostático.

• Difusão pelas
porinas
• Difusão pela
bicamada
fosfolipídica
• self promoted
uptake
Antimicrobiano Resistência por permeabilidade

Aminoglicosídeos Falta de transporte dependente de

oxigénio ( S. aureus)
Alteração das porinas
(Enterobacteriaceae e P.aeruginosa)
Fosfomicina Transportes de glucose-6-fosfato ou
glicerol-fosfato. Este sistema de
transporte não está muito
desenvolvido nas bactérias
Gram positivas
Quinolonas Alterações que ocorrem na
membrana externa das bactérias
Gram
negativas estão relacionadas com um
decréscimo do uptake
Tetraciclinas Alteração de
permeabilidade destes antibióticos
através de alteração das porinas
Alteração do local de ação

Este tipo de resistência caracteriza-se pela diminuição ou mesmo ausência de afinidade do antibiótico ao
local de ligação.

• Alteração da
estrutura do
peptideoglicano
• Interferência na
síntese de
proteínas
• Interferência na
Representação da alteração do local de ação do síntese de DNA
antibiótico (ANVISA, 2007)

Ex: Staphylococcus aureus resistente à oxacilina e estafilococos coagulase-negativos adquiriram o gene

cromossômico Mec A e produzem uma proteína de ligação da penicilina (PBP ou PLP) resistente aos β-
lactâmicos
Bomba de efluxo

Neste tipo de resistência ocorre um efluxo, isto é, o transporte ativo dos antibióticos do meio
intracelular para o meio extracelular.

• Adenosine Triphosphate
Binding Cassette (ABC)
• Major Facilitator Family
(MFS)
• Multidrug And Toxic
Efflux (MATE)
• Resistance Nodulation
Division (RND)
• Small Multidrug
Resistance (SMR)
 ABC- Açúcares, aa,
cátions e drogas
MATE-Transporta (macrolídeos,
detergentes e cloranfenicol,
drogas(aminoglicosí tetraciclinas e
deos e fluoroquinolonas)
fluoroquinolonas)

MFS- Açúcares,
metabólitos RND- Responsável pela
SMR-Transporta tolerância de bactérias a
intermediários e drogas catiônicas
drogas (tetraciclinas, solventes Aminoglicosídeos,
(macrolídeos e fluoroquinolonas, macrolídeos,
cloranfenicol e tetraciclinas)
fluoroquinolonas) tetraciclinas e β-lactâmicos
Mecanismo enzimático

O mecanismo enzimático de resistência devido a inativação do fármaco resulta da produção, pela bactéria,
de enzimas que degradam ou inativam o antibiótico

• Hidrólise
• Transferência
de grupos
• Processo redox

Representação da destruição enzimática do

antibiótico em algumas bactérias. (Anvisa, 2007)
 Enzimas Função

Enzimas que degradam antibióticos beta-lactamases (serina beta-

lactamases e as metalo-beta-
lactamases ou MBL)

Enzimas que alteram antibióticos enzimas modificadoras de

aminoglicosídeos (AME, do inglês
aminoglycoside modifying enzymes)
Proteção ou bloqueio do sítio alvo do antibiótico

A proteção ou bloqueio pode funcionar pela produção de enzimas ou presença de estruturas celulares
bacterianas que impedem a ligação do antibiótico ao sítio alvo.

espessamento da
parede celular em S.
aureus, mediado pela
produção de enzimas
expressão de um
denominadas Qnr,
conjunto de genes
mediada por genes
cromossômicos, que
adquiridos (PMQR,
funciona como uma
Plasmid-Mediated
barreira e bloqueia o
Quinolone
acesso de
Resistance),
glicopeptídeos
(vacomicina) ao sítio
alvo
Biofilmes
A produção de biofilmes é considerada de acordo com Kuma et al. (2013) um novo modo de
resistência, capaz de ocorrer em muitos lugares

(1) a adesão primária

das células a uma
superfície, (2)
formação de
microcolônias que se
acumulam agrupadas
em multicamadas
celulares e iniciam a
síntese da matriz
extracelular primária
que formará o
biofilme
Resistência antimicrobiana frente a peptídeos

• Sistema inatoimune

• Proteção contra os
microrganismos
Resistência antimicrobiana frente a peptídeos

-Mecanismo de resistência ao peptídeo antimicrobiano intrínseco em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas

Determinação de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute (Instituto de Normas

Clínicas e Laboratoriais).
Organização internacional, interdisciplinar e 60 países
educacional que promove o desenvolvimento e a
ampla utilização de normas e procedimentos 1.400
laboratoriais padronizados. organizações
Facilitando um processo exclusivo de
desenvolvimento de padrões de testes
Microbiologistas,
laboratoriais clínicos com base em informações e
farmacêuticos,
consenso entre profissionais da indústria, do
biomédicos, etc.
governo e de saúde .
 Diagnóstico microbiológico
Suspeita Clínica
Epidemiológico

Tipo de Amostra

Colaboração Diagnóstico
Fisiopatológico
interprofissional laboratorial
Coleta Transporte

Etapa crucial
Conhecimento
Diagnóstico microbiológico
Fase Pós-analítica
Fase Pré-analítica 1. Relato do
resultado
1. Coleta
2. Intepretação do
2. Identificação
resultado
3. Transporte da
Paciente 3. Diagnóstico
amostra
4. Tratamento

Fase Analítica

1. Processo
2. Qualidade
3. Resultados
Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos (TSA)
- Orienta a escolha;
- Monitoramento de resistência bacteriana;
- Implantação de medidas de controle.
- Indicativo do tratamento mais eficaz;
- Redução de custos;
- Menor número de procedimentos invasivos;
- Menos tempo de permanência dos pacientes.

• Diluição em caldo
Disco Difusão em • Macrodiluição;
Ágar (Kirby e • Microdiluição; Automatizados
Bauer) • Diluição em Ágar;
• Etest.
Qualitativo
Quantitativo
Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos (TSA)

12.5 6.25 3.12 g/mL

MIC
É a menor concentração inibitória mínima que inibe completamente o
crescimento bacteriano.
Diluição em Caldo
- Macrodiluição
Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos agentes
antimicrobianos e envolve a preparação de diluições seriadas e logarítmicas
de antimicrobianos em um meio de cultura líquido, o qual permitirá o
crescimento bacteriano.
Diluição em Caldo
- Macrodiluição
Determinação de resultado
quantitativo, a CIM

Avaliação de um número substancial

de bactérias

Quantidade de reagentes utilizada

Espaço necessário para o

armazenamento dos tubos

Possibilidade da ocorrência de erros

durante a preparação

Trabalho manual dispendioso na

preparação do teste
Diluição em Caldo
- Microdiluição
A microdiluição em caldo corresponde à miniatura da técnica de diluição. Ao
contrário da anterior, a microdiluição em caldo utiliza placas de Elisa estéreis,
com 96 poços, com o fundo em formato de “U”, para permitir a melhor
visualização do crescimento bacteriano.

É utilizado o caldo Mueller Hinton ajustado com cátions, que contém 20 a 25

mg de Ca2+ e 10 a 12,5 mg de Mg2+. Quantidade insuficiente de cátions
pode aumentar a atividade de aminoglicosídeos e vice-versa.
Diluição em Caldo
- Microdiluição
Diluição em Caldo
- Microdiluição

Vantagens Desvantagens

• economia de espaço e de reagentes;

• reprodutibilidade dos resultados, • inflexibilidade na escolha dos
devido à possibilidade de preparação antimicrobianos a serem testados,
de grande quantidade de placas a quando se utilizam as placas pré-
partir da mesma série de diluições fabricadas;
de antimicrobianos; • alto custo;
• geração de um resultado • dificuldade em discernir o
quantitativo; crescimento bacteriano da amostra
• conveniência de poder utilizar placas inoculada daquele causado por
pré-fabricadas e sistemas bactérias contaminantes.
automatizados.
Diluição em Ágar
O método de diluição em ágar para determinar a susceptibilidade
antimicrobiana, incorpora antimicrobiano no ágar e cada placa contém uma
concentração antimicrobiana diferente. A suspensão da bactéria é ajustada
ao padrão de turvação de 0,5 McFarland. Este método é recomendado para
microrganismos exigentes como o N. gonorrhoeae.

Podem ser avaliadas, incluídos os controles, até 32 bactérias

simultaneamente, quando se utiliza a placa de 90 x 60 mm. Em geral, são
necessárias de 6 a 12 placas para avaliar a sensibilidade a um antimicrobiano.

As amostras bacterianas são inoculadas simultaneamente sobre a superfície

do ágar utilizando o multi-inoculador, que dispensa de 1 a 3 μL de solução
contendo aproximadamente o inóculo final de 1 x 104UFC/mL
Diluição em Ágar
Desvantagens:
•Vantagens:
é um método muito trabalhoso,
no queem
Utilizado seestudos
refere àepidemiológicos
preparação
dasexecução
 Fácil placas e do inóculo
bacteriano;
 Permite testar vários isolados
simultaneamente
as placas
• Promove de ágarquantitativos
resultados contendo
antimicrobianos
 Permite devem ser
o teste de bactérias
fastidiosas
preparadas, preferencialmente,
 Baixo custo (relativo)
no dia em que serão usadas,
Poucos isolados
pois o armazenamento das
 Preparo
placasdas placas
pode e estocagem
determinar a perda
da atividade antimicrobiana.
Etest
Determina a suscetibilidade de maneira quantitativa, é baseado no uso de
tiras ou "epsilômetros" (AB Biodisk, Suécia) que contêm um gradiente
exponencial contínuo de antibiótico e uma escala interpretativa.
Etest

Vantagens:
• flexibilidade na escolha dos agentes
antimicrobianos a serem testados;
• fácil execução e fornecimento de um
resultado quantitativo (CIM).
Desvantagens:
• alto custo das fitas;
• número limitado de antimicrobianos
testados por placa.
Automatizado
Os métodos automatizados costumam usar pontos de corte ou diluições em
concentrações específicas que permitem diferenciar as categorias de
interpretação. Quando sistemas comerciais são usados, as recomendações de
fabricação devem ser seguidas em relação ao armazenamento, inoculação,
incubação e interpretação.

A FDA indica que os sistemas comerciais fornecem resultados de

suscetibilidade equivalentes aos resultados gerados usando o método de
referência recomendado pelo CLSI para os microorganismos e agentes
antimicrobianos descritos no folheto de fabricação.
Automatizado

Vitek 2 WalkAway BD Phoenix

Automatizado
Vantagens
• maior rapidez na emissão dos resultados;
• padronização intra e interlaboratorial;
• disponibilidade de programas de
computação adicionais, que permitem a
redução do trabalho manual e a emissão
simultânea de relatórios para a farmácia
hospitalar;
• alguns sistemas ainda têm um programa
de computação denominado Expert, que
auxilia a interpretação dos resultados dos
testes de sensibilidade.
Desvantagens
• estes sistemas são onerosos;
• não fornecem o resultado exato da CIM,
com exceção do BD PhoenixTM, que
apresenta diluições seriadas;
• alguns equipamentos não apresentam
uma boa acurácia na detecção da
expressão de alguns mecanismos de
resistência, principalmente, os
mecanismos de resistência induzíveis, que
demandam maior tempo para sua
expressão.
Disco Difusão (Kirby e Bauer)
O teste de disco-difusão em ágar foi descrito em 1966, por Kirby e Bauer.

É um dos métodos de suscetibilidade mais simples, confiável e mais utilizado

pelos laboratórios de microbiologia.

Baseia-se na presença ou ausência de uma zona de inibição do crescimento,

que é medida em milímetros.
Disco Difusão (Kirby e Bauer)
Meio de
Preparo
cultura
Inóculo

Aplicação Discos Semeadura

Leitura das
placas
Incubação
Interpretação
das placas
Disco Difusão (Kirby e Bauer)
Disco Difusão (Kirby e Bauer)

Vantagens Desvantagens
falta de mecanização ou automação para
realização deste teste;
• fácil execução; ausência de padronização do método para
• reprodutibilidade; alguns microrganismos e agentes
• utilização de reagentes de baixo antimicrobianos, por exemplo: o S.
custo; pneumoniae versus ceftriaxona, que deverá ser
• resultados de fácil interpretação avaliado por um método quantitativo;
clínica; este método pode não ser adequado para a
• flexibilidade quanto à escolha dos detecção de mecanismos de resistência
resultantes da produção de beta-lactamases,
antimicrobianos; por exemplo: o enterococo versus ampicilina,
• não requer utilização de ou outros mecanismos mais complexos,
equipamentos especiais. como o estafilococo com sensibilidade
diminuída aos glicopeptídeos.
 Disco Difusão (Kirby e Bauer)
- Fatores que influenciam o resultado de um TSA – Disco-difusão (Kirby
e Bauer)

Composição química do meio

de cultura
Concentração de cátions pH

- Agar Müeller-Hinton;
- Variação de cátions
- 4 a 6 mm de espessura;
divalentes, afetarão
- Permite bom
crescimento do
nos resultados com - O pH do meio
aminoglicosídeos,
microrganismo e uma
tetraciclina e colistina; deve estar entre
boa difusibilidade do
- Concentrações; 7,2 e 7,4.
antibiótico, podendo
- Concentrações;
ainda, se necessário, ser
- Timina e timidina.
acrescido de sangue.
 Disco Difusão (Kirby e Bauer)
- Fatores que influenciam o resultado de um TSA – Disco-difusão (Kirby
e Bauer)
Inóculo Discos
- Os discos devem ser
- Um inóculo com armazenados a -8 °C ou
turvação a 0,5 da escala congelados a -14 °C;
de McFarland deve ser - Remoção dos discos duas
horas antes da utilização;
usado. Esta escala deve - Guardados com
ser mantida à dessecantes;
temperatura ambiente e - Devem utilizar o disco com
no escuro. concentração e validade
correta.
Cepas
- De acordo com o teste
de susceptibilidade
(método de difusão
em disco, diluição em
ágar e microdiluição) e
o agente
antimicrobiano, a
cepa ATCC é
selecionada.
Disco Difusão (Kirby e Bauer)
- Fatores que influenciam o resultado de um TSA – Disco-difusão (Kirby
e Bauer)
Incubação

A temperatura e o
tempo de incubação
dependem do
microrganismo a ser
testado.
Disco Difusão (Kirby e Bauer)
- Fatores que influenciam o resultado de um TSA – Disco-difusão (Kirby
e Bauer)
Incubação
Escolha do antimicrobiano
Grupo A
- As recomendações do Instituto
Drogas
Estados Unidos (CLSI) para cada grupo
de de
Padrões do Laboratório
primeira
antibiograma.
escolha para Clínico
de microorganismos abrangem
o dos

agentes com eficácia comprovada cujos testes são aceitáveis in vitro.

Grupo B
Agentes clinicamente importante. Usados quando organismo
resistente ao grupo A, Infecção polimicrobiana, alergia,
- Considerações também são estabelecidas para clínica
intolerância, resposta agentes antimicrobianos
inadequada.
Para
em otestes
CLSI, aespecíficos,
seleçãoAgentes
de eficácia
antimicrobianos baseia-sede
clínica, ouprevalência em tabelas
resistênciadee
Grupo C
relatórios de rotina,
recomendação
alternativos
relatórios seletivos
há resistência
para a seleção
suplementares,
e em de
a antimicrobianos
de antimicrobianos
usados
consulta
primeira
quando
com
primários. o e
linha
comitê deAgentes
Doenças Infecciosasque e asão
farmácia.
Grupo U
agentes alternativos. antimicrobianos usados apenas para o
tratamento de infecções do trato urinário.
- O CLSI agrupa os antimicrobianos da seguinte forma:
Grupo O Inclui agentes que têm indicações clínicas para o grupo
de organismos, mas geralmente não são candidatos a
testes de rotina.

Grupo Inv Inclui agentes que estão sob investigação e ainda

não foram aprovados pelo FDA.
Escolha do antimicrobiano
Quando o microrganismo é inibido pelas
- Os testes de suscetibilidade antimicrobiana
concentrações sãopelo
atingidas indicados para qualquer
agente antimicrobiano
Susceptível (S)em um
organismo envolvido processo
quando a doseinfeccioso;
recomendada é usada para o local da
infecção.
- Não é indicado quando a infecção é causada por um microrganismo
conhecido por ser suscetível a um determinado medicamento ;
A categoria intermediária implica eficácia clínica em
-Intermediário locaisnão
no corpo onde a droga é fisiologicamente
Quando a natureza(I)da infecção é clara e na amostra uma mistura de
concentrada ou quando uma dose maior que o
diferentes microrganismos ou flora normal é observada,
normal pode ser usada. os testes de
suscetibilidade não são indicados, pois podem gerarnão
uméuso inadequado de
Resistente (R)
um antibiótico
Quando o isolamento inibido pelas
concentrações séricas do antimicrobiano
normalmente atingidas em doses normais.
- Critérios para Interpretação de Testes de Suscetibilidade
Não susceptíveis Os isolados que têm CIM acima ou um diâmetro da área
abaixo dos valores indicados para o ponto de corte como
Farmacológico Farmacocinético Microbiológico
suscetíveis, podem ser relatados como "nãoClínico
suscetíveis“.
Escolha do antimicrobiano
- Sugestão do FDA Clinical Indications para grupos de agentes antimicrobianos
Escolha do antimicrobiano
- Sugestão do FDA Clinical Indications para grupos de agentes antimicrobianos
Escolha do antimicrobiano
- Sugestão do FDA Clinical Indications para grupos de agentes antimicrobianos
 Escolha do antimicrobiano
- Controle de Qualidade por teste de Disco Difusão

Condições para o teste:

- Meio: para Disco Difusão
- - Agar Mueller Hinton 90x15mm ou 140x15mm
- - Inoculo: suspensão realizada direto da colônia, equivalente a escala
0,5 de Mac Farland
- - Incubação: temperatura de 35±2ºC, por 20 a 24 horas em ar
ambiente.
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases

São enzimas catalíticas que quebram a ligação amida do anel beta-lactâmico, fazendo com
que o antibiótico perca sua capacidade de se ligar às proteínas de ligação à penicilina e sua
ação bactericida..

- β-lactamases de espectro extendido (ESBL)

Capazes de hidrolisar o anel beta-lactâmico de cefalosporinas de terceira

geração e dos monobactâmicos.

Grupo 2b Grupo 2be

Resistência em Gram-negativas
- Detecção de ESBL
Indicados principalmente para:

Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Escherichia coli

Métodos:

Disco difusão Microdiluição em caldo

O CLSI recomenda que para esta técnica devem ser levadas em

consideração em termos de meio de cultura (Agar Mueller Hinton ou
caldo Mueller Hinton), concentração de inóculo (padrão 0,5 McFarland),
tempo e atmosfera de incubação.
Resistência em Gram-negativas
- Detecção de ESBL
Métodos alternativos:

Etest

Tiras contendo concentrações

decrescentes de cefalosporina
(ceftazidima) e do outro lado a
mesma cefalosporina com uma
concentração fixa de ácido
clavulânico. Ordem da redução da concentração dupla
Ágar Mueller Hinton. Relação >8
Resistência em Gram-negativas
- Detecção de ESBL
Métodos alternativos: Controle de qualidade:
Controle negativo: Escherichia coli ATCC
Duplo disco difusão 25922;
Controle positivo: Klebsiella pneumoniae
ATCC 700603
A cepa é testada frente a dois
discos:

- Cefalosporina de terceira geração;

- Inibidor de beta-lactamase
(amoxacilina + ácido clavilânico).

20 mm Alargamento
Aparecimentodade
zona defantasma
zona inibição
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases AmpC (cefalosporinases)

São enzimas são normalmente resistentes à inibição por ácido clavulânico e

são mais ativas contra as cefalosporinas e cefamicinas como cefoxitina do que
contra benzilpenicilinas..

Atualmente, o CLSI não possui uma técnica padronizada para a detecção de

AmpC; no entanto, o teste de peneira ESBL pode ser usado para rastrear β-
lactamases do tipo AmpC.
Teste do disco com ácido
Teste do disco para AmpC
borônico

Teste tridimensional para detecção Teste com Ágar

de AmpC mediada por plasmídeo suplementado com Cefoxitina
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases AmpC (cefalosporinases)
Teste do disco para AmpC
É colocada sobre a superfície do Ágar
um disco de 30 µg de cefoxitina e
junto um disco Tris EDTA.
Disco contendo Tris-EDTA:
permeabiliza a célula bactéria.
Positivo: é observado uma trinca na
zona de inibição próxima
K. pneumoniae, ao disco
Salmonella, P. de
cefoxitina,Mirabilis
indicandoE. inativação
coli da
enzima.
Teste do disco com ácido
borônico
É um método que é baseado na
inibição de AmpC com ácido fenil
borônico (AFB).
Dois discos de ceftazidima e
cefotaxima de 30 μg
Dois discos ceftazidima e cefotaxima
de 30 μg + 30 μl AFB.
Positivo: alo de inibição dos dois
discos com AFB ≥ 5mm em relação aos
dois discos sem AFB
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases AmpC (cefalosporinases)
Teste Tridimensional
- Inoculação do Ágar Mueller Hinton
com E. coli ATCC 25922;
- Um disco de cefoxitina 30 μg;
- Fenda de 5 mm em forma radial;
- Dentro da fenda a amostra é
colocada.
Positivo: Crescimento do
microrganismo no ponto de
interpetação da zona de inibição e a
fenda.
Teste com ágar suplementado
- Para realizar esta técnica, é utilizado o
Ágar Mueller Hinton com diferentes
concentrações de Cefoxitina (2, 4, 8 e
16 μg/mL) com E. coli ATCC 25922.
- Poços circulares de 5 mm de
diâmetro.
- 30 μL de extrato das células da
amostra cultivada tripticase e
centrifugadas.
Positivo: Zona de crescimento ao redor
K. Pneumoniae e E. coli
da periferia do poço.
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases do tipo Carbapenamases (KPC)

As carbapenemases representam a família mais versátil das betalactamases,

estas enzimas têm a capacidade de hidrolisar os carbapenens e a grande
maioria hidrolisa quase todos os beta-lactâmicos para uso clínico.

O laboratório de microbiologia desempenha um papel muito importante na

detecção e confirmação da resistência em Enterobacteriaceae a carbapenens,
devido à sua rápida disseminação e à sua dificuldade para o tratamento
adequado.
 Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases do tipo Carbapenamases (KPC)
Disco Difusão
- Discos de meropenem e ertapenem de 10
μg;
- Incubação de 35 ± 2 °C em condições
aeróbias para 16-18horas;
- Carbapenemase suspeita: diâmetro de
halo 16-21mm diâmetro halogénio
meropenem ertapenem 19-21mm;
- Deve ser confirmado com o teste de
Hodge;
- Não usar disco imipenem porque é pobre
preditor de carbapenemases;
- Controle de qualidade: E. coli ATCC 25922.
Microdiluição
- Imipenem, meropenem ou ertapenem de
1 μg/ml;
- Incubação de 35 ± 2 °C em condições
aeróbias para 16-20horas;
- Carbapenemase suspeita: ertapenem
2µg/mL, imipenem e meropenem 2-
4µg/mL;
- Deve ser confirmado com o teste de
Hodge;
- Controle de qualidade: E. coli ATCC 25922.
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases do tipo Carbapenamases (KPC)

Teste Hodge

Preparar uma suspensão Inoculação em

Ertapenem
da cepa E. coli ATCC A –ágar
Controle
Negativo;
Mueller
10 µg
25922 Hinton
B – Controle Positivo.
C – Amostra Testada;

Controle Positivo: Fenda no crescimento

Controle 3-5 colônias do
positivo: Sulco sentido
negativo: E. coli microrganismo
K.pneumoniae disco periferia
ATCC 25992 testado
BAA 1705
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases do tipo metalo β-Lactamases (MBL)

São caracterizadas pela capacidade de hidrolisar carbapenêmicos e inibidores

de β-lactâmicos, como ácido clavulânico e tazobactam, mas suscetíveis à
inibição por agentes quelantes como EDTA, ácido mercaptoacético e ácido
mercaptopropiônico.
O CLSI não possui nenhum procedimento padronizado para a detecção de β-
lactamases de metalo; entretanto, alguns autores descreveram técnicas que
podem facilitar a detecção desse mecanismo pelo laboratório:

Etest Sinergismo
Positivo: AEnterobacteriaceae
Limitações: presença de uma e zona
pode
Tiras
fantasma
com imipenem e Semelhante ao teste do acido borônico
dar falsosentre os dois
positivos em gradientes ou
P. aeruginosa sendo que os discos meropenem são
imipenem-EDTA
a deformação na elipse imipenem.
e A. baumannii impregnados com EDTA
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases do tipo metalo β-Lactamases - New Delhi Metalobetalactamase
(NDM)

• É uma enzima da classe das metalo-betalactamases (grupo B de Ambler) ;

• Veiculada por plasmídeos (gene blaNDM);
• Hidrolisa todos beta- lactâmicos;
• quando se percebe a redução de sensibilidade aos carbapenens in vitro
em enterobactérias, é necessária a pesquisa de NDM.
• Para identificação da metalobetalactamase NDM-1 é necessária uma
pesquisa direta do gene blaNDM através da metodologia de PCR.
• O teste modificado de Hodge não foi sensível para detecção da atividade
de NDM. O Etest mostrou um resultado duvidoso.
Resistência em Gram-negativas
- β-Lactamases do tipo Oxacilinase (OXA)

São enzimas dependentes de serina:

- Amplo espectro: Resistentes a Penicilina e Cefalosporinas;
- Espectro expandido: Cefalosporinas e Cabarpenems.
Raramente são inibidas pelo ácido clavulânico, tazobactam ou sulbactam;
Sua atividade pode ser inibida in vitro pelo cloreto de sódio (NaCl).
A dificuldade em detectar OXA é que alguns deles são inibidos pelo ácido
Alguns autores sugerem que o laboratório utiliza análise
clavulânico ou tazobactam como OXA-12, OXA-18, OXA-45 e OAX-46 de P.
espectrofotométrica
aeruginosa comoextratos
e quando se utiliza celulares
teste sinergismo com e na presença
ácido clavulânico
de NaCl.
pode ser confundido com a presença de ESBL.
Resistência em Gram-negativas
- Resistência a aminoglicosídeos
A resistência adquirida aos aminoglicosídeos é devida a três mecanismos
básicos:
Enzimas que modificam Alteração do sítio de Diminuição na
o aminoglicosídeo ação permeabilidade

Para isolados de Salmonella spp e Shigella spp, os aminoglicosídeos podem

ser ativos em mas eles não são clinicamente eficazes e podem não ser
relatados como suscetíveis.
- Resistência a Quinolonas
As quinolonas são ativas contra bactérias gram-negativas. No entanto, o uso
de quinonas aumentou e as cepas resistentes a este antimicrobiano
começaram a aparecer.
Resistência em Gram-negativas
Pseudomonas Stenotrophomonas
Acinetobacter spp
aeruginosa maltophilia

• Resistente a
- O aumento da -• ÉInativação
um patógeno
penicilinas, • É um patógeno
expressão de enzimáticacom
oportunista de um
cefalosporinas se
sistemas de efluxo; oportunista
Antibióticos;
amplo espectro de
primeira
- A perdae dasegunda
porina - frequentemente
β-lactamases;
- síndromes
Bombas de clínicas,
efluxo.
geração, trimetoprim
transmembranar; - associado
Alteraçãoa surtos
de de
e- sulfamtoxazol. infecções - como bacteremia,
Possui uma
Hiperprodução de proteínas de endocardite,
• Pode apresentar nosocomiais, proteína Onr que
enzimas AMPc. membrana; pacientes com câncer,
multiresistência;
- A aquisição de genes particularmente entre contribui para a
- pacientes
Bombascom de efluxo. infecção do trato
• Necessário
que codificamtratar
beta- resistênciae fibrose
respiratório
essas infecções
lactamase com
(MBL e comprometimento intrínseca às
cística.
mais de ESBL).
um anti- imunológico
quiniolonas.
microbiano.
Resistência em Gram-positivas
- S. aureus e Staphylococcus coagulasa negativa (CoNS)
- Resistência a penicilina

Produção de β-Lactamases
É aconselhável testar usando o método de difusão em disco em Mueller
Hinton Agar, seguindo as recomendações do CLSI, com um disco de 10U
penicilina em vez de ampicilina para o disco Staphylococcus.
O teste de β-lactamase induzido pode ser realizado em Staphylococcus com
MIC para penicilina ≤ 0,12μg /mL ou diâmetro de halo ≥ 29 mm antes de
relatar o isolado como suscetível à penicilina.
Resistência em Gram-positivas
- S. aureus e Staphylococcus coagulasa negativa (CoNS)
- Resistência a oxacilina

Este teste é realizado para S. aureus, S lugdunensis e Staphylococcus coagulase

negativo, para o qual um disco de oxacilina de 1 μg ou um disco de cefoxitina
de 30 μg é usado pelo método de difusão de disco seguindo as
recomendações do CLSI. Também pode ser feito usando o método de
microdiluição em caldo usando cefoxitina ou oxacilina.
Resistência em Gram-positivas
- S. aureus e Staphylococcus coagulasa negativa (CoNS)
- Resistência a Vancomicina (VISA)

O CLSI recomenda que, para determinar a suscetibilidade à vancomicina, o

Sthaphylococcus seja realizado pela CIM.
O disco não diferencia os isolados de S. aureus suscetíveis à vancomicina dos
isolados intermediários.
Não diferenciam os isolados de Staphylococcus coagulase-negativos de
suscetíveis, intermediários e resistentes, o que poderia dar zonas de inibição
semelhantes.
Diluição em Ágar

ETest
Resistência em Gram-positivas
- S. aureus e Staphylococcus coagulasa negativa (CoNS)
- Resistência a Macrolídeos (VISA)

Isolados de S. aureus e Staphylococcus coagulase negativa podem apresentar

resistência constitutiva ou indutível à clindamicina e esta resistência é
codificada pelos genes ermA e ermC, o que confere resistência a
macrolídeos, lincosamidas e estreptograminas.
Resistência em Gram-positivas
- S. aureus e Staphylococcus coagulasa negativa (CoNS)
- Resistência a Macrolídeos

Isolados de S. aureus e Staphylococcus coagulase negativa podem apresentar

resistência constitutiva ou indutível à clindamicina e esta resistência é
codificada pelos genes ermA e ermC, o que confere resistência a
macrolídeos, lincosamidas e estreptograminas.
Resistência em Gram-positivas
- S. aureus e Staphylococcus coagulasa negativa (CoNS)
- Resistência a Linezolida
O CLSI estabeleceu novos pontos de corte para linezolida pelo método de
difusão em disco e microdiluição em caldo. Com o método de difusão de
disco, a luz transmitida é usada para leitura e quando dá um resultado
resistente, isto deve ser confirmado usando o CIM.
Resistência em Gram-positivos - Enterococcus spp.
- Detecção de Resistência à Penicilina
E. faecalis.

disco-difusão, diluição ou automação

Detecção
teste rápido da cefalosporina cromogênica -
disco de nitrocefina

Não precisa ser realizado rotineiramente

Resistência em Gram-positivos - Enterococcus spp.
- Detecção de Resistência à Penicilina
E. faecalis.
Teste rápido da cefalosporina cromogênica - disco de nitrocefin
Resistência em Gram-positivos - Enterococcus spp.
- Detecção de resistência à vancomicina
Descritos cinco fenótipos de resistência à vancomicina

intrínseco adquiridos

VanC VanA, VanB, VanD e VanE

Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium

Resistência em Gram-positivos - Enterococcus spp.
- Detecção de resistência à vancomicina
Resistência em Gram-positivos - Enterococcus spp.
- Detecção de Resistência a Estreptomicina e Gentamicina de Alta
Concentração
• Os aminoglicosídeos não são clinicamente ativos para o Enterococcus,
exceto quando usados em conjunto com um agente ativo contra a parede
celular.

• Este teste deve ser realizado em E. faecium e E faecalis

Resistência em Gram-positivos - Enterococcus spp.
- Detecção de Resistência a Estreptomicina e Gentamicina de Alta
Concentração
Streptococccus pneumoniae

resistência à penicilina resulta de alterações das proteínas ligadoras da penicilina (PBPs)

oxacilina 1 µg
Ágar Mueller Hinton
suplementado com 5% de
sangue de corneiro e
incubar a 35ºC por 20-24
horas em atmósfera de
CO2.

Amostra de S. pneumoniae com halo de oxacilina ≥ 20 mm reportar como sensíveis à penicilina e

aos β-lactâmicos que não foram testados por esta técnica devido à falta de padronização.
Determinação da CIM por método de diluição
Determinação da CIM para penicilina de uma amostra de S.
pneumoniae pela técnica de Etest® (CIM 0,25 µg/mL)
Na determinação da CIM para
penicilina, meropenem, cefotaxima ou
ceftriaxona por técnicas de diluição, o
meio de ágar Müeller-Hinton acrescido
de 5% de sangue de carneiro para a
realização das técnicas de Etest®.
Utiliza-se o inóculo bacteriano
correspondente 0,5 da escala
McFarland. O TSA deve ser incubado a
35±2°C, em ar ambiente (microdiluição
em caldo) ou 5% de CO2S (Etest® / ágar
diluição), por 20 a 24 horas
Determinação da CIM por método de diluição
Streptococcus spp β hemolíticos

Grupos Patologias Testes

Grupo A Faringite estreptocócica, febre teste de susceptibilidade à

(S. Pyogenes) reumática aguda, bacitracina
glomerulonefrite
Grupo B pneumonia e meningite em ampicilina, amoxicilina,
(S. Agalactiae) neonatos e em alguns casos amoxacilina clavulânica,
bacteremia ampicilina é usada Sulfactam,
cefazolina, cefepima,
cefizoxima, cefradina,
cefalotina, cefotaxima,
ceftriaxona, imipenem,
ertapenem meropenem
Grupo C e G faringite aguda em crianças e ampicilina, amoxicilina,
adultos, especialmente em amoxacilina clavulânica,
surtos de faringite epidêmica, ampicilina é usada Sulfactam,
um muitas vezes relacionado à cefazolina, cefepima,
comida. cefizoxima, cefradina,
cefalotina, cefotaxima,
ceftriaxona, imipenem,
ertapenem meropenem
Usem o antimicrobiano por via oral, via
intravenosa ou via tópica... Mas nunca por via
das dúvidas!!

OBRIGADO!