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Fica aqui o agradecimento pela excelente e rigorosa colaboração dos meus colegas:
Maria Maia (Capítulo 7), que mesmo sem necessitar de estudar, uma vez que não iria repetir o
exame, resolveu ajudar. O mesmo se passou com o Miguel Guia (Capítulos 12 e 17), que se
voluntariou de seguida para ajudar, sem pretender estudar. Quanto ao Ricardo Vale de
Andrade (Capítulos 10 e 16), ao Marcos Mesquita (Capítulo 11), e à Sónia Cavaco (Capítulo 13),
deixo aqui os agradecimentos sinceros pela colaboração.
Espero que esta sebenta vos ajude, e se no futuro desejarem melhorá-lha, contactem-me por
favor:
fredericobarreto@campus.ul.pt
1 de Março de 2009
Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia 1
FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
Índice
Capítulo 1 – Visão geral sobre as células ................................................................................. 10
Procariótas Actuais.......................................................................................................... 11
E.coli ............................................................................................................................... 13
Leveduras........................................................................................................................ 13
Vertebrados .................................................................................................................... 14
Glícidos ........................................................................................................................... 15
Lípidos ............................................................................................................................ 15
Proteínas......................................................................................................................... 18
Lípidos Membranares...................................................................................................... 18
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DNA recombinante.............................................................................................................. 27
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Cromossomas e Cromatina.................................................................................................. 48
Cromatina ....................................................................................................................... 48
Centrómeros ................................................................................................................... 50
Telómeros ....................................................................................................................... 50
DNA polimerases............................................................................................................. 53
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O Ribossoma ................................................................................................................... 85
Clivagem Proteica............................................................................................................ 89
Glicolização ..................................................................................................................... 90
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Mitocôndrias..................................................................................................................... 103
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Regulação do Ciclo Celular por Sinais de Crescimento e Sinais Extracelulares ................ 129
Restringindo a replicação do DNA a uma única vez por ciclo .......................................... 130
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A primeira célula
Na base do aparecimento de vida está uma teoria que postula que a formação espontânea de
moléculas orgânicas conduziu à posterior formação de macromoléculas. Uma característica
crucial das macromoléculas que deram origem à vida terá sido a capacidade de auto-
replicação, pois só uma macromolécula capaz de direccionar a síntese de novas cópias de si
mesma seria capaz de direccionar a reprodução e posterior evolução.
Auto-Replicação de RNA
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estável entre dois compartimentos aquosos - por exemplo o interior e o exterior de uma
célula.
Evolução do Metabolismo
As células necessitaram de desenvolver os seus próprios mecanismos de geração de energia e
síntese de moléculas necessárias à replicação. Todas as células usam adenosina 5’-trifosfato
(ATP) como fonte de energia para conduzir a síntese de constituintes celulares e outras
actividades que implicam o gasto de energia, como o movimento celular. Os mecanismos para
geração de ATP surgiram em 3 fases, a glicólise, a fotossíntese, e o metabolismo oxidativo.
Procariótas Actuais
Os procariótas actuais dividem-se em dois grupos: archeabacteria (algumas vivem em
ambientes extremos) e eubacteria, as formas comuns de bactérias da actualidade. Os
procariótas mais complexos são as cianobactérias, as quais desenvolveram inicialmente a
fotossíntese.
A estrutura típica de uma célula procarióta é ilustrada pela E.coli, uma habitante do trato
intestinal humano: é rodeada por uma parede celular rígida (porosa), abaixo da qual existe
uma membrana plasmática, na qual uma bicamada fosfolipídica está associada a proteínas. O
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seu DNA é uma molécula circular no nucleóide, não sendo separada do citoplasma, como nos
eucariótas. O seu citoplasma abunda em ribossomas (locais da síntese proteica).
Eucariótas Actuais
Todas são envolvidas por uma membrana plasmática e contêm ribossomas, mas são maiores e
mais complexas, sendo o seu organelo mais proeminente o núcleo (local de síntese de RNA e
replicação de DNA; a tradução dá-se em ribossomas, no citoplasma). Contêm outros organelos
no citoplasma, que ao compartimentalizarem as diferentes actividades metabólicas da célula
as tornam muito mais eficientes. As mitocôndrias (onde se dá o metabolismo oxidativo e
produção de ATP) e os cloroplastos têm papéis fundamentais no metabolismo energético. Os
lisossomas e peroxissomas são compartimentos metabólicos especializados na digestão de
macromoléculas e reacções oxidativas, respectivamente. O retículo endoplasmático (processa
e transporta proteínas e sintetiza lípidos) e o aparelho de Golgi (matura proteínas e sintetiza
lípidos) dedicam-se à distribuição e transporte de proteínas destinadas à secreção,
incorporação na membrana plasmática e lisossomas. As células eucariótas ainda têm uma rede
de filamentos proteicos que se estende no citoplasma, o citoesqueleto, que dá estrutura à
célula, determinando o seu formato, e organização geral do seu citoplasma, sendo também
responsável pelo movimento celular e transporte e posicionamento de organelos numa célula.
O corpo humano é composto por mais de 200 tipos de células diferentes, que são
considerados componentes de 5 tipos principais de tecido: epitelial (cobrem as superfícies do
corpo e órgãos internos), conjuntivo (osso, cartilagem, tecido adiposo), sanguíneo (contém
glóbulos vermelhos e brancos), nervoso (neurónios) e muscular (produção de força –
movimento).
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E.coli
Os procariótas são os seres de eleição para o estudo de aspectos fundamentais da bioquímica
e da biologia molecular, devido à sua simplicidade, quando comparados a outros seres. A E.coli
é a espécie de bactéria mais estudada, pois é relativamente simples, e fácil de propagar e
estudar em laboratório. O seu pequeno genoma (4.6 milhões de pb e 4300 genes), aliado à sua
rápida proliferação laboratorial, confere-lhe vantagens na análise genética. Além disso, uma
população clone de E.coli, na qual todas as células derivam da mesma célula original, pode ser
facilmente isolada num meio de cultura com agar, permitindo tornar a escolha de espécies
resistentes a antibióticos rápida e fácil.
As misturas de nutrientes na qual a E.coli se divide mais rapidamente (20 minutos) inclui
glicose, sais, compostos orgânicos (aa, vitaminas e precursores de ácidos nucleicos). Também
pode ser cultivada num meio mais pobre, contendo apenas amónia e glicose, sendo contudo o
crescimento mais lento.
Leveduras
As leveduras, os eucariotas mais simples, têm vantagens experimentais semelhantes à E.coli,
sendo o modelo da biologia celular dos eucariontes. A espécie mais estudada é a s.cerevisiae,
contendo um genoma com aproximadamente 6000 genes. Apesar da sua simplicidade, exibe
as características típicas das células eucariótas: núcleo rodeado por uma membrana nuclear,
DNA organizado em cromossomas, e o citoplasma contém citoesqueleto e organelos. Em
condições óptimas dividem-se a cada 2 horas, sendo ideais para manipulações genéticas
semelhantes àquelas realizadas em bactérias.
Caenorhabditis elegans
As leveduras unicelulares são modelos muito importantes para o estudo de células eucariótas,
mas a compreensão de seres multicelulares requer o uso de plantas ou de animais, organismos
mais complexos. A c.elegans permite o estudo do desenvolvimento animal e da diferenciação
celular. O seu genoma é bem maior e mais complexo do que o de eucariontes unicelulares mas
bem mais simples e manuseável que o da maioria dos outros animais, sendo facilmente
sujeitado a manipulação genética. Os indivíduos adultos são compostos por apenas 959 células
somáticas, e entre 1000 e 2000 células da linha germinativa.
Drosophila melanogaster
Esta mosca da fruta tem sido um modelo crucial no estudo da biologia do desenvolvimento, e
apesar de conter mais pb no seu genoma, contém menos genes que a c.elegans, sendo
também fácil de manter e reproduzir laboratorialmente (tem um ciclo reprodutivo curto –
duas semanas). A análise genética realizada na Drosophila permitiu a identificação de
inúmeros genes que controlam o desenvolvimento e a diferenciação.
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Vertebrados
Os animais mais complexos são os vertebrados, que incluem os humanos, mamíferos, entre
outros. O genoma humano tem aproximadamente 3 mil milhões de pb, contém 20 000 a 25
000 genes, e mais de 200 tipos diferentes de células especializadas. Esta complexidade torna
os vertebrados difíceis de estudar do ponto de vista da biologia molecular. Uma abordagem
para o estudo de seres humanos e outros mamíferos é o crescimento de células isoladas em
cultura, onde podem ser manipuladas, sob condições laboratoriais. O uso de células em cultura
permitiu elucidar os mecanismos da replicação de DNA, expressão genética, síntese proteica,
processamento, e divisão celular. Além do mais, as propriedades de algumas células altamente
especializadas (neurónios, células musculares), tornam-nas modelos importantes para o
estudo de aspectos particulares da biologia celular. Por exemplo, os neurónios são excelentes
modelos para o estudo do transporte de iões através da membrana.
Entre os mamíferos, o rato é o modelo mais adequado para análise genética, que é facilitada
pela disponibilidade do seu genoma completo. A adequação do rato como modelo para o
desenvolvimento humano é indicada não só pela semelhança entre os genomas humano e do
rato, como também pelo facto de mutações em genes homólogos provocarem o
desenvolvimento de defeitos em ambas as espécies.
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Glícidos
Incluem açúcares simples (monossacáridos), bem como polissacáridos. Os monossacáridos
(como a glicose) são os principais nutrientes de uma célula, e a sua degradação é a fonte de
energia celular e de precursores para a biossíntese de componentes celulares. Os
polissacáridos são a forma de armazenamento de açúcares e formam os componentes
estruturais das células, servindo também como marcadores em processos de reconhecimento
celular.
Lípidos
São os principais componentes das membranas celulares, sendo também uma forma de
armazenamento energético muito importante, além de funcionarem como moléculas
sinalizadoras e hormonas esteróides (estrogénios, testosterona, etc).
Ácidos Nucleicos
Os ácidos nucleicos – DNA e RNA – são as molécula de armazenamento de informação da
célula. O DNA tem como função servir de material genético, sendo que nãos eucariontes se
localiza no núcleo. Existem diferentes tipos de RNA: mRNA (mensageiro), que transporta
informação do DNA para os ribossomas, servindo como molde para a síntese proteica; o rRNA
e o tRNA estão envolvidos na síntese proteica. O RNA além de transportar informação, é capaz
de catalizar algumas reacções químicas (de síntese proteica e processamento de RNA).
O RNA e o DNA são polímeros de nucleótidos, que consistem em bases: purinas (dois anéis),
como a Adenina (A) e a Guanina (G); ou pirimidinas (um anel), como a Citosina (C), a Timina
(T) e o Uracilo (U).
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O DNA consiste em duas purinas (A e G), e duas pirimidinas (C e T). O RNA contém Uracilo em
vez de Timina, como no DNA.
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A diferença entre uma ribose e uma desoxirribose é no carbono 2’ sendo que a ribose a este carbono tem
ligado um grupo hidroxilo (HO) enquanto a desoxirribose tem apenas ligado um hidrogénio (H). O grupo
fosfato dos nucleótidos tem tendência a reagir com o HO do carbono 2’ atacando-o. Ora quando isto
acontece a molécula de RNA torna-se instável e é degradada. Como o DNA não tem o grupo hidroxilo
este não reage com o grupo fosfato e por isso esta molécula é mais estável. É por esta razão que a nossa
informação genética é codificada por DNA e não por RNA (Exame 1º Fase, 2008/2009).
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Proteínas
As proteínas executam as tarefas implícitas pela informação genética, sendo as
macromoléculas mais diversas, e realizando uma grande variedade de funções: componentes
estruturais das células, transporte e armazenamento de pequenas moléculas (hemoglobina
armazena O2), transmissão de informações entre células (hormonas), e defesa imunológica
(anticorpos). A sua propriedade fundamental é a capacidade de actuarem como enzimas, que
catalizam praticamente todas as reacções químicas dos sistemas biológicos.
São polímeros de 20 tipos de aa, que se distinguem pelas diferenças nas cadeias laterais. Os aa
são ligados por ligações peptídicas, entre o grupo α-amina de um aa e o grupo α-carboxilo de
outro aa. Os polipéptidos são cadeias lineares de centenas ou milhares de aa, que têm duas
extremidades: N-terminus, ou terminal amina; C-terminus, ou terminal carboxilo. Os
polipéptidos são sintetizados do N-terminus para o C-terminus, e a sequência de aa num
polipéptido é escrita na mesma ordem.
Cada proteína consiste numa sequência de aa específica, que define a estrutura de uma
proteína. A conformação tridimensional de uma proteína corresponde ao seu estádio
termodinâmico mais estável, que depende das interacções entre os diferentes aa. Logo, a
sequência de DNA que dá origem à proteína também determina a sua estrutura.
Membranas celulares
A estrutura e função das células depende em muito das membranas, que para além de
separarem os ambientes intracelular do extracelular, definem compartimentos internos nas
células eucariótas, delimitando o núcleo e os organelos celulares. As membranas biológicas
são bicamadas de fosfolípidos associadas a proteínas, que são responsáveis por diversas
funções especializadas: receptores de sinais externos; transporte selectivo de moléculas
através da membrana; transporte de electrões de fosforilação oxidativa. Além disso, as
proteínas membranares controlam as interacções entre as células de seres multicelulares.
Lípidos Membranares
Os constituintes essenciais das membranas celulares são os fosfolípidos, que são moléculas
anfipáticas, que consistem de duas cadeias hidrofóbicas de ácidos gordos ligadas a uma
extremidade polar hidrofílica que contém um grupo fosfato. Como as cadeias de ácidos gordos
são pouco solúveis em água, os fosfolípidos tendem a formar bicamadas em meio aquoso
(efeito entrópico e ligações Van der Waals), gerando uma barreira estável entre dois
compartimentos aquosos.
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O colesterol possui anéis de hidrocarbonetos que são rígidos, e interagem com as cadeias de
ácidos gordos dos outros lípidos, diminuindo a mobilidade dos ácidos gordos, tornando a
membrana mais rígida. Por outro lado , a inserção do colesterol interfere com as interacções
entre as cadeis de ácidos gordos, mantendo a fluidez a baixas temperaturas. Assim, o
colesterol funciona como um tampão de fluidez da membrana.
Proteínas membranares
As proteínas são os constituintes principais das membranas celulares, estando inseridas numa
bicamada lipídica, segundo o modelo do mosaico fluido. As proteínas dividem-se em duas
classes principais: proteínas intrínsecas (inseridas directamente na bicamada), e proteínas
extrínsecas (associadas indirectamente à membrana, geralmente interagindo com proteínas
intrínsecas).
A maioria das proteínas intrínsecas são transmembranares, pois cruzam a bicamada lipídica,
tendo porções expostas a ambos os lados da membrana. As porções transmembranares são
geralmente α-hélices, formadas por resíduos apolares, que interagem com a porção
hidrofóbica da membrana. A membrana pode também ser atravessada por uma estrutura em
β-barril. As proteínas transmembranares são moléculas anfipáticas, pelo que as suas porções
hidrofílicas estão expostas ao ambiente aquoso. As proteínas também podem ser ancoradas a
membranas por lípidos ligados covalentemente a cadeias polipeptídicas, e as diferentes
modificações lipídicas ditam a que face da membrana as proteínas ficam ancoradas.
Há duas classes de proteínas transportadoras: canais proteicos, que formam poros através da
membrana, permitindo a livre passagem de moléculas com tamanho apropriado, podendo ser
selectivamente abertos ou fechados; proteínas carregadoras, que se ligam selectivamente e
transportam moléculas específicas, como a glicose.
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Interacções proteicas
Várias abordagens a larga-escala têm sido aplicadas para identificar interacções entre
proteínas e complexos, com o objectivo de elucidar as redes complexas das interacções
proteicas que regulam o comportamento celular.
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Genes e Cromossomas
Cada característica de um ser é determinada por um par de factores herdados, que se chamam
genes. Uma cópia de um gene (alelo) que especifica uma característica é herdada de cada
progenitor. Quando mais de que um alelo diferente está presente num ser, aquele que se
manifesta é dito alelo dominante, e o outro recessivo. O genótipo é a composição genética de
um organismo, enquanto o fenótipo são as características observáveis, que resultam da
expressão dos genes de um organismo. Os genes são transportados pelos cromossomas, sendo
que a maioria dos animais e plantas apresentam duas cópias de cada cromossoma: são
diplóides. Durante a formação das células da linha germinativa, dá-se a meiose (tipo de divisão
celular), na qual apenas um cromossoma do par de cromossomas é transmitido à
descendência. Assim, o oócito e o espermatozóide são haplóides, contendo apenas uma cópia
de cada cromossoma. A união destas duas células haplóides durante a fecundação cria um
novo ser diplóide, contendo agora cada par de cromossomas, derivado um do pai e outro da
mãe. O comportamento dos pares de cromossomas é semelhante ao dos genes, levando à
conclusão que os genes são transportados pelos cromossomas.
Genes e Enzimas
Um gene especifica a sequência de aa de uma cadeia polipeptídica.
A experiência que ditou inicialmente que o DNA seria o material genético e não as proteínas
deriva de estudos com a bactéria que causa a pneumonia, pneumococcus. A estirpe patogénica
do pneumococcus é envolvida por uma cápsula de polissacáridos que protege as bactérias de
um ataque por parte do sistema imunitário do hospedeiro. A estirpe encapsulada é a estirpe S
(“smooth”) e a estirpe mutante que perdeu a capacidade de gerar a cápsula é a estirpe R
(“rough”), que não tendo cápsula, não é patogénica quando inoculada em ratos.
Experimentalmente verificou-se que, ratos inoculados com bactérias R mais bactérias S mortas
por calor desenvolviam pneumonia e morriam. Quando extraídas bactérias dos ratos mortos,
verificavam-se que estas eram da estirpe S. Denotou-se que extractos de bactérias S eram
também capazes de converter a bactéria R para uma bactéria S. Assim, uma substância no
extracto da bactéria S eram responsável pela indução da transformação genética de uma
bactéria R (não patogénica) para uma S (patogénica).
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Outra experiências vieram demonstrar que era o DNA, e não proteínas o material genético. Foi
provada que a actividade do extracto transformador (como no caso dos pneumococcus) era
abolida quando se procedia a digestão enzimática de DNA e não de proteínas. Foi também
demonstrado que quando um vírus (bacteriófago) infecta uma célula, é necessário que o DNA
viral entre na bactéria, e não o proteína viral, de forma a que o vírus se replique. Além disto, é
o DNA viral que se transmite às partículas virais descendentes.
Estrutura do DNA
A molécula de DNA é uma hélice que dá uma volta a cada 3,4 nm, sendo que a cada volta
existem 10 bases. Esta dupla hélice possui um “backbone” (coluna) de açúcar e fosfato do lado
de fora, contendo na porção interna bases, orientadas para formarem pontes de hidrogénio
entre as purinas e as pirimidinas de cadeias opostas. Para justificar que A emparelha com T e G
com C, estão os resultados de experiências que demonstram que a quantidade de adenina é
sempre igual à de timina, e que a quantidade de guanina é sempre igual à de citosina. Assim,
devido a esta complementaridade de bases, as duas cadeias de DNA são complementares.
Logo, cada cadeia contém a informação necessária para especificar a sequência das bases da
outra.
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A estrutura do DNA
Replicação do DNA
As duas cadeias de DNA podem-se separar e servir como moldes para a síntese de novas
cadeias complementares, cuja sequência seria ditada pelo emparelhamento específico de
bases complementares. Este processo denomina-se replicação semiconservativa, pois cada
cadeia de DNA pai é conservada, constituindo metade da nova cadeia sintetizada (apenas
metade da dupla hélice é sintetizada, sendo a outra herdada).
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A capacidade do DNA servir como molde da sua própria replicação foi demonstrada pois, a
DNA polimerase (enzima da E.coli) consegue catalisar a replicação de DNA in vitro, apenas na
presença de um molde de DNA, ao incorporar directamente os nucleótidos numa molécula de
DNA complementar.
O papel do mRNA
Apesar da sequência de nucleótidos no DNA especificar a ordem dos aa nas proteínas, não é o
próprio DNA que intervém directamente na síntese proteica. Como nos eucariontes, o DNA se
encontra no núcleo e a síntese proteica se dá no citosol, terá que existir outra molécula que
transporte a informação genética para os locais de síntese (ribossomas). Assim, o mRNA é o
intermediário da síntese proteica, sendo sintetizado a partir de um molde de DNA.
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Código Genético
Devido à não complementaridade
entre os aminoácidos e o mRNA, existem tRNAs que servem de
adaptadores durante a tradução. Cada aminoácido diferente é ligado,
por uma enzima específica, ao tRNA apropriado. O emparelhamento
entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminoácido que lhe está ligado
para o local correcto do molde de mRNA. A partir de sequências das
quatro bases nucleotídicas do DNA - adenina (A), timina (T), citosina (C)
e guanina (G) - é possível formar exactamente 64 palavras código de
três letras diferentes, tripletos ou codões, pois 43=64. Estes tripletos
são a unidade da mensagem genética que vai codificar a ordenação de
séries de aminoácidos que caracterizam diversas proteínas. Das 64
palavras possíveis, 3 são sinais de paragem (codões STOP), indicando se
chegou ao fim do código de uma proteína. Os restantes tripletos
codificam os 20 aminoácidos, por isso mais que um tripleto pode
codificar o mesmo aminoácido (degenerescência do código genético). A
leitura dos nucleótidos começa num local fixo, gerando um quadro de
leitura (reading frame), que é o conjunto sucessivo de 3 bases que
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forma codões sucessivos. Uma alteração no quadro de leitura (frameshift) causa a mudança da
sequência de codões, de uma mesma cadeia de DNA.
No caso de mutações por adição ou remoção de 1 ou 2 nucleótidos, esta causa uma mudança
no quadro de leitura, fazendo com que todos os aa subsequentes sejam alterados. Adições ou
remoções de 3 nucleótidos alteram apenas um aa, sendo que o quadro de leitura do resto do
gene se mantém normal.
Pouca especificidade do 3º codão, vários codões que sintetizam o mesmo aa têm o 3º codão
igual, pelo que o 3º codão é menos específico, e o 1º é o mais específico.
DNA recombinante
Até à década de 1970 parecia impossível o isolamento e manipulação de genes. Este obstáculo
foi superado pelo desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, que possibilitou aos
cientistas isolar, sequenciar e manipular genes individuais.
Enzimas de restrição
O primeiro passo no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante foi a caracterização
de enzimas de restrição, que clivam o DNA em sequências específicas. São o “bisturi” que
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permite cortar o DNA, fazendo parte do grupo das nucleases, enzimas responsáveis por clivar
as ligações fosfodiéster entre nucleótidos adjacentes. Estas enzimas foram identificadas em
bactérias, onde servem como método de defesa contra a entrada de DNA estranho (provindo
de vírus, etc) na célula. As enzimas de restrição reconhecem de 4 a 8 pb, sendo estas
sequências específicas, que originam fragmentos de DNA.
Porque é que o DNA da bactéria não é digerido pelas suas próprias endonucleases (enzimas de
restrição)? As enzimas de restrição não funcionam sozinhas numa bactéria, trabalhando em
conjunto com enzimas que modificam o DNA bacteriano, tornando-o irreconhecível pelas
endonucleases. Este sistema permite que apenas DNA estranho-não modificado seja digerido
por endonucleases.
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Origem de replicação (ORI), que permite que o vector (molécula de DNA recombinante), se
mantenha na célula e seja transmitida à descendência, ao permitir a sua replicação.
Marca de selecção - a maioria dos vectores possui um gene que confere resistência a um
antibiótico. Assim, apenas as bactérias que possuem o DNA recombinante sobrevivem quando
crescidas em presença desse antibiótico.
Local de policlonagem (MCS): pequena sequência de DNA que contém locais de corte únicos
para várias enzimas de restrição. É neste local que é introduzido o fragmento de DNA que se
pretende clonar.
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Sequenciação de DNA
A sequenciação é uma técnica que permite: inferir a sequência de aa sintetizados por um gene
específico, ao sabermos a sequência de nucleótidos desse gene; estudar as propriedades de
sequencias de DNA que regulam a expressão do gene.
Processo de sequenciação
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3. O produto desta reacção é depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais se
junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP), que são
nucleótidos modificados, desprovidos de grupo hidroxilo no carbono 3’, e, portanto,
impedem o alongamento das cadeias de DNA em que são incorporados.
5. O DNA de cada tubo é desnaturado e colocado num gel de acrilamida com ureia (para
evitar a renaturação do DNA durante a electroforese).
9. Como a síntese de DNA ocorre de 5’ para 3’, os fragmentos menores resultam de uma
incorporação do dNTP mais próxima da extremidade 5’.
10. Em consequência, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequência de nucleótidos
da cadeia 5’-3’.
Para iniciar a reacção de sequenciação é necessário um primer, logo o DNA desconhecido tem
de ser “enquadrado” numa sequência conhecida, para a qual o primer será complementar.
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Para uma reacção PCR são necessários os seguintes componentes: DNA molde; primers (ligam-
se às extremidades que se pretendem ladear e permitem a adição de nucleótidos por parte da
polimerase); DNA polimerase (taq polimerase, termoestável, polimeriza de 5→3); nucleótidos
dNTP; tampão de reacção; termocycler, que assegura ciclos rápidos de aquecimento e
arrefecimento.
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Devido às grandes dimensões do DNA genómico, para que se possa proceder à sua separação,
é necessário tratá-lo com uma enzima de restrição. Esta enzima vai cortar o DNA de forma
previsível, dando origem a milhares de fragmentos diferentes que cobrem um leque vasto de
tamanhos, produzindo um aspecto típico de mancha arrastada (smear) após a electroforese.
As dimensões dos fragmentos genómicos formados vão ser característicos de cada indivíduo,
já que são consequência da existência de um local de restrição da enzima usada em
determinada posição do genoma e, portanto, reflectem a sequência do genoma.
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Southern blotting
O Northern Blotting permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA , e
como o RNA já é fragmentado o passo da digestão com enzimas não é necessário. Esta técnica
dá-nos a informação da expressão de um gene.
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A Hibridação in situ (FISH) de ácidos nucleicos pode ser usada para detectar sequências de
DNA ou RNA homólogas em cromossomas ou células intactas , sendo os resultados analisados
por examinação microscópica de fluorescência. Esta técnica pode ser utilizada para detectar o
locus do gene no cromossoma, e mRNAs específicos em células do mesmo tecido.
No Western Blotting ou Imunoblot as proteínas extraídas das células são separadas por
electroforese em gel de poliacrilamida-SDS, devido aos diferentes tamanhos e carga eléctrica.
As proteínas são colocadas numa solução de SDS, um detergente carregado negativamente
que se liga às proteínas desnaturando-as (passam a ter uma estrutura linear), ficando também
carregadas negativamente. Passam depois para um filtro que permite a reacção com os
anticorpos contra a proteína de interesse.
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Western blotting
Na Imunoprecipitação as células são incubadas com aminoácidos radioactivos que vão marcar
as suas proteínas. Os extractos celulares marcados são incubados com anticorpos que se ligam
com o seu antigénio-alvo. Os complexos anticorpo-antigénio obtidos são isolados e sujeitos a
electroforese permitindo a detecção dos antigénios radioactivos por autoradiografia.
Imunoprecipitação
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Os retrovírus podem também ser usados como vectores para a inserção de um gene de
interesse numa célula animal. Eles são particularmente úteis, uma vez que o seu ciclo de vida
envolve a integração estável do DNA viral no genoma da célula infectada.
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Vectores retrovirais
Genes clonados podem também ser introduzidos na linha germinativa de seres multicelulares,
permitindo o seu estudo no contexto de um animal intacto, em vez de apenas células em
cultura. Um método utilizado para gerar ratos que transportam o gene de interesse (ratos
transgénicos) é a microinjecção directa de DNA clonado no pronúcleo de um ovo fertilizado.
Os ovos injectados são então transferidos para mães de aluguer, e desenvolvem-se. Uma
fracção da descendência terá integrado o DNA de interesse no seu genoma, sendo que este
está presente em todas as células do animal. Como o DNa está presente tanto nas somáticas,
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Genes podem ser alterados por procedimentos de mutagénese in vitro, que levam à
introdução de delecções, inserções, e alterações de nucleótidos. Um dos métodos consiste na
utilização de um oligonucleótido sintético (que carrega a mutação desejada) como primer para
a síntese de DNA. As cadeias de DNA sintetizadas a partir deste primer passarão a conter a
mutação, e podem ser estudadas: aa específicos de uma proteína podem ser alterados para
caracterizar o seu papel na função da proteína.
Os RNAs de interferência (iRNAs) são moléculas de RNA de cadeia dupla, que são clivadas pela
enzima DIcer em RNAs de interferência curtos (siRNAs). Estes siRNAs associam-se a complexos
(RISC) e são desdobrados em cadeias simples, que ao se hibridarem com o mRNA
complementar, induz a sua clivagem por parte do complexo, que depois fica livre para clivar
outros mRNAs.
A inibição directa da função proteica pode ser conseguida pela: microinjecção de anticorpos
que se ligam às proteínas dentro das células, inibindo a sua normal função; adição de proteínas
mutantes que interferem com a função das proteínas normais, podendo competir com elas
por moléculas alvo.
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Intrões e Exões
Em termos moleculares, gene é um segmento de DNA que é expresso num produto funcional
(RNA ou proteína). Muito do DNA eucariótico consiste em sequências entre genes (spacer
sequences). Mas dentro do próprio gene também podem existir: Exões (sequências
codificantes) e Intrões (sequências não codificantes). O gene é totalmente transcrito a RNA
que posteriormente sofre splicing (processamento) - remoção dos intrões, ficando apenas os
exões de modo a formar um mRNA maduro.
A quantidade de DNA em intrões é muito maior que em exões, sendo que na maioria dos
genes humanos a percentagem de intrões é de aproximadamente 90% do material genético.
Os intrões estão presentes na maioria dos genes eucarióticos, excepto nalguns seres mais
simples (leveduras) e em alguns procariótas. Todavia, intrões aparecem em genes raros de
alguns procariótas. Logo, a presença ou ausência de intrões não permite uma distinção
absoluta entre genes procariótas e eucariótas (apesar de prevalecerem principalmente em
eucariótas mais complexos).
Pensa-se que os intrões representam sequências que foram importantes no inicio da evolução,
ou que a facilitaram, permitindo a recombinação de exões de alguns genes. O
desaparecimento de intrões em alguns procariótas deve-se à selecção natural por rápida
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replicação (genoma sem intrões é menor e replica-se mais rapidamente), que não foi tão
relevante para os eucariótas, que assim mantiveram os seus intrões.
Os intrões têm um papel no controlo da expressão genética: a presença de intrões permite que
os exões de um gene sejam combinados de formas diferentes, resultando na síntese de
diferentes proteínas. Este processo denomina-se splicing alternativo, e é responsável por
estender o reportório funcional de 20 a 25 mil genes do genoma humano (por isso é que são
sintetizados mais tipos diferentes de proteínas que o número de genes diferentes existente).
Os intrões podem também ter ajudado a evolução, facilitando a recombinação entre exões de
diferentes genes – exon shuffling. Isto é suportado pelo facto de alguns genes serem quimeras
de exões derivados de vários outros genes.
A sua existência foi demonstrada durante estudos dos rácios de reassociação de fragmentos
de DNA celular desnaturados. As cadeias de DNA desnaturado hibridam umas com as outras
(reassociam-se), voltando a formar moléculas de cadeia dupla. Como a reassociação de DNA é
uma reacção bimolecular (duas cadeias separadas de DNA desnaturado devem colidir para
hibridarem), o rácio de reassociação depende da concentração das cadeias de DNA. Quando
fragmentos do DNA de E.coli eram desnaturados e hibridados, seria esperado que todos
hibridassem ao mesmo ritmo, no caso de cada sequência (fragmento) surgir uma vez apenas
no genoma. Contudo, estudos demonstraram que, aproximadamente 50% dos fragmentos de
DNA reassociavam ao ritmo esperado (caso cada sequência estivesse presente apenas uma vez
no genoma), mas os restantes fragmentos reassociavam muito mais rapidamente que o
esperado. Isto acontece pois algumas sequências estavam presentes no genoma um um´ltiplas
cópias e, consequentemente, reassociavam-se mais rapidamente que as sequências que
ocorriam apenas uma vez no genoma. Descobriu-se que aproximadamente 50% do DNA dos
mamíferos é composto por sequências altamente repetitivas.
Repetições de sequências simples são múltiplas cópias de pequena sequências de DNA, que
podem ser separadas do resto do genoma por uma centrifugação de equilíbrio em gradiente
de densidade de CsCl. As sequências ricas em A=T são menos densas que as ricas em G≡C. As
sequências repetitivas aparecem como bandas afastadas da banda principal de DNA,
denominando-se de DNAs satélite. Estas sequências não são transcritas, nem contêm
informação genética, podendo desempenhas um papel importante na estrutura dos
cromossomas.
SINEs e LINEs são respectivamente elementos curtos dispersos e elementos longos dispersos,
que fazem parte do conjunto de elementos repetitivos de DNA dispersos, que contribuem para
aproximadamente 45% do tamanho do genoma. Alguns SINEs e LINEs são transcritos e até
codificam proteínas, mas não têm função fisiológica a nível celular. Ambos são exemplos de
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Contém aproximadamente 4 000 genes, sendo 90% do genoma sequências que codificam
proteínas.
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Genoma da levedura
Só 4% do seu genoma contém intrões, sendo 70% do genoma sequências que codificam um
total de 6 000 proteínas.
São 10 vezes maiores que o da levedura, mas contêm apenas 2 a 3 vezes mais genes, contendo
mais intrões.
É 20 a 30 vezes maiores que o da C.elegans e Drosophila mas contém apenas 20 000 a 25 000
genes. Apenas 1,2% do genoma humano codifica proteínas, sendo 20% constituído por intrões,
e mais de 60% constituído por vários tipos de sequências repetitivas ou duplicações de DNA,
sendo que o restante corresponde a pseudogenes, e exões que estão presentes nas
extremidades 5’ e 3’ dos mRNAs mas não são traduzidos a proteínas.
Concluindo, o tamanho aumentado dos genomas de eucariótas superiores deve-se muito mais
à presença de grandes quantidade de sequências repetitivas e intrões do que ao aumento no
número de genes.
Cromossomas e Cromatina
O genoma de procariótas contém cromossomas únicos, que são normalmente moléculas de
DNA circular, enquanto que o genoma de eucariótas é composto por vários cromossomas,
contendo cada um uma molécula de DNA linear. O DNA de células eucariótas está ligado a
pequenas proteínas (histonas) que compactam o DNA de forma ordenada no núcleo.
Cromatina
Chama-se cromatina ao complexo formado pelo DNA e as proteínas. As proteínas mais
abundantes são as histonas que contêm uma proporção alta de aminoácidos básicos que
facilitam a ligação à molécula de DNA carregada negativamente. Existem outras proteínas para
além das histonas (nonhistone chromossomal proteins) que participam em vários processos
como a replicação de DNA e a expressão genética.
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Estrutura de um cromatossoma
Durante a Mitose os cromossomas estão muito condensados e não podem servir de molde
para a síntese de RNA, pelo que a transcrição cessa.
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Centrómeros
O centrómero é uma região especializada do cromossoma que assegura a distribuição correcta
dos cromossomas duplicados pelas células filhas, durante a mitose.
Telómeros
Os telómeros são sequências no final dos cromossomas eucariótas que são importantes para a
replicação e manutenção. Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo
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resíduos G numa cadeia. Estas sequências são repetidas milhares de vezes terminando com
uma cadeia simples de DNA. As sequências repetidas do telómero formam loops no final dos
cromossomas aos quais se juntam proteínas que protegem a terminação do cromossoma da
degradação. Os telómeros são importantes para a replicação do final das moléculas de DNA
linear. A DNA polimerase é capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas não é
capaz de iniciar a síntese na extremidade 5’ de uma cadeia de DNA linear (é nesta extremidade
que se liga o primer para a replicação, pelo que a extremidade 5’ não é replicada). Assim, as
extremidades dos cromossomas não podem ser replicados pela acção normal da DNA
polimerase. A manutenção dos telómeros parece determinar a capacidade reprodutiva das
células. Esta manutenção é realizada pela Telomerase, que é uma proteína capaz de produzir
telómeros e de os associar à molécula que está a ser replicada para continuar a replicação. É
uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a partir do RNA.
Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que é complementar às sequências
repetidas que sintetiza – os telómeros.
Estrutura de um telómero
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O Impacto
Descobriu-se que o número de genes humanos eram muito pequeno (20 a 25 mil genes), e ao
que parece, o splicing alternativo é muito comum no genoma humano, pelo que muitos genes
codificam mais que uma proteína. Além disso, os intrões representam 20 % do genoma
humano, e as sequências repetitivas aproximadamente 60%. É de realçar ainda que 40% do
genoma humano é composto por sequências que derivaram da transcrição reversa.
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DNA polimerases
A polimerase I descoberta na E.coli é a principal responsável na reparação de DNA danificado.
As células eucariótas e procariótas contêm DNA polimerase diferentes, que têm funções
diferentes, como replicação e reparação. Nos procarionte, a DNA polimerase III é a polimerase
responsável pela replicação do DNA. Em eucariontes, existem 3 DNA polimerases (α, δ e ε)
responsáveis pela replicação do DNA. Finalmente, a DNA polimerase γ está localizada na
mitocôndria e é responsável pela replicação do DNA mitocondrial.
2. Apenas conseguem adicionar dNTPs a uma cadeia primer pré-formada, não são
capazes de iniciar a síntese de DNA de novo, ao catalisar a polimerização de dNTPs
livres. As RNA polimerases por outro lado, conseguem iniciar a síntese de uma nova
cadeia de RNA na ausência de um primer.
Estas características das DNA polimerases atribuem um alto grau de fidelidade à replicação.
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Forquilha de Replicação
As forquilhas de replicação são regiões de síntese de DNA activa. Em cada forquilha, as cadeias
pais de DNA separam-se e as duas novas cadeias filhas são sintetizadas.
Mas, se as duas cadeias da dupla hélice são antiparalelas (correm em sentidos opostos), a
síntese contínua das duas cadeias na forquilha de replicação requereria que uma cadeia fosse
sintetizada no sentido 5’→3’ e a outra no sentido 3’→5’. Mas as DNA polimerases apenas
adicionando dNTPs no sentido 5’→3’. Como pode então a outra cadeia ser sintetizada?
Estudos demonstram que apenas uma cadeia é sintetizada de uma forma contínua na direcção
global da replicação de DNA, sendo que a outra é formada de curtos pedaços de DNA
sintetizados no sentido contrário ao do movimento da forquilha de replicação. Estes pedaços,
fragmentos de Okazaki, são juntos pela acção da DNA ligase, formando uma nova cadeia de
DNA intacta. A cadeia sintetizada continuamente é chamada de leading strand, enquanto que
a outra cadeia (dos fragmentos de Okazaki) se denomina lagging strand.
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Como é então iniciada a síntese dos fragmentos de Okazaki? Pequenos fragmentos de RNA
servem como primers para a replicação de DNA. A síntese de RNA pode iniciar-se de novo,
através da enzima primase, que sintetiza pequenos fragmentos de RNA, complementares à
lagging strand, na forquilha de replicação. Os fragmentos de Okazaki são depois sintetizados
estendendo estes primers de RNA através da actividade da DNA polimerase.
Para se formar uma lagging strand contínua de DNA, os primers de RNA devem ser removidos
e substituídos por DNA. Em procariontes a DNA polimerase I encarrega-se de remover os
primers de RNA, funcionando também como uma exonuclease, que hidrolisa DNA ou RNA em
ambas a direcções. A acção de exonuclease da DNA polimerase I no sentido 5’→3’ remove os
ribonucleótidos das extremidades 5’ dos fragmentos de Okazaki, permitindo que estes sejam
substituídos por dNTPs, gerando fragmentos constituídos apenas por DNA. Em eucariontes, os
primers de RNA são removidos pela actividade conjunta de RNase H (degrada o RNA de
híbridos RNA-DNA) e exonucleases 5’→3’. Os espaços são preenchidos pela DNA polimerase δ
e os fragmentos de DNA são ligados pela DNA ligase, gerando uma lagging strand intacta.
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Síntese da lagging strand Primase + pol III pol α/primase + pol δ/ε
Existem outras proteínas que actuam ao nível da forquilha de replicação. Uma classe de
proteínas liga-se às DNAs polimerases e mantém-nas ligadas ao molde de DNA, para que
continuem a síntese da nova cadeia de DNA. Estas proteínas formam complexos com as DNA
polimerases responsáveis pela polimerização das cadeias, reconhecendo e ligando-se à porção
de DNA entre o primer de RNA e o molde de DNA. O anel formado por este complexo mantém
a associação necessária entre a DNA polimerase e o molde de DNA, para que a replicação
proceda, permitindo a síntese ininterrupta de milhares de nucleótidos de DNA.
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Em eucariontes, as histonas ligadas à cromatina do DNA pai são divididas pelas cadeias de DNA
filhas, e novas histonas são depois adicionadas.
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Fidelidade da Replicação
A precisão na replicação de DNA é crítica para a reprodução de uma célula. A frequência de
erros durante a replicação corresponde à incorporação de uma base incorrecta por cada 108 a
109 nucleótidos incorporados. A selecção de uma base simplesmente pela sua ligação por
hidrogénio à base complementar resultaria numa frequência de erros na ordem de uma base
incorrecta a cada 100 a 1000 nucleótidos incorporados. Assim, o elevado grau de fidelidade
atingido resulta em grande parte das actividades da DNA polimerase.
A DNA polimerase não catalisa a incorporação de qualquer nucleótido que se ligue por pontes
de hidrogénio à cadeia molde. Em vez disso, discrimina activamente a incorporação de bases
não correspondentes. Além disto, existe outro mecanismo responsável pela precisão da
replicação de DNA, que é a actividade de proofreading da DNA polimerase. As DNA
polimerases replicativas têm actividade de exonuclease na direcção 3’→5’. Esta exonuclease
remove selectivamente bases incorrectamente emparelhadas incorporadas na extremidade da
cadeia em crescimento, aumentando a precisão da replicação.
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Existem ainda mecanismos adicionais (Reparação de DNA) que permitem a remoção de bases
incorrectamente incorporadas na nova cadeia de DNA, contribuindo também para a correcta
replicação da informação genética.
Em E.coli, a replicação inicia-se num local único do cromossoma, designado origem (ori). O
primeiro acontecimento é a ligação de uma proteína iniciadora à ori do DNA, que leva ao
desdobramento parcial do DNA. O restante desdobramento é efectuado pela helicase e
assegurado pelas proteínas de ligação ao DNA de cadeia simples. Depois primers de RNA são
sintetizados pela primase. Surgem assim duas forquilhas de replicação na origem, que se
movem em direcções opostas ao longo da molécula de DNA circular.
Apesar de origens de replicação únicas serem suficientes para replicar os genomas virais e
bacterianos, múltiplas origens são necessárias para replicar os genomas muito maiores dos
eucariontes durante um período de tempo razoável.
A função das proteínas do complexo ORC é a mesma para todos os eucariontes, das leveduras
aos mamíferos. Contudo, para eucariótas mais complexos, a iniciação da replicação pode ser
determinada por aspectos como a estrutura da cromatina.
A telomerase é uma transcriptase reversa, uma classe de DNA polimerases que sintetizam o
DNA a partir de um molde de RNA. A telomerase transporta consigo o seu próprio molde de
RNA, que é complementar às sequências repetitivas do telómero, como parte do seu complexo
enzimático. O uso deste molde de RNA permite à telomerase gerar múltiplas cópias das
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Acção da telomerase
O DNA dos telómeros é uma sequência de repetições simples, com uma extremidade 3’ de
cadeia simples, na leading strand. A telomerase transporta a sua própria molécula de RNA, que
é complementar ao DNA dos telómeros. A extremidade 3’ de cadeia simples emparelha com o
RNA da telomerase, que serve de molde para a extensão da leading strand por uma unidade
de repetição. A lagging strand de DNA telomérico pode então ser elongada por priming de RNA
convencional e actividade da DNA polimerase.
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Acção da Telomerase
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Reparação de DNA
O DNA pode sofrer mutações durante a replicação, através da incorporação incorrecta de
bases. Pode também sofrer mudanças químicas espontâneas ou como resultado da exposição
a químicos ou radiações. Tais danos ao DNA podem bloquear a replicação ou transcrição. Para
manter a integridade dos genomas, as células desenvolveram mecanismos de reparação de
DNA, que se didivem em duas classes: reversão directa da reação química responsável pelos
danos; remoção das bases danificadas seguida da subsitituição por novos nucleótidos. Quando
a reparação de DNA falha, outros mecanismos celulares entram em acção.
Existem duas formas de danificação espontânea do DNA: desaminação (perda da amina – NH2)
da adenina, citosina e guanina; e depurinação (perda das bases de purinas), que resulta da
quebra da ligação entre as bases de purina e a desoxirribose.
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Reparação Recombinacional
O DNA danificado pode ser substituído pela recombinação com uma molécula íntegra. Este
mecanismo é muito importante em casos de reparação de DNA durante a replicação, e de
quebras de DNA em ambas as cadeias.
Rearranjos de DNA
A recombinação homóloga rearranja os cromossomas homólogos, mas não produz alterações
nas posições dos genes ao longo do genoma. Estes fenómenos de rearranjo que movem os
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genes ao longo do genoma são importantes tanto para a regulação génica, como para a
evolução de geração de biodiversidade.
Recombinação Site-Specific
Com ampla homologia entre as sequências, a recombinação site-specific ocorre entre
sequências especificas do DNA, normalmente homólogas em apenas uma pequena parte do
DNA. Esta interacção é mediada por proteínas e não por complementaridade de bases. Um
exemplo desta recombinação é a integração e remoção do DNA viral aquando da infecção da
E.Coli pelo bacteriófagoγ.
Esta recombinação é ainda importante para os rearranjos programados que ocorrem nos
genomas celulares, como é o caso do desenvolvimento do sistema imunológico. Os anticorpos
são resultado deste tipo de recombinação entre os genes para as imunoglobulinas (linfócitos
B) e os receptores de células T, o que lhes permite identificar um grande número de
antigénios. As RAG 1 e RAG 2 estão envolvidas em processos de clivagem e junção na
recombinação site-specific para a formação de anticorpos.
A recombinação VDJ
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replicação e integração num novo local, ficando a sequêncoa de inserção original no seu local
inicial.
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Amplificação Génica
A amplificação génica resulta na replicação repetitiva de uma certa região do cromossoma. Em
certos casos, a amplificação génica serve para aumentar a expressão genética durante o
desenvolvimento. A amplificação também ocorre frequentemente em células cancerosas,
onde pode resultar na elevada expressão de genes que contribuem para a proliferação celular
descontrolada.
Amplificação génica
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A RNA polimerase é uma enzima complexa, constituída por múltiplas cadeias polipeptídicas e
várias subunidades - α, β, β’, ω, σ. Esta última tem uma fraca ligação e facilmente se separa
das outras. A RNA polimerase é capaz de fazer a transcrição sem a subunidade σ, mas sem ela
não se consegue ligar especificamente às sequencias de DNA que sinalizam o início da
transcrição – a subunidade σ é essencial para o inicio da transcrição.
A sequencia especifica de DNA ao qual a RNA polimerase se liga para dar inicio à transcrição é
chamada promotor. A região antes do inicio da transcrição contem dois sets de sequências
que são semelhantes numa série de genes. Estes sets têm 6 nucleótidos cada, e localizam-se
nas posições -10 e -35, relativamente ao inicio da transcrição, nucleótido +1.
Primeiro, genes com promotores que diferem destas sequências consenso são transcritos
menos eficientemente do que genes com promotores com sequências mais próximas.
Segundo, mutações nas sequências consenso -10 ou -35 têm fortes efeitos na funcionalidade
do promotor. Terceiro, os locais onde a RNA polimerase se liga ao promotor foram
identificados por experiencias footprinting. A subunidade σ liga-se especificamente a
sequências nas regiões -10 e -35 do promotor, confirmando a importância destas sequências.
O DNA footprinting é uma técnica que permite identificar exactamente onde uma proteína se
liga ao DNA (por exemplo a identificação dos locais de ligação da RNA polimerase).
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Footprinting de DNA
Concluindo, na ausência de σ a RNA polimerase liga-se não especificamente ao DNA, com baixa
afinidade. σ direcciona a RNA polimerase para o promotor, levando ao inicio da transcrição.
Após a adição de cerca de 10 nucleótidos, a subunidade σ é libertada da RNA polimerase, que
depois deixa o promotor e continua a elongação. À medida que avança, a RNA polimerase
desenrola a cadeia de DNA à frente, e volta a enrolar atrás.
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Terminação da transcrição
O principio da regulação por genes é que o controlo da transcrição é mediado por sequências
especificas de DNA. Este sistema é aplicável a procariótas e a eucariótas.
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O promotor de muitos genes transcritos pela polimerase II contém uma sequência semelhante
a TATAA localizada entre 25-30 nucleótidos acima do local de inicio da transcrição. Esta
sequência – TATA box – assemelha-se à sequência em -10 no promotor das bactérias. Os
promotores da polimerase II contêm ainda uma segunda sequência bastante importante –
uma sequência de iniciação ou Inr. Apesar de alguns promotores possuírem estas duas
sequências, há outros que apenas têm uma delas. Muitos promotores que não têm a TATA
box, mas têm a sequência Inr têm uma sequência adicional – DPE – que funciona em
cooperação com a sequência Inr.
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Promotor eucarióta
Genes transcritos pela RNA polimerase II têm alguns elementos importantes no promotor,
como a TATA box e a sequencia Inr, que servem como local de ligação especifico para os
factores de transcrição. Mas existem outras sequências igualmente importantes que servem
como local de ligação a diversos factores de regulação que controlam a expressão de genes
individualmente. Localizam-se na maior parte das vezes a montante (upstream) da TATA box, a
100 nucleótidos, ou até a 10 Kb. Estas sequências são chamadas enhancers – 2 repetições de
72 pares de bases, essenciais à transcrição a partir deste promotor. Descobriu-se que estas
repetições estimulavam a transcrição, e que a sua actividade não depende nem da distância ao
promotor, nem da sua orientação relativamente ao promotor – são eficazes tanto upstream,
como downstream, forward ou backward.
Acção de enhancers
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Isto é possível devido à capacidade do DNA fazer loopings, que permite que um factor de
transcrição ligado a um enhancer muito distanciado, possa interagir com as proteínas
associadas à RNA polimerase ou Mediador.
Apesar do DNA looping permitir aos enhancers actuar a uma distância considerável, a
actividade de qualquer enhancer é específica a um determinado promotor. Esta especificidade
é mantida em parte por insulator ou elementos barreira, que dividem os cromossomas em
domínios independentes e apenas permitem que um enhancer actue apenas no seu promotor.
Nota: Uma grande barreira para a terapia genética é que os genes introduzidos são muitas
vezes mal regulados ou inactivados por causa da estrutura da cromatina próxima.
Repressores eucariótas
A expressão genética das células eucariótas é regulada por repressores assim como por
activadores da transcrição. Os repressores ligam-se a sequencias especificas de DNA e inibem
a transcrição. Nalguns casos, os repressores limitam-se a interferir com a ligação de outras
factores de transcrição ao DNA. Por exemplo, a ligação de um repressor perto do local de inicio
da transcrição, pode bloquear a interacção da RNA polimerase com o promotor, que é uma
acção semelhante aos repressores nas bactérias.
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Muitos repressores activos têm um importante papel na regulação, como por exemplo no
crescimento celular e diferenciação. Os alvos dos repressores são diferentes: os repressores
podem inibir a transcrição interagindo com proteínas específicas, com o Mediador ou factores
de transcrição, e corepressores que actuam modificando a estrutura da cromatina. Um
importante papel dos repressores, é também inibir a expressão de certos genes em certas
células, levando assim à diferenciação celular.
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Acetilação de Histonas
Outro modo de regular a estrutura da cromatina é através dos factores de remodelação dos
nucleossomas, que actuam sem remover ou alterar as histonas.
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Os miRNAs são transcritos como precursores contendo repetições inversas que formam
estruturas steam-loop. De seguida são clivados e dão origem a miRNA maduros. Estes podem
associar-se a complexos RISC ou a RITS.
Apesar do fenómeno ainda não ser completamente claro, parece que a chave está nas
sequências não codificantes de RNA.
Metilação do DNA
Este é outro mecanismo que controla a transcrição nos eucariótas. Os resíduos de citosina
podem ser modificados pela adição de um grupo metilo. O DNA é metilado especificamente
em citosinas localizadas antes de Guaninas, na cadeia de DNA, e esta metilação está
relacionada com a repressão da transcrição. Os genes no cromossoma X inactivo estão
também metilados, o que supõe que este processo está também envolvido no processo de
inactivação.
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Metilação de DNA
A metilação tem também um importante papel de regulação num fenómeno conhecido como
genomic imprinting, que controla a expressão de alguns genes envolvidos no desenvolvimento
de embriões. Há alguns imprinting genes cuja expressão depende se provêm do pai ou da mãe.
Nalguns casos apenas o alelo paterno é expresso, e o alelo materno é transcricionalmente
inactivo.
Metilação de DNA parece ter um papel chave na distinção entre alelos paternos e maternos. O
gene H19 é um exemplo. É transcrito apenas o alelo materno. Este gene é especificamente
metilado durante o desenvolvimento das células germinativas masculinas, mas não nas
femininas.
Imprinting genético
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Mas a modificação mais significativa é a remoção dos intrões, por splicing. As sequências
codificantes de RNA (exões) são interrompidas por outras não codificantes (intrões) que são
retiradas.
Mecanismos de Splicing
Vários sistemas foram desenvolvidos in vitro para explicar este mecanismo.
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Splicing de pré-mRNA
Análises bioquímicas revelaram que o splicing ocorre num grande complexo – spliceossoma –
composto por proteínas e RNAs. Os RNAs constituintes do spliceosoma denominam-se small
nuclear RNA (snRNA) e são U1, U2, U4, U5 e U6.
O primeiro passo realizado pelo spliceossoma é a ligação de U1 snRNA ao local de splicing 5’.
Esta ligação involve o reconhecimento de certos pares de bases. U2 snRNA liga-se de seguida
ao branch point, também por complementariedade de bases. De seguida, um complexo
formado por U4/U6 e U5 snRNAs é incorporado no spliceosoma. A reacção de splicing é
acompanhada por rearranjos nos snRNAs. U5 liga-se de seguida às sequências na extremidade
3’ do intrão, seguido do corte e ligação dos exões. Os snRNA não se limitam a reconhecer as
sequências consenso, mas clivam também o intrão – self-splicing. São capazes de remover os
seus próprios intrões na ausência de outras proteínas ou factores de RNA.
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Intrões Self-splicing
O splicing alternativo actua pela acção de um repressor que funciona bloqueando a ligação de
um factor do spliceossoma, e um grande grupo de proteínas regulam o splicing alternativo,
ligando-se a sequências silenciadoras nos pré-mRNA. Noutros casos, o splicing alternativo é
controlado por activadores que recrutam factores do spliceosoma para locais de ligação do
intrão, que de outra maneira não seriam reconhecidos. O activador de splicing melhor
estudado pertence à família das proteínas SR.
Edição de RNA
A Edição de RNA refere-se a eventos que introduzem alterações nas sequências codificantes
de proteínas de alguns mRNA. Este tipo de alterações inclui a desaminação das citosinas em
uridinas e adenosinas em inosinas. Um dos melhores exemplos é a edição de mRNA da
apolipoproteína B, que transporta lípidos no sangue. Neste caso, dois diferentes tecidos geram
duas formas diferentes de apolipoproteínas a partir do mesmo mRNA. Nos humanos, a Apo-
B100 é sintetizada no fígado por tradução de um mRNA não editado. No entanto, uma
proteína mais curta é sintetizada no intestino como resultado da tradução de um mRNA
editado, onde um C foi trocado por um U por desaminação. Esta alteração altera do codão da
glutamina (CAA) no mRNA não editado, para um codão de terminação (UAA), resultando na
síntese de um mRNA mais curto.
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Degradação de RNA
Os mRNAs funcionais de eucariótas são degradados a diferentes velocidades, funcionando
como um mecanismo adicional de controlo da expressão genética. Em alguns casos, sinais
extracelulares são responsáveis pelas taxas de degradação de mRNAs.
A degradação no citoplasma ocorre por: encurtamento das cadeias poli-A; remoção do cap na
extremidade 5’; degradação por nucleases a partir das extremidades. Existem ainda mRNA’s
instáveis que codificam proteínas reguladoras e contêm muitas sequências ricas em AU perto
da extremidade 3’.
Regulação do mRNA para o receptor transferrina: Os níveis de mRNA para o receptor transferrina
(receptor membranar que permite a entrada de ferro na célula) são controlados pela disponibilidade de
ferro. Se a disponibilidade de ferro for adequada, o mRNA é rapidamente degradado, como resultado de
uma clivagem perto da extremidade 3’. Se o ferro for escasso, contudo, uma proteína reguladora liga-se
à sequência perto da extremidade 3’ do mRNA, protegendo-o da clivagem.
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Na tradução temos vários intervinientes: o mRNA que contém a informação genética para a
síntese de proteínas; os aminoácidos que são monómeros das proteínas; tRNA que selecciona
e transporta o aminoácido apropriado e reconhece o codão correspondente do mRNA;
ribossomas que são sistemas de leitura, que promovem a ligação entre aminoácidos, sendo
constituídos por RNA ribossómico (rRNA) e proteínas; enzimas que catalisam as reacções e
ATP que transfere energia para o sistema.
RNAs de transferência
Cada um dos 20 aminoácidos tem que ser alinhado com os codões correspondentes do mRNA.
Para isso existe o tRNA, que serve como adaptador para este processo, fazendo a ligação entre
o mRNA e o aminoácido correspondente. Este tem uma estrutura de L, requerida para se
encaixar do ribossoma durante a tradução. Todos os tRNAs terminam numa extremidade 3’
com a sequência CCA à qual se liga o aminoácido. Na outra porção do tRNA localiza-se uma
sequência de 3 nucleótidos complementar ao codão (anticodão). A ligação dos aminoácidos ao
tRNA específico é catalisada pela aminoacil tRNA sintetase (ATP-dependente), que reconhece
um aminoácido para o tRNA correcto.
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O Ribossoma
Os ribossomas são locais de síntese proteica, tanto nos procariótas, como nos eucariótas.
Neles se faz a ligação entre o tRNA e o mRNA. Os ribossomas têm duas subunidades que
geralmente se apresentam separadas no citoplasma, só se ligando para efectuar a síntese
proteica, contendo cada uma delas proteínas e rRNA. O ribossoma permite manter os aa
juntos e a realização das ligações peptídicas durante a síntese proteica.
Nos procariótas os codões de iniciação de mRNAs são precedidos por uma sequência, a
sequência Shine-Dalgarno, que alinha o mRNA no ribossoma para a tradução, através da
complementaridade de bases com a extremidade 3’ do rRNA. Assim, este emparelhamento
permite não só a iniciação da tradução na extremidade 5’, como em locais internos do mRNA,
no caso de mRNAs policistrónicos
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Em engenharia genética é muito importante notar que RNAs humanos não contêm a
sequência Shine-Dalgarno, e por isso quando se recorre a um vector plasmídico e se coloca
num procarióta, se o gene de interesse não contiver esta sequência, o ribossoma do procarióta
não conseguirá reconhecer o local a partir do qual se começa a síntese proteica.
Processo de Tradução
A tradução divide-se em 3 etapas: iniciação, elongamento e finalização.
Iniciação
Alongamento
É a fase de tradução dos codões sucessivos do mRNA e da ligação dos aminoácidos. Os locais
do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se sítios P, A e E.
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5. O alongamento do péptido continua até que um codão STOP seja translocado no sitio
A do ribossoma.
Finalização
2. Rapidez: uma célula eucariótica junta 140 aminoácido de uma cadeia de hemoglobina
em dois a três minutos.
3. Amplificação: a mesma zona de DNA pode ser transcrita várias vezes, formando-se
assim várias moléculas de mRNA idênticas. Por outro lado, os polirribossomas
mostram que a tradução da mesma mensagem é descodificada simultaneamente por
vários ribossomas. Originam-se, deste modo, várias cadeias polipeptídicas idênticas,
resultando cada uma delas da tradução efectuada por cada ribossoma. Desta forma,
apesar de o mRNA ter curta duração, como a sua mensagem podem ser traduzida
várias vezes é amplificada a sua actividade.
Regulação da Tradução
A tradução de mRNAs particulares pode ser regulada pela ligação de proteínas repressoras,
microRNAs não-codificantes, e poliadenilação controlada. De forma global, a actividade das
células é modulada em resposta ao stress celular, disponibilidade de nutrientes, e estimulação
por factores de crescimento (FC).
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É de realçar que a ligação da mesma proteína reguladora a locais diferentes do mRNA pode
gerar efeitos diferentes na expressão génica, num caso podendo inibir a tradução, e noutro
estabilizando o mRNA, aumentando a síntese proteica.
A regulação da tradução pode ainda ser efectuada por miRNAs (cadeia dupla), que se associam
ao complexo RISC, desdobrando-se em duas cadeias simples. Depois o miRNA conduz o RISC à
sequência complementar de mRNA, levando à clivagem do mRNA ou repressão da sua
tradução.
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Clivagem Proteica
A clivagem proteica da cadeia polipeptídica, designada de proteólise, é um passo importante
na maturação de muitas proteínas (um exemplo é a frequente remoção da metionina
iniciadora).
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Outro exemplo é o da insulina, que é sintetizada contendo uma única cadeia, que contém uma
sequência sinalizadora. Inicialmente é clivada essa sequência sinalizadora, pelo que a restante
cadeia estabelece as ligações que irão dar origem à sua conformação tridimensional. Por fim,
esta cadeia é clivada em dois pontos, sendo retirado um segmento intermédio, originando-se
assim dois domínios diferentes. A presença daquele segmento intermédio não é para
contribuir para a função da proteína, mas sim para a sua correcta conformação.
Glicolização
Muitas proteínas são modificadas por adição de glícidos, num processo denominado de
glicosilação, e passam a designar-se glicoproteínas. As porções glicídicas desempenham um
papel importante na dobragem proteica no retículo endoplasmático, na marcação de proteínas
e como locais de reconhecimento nas interacções célula a célula. As glicoproteínas são
geralmente segregadas ou incorporadas na membrana, e o processo de glicosilação ocorre no
reticulo endoplasmático, geralmente, durante a tradução. Existe a N ou O glicosilação,
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dependendo do local onde esta ligado o glícido, e isso faz com que difira o local onde e
realizada a glicosilação
Ligação de Lípidos
Algumas proteínas são modificadas pela ligação de lípidos à cadeia polipeptídica, que
geralmente marcam e ancoram essas proteínas à membrana plasmática. Existem três tipos de
adição de lípidos: N-miristoilação, prenilação e palmitoilação. Um quarto tipo, a adição de
glicolípidos, tem um papel importante no ancoramento de algumas proteínas na face
extracelular da membrana.
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Porque a organização das células eucariótas é complexa, tarefas como o encaminhamento das
proteínas aos seus destinos é de grande relevância. O primeiro passo do encaminhamento
proteico toma lugar ainda durante a tradução pelos ribossomas livres, que podem ligar-se à
membrana do retículo endoplasmático. O elongamento da cadeia peptídica prossegue neste
organito com o seu deslocamento para o lúmen, local em que ocorre o folding (dobragem). É a
partir do retículo endoplasmático que as protéinas são dirigidas para organitos como o
Aparelho de Golgi, em que são processadas e encaminhadas selectivamente para os seus
destinos: endossomas, lisossomas, membrana citoplasmática ou exterior da célula. Estes
organitos distinguem-se dos restantes pelo seu papel no processamento de proteínas, à qual
se associa o transporte de vesículas entre eles.
O retículo endoplasmático
O RE é um organito que consiste num conjunto de tubos e sacos (cisternas) que se estendem
da membrana nuclear para o citoplasma, sendo o maior organito de muitas células
eucarióticas. Estas cisternas encontram-se delimitadas pela membrana do retículo
endoplasmático. Consideram-se 3 domínios na membrana do retículo: RE rugoso, coberto de
ribossomas na sua superfície externa; RE de transição, em que ocorre a exportação de
vesículas para o Golgi; e, por fim, RE liso, que está envolvido no metabolismo de lípidos.
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durante ou após a tradução dos mRNA pelos ribossomas livres. Nos mamíferos, este
encaminhamento ocorre principalmente durante a tradução dos mRNA (embora possa ser pós-
tradução), enquanto nas leveduras, por exemplo, o encaminhamento é maioritariamente
posterior à tradução. As proteínas destinadas a outros organitos, tais como citoplasma,
mitocôndrias, cloroplastos ou peroxisomas são sintetizadas nos mesmos ribossomas livres e
libertadas directamente no citosol.
Não existe diferença estrutural entre os ribossomas livres e os ribossomas associados a RE.
Toda a síntese proteica se inicia em ribossomas livres. No entanto, ribossomas livres
envolvidos na síntese de proteínas de secreção são encaminhados para a membrana do
retículo endoplasmático através de uma sequência-sinal intrínseca à própria proteína em
tradução. Estes pequenos segmentos de sinalização são normalmente clivados da cadeia
polipeptídica durante a transferência da proteína para o lúmen do retículo endoplasmático.
Esta hipótese foi estudada em 1971, através de experiencias in vitro em que se conclui que
ribossomas livres traduzem proteínas de secreção um pouco maiores do que a proteína
secretada in vivo. No entanto, se na experiência fossem incluídos microssomas (a unidade
básica do retículo endoplasmático rugoso) verificava-se uma clivagem daquelas proteínas à
dimensão esperada.
Estas experiências deram mais detalhe à hipótese que propunha a existência de uma
sequência no terminal amina que encaminharia a cadeia polipeptídica até ao ER e seria
posteriormente clivada por uma protease microssomal. As conclusões foram confirmadas por
outras experiências envolvendo DNA recombinante, em que a adição de uma sequência
codificante de uma sequência sinal se mostrou suficiente para direccionar a proteína
recombinante ao retículo endoplasmático.
Depois de emergirem do ribossoma, durante a tradução, as sequências-sinal são reconhecidas
e acopladas a uma signal recognition particle (SRP) que consiste em seis polipéptidos e ainda
um pequeno RNA (srpRNA). A SRP liga-se então ao ribossoma e à sequência-sinal, inibindo a
tradução até que o complexo – SRP, ribossoma e cadeia polipeptídica em crescimento – se
ligue ao receptor de SRP, na membrana do RE. A ligação daquele complexo ao receptor de SRP
promove a separação deste último do complexo, originando-se uma SRP livre para um novo
ciclo de encaminhamento. Já acoplado à membrana do RE, o ribossoma liga-se então a uma
proteína de translocação, que promove a inserção da sequência-sinal num canal da membrana
- translocon. Todo este processo é mediado pela ligação de GTP à SRP e ao receptor de SRP. É
a transferência do complexo ribossoma + cadeia polipeptídica para o translocon que abre o
canal de membrana e permite, a prossecução da tradução através deste. A sequência-sinal é
então clivada e a cadeia polipeptídica é libertada no lúmen do RE.
O encaminhamento de cadeias polipeptídicas para o RE pode, nalguns casos, ser feito após a
tradução. Estas proteínas são sintetizadas nos ribossomas livres, mantidas na estrutura
primária por proteínas (chaperonas) do citosol (para que possam entrar no translocon) e a sua
sequência-sinal é reconhecida por receptores da membrana do RE associados ao translocon.
Não há necessidade de SRP.
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1
Sequência usualmente em hélice- que impede a translocação da cadeia peptídica “a montante” para o
lúmen do RE. Figura 10.12
2
Figura 10.12
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FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
3
Figura 10.14
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O Aparelho de Golgi
O aparelho (ou complexo) de Golgi funciona como uma fábrica em que as proteínas recebidas
do RE são processadas e destinadas a vários locais: endossomas, membrana citoplasmática,
lisossomas ou meio extra-celular. Conforme já referido, a síntese de esfingomielina e
glicolípidos tem lugar neste organito.
Organização do Golgi
Na maioria das células o Golgi é constituído por cisternas e vesículas cujos limites são
membranas lipídicas. Uma das propriedades deste organito é a sua polaridade, tanto em
estrutura como em função. Assim, as proteínas do RE entram pela face cis, convexa e
orientada para o núcleo, e saem pela face trans, côncava. Este processo de transporte é
essencial na manutenção da estrutura e funcionalidade do complexo de Golgi, como
demonstram experiências em que o transporte de vesículas a partir do RE é bloqueado. Ao
passar pelo Golgi, as proteínas são modificadas e destinadas aos seus locais.
No Golgi podem considerar-se quatro compartimentos: a rede cis, a rede trans e as pilhas
Golgi medial e trans. É nestas últimas que ocorrem os principais metabolsimos do complexo de
Golgi. As proteínas modificadas são posteriormente transportadas à rede trans, um centro de
distribuição, dirigindo as moléculas aos seus destinos.
A extensão destas modificações depende de diversos factores tais como estrutura da proteína
e quantidade de enzimas de processamento disponíveis no Golgi, que varia de acordo com o
tipo de célula. Assim, consoante estes factores variem é possível obter glicoproteínas muito
variadas. As glicosiltransferases adicionam resíduos de monossacarídeos, enquanto as
glicosidades removem esses mesmos resíduos.
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O processamento dos resíduos glicídicos N-linked das proteínas lisossomais difere do aplicado
às proteínas dirigidas à membrana citoplasmática ou à secreção. Estes são modificados por
uma reacção de fosforilação de manose, cuja enzima reconhece a estrutura tridimensional das
proteínas lisossomais (folding). Esta etapa previne a remoção dos resíduos noutras etapas de
processamento. O sinal manose-6-fosfato é então reconhecido por um receptor próprio na
região trans do Golgi, que encaminha a glicoproteína para os lisossomas ou endossomas.
Outras modificações proteicas podem ter lugar no Golgi, tais como: adição sequencial de
resíduos glicídicos às cadeias laterais de serina e treonina dentro de sequências específicas.
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FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
vesículas específicas dirigidas àqueles organitos. No caso das plantas e leveduras, em que não
existem lisossomas, as proteínas são transportadas para os vacúolos.
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FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
vesículas clathrin-coated podem ter variados destinos. Como os alvos requerem diferentes
proteínas, diferentes proteínas medeiam o seu transporte até aos diferentes destinos.
Fusão de Vesículas
A fusão de uma vesícula de transporte com a membrana do alvo
envolve dois eventos: (1) o reconhecimento da membrana alvo por
parte da vesícula e (2) a fusão das membranas e a consequente
libertação do conteúdo para o organelo-alvo. Estudos dos últimos anos
sustentam modelos de fusão de vesículas baseados no
reconhecimento entre proteínas da vesícula e do alvo – tethering,
seguida de fusão das mesmas. Análises destas proteínas permitiram o
desenvolvimento da hipótese SNARE, em que a fusão das vesículas é
mediada por interacções entre proteínas transmembranares SNARE (v-
SNAREs [proteínas transmembranares das vesículas] e t-SNARES [dos
alvos]). É a interacção entre as SNAREs que promove a aproximação
das membranas, a sua instabilidade e consequente fusão das mesmas.
No entanto, todo este processo, que envolve docking, tehtering e
fusion envolve a formação de um complexo proteico à semelhança do
que acontece no destacamento de vesículas. As proteínas Rab, GTP
bindind-proteins, participam em muitos destes processos de fusão e
destacamento de vesículas e estão directamente envolvidas na
especificidade dos transportes de vesículas. (Para pormenores, v. p.
423).
Lisossomas
Os lisossomas são organelos delimitados por membrana que contêm enzimas capazes de
degradar todos os tipos de biomoléculas aos seus monómeros constituintes. Pode dizer-se que
o lisossoma funciona como o sistema digestivo da célula, permitindo a digestão de moléculas
provindas do meio extra-celular ou dos próprios constituintes das células. Podem apresentar
diferentes formas consoante o seu conteúdo.
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FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
mutações nos genes que codificam as enzimas responsáveis pela adição do sinal de manose-6-
fosfato às proteínas destinadas aos lisossomas. Estas enzimas têm um pH de actuação óptimo
consideravelmente abaixo do pH citoplasmático, o que garante uma digestão controlada. O
carácter ácido dos lisossomas é assegurado pelo uptake de H+, que, com gasto de ATP,
assegura uma concentração de protões 100 vezes superior no lisossoma.
Como referido anteriormente, as hidrolases ácidas são incorporadas em vesículas dirigidas aos
lisossomas através do resíduo de M6P. Depois da remoção das clatrinas destas vesículas, elas
fundem-se com os endossomas maturos. O pH ácido promove a dissociação dos complexos
receptor-M6P, libertando-se as enzimas no interior do endossoma. Os receptores podem ser
dirigidos até ao Golgi (reciclagem). Os late endossomes são então maturados em lisossomas,
adquirindo um carácter muito ácido que promove a digestão de biomoléculas.
Fagocitose e Autofagia
Nos lisossomas, além da via da secreção e da via endocítica, convergem também duas outras
vias: a fagocitose e a autofagia. A fagocitose consiste num uptake de grandes partículas,
associadas à emissão de pseudópodes pela célula fagocítica. Origina-se uma vesícula fagocítica
que se funde com o lisossoma, procedendo-se à digestão do seu conteúdo. Os lisossomas
assim formados podem ser muito grandes e heterogéneos, em função do seu conteúdo. Os
lisossomas são também responsáveis pela autofagia, ou seja, o gradual turnover os próprios
componentes da célula. A autofagia, ao contrário da fagocitose, ocorre em todas as células e
desempenha tarefas críticas em certas etapas do desenvolvimento embrionário. O primeiro
passo da autofagia é a enclausura de um organelo numa membrana derivada da membrana do
retículo endoplasmático. A vesícula resultante – um autofagossoma – funde-se com um
lisossoma, ocorrendo a digestão do material nela presente.
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Mitocôndrias
Geram energia metabólica em células eucarióticas, criando ATP de glícidos e ácidos
gordos através de fosforilação oxidativa.
Contêm o seu próprio DNA, RNA (mRNA, tRNA e rRNA) e as suas proteínas provêm
tanto do genoma nuclear, sintetizadas em ribossomas livres no citosol, como do seu
próprio genoma.
São constituídas por uma dupla membrana com um espaço intermembranar e uma
matriz.
Na matriz estão presentes o património genético do organito e enzimas necessárias ao
metabolismo oxidativo.
A membrana interna, que apresenta cristas projectadas na matriz que aumentam a
sua área, possui proteínas envolvidas na fosforilação oxidativa e proteínas de
transporte. É também impermeável à maioria dos iões e pequenas moléculas,
mantendo o gradiente de protões que dirige a fosforilação oxidativa.
A membrana externa possui porinas que permitem a passagem de pequenas
moléculas, tornando o espaço intermembranar análogo ao citoplasma.
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(estes assuntos estão explicados em muito maior detalhe dos documentos disponibilizados
pela Teresa Tomaz)
Como já foi referido, a maioria dos genes que codificam proteínas necessárias à
replicação e expressão do DNA mitocondrial estão no núcleo da célula. Alguns destes
genes foram transferidos para o núcleo aquando a associação endossimbiótica entre
células.
As proteínas mitocondriais codificadas pelo genoma nuclear são sintetizadas em
ribossomas livres e têm que atravessar parte ou toda dupla membrana mitocondrial
para o seu destino final, a matriz, o espaço intermembranar ou a própria membrana.
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1. Hsp70 citosólica – mantém as proteínas num estado apenas parcialmente folded para
que possam ser translocadas através das membranas.
2. Hsp70 mitocondrial (associada ao complexo Tim) – funciona como alavanca para
“puxar” a proteína para a matriz.
3. Hsp70 mitocondrial (da matriz) – ajudam ao término do folding proteico.
4. Hsp60 mitocondrial (chaperonina) – dentro da qual pode existir folding adicional.
NOTA: todas as interacções entre proteínas e chaperonas necessitam de ATP dentro e fora da
mitocôndria e do potencial electroquímico gerado através da membrana interna.
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NOTA: A translocase que dirige as proteínas do caso anterior a partir da matriz é também
responsável pela integração das poucas proteínas membranares codificadas pelo genoma da
mitocôndria.
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Peroxissomas
São pequenos organitos revestidos por membrana que contêm enzimas envolvidas
num leque de reacções metabólicas, algumas de metabolismo energético.
Não possuem genoma, todas as suas proteínas (peroxinas) estão codificadas no
genoma nuclear e são na sua maioria* sintetizadas em ribossomas livres.
Normalmente replicam-se por divisão.
1. Diversas reacções de oxidação, tendo como substratos ácido úrico, purinas, metanol e
o mais importante, ácidos gordos.
2. Degradação do peróxido de hidrogénio (H2O2, água oxigenada) através da enzima
catalase, criado nas suas próprias reacções de oxidação.
3. Biossíntese de lípidos, do aminoácido lisina e plasmalogéneos - fosfolípidos presentes
apenas no cérebro e coração).
Construção de Peroxissomas
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estabelece ligações cruzadas entre os filamentos de actina, originando redes ortogonais (Fig
12.11).
Existem filamentos de actina nos locais de adesão entre células adjacentes. As adesões focais
são mediadas pela ligação de integrinas (proteínas transmembranares) a proteínas da matriz
extracelular. As fibras “stress” (feixes de filamentos de actina ligados de forma cruzada por α-
actinina) encontram-se ligadas ao domínio citoplasmático das integrinas por complexos que
envolvem várias proteínas (Fig 12.16). Nas zónulas de adesão, as proteínas transmembranares
são as caderinas. Estas, que são dependentes de cálcio, ligam-se a outras caderinas no espaço
extracelular e a cateninas no lado citosólico. É a este complexo que se ligam os filamentos de
actina (Fig 12.17).
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Filamentos Intermédios
Ao contrário dos filamentos de actina e dos microtúbulos, os filamentos intermédios não estão
directamente envolvidos no movimento celular. Apresentam uma função estrutural, visto que
fornecem força mecânica às células e tecidos.
Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia 110
FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
Consultar o texto “Expression Of Mutant Keratin Causes Abnormal Skin Development” pág.
502/503
Microtúbulos
São o terceiro componente do citoesqueleto, sendo estruturas rígidas que, tal como a actina,
são dinâmicas. Estão envolvidos na determinação da forma da célula, numa grande variedade
de movimentos celulares, no transporte intracelular de organelos e na separação dos
cromossomas durante a mitose.
Os microtúbulos são polares, uma vez que, tal como a actina, apresentam uma extremidade
positiva (de crescimento rápido) e uma extremidade negativa (de crescimento lento) (Fig
12.43).
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Cílios e Flagelos
Os cílios e os flagelos são projecções baseadas em microtúbulos, que permitem o movimento
(locomoção) de uma grande variedade de células eucarióticas. Para visualizar exemplos de
cílios e flagelos consultar Fig 12.53.
A principal estrutura dos cílios e flagelos é o axonema, que é composto por micortúbulos e por
proteínas a eles associadas. Os microtúbulos encontram-se organizados numa disposição
“9+2”, na qual um par central de microtúbulos está rodeado por 9 conjuntos de 2
microtúbulos. Os microtúbulos periféricos estão ligados por pontes de nexina e apresentam 2
braços de dineínas. É a actividade motora dessas dineínas axonemais que dirige o batimento
dos cílios e dos flagelos. (Fig 12.54)
As extremidades negativas dos microtúbulos dos cílios e flagelos estão ancorados no corpo
basal, que é uma estrutura similar ao centríolo e que contém 9 tripletos de microtúbulos (Fig
12.55)
Os microtúbulos intervêm na separação dos cromossomas durante a mitose, visto que são
essenciais para a formação do fuso mitótico, que pode ser visualizada na Fig 12.58
Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia 112
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A fibrose cística é uma doença letal hereditária recessiva. Afecta um em cada 2500 recém-
nascidos brancos, rara nas outras “raças”. A disfunção característica da fibrose cística é a
produção de muco anormalmente espesso e aderente por vários tipos de células epiteliais,
incluindo as células que revestem os tractos respiratório e gastrointestinal. A manifestação
clínica primária é uma doença respiratória resultante da obstrução das vias aéreas superiores
por muco, seguida por infecções bacterianas recorrentes. Na maioria dos doentes o pâncreas
também fica comprometido, pois os ductos pancreáticos ficam obstruídos por muco. As
glândulas sudoríparas também apresentam um funcionamento anormal e a presença excessiva
de sal no suor é um indicativo para o diagnóstico da fibrose cística.
Os procedimentos-padrão para esta doença incluem terapia física para promover drenagem
bronquial, administração de antibióticos e reposição de enzimas pancreáticas.
Defeito no transporte de Cl- nos epitélios afectados (que incluem os ductos de glândulas
sudoríparas e as células que revestem o tracto respiratório). O gene da fibrose cística codifica
uma proteína (denominada CFTR – regulador da condutância transmembranar da fibrose
cística) que pertence à família dos transportadores ABC. A CFTR funciona como um canal de Cl-
, portanto as mutações responsáveis pelo estabelecimento da fibrose cística resultam
directamente no transporte deficitário de Cl-.
Prevenção e Tratamento
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Estudos com animais experimentais têm demonstrado que vectores virais podem
transmitir o cDNA da CFTR para o epitélio respiratório, e em 1993 iniciou-se o primeiro
protocolo experimental de tratamento em humanos contudo a eficiência de de
transferência tem sido baixa e a expressão do cDNA da CFTR transferido tem sido
mantida por menos de um mês.
Endocitose
Endocitose é o processo através do qual as células eucarióticas são capazes de
englobar macromoléculas e partículas do meio que as circunda. Na endocitose, o
material a ser internalizado é circundado por uma área de membrana plasmática, que
brota para o lado de fora para formar a vesícula que conterá o material a ser
internalizado.
Fagocitose
Durante a fagocitose as células internalizam grandes partículas como bactérias, resto
celulares ou até células intactas. A ligação de uma partícula aos receptores de
superfície de uma célula fagocítica leva à emissão de pseudópodes, que circundam as
partículas e depois as suas membranas fundem-
se para formar uma grande vesícula intracelular
(fagossoma). Os fagossomas fundem-se com os
lisossomas, formando fagolisossomas, nos quais o
material ingerido é digerido por acção de
hidrolases ácidas dos lisossomas.
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FML 2008/09 Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition
de superfície celular são necessários para a internalização de LDL); ou as células podem ligar-se
mas ser incapazes de internalizá-lo (os receptores destes pacientes são incapazes de se
concentrar nas regiões recobertas por clatrina, o que evidencia o papel central das regiões
recobertas por clatrina na endocitose mediada por receptores).
A clatrina organiza-se numa estrutura semelhante a uma cesta de basquete que distorce a
membrana, formando pontos de invaginação. Uma proteína de ligação a GTP, a dinamina,
organiza-se em anéis em redor desses pontos invaginados, promovendo finalmente a liberação
das vesículas cobertas para o lado de dentro da célula.
Fluidos extracelulares também podem ser incorporados nas vesículas cobertas conforme estas
brotam da membrana plasmática, de modo que a endocitose mediada por receptor resulta
numa internalização não-selectiva de fluidos extracelulares e outros materiais (endocitose de
fase fluida), além da internalização de macromoléculas específicas. As regiões recobertas por
clatrina geralmente ocupam 1 a 2% da área da superfície da membrana plasmática.
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contraste a HMG-CoA redutase não é afectada pela adição de LDL às células dos pacientes,
resultando numa superexpressão de colesterol pelas células FH. Contudo, experiências
subsequentes indicaram que esta anomalia na regulação da enzima HMG-CoA redutase não é
resultante de mutações no gene da enzima, em vez disso, a regulação anormal da enzima
parecia estar relacionada com uma incapacidade das células FH de extrai colesterol a partir do
LDL. Brown e Goldstein, em 1974, demonstraram que a lesão nas células FH é resultante de
um defeito na ligação do LDL ao seu receptor na superfície celular.
Esquematicamente:
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O Impacto
Após a identificação do receptor de LDL, Brown e Goldstein demonstraram que o LDL ligado à
superfície celular é rapidamente internalizado e degradado nos lisossomas, gerando colesterol
livre. Posteriormente, em colaboração com Richard Anderson, estabeleceram que o receptor
de LDL é internalizado por endocitose a partir de regiões recobertas por ligantes. Além disso,
os seus estudos iniciais demonstraram que o receptor de LDL é reciclado para a membrana
plasmática após a dissociação do seu ligante dentro da célula.
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Os endossomas jovens mantêm um pH interno ácido (de 6 a 6,2) como resultado da acção da
bomba de H+ da membrana, o que leva à dissociação de vários ligantes dos seus receptores
dentro do endossoma jovem.
Ligantes e proteínas de membrana que são destinados para a degradação nos lisossomas são
transportados dos endossomas jovens para os endossomas maduros (mais ácidos que os
jovens), que estão localizados próximos ao núcleo. Estes endossomas maduros evoluem para
lisossomas e tornam-se ainda mais ácidos (pH em torno do 5). Dentro dos lisossomas o
material endocitado é degradado por acção de hidrolases ácidas.
Alguns receptores são transportados para os lisossomas, onde são degradados juntamente
com os seus ligantes.
gEm células polarizadas, receptores internalizados também podem ser transferidos através da
célula para domínios celulares opostos da membrana plasmática (p. e. domínio basolateral –
endossoma jovem – membrana apical), um processo denominado transcitose.
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2. Parócrina, em que a molécula sinalizadora é libertada pelas células e actua nas células
vizinhas alvo (neurotransmissores).
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Devido aos seus caracteres hidrofóbicos, estas hormonas são capazes de entrar nas células,
difundindo-se pela membrana celular. Dentro da célula ligam-se a receptores intracelulares,
que são membros da superfamília dos receptores nucleares. Estes são factores de transcrição
que contêm domínios para a ligação ao ligando, ligação ao DNA, e activação da transcrição. A
ligação do ligando regula função destes receptores, activando ou inibindo os genes alvo, pelo
que estas hormonas estão directamente relacionadas com a regulação da expressão genética.
Neurotransmissores
Os neurotransmissores transportam sinais entre neurónios, ou de um neurónio para células
alvo (como as células musculares). São pequenas moléculas hidrofílicas, que incluem:
acetilcolina; dopamina; epinefrina (adrenalina); serotonina; histamina; glutamato; glicina; e o
ácido GABA. A libertação dos neurotransmissores é sinalizada pela chegada de um potencial de
acção no terminal do neurónio. Os neurotransmissores difundem-se pela fenda sináptica e
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ligam-se aos receptores na superfície da célula alvo. Há neurotransmissores que também têm
função hormonal, como a epinefrina. Como são moléculas hidrofílicas, os neurotransmissores
são incapazes de se difundirem através da membrana celular.
Muitos receptores são canais iónicos dependentes de ligandos, pelo que a ligação dos
neurotransmissores induz uma mudança conformacional que abre estes canais, resultando
num fluxo de iões através da membrana. Outros receptores de neurotransmissores estão
associados a proteínas G, que indirectamente induzem a abertura de canais.
As hormonas peptídicas, e os FC são incapazes de cruzar a membrana celular, por isso actuam
ligando-se a receptores na superfície das células alvo.
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Há vários tipos de proteínas G, e estas ligam-se a diferentes tipos de receptores. Além disto,
algumas subunidades de certas proteínas G regulam canais iónicos. (neurotransmissor
acetilcolina).
Há muitos tipos de tirosina cinases. Mas o mecanismo pelos quais actuam é similar:
4. Fosforilação das proteínas alvo propaga o sinal iniciado pela ligação do FC.
Em alguns tipos de receptores, o ligando induz a formação de dímeros (dois receptores iguais
juntam-se), o que provoca a autofosforilação da porção citosólica desses receptores. Esta
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autofosforilação aumenta a actividade cinásica, e induz a criação de locais para a ligação com
proteínas alvo, que serão fosforiladas.
Alguns receptores de citocina são usados pelo HIV como receptores da superfície celular para a
infecção dos linfócitos.
Alguns ligandos peptídicos ligam-se a receptores cujos domínios citosólicos são guanilil
ciclases, que catalisam a formação de cGMP. Receptores Guanilil ciclases têm um domínio
extracelular que permite a ligação do ligando, pelo que esta estimula a formação de cGMP. O
cGMP é um mensageiro secundário.
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Cada ligando activa apenas um receptor, contudo um receptor por estimular centenas de
moléculas. E cada uma dessas moléculas pode estimular a produção de outras, ao longo da
cascata de sinalização. Assim, a ligação de hormonas a um pequeno número de receptores
activa um grande número de enzimas alvo intracelulares.
GMP cíclico
O GMP cíclico (cGMP) é também ele um importante mensageiro secundário em células
animais. O cGMP é formado pela guanilil ciclase, e degradado por uma fosfodiesterase. A
estimulação das guanilil ciclases (NO ou ligandos peptídicos) eleva os níveis de cGMP, que vão
mediar respostas biológicas (exemplo: dilatação de vasos sanguíneos). A maioria das vezes o
cGMP activa proteínas cinases dependentes de cGMP, podendo também regular canais
iónicos.
Fosfolípidos e CA2+
Os fosfolípidos e o cálcio são mensageiros secundários comuns, activados a jusante de
receptores associados a proteínas G ou associados a tirosina cinases. A hidrólise do
fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) gera diacilglicerol e inositol 1,4,5 trifosfato (IP3), que
activa a proteína cinase C e mobiliza o cálcio de reservas intracelulares, respectivamente. O
aumento dos níveis de cálcio intracelulares activam diversas proteínas alvo, como as cinases
dependentes de Ca2+/calmodulina.
FC + Receptor ocorre troca de GDP por GTP na Ras activa a Raf cinase
fosforila/activa MEK fosforila/activa ERK ERK passa para o núcleo e liga-se a
regiões reguladoras de DNA (activa determinados genes) transcrição proteína
determina entrada no ciclo celular
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vida da célula, é o processo mais crítico de todo o ciclo, pois é nele que ocorre a separação dos
cromossas e a citocinese. Compreende uma série de sub-etapas que serão abordadas mais à
frente.
O estudo das fases do ciclo celular requer a identificação das células. Enquanto as sub-fases da
fase M são facilmente vislumbradas ao microscópio óptico, as fases G1, S e G2 necessitam de
uma interpretação bioquímica. Células em fases S podem ser facilmente identificadas por
autoradiografia, se cultivadas num meio com nucleótidos radioactivos durante poucos
minutos. Estas análises permitem estimar o tempo que dura cada uma das fases. Considere-se
a situação de se colocarem nucleótidos radioactivos num meio com células em cultivadas
durante diferentes tempos. Células que se encontravam na fase S serão observadas durante
várias horas, pois incorporaram os ditos nucleótidos. Células marcadas radioactivamente em
mitose serão observadas apenas passadas 4 horas, o que sugere que entre G2 e Fase M
medeia esse intervalo de tempo.
Células em diferentes fases do ciclo celular apresentam diferentes quantidades de DNA (para
pormenores, v. p. 652). Experimentalmente, pode determinar-se essa quantidade (entre 2n e
4n) células com recurso a marcadores fluorescentes e a uma posterior medição da
intensidade.
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dimensões mínimas para que a divisão possa prosseguir. O START representa, assim, uma
verificação da existência, ou não, das condições necessárias à divisãog.
Na maior parte das células animais o processo é análogo, designando-se o checkpoint START
por restriction point. No entanto, são factores de crescimento extracelulares que sinalizam a
proliferação e determinam a entrada na fase S e no resto do ciclo, diferentemente do que
acontece nas leveduras, em que a disponibilidade de nutrientes no
meio é mais relevante. No caso da ausência de factores de
crescimento durante a fase G1, a célula não progride no ciclo e entra
num estado de latência denominado G0, em que a taxa metabólica é
reduzida. Os fibroblastos são um exemplo pertinente de células que
permanecem num estado de latência G0 até que factores de
crescimento derivados de plaquetas, extravasados dos vasos
sanguíneos quando, por exemplo, há uma ferida, estimulam a sua proliferação. Existem
também células eucariotas em que o principal ponto de controlo das condições necessárias à
divisão é feito no final da fase G2, como por exemplo S. Pombe. No caso dos vertebrados, os
oócitos ilustram esta regulação, podendo estas células ficar retidas na fase G2 várias décadas
até que um contexto hormonal adequado permite a prossecução para a Fase M.
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ACdc2 forma complexos com a ciclina B durante S e G2. A Cdc2 é então fosforilada no aminoácido 161, o que lhe
confere actividade, como também no aminoácido 15 (e também no aminoácido 14 nas células dos vertebrados), o
que inibe a Cdc2. A dos aminoácidos 14 e 15 activa o MPF ao nível da transição entre G2 e a fase M. A actividade da
MPF é terminada no fim da Mitose por degradação proteolítica da ciclina B.
Uma vez fosforilada, a Cdk1 fosforila várias proteínas que iniciam os eventos da fase M. Por
seu turno, esta proteína estimula também a degradação da Ciclina B, que ocorre por um
processo de degradação proteolítca mediado pela ubiquinona. Esta degradação, por seu turno,
inactiva a Cdk1 e termina a Mitose.
Vários estudos confirmaram, no entanto, que este emparelhamento não estanque. Com
efeito, verificou-se que ratinhos mutados para algumas ciclinas D e E e também Cdk(2,4,6) são
capazes de proliferar, sugerindo uma redundância no funcionamento destas proteínas.
A actividade das Cdk’s é regulada por quatro mecanismos moleculares: (1) associação com
ciclinas, que são sintetizadas e degradadas periodicamente; (2) fosforilação do aminoácido
160; (3) fosforilação inibitória de resíduos de aminoácidos (posições 14 ou 14 e 15) na porção
amino-terminal; (4) proteínas inibitórias das CDK’s. É a combinação e o balanço destes
múltiplos processos de regulação que dirige a progressão no ciclo celular e,
consequentemente, a proliferação.
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A ligação entre as Ciclinas D, o controlo do ciclo e o cancro é ainda corroborado por estudos
que mostraram que uma proteína RB (provinda
de um gene imunosupressor) mutada está
envolvida em muitos cancros humanos. Esta
proteína é um regulador de factores de
transcrição – E2F, controlando a actividade
destes últimos. Assim, uma proteína RB não
funcional pode determinar uma transcrição de
genes (por exemplo para a proteína Ciclina E)
desregulada e uma falta de coordenação entre esta tarefa e a presença/ausência de factores
de crescimento externos, o que pode comprometer o ciclo celular. O par Cdk2 / Ciclina E,
inibido pela proteína p27 em G0 e na fase inicial de G1, é responsável pela entrada na fase S.
Assim, compreende-se outro ponto de contacto entre os factores de crescimentos externos e
as vias reguladores do ciclo internas, já que as concentrações dessa proteína p27, inibitória da
entrada na fase S, são controladas pelos tais factores externos.
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Famílias de Proteases
Lisossomais
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Caspases
As caspases são uma família de proteases que conduzem aos acontecimentos que
caracterizam a apoptose. Entre os seus alvos estão as lâminas nucleares. Elas clivam ao longo
da proteína logo a seguir ao aspartato, fazendo com que a lâmina fique fragmentada (Fig 17.4).
As principais acções das caspases são destruir o inibidor da DNase, clivar lâminas nucleares e
proteínas do citoesqueleto, o que conduz à fragmentação do núcleo, destruição do
citoesqueleto, e fragmentação celular.
Todas as caspases são sintetizadas como precursores inactivos, que podem ser convertidos na
sua forma activa através de clivagem proteolítica, catalisada por outras caspases. Assim, a
activação de uma caspase iniciadora desencadeia uma cadeia de reacções que levam à
activação de caspases a jusante e à morte celular.
Nas células de mamíferos, a caspase iniciadora é a Caspase 9, que é activada ligando-se à Apaf-
1 e formando um complexo com múltiplas subunidades chamado apoptossoma. A formação
deste apoptossoma também requer citocromo C (cytC), que é libertado da mitocôndria por
estímulos que desencadeiam a apoptose. Uma vez activada no apoptossoma, a Caspase9 cliva
e activa caspases efectoras, que levam à morte celular.
1. Antiapoptóticas (Bcl-2)
6. Apoptose
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As caspases também são reguladas pela família de proteínas IAP, que suprimem directamente
a apoptose, inibindo as caspases, e marcando-as para degradação em proteossomas.
1. Danos no DNA
5. p53 induz a transcrição dos genes que codifica pró-apoptóticas BH3-only (Puma e
Noxa)
6. Morte celular
Nota: O p53 medeia tanto a paragem do ciclo celular como a apoptose, em resposta a danos
no DNA, o que depende da sua extensão (se não se conseguir corrigir os erros ocorre
apoptose).
Uma das vias de sobrevivência celular consiste em factores de sobrevivência que estimulam
um receptor membranar tirosina cinase, que activa uma cadeia de fosforilações, que lvam à
fosforilação da proteína pró-apoptótica BH3-only, mantendo-a estável na sua forma inactiva.
Controla-se assim a supressão da apoptose.
Existem alguns péptidos (família dos “tumor necrosis factor” TNF) que induzem directamente a
apoptose. Estes TNF ligam-se a receptores da superfície, induzindo a activação directa de
caspases (caspase 8), que activam a proteína BH3-only, desencadeando todo o processo que
leva à apoptose.
Nota: No final do capítulo encontram-se resumos da matéria feitos pelo Miguel Guia.
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No caso dos fibroblastos, estes estão dispersos pelos tecidos conjuntivos, secretando
colagénio. Os fibroblastos da pele estão normalmente suspensos em G0, mas rapidamente
proliferam se for necessário reparar danos (feridas). Coagulação sanguínea no local da ferida
liberta o factor de crescimento PDGF, que activa os receptores tirosina cinases , estimulando a
proliferação e migração dos fibroblastos para a ferida, e a secreção de colagénio, que levará à
reparação do tecido lesado.
As células do endotélio são estimuladas a proliferar pelo factor de crescimento VEGF, que é
secretado por células privadas de O2, levando ao crescimento de novos capilares em tecidos
com falta de suprimento sanguíneo.
No caso das células hepáticas, que estão paradas em G0, quando grande quantidade destas se
perde, as células restantes são estimuladas a proliferar, substituindo o tecido perdido.
Células Estaminais
Células Estaminais são células que se dividem para produzir células-filhas, uma das quais se
mantém célula estaminal, e a outra se diferencia. Servem para manter os tecidos e órgãos de
organismos adultos, ao contribuírem para a reposição de células perdidas.
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ATENÇÃO: Para uma compreensão rápida e geral dos mecanismos da apoptose, foram feitos
apontamentos pelo Miguel Guia, que ajudam a assimilar a matéria.
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