Aloe vera aumenta a expressão de mRNA de enzimas antioxidantes em tecido

ovariano bovino criopreservado e promove o crescimento folicular e a sobrevivência

após cultivo in vitro

Resumo
Os objetivos do presente estudo foram avaliar os efeitos do extrato de Aloe vera na
expressão de mRNA para enzimas antioxidantes em tecido ovariano bovino após
vitrificação, bem como na morfologia folicular, viabilidade, ativação e matriz
extracelular em tecidos ovarianos cultivados anteriormente vitrificado . Fragmentos de
tecido cortical ovariano bovino foram criopreservados em solução de vitrificação isolada
ou suplementados com duas concentrações de Aloe vera (10 ou 50%). Após o
descongelamento, os tecidos criopreservados foram analisados por técnicas histológicas,
bem como os níveis de mRNA para SOD , CAT , PRDX6 e GPX1foram
investigados. Além disso, os fragmentos criopreservados foram então cultivados in
vitro em α-MEM por 6 dias. A avaliação histológica dos tecidos cultivados foi realizada
para determinar as porcentagens de folículos normais e em desenvolvimento. Os
resultados mostraram que, após a vitrificação, a presença de Aloe vera em ambas as
concentrações foi capaz de manter percentuais de fibras colágenas semelhantes aos
tecidos frescos (P <0,05). Aloe vera em ambas as concentrações aumentou
significativamente os níveis de mRNA para PRDX6 e GPX1 em tecidos criopreservados,
enquanto 10% de Aloe vera aumentou os níveis de mRNA para SOD (P
<0,05). Paralelamente, após in vitroEm cultura, os fragmentos vitrificados na presença
de Aloe vera a 10% apresentaram níveis significativamente maiores de folículos
morfologicamente saudáveis quando comparados aos tecidos que foram vitrificados
sem Aloe vera . Nos fragmentos vitrificados com Aloe vera , a taxa de folículos em
desenvolvimento foi significativamente maior do que nos tecidos vitrificados sem Aloe
vera. Os tecidos vitrificados com 10% de Aloe vera e cultivados in vitro mantiveram
percentuais de fibras de colágeno semelhantes aos tecidos frescos. Em conclusão, 10%
de Aloe veraaumenta a expressão de mRNA para PRDX6, GPX1 e SOD em tecidos
ovarianos vitrificados, mantém a sobrevivência folicular e promove a ativação e o
desenvolvimento de folículos após cultura in vitro de tecido ovariano bovino vitrificado.
 1 . Introdução
A vitrificação do tecido ovariano tem sido aplicada para preservar a fertilidade em
pacientes com câncer em quimioterapia e em meninas pré-púberes ou mulheres com
neoplasias hormonais sensíveis [ 1 , 2 , 3 ]. Em animais domésticos, o armazenamento de
longo prazo de tecidos ovarianos é realizado para promover uma conservação genética de
fêmeas de espécies ameaçadas de extinção e animais valiosos [ 4 ]. No entanto, apesar da
expressividade dos estudos nessa área, os protocolos de criopreservação ainda precisam
de mais aprimoramentos [ 5 ]. Sabe-se que durante o processo de vitrificação, espécies
reativas de oxigênio (ROS) podem ser geradas por diferentes mecanismos, como
aumentometabolismo oxidativo , estresse osmótico, ou mesmo por alterações
nosmecanismos de defesa celular [6,7]. Como resultado, o desequilíbrio entre a produção
de ROS e as defesas antioxidantes celulares pode causar danos
ao citoesqueleto celular,lipídios de membrana, proteínas e DNA [8,9]. Além disso,
amatriz extracelulartambém pode ser afetada pelo acúmulo de ROS nos tecidos [10]. ROS
pode desregular a expressão de metaloproteinases (MMPs), que são uma importante
família de enzimas responsáveis pela clivagem de componentes da matriz extracelular
(ECM), como o colágeno,fibronectina e laminina [ 11 ]. Além disso, a degradação da
matriz também pode ocorrer devido ao dano gradual às bases do DNA em genes que
codificam componentes dessa estrutura [ 10 ]. Juntos, esses efeitos controlam
a senescência celular , apoptose e sinalização celular alterada , o que compromete a
viabilidade do tecido criopreservado [ 5 ].
Nesse sentido, estudos têm sido realizados para minimizar o dano celular induzido pela
criopreservação [ 12 ]. Dentre as estratégias, a adição de antioxidante natural à solução
de vitrificação foi avaliada [ 13 ]. Para tanto, o extrato de Aloe vera é uma alternativa,
mas os mecanismos moleculares de ação da Aloe vera ainda não estão totalmente
documentados [ 14 ]. Sabe-se que seu conteúdo sólido de Aloe vera contém mais de 75
diferentes compostos potencialmente ativos, incluindo minerais, enzimas, vitaminas
solúveis em água e gordura, polissacarídeos simples e complexos , bem como compostos
fenólicos e ácidos orgânicos, fazendo com que a planta tenha várias propriedades
farmacológicas, incluindo atividade antioxidante [ 15 , 16 ]. Esta atividade moduladora
do estresse oxidativo foi atribuída à presença de quantidades substanciais de compostos
antioxidantes no gel vegetal, incluindo α-tocoferol (vitamina E), carotenóides , ácido
ascórbico (vitamina C), flavonóides e taninos . Estudos in vitro demonstraram o
potencial do gel de Aloe vera para eliminar vários radicais livres [ 17 ]. Sumi et al. [ 16 ]
demonstraram o efeito benéfico deAloe vera no estresse oxidativo no tecido cardíaco de
ratos. Nesta investigação, o Aloe vera foi capaz de aumentar a atividade de importantes
enzimas antioxidantes como a catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD), além de
aumentar a glutationa (GSH) no tecido. Simultaneamente, uma diminuição significativa
do malondialdeído (MDA) também foi observada. Além disso, o Aloe vera já
demonstrou uma atividade protetora da MEC pela redução dos níveis de
metaloproteinases-9 (MMP-9) pelo alívio de lesões gástricas em um modelo de rato
[ 14 ]. No entanto, os efeitos da Aloe veraextrato em solução de vitrificação na expressão
de mRNA para enzimas antioxidantes, bem como no subsequente desenvolvimento
folicular durante o cultivo in vitro de tecido ovariano bovino ainda são desconhecidos.
O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do extrato de Aloe vera como
suplemento do meio de vitrificação de tecido ovariano bovino e investigar seu papel na
expressão de mRNA para enzimas antioxidantes (SOD, CAT, PRDX1 e GPX6) em
tecidos vitrificados, também. quanto à morfologia folicular, viabilidade, ativação e matriz
extracelular de tecidos ovarianos cultivados in vitro.
2 . material e métodos
2.1 . Produtos químicos
Os meios de cultura e outros produtos químicos usados no presente estudo foram
comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis, EUA), a menos que indicado de outra
forma no texto.
2.2 . Material vegetal e preparação de extrato
A planta Aloe vera foi cultivada em solo argiloso arenoso em Frecheirinha - Ce, nordeste
do Brasil (3 ° 45′49,3 ″ S, 40 ° 50′14,0 ″ W), com clima tropical semi-árido e temperaturas
variando de 24 ° a 36 ° C. Para a obtenção do extrato bruto de Aloe vera , foram coletadas
folhas em estágio intermediário de maturação. A identificação do estágio de maturação
da Aloe vera foi realizada de acordo com Ahlawat et al. [ 18] As folhas selecionadas
apresentavam coloração verde amarelada e localizavam-se em posição intermediária do
eixo central da planta. Imediatamente após a coleta, as folhas foram devidamente
desinfetadas, colocadas em caixa térmica e transportadas para o laboratório em até 1 h
em temperatura ambiente (~ 25 ° C). Em seguida, as folhas foram lavadas com água
destilada e suas partes superficiais removidas para expor um gel incolor que foi extraído
do parênquima das folhas. Para cada experimento, após a extração do gel, este foi filtrado
em uma peneira e armazenado a 4 ° C em tubos Falcon estéreis de 50 mL até o uso
[ 19 ]. Antes da suplementação do meio de cultura, o extrato foi filtrado novamente
através de membranas de 0,45 μm .
2.3 . Fonte dos ovários
Ovários bovinos (n = 10 pares) de fêmeas adultas foram coletados em
um matadouro local . Imediatamente após o abate, cada par de ovários foi lavado em
etanol (70%) por cerca de 10 s, seguido de duas lavagens em solução salina 0,9%, a 4 °
C, suplementado com penicilina (100 μg / ml) e estreptomicina (100 μg / ml). Após a
lavagem, cada par de ovários foi transportado individualmente para o laboratório em
tubos falcon contendo α-MEM suplementado com penicilina (100 μg / ml) e
estreptomicina (100 μg / ml) em 1 h. Este estudo foi aprovado e realizado de acordo com
as normas e diretrizes do Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da Universidade Federal
do Ceará (nº 04/2019).
2.4 . Preparação de tecido ovariano
No laboratório, usando bisturis n. 22, o tecido cortical ovariano do mesmo par ovariano
(n = 10 pares) foi cortado em fatias (3 mm × 3 mm x 1 mm) em meio de dissecção
composto por α-MEM suplementado com penicilina (100 μg / ml) e estreptomicina ( 100
μg / ml). Para o controle in vivo , de cada par de ovários, 4 fragmentos foram retirados ao
acaso e imediatamente fixados em paraformaldeído (4%) por 12h a 4 ° C, dois deles
foram destinados a análise histológica em que foram avaliados a morfologia e o
crescimento folicular . Os outros dois fragmentos foram usados para analisar ECM e dois
foram imediatamente incubados com calceína e homodímeroetídio-1 para análise de
viabilidade. Outros dois fragmentos foram armazenados para análise da expressão gênica
por RT-PCR. Os fragmentos remanescentes foram então criopreservados pelo método de
vitrificação de superfície sólida [ 20 ].
2,5 . Avaliação da toxicidade da solução de vitrificação
Considerando que esta solução de vitrificação ainda não foi testada em tecido ovariano,
realizamos este teste de toxicidade . De cada par ovariano, 6 fragmentos (2 por grupo de
tratamento por animal) foram submetidos à solução de vitrificação (VS) por 5 min, com
0, 10 ou 50% de AV e agente crioprotetor (10% de dimetilsulfóxido (Me 2 SO)) . Após a
exposição às soluções de vitrificação, os fragmentos foram submetidos ao processo de
remoção do crioprotetor, o qual foi imerso em meio α-MEM contendo soro fetal
bovino.(FBS) e concentrações decrescentes de sacarose (0,5 M, 0,25 M, 0 M), por 5 min
em cada concentração. Posteriormente, as amostras foram avaliadas pela histologia
clássica em que foram analisadas a morfologia folicular e a MEC.
2.6 . Vitrificação e descongelamento do tecido ovariano
A vitrificação seguiu a metodologia descrita por Brito et al. [ 20 ] com
modificações. Inicialmente, os fragmentos foram colocados individualmente em poços
contendo 2 mL de VS composto por α-MEM suplementado com 10% de FBS, 0,25 M de
sacarose, 10% de Me 2 SO e diferentes concentrações de Aloe vera : Grupo 1: VS
sem Aloe vera (controle vitrificado - VS [AV0]); Grupo 2: VS suplementado com 10%
de Aloe vera (VS [AV10]); Grupo 3: VS suplementado com 50% de Aloe vera (VS
[AV50]. Após 5 min de exposição ao VS, os fragmentos foram vitrificados em uma
superfície sólida, na qual uma das superfícies de uma placa metálica foi colocada em
contato direto com o líquido azotoe os fragmentos de tecido ovariano foram colocados
em contato com a outra superfície de metal, passando imediatamente para o estado
vítreo. Em seguida, os fragmentos foram colocados individualmente em criotubos (2 mL)
e armazenados em nitrogênio líquido (−196 ° C).
Após duas semanas, as amostras foram descongeladas. Para isso, os criotubos foram
expostos à temperatura ambiente (25 ° C) por 1 min e, em seguida, imersos rapidamente
em banho-maria (37 ° C) para a retirada do gelo formado ao redor do criotubo. As
amostras foram incubadas sequencialmente em poços contendo 2 ml de α-MEM
suplementado com FBS a 10% e concentrações decrescentes de sacarose (0,5 M, 0,25 M,
0 M) durante 5 min cada. Após o descongelamento, 2 fragmentos por tratamento por
animal foram submetidos à avaliação da morfologia folicular, viabilidade, matriz
extracelular e expressão de mRNA de enzimas antioxidantes.

2.7 . Cultura in vitro pós-vitrificação

Para avaliar a capacidade de desenvolvimento folicular e manutenção da integridade da
MEC após a vitrificação e cultura, 2 fragmentos por tratamento por animal foram
cultivados in vitro . Fragmentos de ovário foram cultivados por 6 dias em placas de
cultura de 24 poços em α-MEM (pH 7,2-7,4) suplementado com BSA (1,25 mg / ml)
glutamina (2 mM), hipoxantina (2 mM), penicilina / estreptomicina (100 μg / ml), ácido
ascórbico (50 μg / ml), insulina (10 μg / ml), transferrina (5,5 μg / ml) e selênio (10 μg /
ml). As condições de cultura estavam a 38,5 ° C com 5% de CO 2no ar. O meio de cultura
foi estabilizado a 38,5 ° C por 4 h antes do uso e, a cada 2 dias de cultivo, 60% do meio
de cada poço foi substituído por meio fresco. Após o período de cultivo em cada
tratamento, os fragmentos foram enviados para as mesmas avaliações realizadas para os
tecidos controle.
2.8 . Análises morfológicas e avaliação do crescimento folicular in vitro

A análise histológica foi realizada de acordo com a metodologia de Bizarro-Silva et

al. [ 21 ], com modificações. O controle fresco (D0), bem como os tecidos vitrificados e
cultivados foram fixados em paraformaldeído (4%) a 4 ° C, por 24 he desidratados em
concentrações crescentes de etanol, depurados com xilol , incluídos em parafina e
seccionados em série em intervalos de 6 μm. Em cada 5ª seção, as lâminas foram
montadas e coradas com hematoxilina e eosina. Apenas folículos pré-antrais cujos
ovócitos apresentavam núcleo evidente no corte observado foram analisados para evitar
dupla contagem. A análise dos folículos nos tecidos foi realizada em todos os cortes em
microscópio óptico (Nikon, Eclipse, TS 100, Japão) com aumento de 100 e 400 x. A
classificação dos folículos saudáveis foi de acordo com Telfer et al. [ 22 ] com
modificação. Para que os folículos sejam categorizados como morfologicamente normais,
o oócito deve ser aproximadamente circular cercado por células da granulosabem
organizados em uma ou mais camadas, ausência de corpos picnóticos e retração
citoplasmática. Além disso, o grau de organização das células da granulosa
circunvizinhas foi considerado. Folículos degenerados foram definidos como aqueles
com ovócito retraído, presença de núcleo picnótico e / ou circundado por células da
granulosa desorganizadas, destacadas da membrana basal [ 23 ].
O estágio de desenvolvimento folicular foi categorizado de acordo com Telfer et
al. [ 22 ]. Os folículos foram classificados em primordiais (ovócitos circundados por uma
camada de células granulosas achatadas), primários (ovócitos circundados por uma
camada de células granulosas cúbicas) e secundários (ovócitos circundados por duas ou
mais camadas completas de células granulosas cúbicas). A proporção de folículos em
diferentes estágios de desenvolvimento foi definida como uma porcentagem de folículos
morfologicamente saudáveis sobre a contagem total de folículos.

2.9 . Análise de matriz extracelular

Para avaliar a distribuição das fibras de colágeno na MEC, os tecidos corticais ovarianos
foram corados com Picrosirius Red (Kit Abcam), de acordo com a metodologia descrita
por Rittié [ 24], com modificações. Resumidamente, seções ovarianas de 6,0 μm foram
desparafinadas em xilol e incubadas em solução Sirius Red (0,1%) por 1 h em temperatura
ambiente. Após remoção do excesso de corante com solução de ácido acético (0,5%), os
cortes foram desidratados e avaliados em microscópio óptico (Nikon, Eclipse, TS 100,
Japão) com aumento de 400x. Para cada tratamento, a porcentagem de área com fibras de
colágeno em dez campos diferentes foi medida por um DS Cooled Camera Head DS-Ri1
acoplado a um microscópio (Nikon, Eclipse, TS 100, Japão) e as imagens foram
analisadas por Image J Software ( Versão 1.51p, 2017). Após a coloração, as fibras de
colágeno foram marcadas em vermelho por picrosirius vermelho, enquanto os folículos
permaneceram sem cor.
2,10 . Avaliação da viabilidade dos folículos pré-antrais por microscopia de
fluorescência
Após o descongelamento, os fragmentos ovarianos foram incubados em gotas de 30 μl de
PBS suplementado com 4 mM de calceína-AM e 2 mM de homodímero de etídio -1
(Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) a 37 ° C por um período de 15
min. Em seguida, os fragmentos foram lavados três vezes em PBS e, em seguida,
examinados em microscópio de fluorescência (Nikon, Eclipse, TS 100, Japão). Oócitos e
células da granulosa foram considerados viáveis se o citoplasma fosse corado
positivamente com calceína AM (verde) e inviável se a cromatina fosse positivamente
marcada com homodímero de etídio-1 (vermelho).
2,11 . Expressão de mRNA para SOD, CAT, PRDX6 e GPX1 em tecido ovariano
Para análise da expressão gênica, os tecidos ovarianos foram armazenados a −80 ° C
imediatamente após o descongelamento até a extração do RNA total para posterior análise
da expressão dos mRNAs de SOD , CAT , PRDX6 e GPX1 . Para isso, os tecidos foram
macerados em bisturis n.22 em condições estéreis e, a seguir, submetidos à extração do
RNA total que foi realizada por meio de um aparelho depurificaçãoTrizol®.kit
(Invitrogen, São Paulo, Brasil) de acordo com as instruções do fabricante. A
quantificação do mRNA foi realizada usando SYBR Green. As reações de PCR foram
compostas por 1 μL de cDNA como modelo em 7,5 μL de SYBR Green Master Mix (PE
Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), 5,5 μL de água ultra pura e 0,5 μM de cada
primer. Os primers foram projetados para realizar a amplificação de SOD, CAT, PRDX6,
GPX1 e GAPDH ( Tabela 1 ). A especificidade de cada par de primers foi confirmada
pela análise da curva de fusão dos produtos de PCR. O perfil do ciclo térmico para a
primeira rodada de PCR foi a desnaturação inicial e ativação da polimerasepor 10 min a
95 ° C, seguido por 40 ciclos de 15 sat 95 ° C, 30 sat 58 ° C e 30 sat 72 ° C. A extensão
final foi de 10 min a 72 ° C. Todas as reações foram realizadas em
um instrumento Step One Plus (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O método
ΔΔCt foi usado para transformar os valores de Ct em níveis de expressão relativa
normalizados.

Tabela 1 . Pares de primers usados para PCR em tempo real.

Gene Sequência de primer (5 '→ 3 ′) Sentido Número de

alvo (S), acesso do
anti- GenBank
sentido
(As

GAPDH TGTTTGTGATGGGCGTGAACCA S GI: 402744670

ATGGCGCGTGGACAGTGGTCATAA As

PRDX6 GCACCTCCTCTTACTTCCCG S GI: 59858298

GATGCGGCCGATGGTAGTAT As

GPX1 AACGTAGCATCGCTCTGAGG S GI: 156602645

GATGCCCAAACTGGTTGCAG As

SOD GTGAACAACCTCAACGTCGC S GI: 31341527

GGGTTCTCCACCACCGTTAG As

GATO AAGTTCTGCATCGCCACTCA S GI: 402693375

GGGGCCCTACTGTCAGACTA As

2.12 . Análise estatística

A análise estatística foi realizada por meio do GraphPad Prisma (5.0). Os dados que não
apresentaram distribuição normal, selecionados pelo teste de Shapiro-Wilk, sofreram
transformação logarítmica. As variáveis paramétricas de folículos normais, classe
folicular e ativação folicular em cada tratamento foram avaliadas pelo teste de Tukey e
as comparações entre os tratamentos foram realizadas pelo teste não paramétrico
de Kruskal-Wallis. Os dados de distribuição das fibras de colágeno e dados de PCR de
expressão foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pela comparação de
Dunn. As diferenças foram estatisticamente significativas quando p <0,05.
3 . Resultados
3.1 . Efeito da solução de vitrificação na morfologia folicular e ECM
A análise histológica demonstrou que a solução de vitrificação não influenciou na
manutenção da estrutura folicular normal, independentemente da concentração de Aloe
vera utilizada. Em todos os tratamentos, as taxas de folículos morfologicamente
saudáveis (mais de 94%) foram semelhantes às dos tecidos frescos ( Fig. 1 (A) , P
<0,05). Quando avaliada a densidade da matriz extracelular, foi possível verificar que a
presença de 10% de Aloe vera mantinha níveis de colágeno semelhantes aos de tecidos
frescos ( fig. 1 (B) , P <0,05).

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Fig. 1 . (A) . Porcentagens de folículos morfologicamente saudáveis no controle
fresco (tecido não submetido à solução de vitrificação) e em diferentes grupos de
 tratamento após contato com a solução de vitrificação: sem Aloe vera (VS
[AV0]); ou com 10% de Aloe vera (VS [AV10]) e 50% de Aloe vera (VS
[AV50]). (P <0,05). (B) Níveis de colágeno em tecidos ovarianos analisados pelo
picrosirius red no controle fresco (tecido não submetido à solução de vitrificação)
e em diferentes grupos de tratamento após contato com solução de vitrificação:
sem Aloe vera (VS [AV0%]); ou com 10% de Aloe vera (VS [AV10%]) e 50%
de Aloe vera(VS [AV50%]).). a, b, c Letras diferentes indicam diferença
significativa entre os tratamentos (P <0,05).
3.2 . Efeito da Aloe vera na distribuição folicular, viabilidade e ECM após
vitrificação dos tecidos ovarianos
A presença de Aloe vera na solução de vitrificação não influenciou as porcentagens de
folículos primordiais e primários morfologicamente normais. No entanto, 10% de Aloe
vera aumentou as taxas de folículos secundários morfologicamente saudáveis em
comparação com o controle fresco ( Fig. 2 (A) , P <0,05). A análise microscópica
de fluorescência usando calceína-AM e homidímero de etídio -1 mostrou que os folículos
criopreservados em soluções de vitrificação suplementadas com diferentes concentrações
de Aloe vera coraram positivamente para calceína - AM ( Fig. 2 (B) ). Fig. 3 (A e B)
mostra que a presença de Aloe vera em ambas as concentrações foi capaz de manter
percentuais de colágeno semelhantes ao controle fresco (P <0,05).
1. Download: Baixe imagem em alta resolução (592 KB)
2. Download: Baixe a imagem em tamanho real
Fig. 2 . (UMA). Porcentagens de folículos morfologicamente saudáveis em
diferentes categorias foliculares no controle fresco (tecido não vitrificado) e após
a vitrificação: sem Aloe vera (VS [AV0%]); ou 10% de Aloe vera (VS [AV10%])
e 50% de Aloe vera (VS [AV50%]). (P <0,05). a, b, c Letras diferentes indicam
diferença significativa entre os tratamentos (P <0,05). (B) Folículos bovinos
viáveis em diferentes categorias foliculares após vitrificação sem Aloe vera (VS
[AV0%]); ou com 10% de Aloe vera (VS [AV10%]) e 50% de Aloe vera (VS
[AV50%]).
1. Download: Baixe imagem em alta resolução (2 MB)
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 Fig. 3 . (A) Imagens representativas de fibras de colágeno marcadas por manchas
vermelhas de picrosirius e observadas em microscopia óptica (400x). Controle
fresco (a); VS [AV0%] (b); VS [AV10%] (c) e VS [AV50%] (d). As setas pretas
mostram a área folicular incolor. Barra de escala: 100 μm. (B) Níveis de colágeno
(média ± SE) em tecidos ovarianos analisados por picrosirius red no controle
fresco (tecido não vitrificado) e em tecidos vitrificados sem Aloe vera (VS
[AV0]); ou com 10% de Aloe vera (VS [AV10]) e 50% de Aloe vera(VS
[AV50]). a, b, c Letras diferentes indicam diferença significativa entre os
tratamentos (p <0,05). (Para interpretação das referências à cor na legenda da
figura, o leitor deve consultar a versão da Web deste artigo.)
3.3 . Expressão de mRNA para SOD, CAT, PRDX6 e GPX1 após vitrificação de
tecidos ovarianos
A presença de Aloe vera não influenciou os níveis de mRNA de CAT quando comparada
aos controles frescos e criopreservados ( Fig. 4 ). No entanto, a suplementação de meio
com 10 ou 50% de Aloe vera aumentou significativamente os níveis de mRNA
para PRDX6 e GPX1 . Além disso, a presença de 10% de Aloe vera aumentou os níveis
de mRNA para SOD em comparação com o controle fresco (P <0,05).

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 2. Download: Baixe a imagem em tamanho real
Fig. 4 . Níveis de mRNA para SOD (A), CAT (B), PRDX6 (C) e GPX1 (D) no
controle fresco (tecido não vitrificado) e em tecidos vitrificados sem Aloe
vera (VS [AV0%]); ou com 10% de Aloe vera (VS [AV10%]) e 50% de Aloe
vera (VS [AV50%]). a, b, c Letras diferentes indicam diferença significativa entre
os tratamentos (P <0,05).
3.4 . Efeito da Aloe vera na morfologia folicular, desenvolvimento e ECM
após cultura in vitro de tecidos ovarianos vitrificados
Um total de 928 folículos foram analisados. Folículos morfologicamente normais
exibiam ovócitos com núcleo central e células da granulosa íntegras e bem organizadas ,
enquanto folículos degenerados apresentavam picnose nuclear, retração citoplasmática
ou desorganização das células da granulosa ( Fig. 5 (A) ). Nenhum folículo antral foi
encontrado em qualquer fragmento ovariano.
1. Download: Baixe imagem em alta resolução (2 MB)
2. Download: Baixe a imagem em tamanho real
Fig. 5 . (UMA). Imagens representativas de seções de tecido ovariano bovino
vitrificado e cultivado mostrando folículos morfologicamente normais (a – c) e
 degenerados (d – f) de diferentes categorias corados
com hematoxilina e eosina . Folículos primordiais normais (a), folículos
degenerados (d); folículos normais (b); folículo degenerado (e) folículos normais
primários e (c) folículo secundário degenerado (f). Células da
granulosa (GC); oócito (O); núcleo do ovócito (N). Barra de escala: 100
μm. (B) . Porcentagens de folículos morfologicamente saudáveis em controle
fresco (tecido não vitrificado e não cultivado) e em tecidos vitrificados e in
vitroculto. Tecidos vitrificados sem Aloe vera (VS [AV0%]); ou com 10%
de Aloe vera (VS [AV10%]) e 50% de Aloe vera (VS [AV50%]). ]). a, b, c Letras
diferentes indicam diferença significativa entre os tratamentos (P <0,05).
Foi observada redução significativa na porcentagem de folículos normais em todos os
tratamentos ao final do período de cultivo. No entanto, os fragmentos vitrificados na
presença de Aloe vera a 10% apresentaram níveis significativamente maiores de folículos
morfologicamente saudáveis quando comparados aos fragmentos que foram vitrificados
sem Aloe vera ( Fig. 5 (B) , P <0,05). Quando as taxas de ativação e desenvolvimento
folicular foram avaliadas, uma redução significativa nas porcentagens de folículos
primordiais em todos os tratamentos foi observada quando comparada ao controle fresco
( Fig. 6 (A) , P <0,05). No entanto, em fragmentos vitrificados com a presença de Aloe
vera, a taxa de desenvolvimento de folículos foi significativamente maior do que em
tecidos vitrificados sem Aloe vera ( Fig. 6 (B) , P <0,05).
 1. Download: Baixe imagem em alta resolução (235 KB)
2. Download: Baixe a imagem em tamanho real
Fig. 6 . (UMA). Porcentagem de folículos primordiais morfologicamente
saudáveis no controle fresco (tecido não vitrificado e não cultivado) e em tecidos
vitrificados e em cultura in vitro . Solução de vitrificação sem Aloe vera (VS
[AV0%]); ou com 10% de Aloe vera (VS [AV10%]) e 50% de Aloe vera (VS
[AV50%]). ]). a, b, c Letras diferentes indicam diferença significativa entre os
tratamentos (P <0,05). (B). Porcentagem (média ± SE) de folículos em
desenvolvimento morfologicamente saudáveis no controle fresco (tecido não
vitrificado e não cultivado) e em tecidos vitrificados e em cultura in
vitro . Solução de vitrificação semAloe vera (VS [AV0]); ou com 10% de Aloe
vera (VS [AV10]) e 50% de Aloe vera (VS [AV50]). a, b, c Letras diferentes
indicam diferença significativa entre os tratamentos (P <0,05).
A análise de ECM em tecidos cultivados por 6 dias após a vitrificação é mostrada na Fig.
7 . Ao final do período de cultivo, os fragmentos que foram vitrificados em solução
contendo Aloe vera mantiveram os percentuais de colágeno semelhantes ao controle
fresco. No entanto, a presença de 50% de Aloe vera na vitrificação não apresentou efeito
quando comparada aos tecidos vitrificados sem Aloe vera (P <0,05).

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Fig. 7 . Níveis de colágeno nos tecidos ovarianos analisados pelo picrosirius red
no controle fresco (tecido não vitrificado e não cultivado) e após vitrificação e
cultura in vitro . Solução de vitrificação sem Aloe vera (VS [AV0]); de com 10%
de Aloe vera (VS [AV10]) e 50% de Aloe vera (VS [AV50]). (P <0,05). a, b, c
Letras diferentes indicam diferença significativa entre os tratamentos (p <0,05).
4 . Discussão
Este é o primeiro estudo que mostrou os efeitos benéficos do extrato de Aloe vera durante
a vitrificação de tecidos ovarianos bovinos. A presença de Aloe vera aumentou as taxas
de folículos morfologicamente saudáveis após a vitrificação, manteve a porcentagem
de fibras de colágeno e aumentou os níveis de mRNA para
PRDX6, GPX1 e SOD . Estudos anteriores relataram os benefícios da adição de
diferentes substâncias antioxidantes (resveratrol [ 12 ]; anetol [ 25 ]; catalase [ 26 ]) na
viabilidade de gametas femininos vitrificados / descongelados .
A presença de Aloe vera na solução de vitrificação manteve os níveis elevados de
folículos morfologicamente saudáveis e os níveis de colágeno na MEC do tecido ovariano
em proporções semelhantes ao controle fresco. Esses achados sugerem que não há efeitos
deletérios significativos na associação de 10% de Me 2 SO com concentrações de 10% ou
50% de Aloe vera na solução de vitrificação. Como o método de vitrificação requer
uma solução crioprotetora concentrada , uma grande preocupação na criobiologia são os
estresses mecânicos potencialmente letais aos quais as células são submetidas quando
expostas a soluções com alta osmolaridade . Lima et al. [ 27] mostram a importância de
estudos que avaliem a concentração ideal de agentes crioprotetores, bem como os efeitos
de sua associação com outras substâncias. Para padronizar o uso do gel de Aloe
vera na criopreservação de tecidos , ainda é necessário minimizar
as variações fitoquímicas naturais em sua composição. De acordo com Ahlawat et
al. [ 18 ] mudanças morfológicas em uma folha de planta com a maturidade são bastante
óbvias e são refletidas por mudanças em suas dimensões, como comprimento, peso,
espessura e largura, que podem influenciar o rendimento e a composição do gel. Assim,
padronização de métodos de extração e purificaçãode gel de plantas cultivadas sob
condições estritamente controladas de temperatura, luz, umidade e nutrição , bem como
em estágio específico de maturação podem contribuir para o uso bem sucedido
do gel de Aloe vera na criopreservação de tecidos ovarianos. Outra possibilidade é usarpó
de Aloe vera processado comercialmente[ 28 ].
A manutenção dos níveis de colágeno observados nos grupos tratados com Aloe
vera pode ter contribuído para manter o percentual de folículos morfologicamente
normais, uma vez que a MEC é composta por uma rede de proteínas ricas em
colágeno, polissacarídeos e água [ 29 ], permitindo a estabilização do quadro físico.
estrutura dos tecidos [ 30 ]. De acordo com Muncie e Weaver [ 30 ], a estabilização da
estrutura da ECM também permite um microambiente especializado para regular a
atividade e o desenvolvimento celular , incluindo proliferação e
sobrevivência celular , esteroidogênese , regulação da agregação e morfologia celular.
Hassanpour et al. [ 31 ] relatam que a ECM também atua como um reservatório de
moléculas bioativas, como fatores de crescimento e citocinas, e influencia a formação,
maturação e destino dos folículos ovarianos . Assim, a manutenção da integridade
do estroma é importante para a sobrevivência folicular após a criopreservação do tecido
ovariano. Outros autores também apontam que danos à estrutura do colágeno podem
ocorrer devido à expressão desregulada de uma classe de enzimas conhecidas MMPs que,
em situações fisiológicas, são reguladas por inibidores
de metaloproteinase tecidual (TIMPs). Porém, em uma situação de estresse oxidativo ,
por exemplo, essa regulação pode ser prejudicada, favorecendo a ação das
metaloproteinases [ 32, 11 ]. Chul-Hong et al. [ 14 ] mostraram que o Aloe vera foi capaz
de suprimir os níveis de mRNA para MMP-9 em tecidos de camundongos, mantendo a
estrutura do tecido. Além disso, foi relatado que o Aloe vera estimulou fortemente a
proliferação de fibroblastos [ 33 ]. Esse efeito é importante tendo em vista o papel dessas
células na produção de colágeno [ 34 ]. Sigaroodi et al. [ 35 ] relataram que o Aloe
vera também aumentou o conteúdo de colágeno tipo III nos tecidos e que o acemanan,
um polissacarídeo presente no gel de Aloe vera , estimula a síntese da matriz extracelular.
Aloe vera promoveu um aumento significativo nos níveis de mRNA para PRDX6, GPX1
e SOD, e reduziu a expressão para CAT. Alterações na expressão dessas enzimas podem
estar relacionadas às maiores taxas de sobrevivência e crescimento folicular
após cultura in vitro de tecidos ovarianos. Nesse sentido, Leyens et al. [ 36 ] relatam que,
tanto nas células quanto nos tecidos, as peroxidases estão envolvidas na defesa
antioxidante e na sinalização intracelular por meio de suas atividades de alquil e peróxido
de hidrogênio redutase . A peroxideroxina 6 (Prdx6, 1-cys peroxiredoxina), cuja
expressão de mRNA foi significativamente aumentada em duas concentrações de Aloe
vera utilizadas neste estudo (10 e 50%), é a únicaperoxirredoxina capaz de
reduzir hidroperóxidos de fosfolipídios por meio da atividade da glutationa
peroxidase (GPX) [ 37]. Outras enzimas envolvidas na defesa antioxidante, incluindo
GPX1, SOD e CAT, desempenham um papel importante na regulação dosníveis
de ROS no ambiente intracelular. Dentre eles, o GPX1, que em nosso estudo teve seus
níveis de mRNA aumentados em ambas as concentrações deAloe vera, é um membro
amplamente expresso e importante do metabolismo de ROS [38]. SOD catalisa a
dismutação do ânion superóxido (O2-) em oxigênio (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2),
sendo o último eliminado pela glutationa peroxidase ou catalase. Por esse motivo, é uma
importante defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigênio [ 39 ]. Aloe
vera também aumentou os níveis de SOD nos espermatozoides de camundongos após a
toxicidade induzida por bisfenol A e raios-X, respectivamente [ 40 , 41 ]. Corroborando
com esses relatos, o mesmo efeito foi observado em fibroblastos de pele humana , onde
a superexpressão de SOD foi associada a uma redução no dano oxidativo a lipídios e
DNA [ 42 ]. Em geral, a alta expressão de mRNAs por enzimas antioxidantes pode estar
relacionada à manutenção da morfologia e viabilidade folicular observada em nossa
investigação .
Após cultura in vitro por 6 dias de tecidos ovarianos vitrificados, constatamos que a
presença de Aloe vera na solução de vitrificação foi capaz de proporcionar maiores taxas
de ativação e desenvolvimento folicular do que as observadas no grupo sem Aloe
vera . Vários estudos têm mostrado que a transição dos folículos primordiais
em repouso para os estágios de crescimento é um processo muito dinâmico e ainda pouco
compreendido. Já foi sugerido que a fragmentação do tecido ovariano promove um
aumento na polimerização da actina, o que interrompe a via de sinalização do
Hipopótamo e leva ao aumento da expressão de fatores de crescimento, incluindo o fator
de crescimento do tecido conjuntivo.(CTGF ou CCN2) e nefroblastos de superexpressão
(NOV ou CCN3) [ 43 ]. Hsueh et al. [ 44 ] mostraram que a secreção de CCN2 e que esse
fator é capaz de promover o crescimento dos folículos primordiais in vitro . Como já
discutido, a ECM atua como um reservatório para moléculas bioativas, como fatores de
crescimento e, em nosso estudo, o Aloe vera foi capaz de manter a integridade da
ECM. Esse fato pode ter contribuído para promover a ativação e o desenvolvimento
folicular observado em nosso relato.
O equilíbrio entre a produção de ROS e as defesas antioxidantes celulares é essencial para
o desenvolvimento folicular saudável. Nesse sentido, já foi demonstrado que uma
mudança na concentração de ROS inicia a apoptose , causando danos em todos os
estágios foliculares [ 45 ]. Uma concentração adequada de antioxidantes reduz o
comprometimento das membranas celulares , o que é importante tendo em vista seu papel
na manutenção da homeostase celular., bem como na modulação de eventos fisiológicos
que potencializam o desenvolvimento celular. Assim, é essencial manter níveis
adequados de enzimas antioxidantes durante a cultura folicular. A ativação e o
desenvolvimento folicular observados em nosso estudo podem ter sido favorecidos pela
maior expressão de mRNA para enzimas antioxidantes na presença de Aloe vera , o que
pode ter contribuído para uma menor taxa de ROS nos tecidos após a vitrificação. Essa
afirmação de acordo com Sá et al. [ 45 ], que relataram que em situações de menores
concentrações de ROS houve maior ativação e desenvolvimento de folículos primordiais
em tecido ovariano caprino cultivado com anetol, uma substância antioxidante.
Em conclusão, mostramos que a presença de 10% de Aloe vera na solução de vitrificação
aumenta a expressão de mRNA para PRDX6, GPX1 e SOD, mantém a sobrevivência e
promove ativação e desenvolvimento folicular após cultivo in vitro de tecidos ovarianos
bovinos vitrificados. Esses resultados abrem novas perspectivas para avaliar o potencial
de fertilidade após o transplante de tecidos ou para obter oócitos maduros competentes
após o cultivo in vitro de folículos criopreservados. Embora mais estudos devam ser
realizados para determinar um método ideal para criopreservar folículos pré-antrais
bovinos encerrados em tecido ovariano, este trabalho representa um avanço neste
campo. Nossos resultados em espécies bovinas servem como um modelo importante para
a otimizaçãoprotocolos de criopreservação de tecido ovariano , que podem ser traduzidos
em uso clínico.