ASSOCIAÇÃO ENTRE OS GENÓTIPOS DOS VÍRUS DA HEPATITE A

E B EM RELAÇÃO AOS DIFERENTES PADRÕES DE INFECÇÃO

VIRAL

Andreza Salvio Lemos

Rio de Janeiro

2013
 ANDREZA SALVIO LEMOS

Aluna do curso de Tecnologia em Biotecnologia

Matrícula: 1111321020

ASSOCIAÇÃO ENTRE OS GENÓTIPOS DOS VÍRUS DA HEPATITE A

E B EM RELAÇÃO AOS DIFERENTES PADRÕES DE INFECÇÃO
VIRAL

Trabalho de conclusão de curso - TCC

apresentado ao curso de graduação em
Tecnologia em Biotecnologia do Centro
Universitário Estadual da Zona Oeste - UEZO,
como requisito parcial para obtenção do título
de Tecnólogo em Biotecnologia.

Orientação: Dra. Vanessa Salete de Paula

Coorientação: Msc. Renata Tourinho Santos

Rio de Janeiro

Dezembro de 2013
L556 Lemos, Andreza Salvio.

Associação entre diferentes genótipos dos vírus da

hepatite A e B em relação aos diferentes padrões de infecção
viral. / Andreza Salvio Lemos — 2013.

60 f.; 30 cm.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Tecnologia em

Biotecnologia)— Centro Universitário Estadual da Zona Oeste,
Rio de Janeiro, 2013.

Bibliografia: f. 36-42.

1. Hepatite. 2. Genotipagem. 3. HAV. 4. HBV. I. Título.

CDD 616.3623
ASSOCIAÇÃO ENTRE OS GENÓTIPOS DOS VÍRUS DA HEPATITE A E B EM

RELAÇÃO AOS DIFERENTES PADRÕES DE INFECÇÃO VIRAL

Elaborado por Andreza Salvio Lemos

Aluna do curso de Tecnologia em Biotecnologia

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com grau: 9

Rio de Janeiro, 12 de dezembro de 2013.

___________________________________________

Dra. Luciane Almeida Amado – UEZO.

Examinador.

___________________________________________

Msc. Amanda Perse da Silva – IOC/FIOCRUZ.

Examinador.

___________________________________________

Dra. Vanessa Salete de Paula – IOC/ FIOCRUZ

Presidente.

RIO DE JANEIRO, RJ-BRASIL

DEZEMBRO DE 2013

ii
Dedico este trabalho a minha família tanto material quanto espiritual e aos meus
companheiros de jornada na Terra.
iii
 AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a meus pais, Ana Maria e Luiz Flávio Lemos, que,
apesar da distância, estão sempre tão presentes comigo mesmo que por pensamento
Agradeço a eles por minha formação como ser humano, por sempre me incentivarem a
seguir e lutar por meus sonhos e objetivos, e pelo apoio também nos momentos ruins e
difíceis. Agradeço por nunca me deixarem desistir e por acreditarem tanto em mim. Queria
agradecer também a toda a minha família, por minha formação como pessoa e por estarem
sempre presentes em todas as fases da minha vida. E a Luana Lemos, minha irmãzinha, por
ser minha companheira desde sempre e por todo o apoio.
Uma vez, disse Leonardo Da Vinci, “Os que se encantam com a prática sem a ciência
são como os timoneiros que entram no navio sem timão nem bússola, nunca tendo certeza do
seu destino”. Desta forma, agradeço a Vanessa de Paula e Renata Tourinho por me
proporcionarem o acesso ao timão e a bússola neste meio científico e por me ensinarem a
usá-los da melhor forma possível. Com certeza, vocês foram cruciais para a realização deste
trabalho.
Agradeço a minha orientadora, Vanessa Salete de Paula, por confiar em mim e
acreditar no meu potencial. Agradeço por todo o conhecimento e apoio que recebi de você.
Renata, eu sou eternamente grata por toda a sua paciência comigo, principalmente,
por ter me escolhido como aluna de Iniciação Científica, espero não ter decepcionado vocês.
Obrigada por sempre me socorrer no laboratório e por me explicar tudo sempre de forma tão
clara e calma.
Não poderia deixar de agradecer a todo o grupo do Laboratório de Desenvolvimento
Tecnológico em Virologia, vocês tornam o LDTV um laboratório ótimo de se trabalhar com
harmonia e trabalho em equipe. Especialmente, agradeço às minhas companheiras de IC,
Camilla Rodrigues e Amanda Lopes, pela amizade e companheirismo de vocês não só no
laboratório, mas também fora dele. Vocês tornaram minha experiência como IC mais
divertida.
Gostaria de agradecer a minha banca examinadora, por estarem presentes neste
momento muito importante da minha formação e por aceitarem o convite e somarem a este
trabalho com suas opiniões.

iv
 Agradeço ao Instituto Oswaldo Cruz pela oportunidade de ter acesso a ciência e pelo
desenvolvimento deste projeto, além de todo o suporte e acesso ao conhecimento oferecido
pela instituição. Agradeço a CNPq por acreditar em meu potencial e no projeto.
Não poderia deixar de mencionar também meus colegas de faculdade pela
companhia nesses três anos, principalmente a Jéssica Tostes e Jessika Neto pela amizade de
vocês. Agradeço aos meus professores pelo conhecimento transmitido e pela contribuição a
minha formação acadêmica e ao Centro Universitário Estadual da Zona Oeste por
proporcionar tudo isso. Fiz amigos sinceros na UEZO e desejo muito sucesso a vocês.
Rafael Medeiros, obrigada por sua imensa paciência, carinho e compreensão,
principalmente nos momentos em que eu estava nervosa e cansada. Obrigada também a
todos meus amigos que sempre estiveram caminhando comigo faça sol ou faça chuva.
Agradeço a Matheus Kafuri, por me incentivar, apoiar e acreditar em mim. Agradeço
a Thaís Alves por todo o amparo e compreensão. Vocês são imensamente importantes para
mim.
Por fim, agradeço a todos aqueles que sempre me acompanham, me dão apoio e
força não só nesta fase, mas em todas elas.

v
“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em
descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o
imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.

(Isaac Newton)
vi
 RESUMO

As hepatites virais constituem um grande problema de saúde pública não só no Brasil, mas
também em todo o mundo, sendo a hepatite A uma das infecções agudas mais reportadas.
Devido a sua transmissão ocorrer via fecal-oral, a falta de saneamento básico e de medidas
sanitárias está altamente associada à alta prevalência da doença; a Hepatite B é uma das
principais doenças transmitidas de forma parenteral e é responsável pela maioria dos casos
de hepatite crônica que levam a cirrose e ao carcinoma hepatocelular. Tanto o vírus da
hepatite A (HAV) quanto o vírus da hepatite B (HBV) podem causar desde quadros
assintomáticos a fulminantes, sendo este último responsável por um alto grau de
mortalidade. Apesar dos avanços nas pesquisas a respeito, ainda há poucos dados que
relacionem os genótipos dos vírus das hepatites A e B com o padrão de infecção
desenvolvido pelo paciente, principalmente nos casos fulminantes. Dessa forma, o objetivo
do presente estudo foi avaliar associação entre os genótipos dos vírus das hepatites A e B e
os padrões clínicos desenvolvidos pelos pacientes. Para tanto, foram coletadas amostras com
etiologia comprovada por sorologia para HAV e HBV, excluindo-se casos de coinfecções.
Estas amostras foram coletadas por punção venosa periférica e selecionadas sorologicamente
por triagem de inclusão e exclusão. Em seguida, foi realizada extração do RNA das 120
amostras positivas para hepatite A (anti-HAV IgM positivas), seguidas pela técnica de RT-
PCR para síntese do DNA complementar e por nested-PCR para amplificação das regiões
VP1 e VP1/2A do HAV. Para as amostras de HBV, foi realizada a extração de DNA de 47
amostras, em seguida foi feita a técnica de PCR para a amplificação da região Pré-S/S do
HBV. Após a amplificação das regiões VP1 e VP1/2A do HAV e da região Pré-S/S do
HBV, os produtos de PCR passaram por eletroforese para a confirmação da presença de
material genético. Após a eletroforese, as bandas foram purificadas e enviadas para o
sequenciamento. As sequencias foram editadas utilizando o programa BioEdit e as os
dendogramas das amostras foram construídos utilizando o programa MEGA 5.1 para as
regiões amplificadas. Ao final, 66 amostras de HAV tiveram seus genótipos definidos para a
região VP1/2A, sendo 58 amostras do genótipo IA e 8 amostras do genótipo IB, e 11
amostras também foram genotipadas segundo a região VP1, todas do genótipo IA, havendo
concordância entre os genótipos das amostras pareadas quando comparados os resultados
obtidos pelas duas regiões. Amostras de diferentes quadros clínicos de hepatite A se
encontraram agrupadas nas árvores filogenéticas segundo as regiões do HAV, demonstrando
que não houve associação entre os genótipos do HAV e o padrão de infecção viral. Ao todo,
apenas 6 amostras de HBV tiveram seus genótipos definidos pela região Pré-S/S, assim,
mais dados são necessários para que seja determinado se há ou não associação entre os
genótipos do vírus da hepatite B e os padrões de infecção viral, embora, esta relação tenha
sido descrita por outros autores.

Palavras-chave: Hepatites, HAV, HBV, Falência hepática fulminante, genotipagem.

vii
 ABSTRACT

The viral hepatitis constitute a public health issue not only in Brazil but, also, worldwide,
and the hepatitis A is one of the most reported infections in the world. Due to its fecal-oral
transmission, hepatitis A is highly associated to the lack of basic sanitation, due to its fecal-
oral transmission; hepatitis B is a major parenterally transmitted disease and it is responsible
for the majority of chronic cases, which can lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
Either Hepatitis A Virus (HAV) or Hepatitis B Virus (HBV) can cause a wide range of
clinical conditions, from asymptomatic to fulminant cases, which are rare, but responsible
for high level of mortality. Besides the developments in research, there are few data about
the relation between the hepatitis A and B viruses’ genotypes and the patterns of viral
infection, mainly in the fulminant cases. Thereby, the objective of the present study was to
determinate the association between viral genotypes and clinical patterns for HAV and HBV
infections. To do so, samples were collected by peripheral venous puncture from patients
with confirmed etiology for HAV and HBV infection, without the presence of co-infections.
These samples were screened for inclusion or exclusion on the study. After that, the RNA
extraction was performed for 120 HAV samples, followed by the RT-PCR for the synthesis
of the cDNA and PCR for the amplification of VP1 and VP1/2A regions from HAV
genome. The DNA extraction was performed for 47 HBV samples, followed by PCR for the
amplification of genomic Pre-S/S region. After the PCR reactions were concluded for both
HAV and HBV samples, the products of amplification were submitted to electrophoresis to
confirm the presence of the virus in the samples and also to confirm the amplification
occurred properly. The amplified products of VP1 and VP1/2A regions, in HAV, and Pre-
S/S region, in HBV, were purified from the agarose gels and sent to sequencing platform.
The sequences obtained were edited using the software BioEdit and the dendrograms were
built by the software MEGA 5.1 for HAV VP1 and VP1/2A samples and HBV Pre-S/S
samples. After all the process, the genotypes of 66 HAV samples were defined, with 58
genotype IA samples and 8 genotype IB samples. The phylogenetic trees built based on VP1
and VP1/2A showed concordant results. Samples from patients in different clinical patterns
were found clustered in HAV phylogenetic trees; it demonstrates that there is no association
between HAV genotypes and the infection patterns. In all, 6 HBV samples were successfully
genotyped for Pre-S/S region, therefore, more data are necessary to determinate if the
relation between HBV genotypes and the clinical patterns of infections is real or not, even
though this association patterns has been widely discussed by other authors.

Keywords: Hepatitis, HAV, HBV, fulminant hepatic failure, genotyping.

viii
 LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Micrografia de secção do fígado em quadro de hepatite A aguda...........................2
Figura 2. Vírions infecciosos de HBV.....................................................................................3
Figura 3. Evolução típica da infecção aguda por HAV...........................................................6
Figura 4. Prevalência de infecção por HAV............................................................................7
Figura 5. Esquematização do RNA genômico do HAV..........................................................8
Figura 6. Ciclo de replicação do HAV..................................................................................10
Figura 7. Evolução da infecção aguda por HBV...................................................................11
Figura 8. Evolução da infecção crônica por HBV.................................................................12
Figura 9. Prevalência da infecção por HBV em adultos........................................................13
Figura 10. Esquematização do DNA genômico do HBV......................................................15
Figura 11. Ciclo de replicação do HBV................................................................................16
Figura 12. Eletroforese com bandas de VP1/2A do HAV....................................................24
Figura 13. Eletroforese com bandas de VP1do HAV...........................................................24
Figura 14. Dendograma construído a partir da região VP1/2A do HAV..............................25
Figura 15. Dendograma construído a partir da região VP1 do HAV....................................26
Figura 16. Eletroforese 1 com bandas de Pré-S/S do HBV...................................................28
Figura 17. Eletroforese 2 com bandas de Pré-S/S do HBV...................................................28
Figura 18. Dendograma construído a partir da região Pré-S/S do HBV...............................29

ix
 LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Relação entre amostras de hepatite A e B..............................................................23
Tabela 2. Amplificação de amostras para região VP1 e VP1/2A do HAV. .........................23
Tabela 3. Relação entre os quadros clínicos dos pacientes infectados com hepatite A e os
genótipos detectados...............................................................................................................27
Tabela 4. Relação de amostras coletadas, amplificadas, sequenciadas e genotipadas de
HBV........................................................................................................................................27
Tabela 5. Relação entre os quadros clínicos dos pacientes infectados pelo vírus da Hepatite
B e os genótipos detectados....................................................................................................30

x
 LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% Por cento
°C Grau Celsius
AE Tampão de eluição para a extração de DNA
AL Tampão de lise
ALT Alanina transferase
Anti-HAV Anticorpo anti-vírus da hepatite A
Anti-HAV IgM Anticorpo IgM anti-vírus da hepatite A
Anti-HBc Anticorpo anti-antígeno do nucleocapsídeo do vírus da hepatite
B
Anti-HBc IgM Anticorpo IgM anti-antígeno do nucleocapsídeo do vírus da
hepatite B
Anti-HBs Anticorpo anti-antígeno de superfície do vírus da hepatite B
Anti-HCV Anticorpo anti- virus da hepatite C
Anti-HEV Anticorpo anti-vírus da hepatite E
AVE Tampão de eluição utilizado na extração de RNA
AW1 Washer buffer 1
AW2 Washer buffer 2
cccDNA Covalently Closed Circular DNA
cDNA Complementary DNA
CEP Comitê de ética em pesquisa
CG Complexo de Golgi
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNAse Desoxirribonuclease
dNTP Desoxirribonucleotídeos trifosfatos
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etileno diamino tetra acético
EUA Estados Unidos da América
FHF Falência Hepática Fulminante
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
HAV Hepatitis A vírus
HBc Antígeno do nucleocapsídeo do vírus da hepatite B
HBcAg Antígeno do core do vírus da hepatite B

xi
HBeAg Antígeno do envelope do vírus da hepatite B
HBsAg Antígeno de Superfície do vírus da hepatite B
HBV Hepatitis B virus
HCC Hepatocellular carcinoma
IFN Interferon
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IOC Instituto Oswaldo Cruz
kb kilobase
M Molar (mol/L)
MgCl² Cloreto de magnésio
mL Mililitros
mRNA RNA mensageiro
nm Nanômetro
ORF Open Reading Frame
P3 Proteína estrutural 3
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase
pmol Picomol
RE Retículo endoplasmático
RNA Ácido ribonucleico
RNAse Ribonuclease
rpm Rotações por minuto
SS III Enzima SuperScript III
TAP Tempo de atividade da protrombina
TN93+I+G Modelo Tamura-Nei 1993 com distribuição gama incorporando sítios
Invariáveis
VP1 Viral protein 1
U/μL Unidade por microlitro
μL Microlitros

xii
 SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA .........................................................................................5
2.1. Hepatite A.........................................................................................................................5
2.1.1. Infecção por HAV.........................................................................................................5
2.1.2. Epidemiologia................................................................................................................6
2.1.3. O vírus da hepatite A e seu material genético............................................................7
2.2. Hepatite B ......................................................................................................................10
2.2.1. Infecção por HBV.......................................................................................................10
2.2.2. Epidemiologia .............................................................................................................13
2.2.3. O vírus da hepatite B e seu material genético..........................................................14
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................17
3.1. Objetivo Geral ...............................................................................................................17
3.2. Objetivos Específicos ....................................................................................................17
4. METODOLOGIA ............................................................................................................18
4.1. Aspectos éticos da pesquisa ..........................................................................................18
4.2. Seleção de pacientes ......................................................................................................18
4.3. Coleta das Amostras .....................................................................................................18
4.4. Marcadores sorológicos e dados clínicos.....................................................................18
4.5. Detecção de hepatite A e amplificação dos isolados...................................................19
4.5.1 Extração do RNA viral em amostras de soro (Kit Qiamp viral RNA mini, Qiagen)
................................................................................................................................................19
4.5.2. Síntese de DNA complementar (cDNA) ...................................................................19
4.5.3. PCR qualitativo (Reação em cadeia da Polimerase)...............................................20
4.5.4. Eletroforese.................................................................................................................20
4.6. Detecção de hepatite B e amplificação dos isolados....................................................21
4.6.1 Extração do DNA viral em amostras de soro (Kit Qiamp viral DNA mini, Qiagen)
................................................................................................................................................21
4.6.2. PCR qualitativo (Reação em cadeia da Polimerase) .............................................21
4.6.3. Eletroforese.................................................................................................................22
4.7. Sequenciamento.............................................................................................................22

xiii
4.8. Construção do Dendograma.........................................................................................22
5. RESULTADOS.................................................................................................................23
5.1. Hepatite A ......................................................................................................................23
5.2. Hepatite B......................................................................................................................27
6. DISCUSSÕES ..................................................................................................................31
7. CONCLUSÕES ................................................................................................................35
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................36
9. ANEXOS______________________________________________________________43
9.1. ANEXO 1____________________________________________________________43
9.2. ANEXO 2____________________________________________________________44

xiv
1. Introdução

As hepatites virais podem ser causadas por diferentes agentes etiológicos que, em
comum apresentam o hepatotropismo. São doenças que possuem semelhanças do ponto de
vista clínico-laboratorial e diferenças importantes quanto à evolução. Como semelhanças
podem ser citados os sintomas apresentados em infecção aguda, como icterícia e náuseas, e
como diferença pode ser citada a evolução para o quadro crônico da doença que pode
ocorrer em casos de infecção por HBV, mas não ocorre em casos de infecção por HAV. A
grande importância dessas doenças também tem relação com as complicações das formas
agudas e crônicas. Os vírus causadores das hepatites levam a uma ampla variedade de
quadros clínicos, podendo o portador apresentar quadro assintomático, agudo ou crônico,
levando a cirrose e carcinoma hepatocelular em alguns casos (BRUGUERA & SANCHES-
TAPIAS, 2000).
A Hepatite A é considerada um problema de saúde pública, sendo uma das doenças
infecciosas mais reportadas no mundo (MARTIN & LEMON, 2006).
Segundo Asher e colaboradores (1995), a hepatite A ocorre tanto em casos
esporádicos quanto em casos epidêmicos.
A hepatite A apresenta alta prevalência em regiões com carência de saneamento
básico, tendo assim as condições ideais para sua disseminação nessas áreas (VITRAL et al.,
1998). Entre as hepatites virais, a hepatite A encontra-se como a mais comum no Brasil, com
68,7% dos casos de hepatites virais notificados no país entre 1999-2010, segundo boletim
emitido pelo Ministério da Saúde em 2010.
A hepatite A é uma doença caracterizada, geralmente, como, autolimitada e não
apresenta formas crônicas. Porém, entre pacientes adultos, principalmente, esse quadro pode
se apresentar com extrema gravidade em casos de Falência Hepática Fulminante (FHF),
apesar de sua ocorrência ser rara (0,5 – 1% dos casos) (GURFINKEL, 1988; FUJIWARA et
al., 2003).
O HAV (Vírus da Hepatite A) é transmitido, principalmente, por via fecal-oral, pelo
contato de pessoa a pessoa e/ou por consumo de alimentos e água contaminados (HADLER
et al., 1980).
Apesar de o mecanismo pelo qual o vírus chega o fígado permanecer sem definição
exata, é aceito que ele alcance o órgão pela via porta. O HAV replica-se no interior dos
hepatócitos e, então, é transportado pela bile até o intestino, onde será liberado pelas fezes.
 2
Os mecanismos de liberação do vírus na bile e no sangue não são bem definidos
(CUTHBERT, 2001).
O Vírus da Hepatite A (HAV) é hepatotrópico (Fig. 1) e pertence à família
Picornaviridae, do gênero Hepatovirus. É um vírus de RNA de fita simples, com polaridade
positiva (CUTHBERT, 2001), replicando-se por uma fita complementar de RNA de
polaridade negativa, que funciona como um mRNA (WIMMER et al., 1987).
O vírus da hepatite A apresenta seis diferentes genótipos (I-VI) e seis subgenótipos
(IA, IB, IIA, IIB, IIIA e IIIB), conforme mostrado em estudos de Lu e colaboradores (2004).
Entre os genótipos, há diversidade de 15-25% e os subgenótipos se diferem em
aproximadamente 7,5% nas posições das bases (ROBERTSON et al.,1992).

Fig. 1: Fotomicrografia de uma secção do fígado em infecção aguda por HAV, mostrando a
inflamação das regiões portal e periportal do órgão (MARTIN & LEMON, 2006).

De acordo com Lavanchy (2005), a hepatite B é especialmente importante entre as

doenças transmitidas de forma parenteral, apresentando 400/500 milhões de portadores pelo
mundo todo, com taxa de 5% de casos crônicos e responsável pela etiologia de 58% dos
casos de Câncer Hepatocelular (HCC).
A Hepatite B pode se apresentar na forma de diferentes quadros clínicos nos
pacientes, de doença hepática aguda a crônica. Com período de incubação de 45-180 dias
para surgimento dos sintomas característicos do quadro agudo. Após 180 dias de
persistência do antígeno de superfície do HBV no soro (HBSAg), a doença evolui e se
caracteriza como crônica. Há também casos, embora raros (cerca de 1% dos casos), de maior
gravidade, de Falência Hepática Fulminante, com alto grau de mortalidade (80% dos
 3
pacientes não transplantados) (HOOFNAGLE & BISCEGLIE, 1991; FUJIWARA et al.,
2003).
O vírus da hepatite B (HBV) pode ser transmitido de forma parenteral, perinatal
(verticalmente) ou horizontalmente (entre membros da mesma família). Quando a
transmissão não ocorre de modo parenteral, sexual ou perinatal, o meio primário das
transmissões domésticas é por saliva ou ferimentos abertos, embora o mecanismo exato da
transmissão doméstica ainda não tenha sido estabelecido (EROL et al., 2003).
O HBV é também hepatotrópico. É um vírus envelopado, pertencente ao gênero
Orthohepadnavirus e à família Hepadinaviridae (Fig. 2). De todos os membros da família
Hepadinaviridae, o HBV é o único que causa infecção em seres humanos (SENOL et al.,
1998).
Com material genético disposto em DNA helicoidal de fita parcialmente dupla,
apresentando apenas 3200 nucleotídeos é considerado o menor entre todos os vírus
conhecidos de DNA que parasitam animais (SENOL et al., 1998).
O HBV apresenta 8 genótipos conhecidos (A-H) com diferentes prevalências em
diferentes regiões do mundo (ALCADE et al., 2009).

Fig. 2: Vírions infecciosos de HBV (partículas de Dane) por microscopia de transmissão.

(Fonte: CDC: http://cdc.gov)
 4
A Falência Hepática Fulminante (FHF) já mencionada é uma síndrome clínica
drástica que resulta na morte massiva das células do fígado sem a atividade regenerativa que
seria necessária para equilibrar a perda. A FHF é caracterizada, geralmente, pelo surgimento
abrupto de encefalopatia e distúrbios de coagulação em indivíduos que anteriormente
apresentavam função hepática normal. Nesse tipo de caso, a única alternativa de tratamento
definitivo é o transplante de fígado (O’GRADY et al., 1993).
Apesar dos avanços no conhecimento a respeito dos vírus das Hepatites A e B, há
poucos dados sobre a associação entre seus genótipos e o curso clínico destas doenças,
principalmente em relação a hepatite fulminante, no Brasil (SANTOS et al., 2009).
 5

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Hepatite A
2.1.1. Infecção pelo vírus da hepatite A (HAV)
A forma mais comum de transmissão do vírus da hepatite A é pela ingestão de
alimentos ou água contaminados com partículas virais, por via fecal-oral (CUTHBERT,
2001). Porém, em raros casos, a infecção pode ser transmitida por transfusão de sangue ou
por produtos derivados de sangue de doadores infectados pelo HAV durante o período de
viremia (GOWLAND et al., 2004).
A infecção pelo vírus da Hepatite A pode ocorrer de forma assintomática,
sintomática anictérica ou de forma sintomática ictérica. As manifestações clínicas aparecem
após um período de incubação de duas a sete semanas após a infecção pelo vírus e dura por
volta de 30 dias (Fig. 3). Nos países subdesenvolvidos, as infecções ocorrem em idades
precoces e são frequentemente assintomáticas em crianças de regiões endêmicas. O
tratamento da doença costuma ser sintomático (MICHIELSEN & DAMME, 1999).
No geral, a evolução da hepatite A ocorre de forma benigna, se desenvolvendo de
forma autolimitada e terminando em cura na maioria dos casos. Porém, nos casos
fulminantes, em que ocorre insuficiência hepática, há altas taxas de mortalidade relatadas
como, por exemplo, de 65% nos casos nos Estados Unidos, para todas as idades
(MOREIRA-SILVA et al., 2002).
Nas infecções sintomáticas, a fase pré-ictérica, ou seja, antes do surgimento de
icterícia, pode variar de alguns dias a pouco mais de uma semana. Em mais de metade dos
pacientes, o estado prodrômico é tipicamente caracterizado por anorexia, febre acima de
39,4 ºC, fadiga, mal-estar, mialgia, náusea e vômito. A hepatite fulminante pode ocorrer
durante as 6 a 8 semanas de infecção, é caracterizada pelo surgimento repentino de febre
alta, dor abdominal localizada, vômitos e icterícia, seguidos pelo desenvolvimento de
encefalopatia hepática, associados a coma profundo e convulsões. Ascite, diátese
hemorrágica e rigidez descerebrada levam à morte de 70-90% dos pacientes com estes
sintomas (RACANIELLO, 2001).
 6

Fig. 3: Esquema mostrando a evolução típica infecção por HAV, mostrando as variações de presença
do vírus nas fezes, soro e saliva e indica o período de apresentação dos sinais e sintomas e níveis de
IgM e IgG (PAULA, 2003).

2.1.2. Epidemiologia
A Hepatite A encontra-se distribuída por todo o mundo, sendo endêmica em várias
regiões. O grau de prevalência da doença varia de acordo com fatores de higiene e medidas
sanitárias para a população (Fig. 4). Podem ser observados quatro padrões de endemicidade:
em países pobres, com carência de saneamento básico, há alta incidência, com mais de 90%
das crianças sorologicamente positivas ao fim da primeira década de vida, desse modo, as
epidemias são raras entre os nativos; em países de melhores condições sanitárias, ocorre
incidência intermediária, com uma curva de crescimento sigmoide, em que há menor
prevalência nas duas primeiras décadas de vida, com pico de prevalência ao fim da infância
e início da adolescência, assim, nessas regiões ocorrem mais casos agudos da doença e
surtos epidêmicos, o que representa risco à parte da população não vacinada; em regiões
desenvolvidas, há incidência baixa de infecção por HAV, com poucos picos de prevalência
de sorologia positiva na população entre jovens adultos, assim, a incidência é baixa e as
epidemias são raras; e em regiões desenvolvidas, com baixo fluxo migratório, a incidência é
 7
muito baixa e os picos de prevalência ocorrem mais tardiamente, em adultos, a doença é
frequentemente adquirida em viagens à áreas de maior endemicidade e de surtos, mas ainda
assim, os casos são raros (CUTHBERT, 2001; FEINSTONE & GUST, 2000).

Fig.4: Distribuição geográfica de prevalência de infecções por HAV. (Fonte: CDC: http:// cdc.gov)

Os padrões de prevalência de anti-HAV total no Brasil são variáveis de acordo com a

região do país com alta prevalência nas regiões Norte e Centro-Oeste, com padrão
semelhante ao de regiões subdesenvolvidas e com prevalência decrescente no Sudeste e no
Sul do Brasil, com prevalência na primeira década, mesmo na população de baixa renda,
inferior à relatada na região Norte. Essas observações epidemiológicas no Brasil, nas regiões
desenvolvidas, têm mostrado grande aumento o número de crianças susceptíveis, de todas as
classes sociais. Esse aumento é decorrente de melhorias nas condições sanitárias
(CUTHBERT, 2001; FEINSTONE & GUST, 2000).

2.1.3. O vírus da Hepatite A e seu material genético

O vírus da hepatite A (HAV) pertence à família Picornaviridae e ao gênero
Hepatovírus. Seu genoma está disposto em RNA de fita simples e polaridade positiva, ou
 8
seja, pronto para a tradução. O RNA genômico é covalentemente associado à proteína VPg
na extremidade 5’, que tem papel importante de iniciadora da síntese de RNA (como sítio
para entrada do ribossoma) (Fig. 5). Tanto o RNA genômico quanto proteínas não
estruturais associadas são envoltas por um capsídeo de simetria icosaédrica e o HAV não
apresenta envelope (PEREIRA & GONÇALVES, 2003).

Fig. 5: Esquematização do genoma do vírus da Hepatite A. Destacando a região VP1 e a junção

VP1/2A, além da VPg (MARTIN & LEMON, 2006).

O genoma do HAV é semelhante aos dos outros Picornavírus. Sua cadeia de RNA,
com cerca de 7500 nucleotídeos, é constituída de três regiões: a região não codificadora da
extremidade 5’ (732 – 740 nucleotídeos), a região intermediária codificadora (2225 – 2227
nucleotídeos) e a região não codificadora da extremidade 3’ (40 – 80 nucleotídeos). VP1,
VP2 e VP3 e VP4 são suas proteínas estruturais principais, que são derivadas da proteína
primária pela clivagem da protease 3C, codificada na região P3 (que também codifica a
VPg) (PEREIRA & GONÇALVES, 2003).
As proteínas virais são traduzidas diretamente do RNA genômico funcionando como
mensageiro, que é levado ao citoplasma após o desencapsulamento da partícula viral. Como
os poliovírus, a transcrição do RNA é mais provável que ocorra com um iniciador proteico,
no caso do HAV, essa proteína é a VPg uridilada (proteína 3B) agindo como primer para a
transcrição e replicação do genoma viral na célula do hospedeiro (MARTIN et al., 1995).
O HAV apresenta 6 genótipos conhecidos (I – VI) e 6 subgenótipos (IA, IB, IIA, IIB,
IIIA e IIIB) (ROBERTSON et al., 1992), com variabilidade de 15 – 25% entre os genótipos
 9
e diversidade de 7,5% entre seus subgenótipos (ROBERTSON et al., 1992). Entre os
humanos, os genótipos mais comuns nas infecções por HAV são os genótipos I e II
(PEREIRA & GONÇALVES, 2003).
Para a definição dos genótipos do HAV, é realizado o sequenciamento de
determinadas regiões do genoma viral, geralmente, incluindo a C-terminal da região VP3
(HUTIN et al., 1999), N-terminal da região VP1 (APAIRE-MARCHAIS, 1995), a junção
VP1/2A de 168 pares de base (pb) (ROBERTSON et al., 1992; PAULA et al., 2002;
HUTIN et al., 1999), a região da VP1-P2B de 390 pb (JANSEN & LEMON, 1990) e a
região completa da VP1 (COSTA-MATTIOLI et al., 2002).
Seus vírions são simples quanto à composição de um escudo proteico ao redor do
RNA genômico puro (RACANIELLO, 2001).
A replicação dos Picornavírus ocorre totalmente no citoplasma da celular (Fig. 6). O
primeiro passo é a ligação ao receptor celular. Então o RNA genômico é descoberto, um
processo que envolve alterações estruturais no capsídeo. Uma vez que a cadeia viral positiva
entra no citoplasma celular, ela é traduzida para prover proteínas virais essenciais para a
replicação do genoma e a produção de novas partículas virais. Essas proteínas são
sintetizadas a partir de uma poliproteína precursora que sofre clivagens, as quais são
realizadas, principalmente, por duas proteinases virais, 2A pro e 3Cpro/3CDpro. Entre as
proteínas sintetizadas estão as RNA polimerases virais e proteínas acessórias
RNAdependentes necessárias para a replicação e síntese do mRNA (RNA mensageiro). O
primeiro passo na replicação do RNA viral é copiar o RNA genômico para formar uma fita
complementar de polaridade negativa. A seguir, ocorre a produção de fitas adicionais de
polaridade positiva. Esses eventos ocorrem dentro de pequenas vesículas membranosas que
foram induzida por várias proteínas virais. Uma vez que o conjunto de proteínas do capsídeo
é suficientemente grande, a encapsulação se inicia. A capa proteica precursora P1 é clivada
para formar um promotor imaturo, que então se organizam em pentâmeros. Eles se juntam às
fitas de polaridade positiva recém-sintetizadas para formar vírus infecciosos. Capsídeos
vazios são também encontrados no interior de células infectadas, eles provavelmente ficam
armazenados para a formação de pentâmeros (RACANIELLO, 2001).
 10

Fig. 6: Representação da replicação do HAV no interior do hepatócito (MARTIN & LEMON, 2006).

2.2. Hepatite B
2.2.1. A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV)
O vírus da Hepatite B é transmitido por exposição percutânea ou de mucosa a sangue
ou fluidos corporais infectados. Sua transmissão pode ocorrer de diversas formas de contato
humano: perinatal ou de mãe para filho, entre membros da mesma família (de modo não
sexual), por uso de drogas (compartilhamento de agulhas), sexual e ocupacional (agentes de
saúde, por exemplo). Assim, as maiores concentrações do vírus estão no sangue e soro,
porém, outros fluidos, como sêmen e saliva, também são infecciosos. Pacientes crônicos são
os maiores reservatórios do vírus, embora qualquer pessoa positiva para o antígeno de
 11
superfície do HBV (HBsAg) encontra-se potencialmente infecciosa para transmissão entre
membros da família ou por via sexual (BOND et al., 1977; SHEPARD et al., 2006).
A doença causada pelo vírus da Hepatite B pode resultar em infecção assintomática,
hepatite aguda autolimitante, hepatite crônica ou hepatite fulminante, que requer transplante
de fígado. Pacientes com a infecção causada pelo HBV podem também desenvolver a
hepatite crônica, que pode levar a cirrose ou carcinoma hepatocelular (HCC). Em casos
agudos, o período de incubação dura por volta de 90 dias, entre 60-120 dias (Fig.7). A
probabilidade de desenvolver os sintomas pode variar com a idade do paciente, assim, mais
de 90% dos casos de infecção perinatal são assintomáticos e os quadros sintomáticos tem
maior prevalência entre crianças mais velhas, adolescentes e adultos (MCMAHON et al.,
1985).

Fig. 7: Gráfico representativo da evolução clínica da infecção aguda por HBV. (Fonte:
http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hepatology/hepatits-B/)

Pacientes com infecção aguda apresentam sintomas como náusea, dor abdominal,
vômito, febre, icterícia, urina escurecida, alteração na coloração das fezes, hepatomegalia e
esplenomegalia (SHEPARD et al., 2006).
 12
A infecção crônica por HBV é definida pela presença de HBsAg no soro, por pelo
menos 6 meses, seja o paciente positivo ou negativo para testes sorológicos para anticorpos
IgM para HBc , o antígeno de superfície do core (núcleo viral) do HBV (Fig. 8). Diferente
das pessoas com infecção aguda, os pacientes crônicos não desenvolvem anti- HBs e o
HBsAg pode persistir no organismo por décadas (SEEF et al., 1987).
Dos pacientes infectados com HBV em quadro crônico quando crianças, 15-25%
tendem a ter morte prematura por cirrose ou carcinoma hepatocelular. Pacientes que
desenvolvem sequelas como cirrose e carcinoma hepatocelular relacionadas à hepatite B
podem permanecer assintomáticos até o diagnóstico. Eles podem apresentar crises
periódicas de sinais e sintomas típicos da hepatite aguda. Complicações extra-hepáticas
podem ocorrer, como arterite nodosa, glomerulonefrite membranoproliferativa,
glomerulonefrite membranosa (BEASLEY, 1988).

Fig. 8: Evolução da infecção crônica pelo vírus da hepatite B. É possível observar a presença
constante do HBsAg no soro. (Fonte:
http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hepatology/hepatitis-B/)
 13
2.2.2. Epidemiologia
No mundo, há cerca de 2 bilhões de pessoas infectadas com o vírus da hepatite B
(HBV), 360 milhões entre essas pessoas apresenta o quadro de hepatite B crônica. São cerca
de 600.000 mortes por ano devido a doenças hepáticas relacionadas ao HBV, como a cirrose
ou o carcinoma hepatocelular (SHEPARD et al., 2006).
Aproximadamente 60% da população mundial vive em áreas de alta prevalência da
infecção por HBV, como China e Tailândia (Fig. 9). O Sul da Europa, Oriente Médio e o Sul
da Ásia apresentam um nível intermediário de endemicidade. A soroprevalência de HBsAg
na Índia é de aproximadamente 5%, e os principais meios de transmissão dessa região são
por via perinatal, entre crianças (horizontal), entre profissionais da área da saúde e por
agulhas e seringas contaminadas. Na Itália, Rússia e Turquia, a prevalência de infecções
crônicas por HBV é de 3-10%, onde a principal rota de transmissão é pelo uso de agulhas
contaminadas. A América do Sul e a maior parte da América Central são consideradas áreas
de baixa endemicidade, porém, na região da Bacia do Oeste da Amazônia, incluindo Brasil e
Peru, há alta endemicidade, com soroprevalência de HBsAg acima de 10%. Muitos países
desenvolvidos, incluindo os Estados Unidos, estão na categoria de baixa endemicidade
(WHITTLE et al., 1983; KURIEN et al., 2005; IASHINA et al., 1992; ERDEN et al., 2003;
VILLA & SEPE, 1999; BRASIL et al., 2003).

Fig.9: Distribuição geográfica mundial da prevalência de infecção por HBV em adultos. Regiões
mais escuras indicam mais prevalência e regiões mais claras, menor prevalência. Regiões em tons
mais escuros apresentam maior prevalência e as de tons mais claros, menor. (Fonte: CDC:
http://cdc.gov)
 14
2.2.3. O Vírus da Hepatite B e seu material genético
O HBV é um vírus de DNA pertencendo à família Hepadinaviridae, e ao gênero
Orthohepadnavirus e tem como único hospedeiro natural conhecido o homem (SHEPARD
et al., 2006). É envelopado e o menor dentre os hepadnavírus, sendo o único da família a
causar infecção em humanos, e também o menor vírus de DNA que parasita animais
(SENOL et al., 1998).
Seu material genético é disposto sob forma de DNA helicoidal com fita parcialmente
dupla, contendo apenas 3200 nucleotídeos (Fig. 10) (SENOL et al., 1998). Ele apresenta 8
genótipos (A-H) conhecidos (ALCADE et al., 2009).
Segundo Alvarado-Mota (2010), no Brasil, estudos para identificação de genótipos e
subgenótipos de HBV mostram que a variabilidade ocorre na distribuição geográfica do
vírus. Como resultado de indivíduos vindos da Europa e África para o país por muitas
décadas, a população se tornou miscigenada e começou a mostrar um padrão de circulação
diferenciado do encontrado em outros países da América Latina. De acordo com Ribeiro e
colaboradores (2006), a presença dos genótipos A e D sugere influências de descendentes
africanos como resultado do período de escravidão e colonização europeia, respectivamente.
A análise de genomas de vírus causadores de hepatite na população humana
identifica variantes filogenéticas, chamadas de genótipos virais. Os genótipos são
caracterizados pela variação de 8% em nucleotídeos ou mais em todo o comprimento do
genoma do HBV ou 4%, ou mais, dentro do gene S do antígeno de superfície viral (HBsAg)
(KIM et al., 2011). Na verdade, observações biológicas e epidemiológicas sugerem que as
diferenças entre os genótipos de HBV induzem comportamentos clínicos e terapêuticos
diferentes (RAIMONDI et al., 2010).
 15

Fig. 10: Representação do DNA genômico do vírus da hepatite B com destaque para a região
da Pré-S/S (SEEGER & MASON, 2000).

O HBV entra no fígado pela corrente sanguínea e a replicação ocorre apenas no

tecido hepático. O vírus infeccioso intacto mede entre 42 e 47 nm de diâmetro e circulam
pelo sangue em concentrações altas, como 108 vírions por mililitro. O core interior do vírus
contém antígeno do core de hepatite B (HBc), antígeno do envelope do vírus da hepatite B
(HBeAg), uma fita parcialmente dupla de molécula de DNA de 3200 nucleotídeos e uma
DNA polimerase com atividade de transcrição reversa. O antígeno de superfície do HBV
(HBsAg) é encontrado tanto na superfície do vírus e como partícula esférica ou tubular não
infecciosa de automontagem (SHEPARD et al., 2006).
O HBV se diferencia dos outros vírus que infectam animais quanto à produção de
múltiplos tipos de partículas relacionadas a vírus. A partícula de Dane é o vírion infeccioso
do HBV (RACANIELLO, 2001). A replicação viral do DNA desse vírus não procede de
modo convencional de síntese de DNA semiconservativa, mas pela transcrição reversa de
um RNA intermediário (GANEM & SCHNEIDER, 2001).
Segundo Hruska e colaboradores (1977), o DNA do vírion do HBV é circular e
parcialmente duplo de 3,2kb, cuja circularidade é mantida pela extremidade coesiva 5’. Esta
molécula apresenta uma estrutura peculiar, na qual há duas fitas de DNA que não são
perfeitamente simétricas. Além disso, HBsAg e HBcAg são essenciais à estruturação do
vírion.
 16
A região genômica que codifica o HBsAg foi identificada pelo alinhamento entre a
sequencia de DNA traduzida e a sequencia de aminoácidos N-terminal conhecida. Isto
revelou que a ORF (open-reading frame) para esse antígeno é aberta por cerca de 400
nucleotídeos 5’ ao códon de iniciação (AUG), e que a ORF que fica mais acima (pré-S)
pode ser dividida em duas sub-regiões, a pré-S1 e a pré-S2, devido à presença de dois
códons de iniciação dentro do frame. Esta organização de codificação proporcionou uma
explicação para a maioria das poliproteínas já observadas na elaboração do HBsAg
(GANEM & SCHNEIDER, 2001).
Para que ocorra sua replicação (Fig. 11), após ligação com receptores, os vírions
entregam os nucleocapsídeos para o citoplasma da célula hospedeira. Eles então, se
deslocam para o núcleo, onde o DNA genômico viral atinge a forma de cccDNA. O DNA é
então transcrito pela RNA polimerase II do hospedeiro e os RNAs são traduzidos para dar
origem às proteínas P, C, pré-S/S e outros produtos gênicos. RNAs virais pré-genômico são
seletivamente encapsulados dentro de partículas do core no citoplasma, junto com os
produtos do gene P. Dentro desta estrutura, a síntese do DNA viral é iniciada. Após a síntese
da fita negativa e a concomitante degradação do RNA molde, ocorre a síntese da fita de
polaridade positiva. Quando a síntese do DNA viral se completa, os novos cores brotam para
as membranas intracelulares, geralmente o Retículo Endoplasmático (RE) ou o Complexo de
Golgi (CG) para adquirirem seus envelopes glicoproteicos. Então, vírions envelopados são
secretados da célula através da via constitutiva do transporte vesicular (GANEM &
SCHNEIDER, 2001).

Fig.11: Processo de replicação do HBV no interior de um hepatócito (GANEM & PRINCE, 2004).
 17
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
 Associar os genótipos dos vírus da hepatite A e B em pacientes com diferentes
padrões de infecção viral.

3.2. Objetivos específicos

 Determinar os genótipos dos vírus da hepatite A nos casos de infecção aguda e
fulminante.
 Compararar a genotipagem do vírus da hepatite A utilizando duas regiões genômicas
variáveis, a junção VP1/2A e VP1.
 Determinar os genótipos dos vírus da hepatite B nos casos de infecção aguda, crônica
e fulminante.
 18
4. METODOLOGIA
4.1. Aprovação do Comitê de Ética
O estudo foi submetido à apreciação do comitê de ética em pesquisa com seres
humanos (CEP/Fiocruz) como um adendo ao projeto “Avaliação dos aspectos
Imunopatológicos envolvidos em quadros de hepatite aguda com evolução para Falência
Hepática Fulminante” aprovado sob o protocolo 222/03. Todos os indivíduos
participantes do estudo assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido que
formalizou a participação como voluntários consensuais no projeto.

4.2. Recrutamento de pacientes

O estudo retrospectivo compreendeu 11 amostras coletadas desde 2004 de pacientes,
que apresentaram quadro de falência hepática fulminante (FHF) por etiologia viral (HAV
e/ou HBV, n=11), submetidos a transplante hepático no Hospital Federal de Bonsucesso,
Rio de Janeiro.
O estudo prospectivo compreendeu 167 amostras de pacientes com hepatite A e B
agudas, com hepatite B crônica e com FHF por HAV e HBV. Essas amostras foram
coletadas de todos os indivíduos consensuais, rotineiramente acompanhados no ambulatório
de hepatites virais do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), com tais etiologias comprovadas por
sorologia (Vikia HBsAg, Biomerieux, França; Anti-HBc e anti-HBc IgM, Biokit, Espanha;
ETI- HA-IgMK PLUS,DiaSorin, EUA).

4.3. Coleta de amostras

Foram coletadas por punção venosa, 5mL de sangue periférico de cada indivíduo em
tubos tipo vacutainer (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, EUA) para a
obtenção das amostras de soro. Após centrifugação, a 3.500 rpm por 5 minutos, o plasma foi
separado e congelado a -20º C.

4.4. Marcadores sorológicos e dados clínicos

Todas as amostras foram testadas para os marcadores anti-HAV IgM (DiaSorin,
EUA), HBsAg (Biomerieux, França), anti-HBc IgM (BioKit, Espanha), anti-HBc (BioKit,
Espanha), anti-HCV (Dia Sorin, Itália) e anti-HEV (BioKit, Espanha) (prática rotineira no
ambulatório de hepatites virais/IOC), como triagem para exclusão e inclusão de amostras no
estudo. Os casos de coinfecção com outros agentes de etiologia viral foram descartados do
estudo. Os dados clínicos e sorológicos dos pacientes tais como tempo de atividade da
 19
protombina (TAP), alanina transferase (ALT), bilirrubina total e grau de encefalopatia foram
obtidos dos prontuários médicos durante o período de tratamento. Dados
socioepidemiológicos, também, foram coletados dos indivíduos participantes do estudo.

4.5. Detecção do HAV e Amplificação dos Isolados

Foi realizado PCR qualitativo para detecção do material genético viral de HAV.
Foram amplificadas as regiões VP1 (1119 pb), que codifica a proteína estrutural 1, e junção
VP1/2A (243 pb) do vírus da hepatite A, que fica entre as regiões VP1 e 2A (codifica a
proteinase viral 2A pro) , ambas as regiões são utilizadas para a identificação dos genótipos
virais. Para tal, foi necessária a extração do material genético, a transcrição reversa do RNA
para DNA e a amplificação do material genético.

4.5.1. Extração do RNA viral em amostras de soro (Kit Qiamp viral RNA mini,
Qiagen)
Foram adicionados 140 L de cada amostra em tubos de 1,5 mL devidamente
identificados. Posteriormente, foram adicionados 500 L de tampão de lise adicionado do
Carrier de RNA. As amostras foram, então, homogeneizadas e ficaram incubando por 10
minutos a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram brevemente centrifugadas e
560 L de etanol a 96% foram adicionados aos tubos. Foram transferidos, após
homogeneização e centrifugação, 630L desta solução obtida para a coluna do kit e
submetida à centrifugação a 8.000 rpm por 1 minuto a 4ºC. Após a centrifugação, os tubos
coletores da coluna foram descartados e novos tubos, recolocados. O restante da solução
inicial foi adicionado a coluna e os tubos foram, novamente, centrifugados a 8.000 rpm por 1
minuto a 4ºC. Em seguida, foram aplicados 500 L solução de lavagem AW1 a cada coluna
e posteriormente foram centrifugadas a 8.000 rpm por 1 minuto. O mesmo passo foi feito
com o tampão de lavagem AW2 e centrifugada a 14.000 rpm por 3 minutos. As colunas
foram transferidas para um novo tubo de eluição e foram adicionados 60 L de tampão AVE
para eluir o RNA. As colunas foram, então, submetidas à centrifugação a 8.000 rpm por 1
minuto a 4°C. A coluna foi removida e descartada. O RNA foi armazenado a -20°C.

4.5.2. Síntese do DNA complementar (cDNA)

Para cada amostra, foi identificado um tubo de poliestireno de 1,5 mL. Foram
acrescentados a cada tubo: dNTP (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) a 1,25mM
 20
(Invitrogen, CA, EUA), tampão de reação da enzima 10x, Random primers a 20pmol/µL
(Invitrogen, Escócia), RNAsin (inibidor de RNA) a 20U/L (Invitrogen, Escócia), água
DNAase/RNAase free, DTT, enzima SSIII (200 u/L) e 10 L de RNA viral. As amostras
foram incubadas por 1 hora à 37ºC e, em seguida, foram incubadas à 65ºC durante 10
minutos para inativação da enzima. O material foi armazenado a –20ºC.

4.5.3. PCR qualitativo

Para detecção da região VP1/2A e VP1 do HAV, no PCR convencional, foram
utilizados pares de oligonucleotídeos específicos para amplificação do material genético.
Para cada reação foi identificado um tubo de 0,5 mL da respectiva amostra. Para cada
amostra foram adicionados: dNTP (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) (1,25mM-
Invitrogen, CA, EUA), tampão de reação da enzima Taq DNA polimerase 10x (Promega,
WI, EUA), MgCl2 (50 mM, Promega, WI, EUA), primer sense (10pmol/µL Invitrogen,
Escócia), primer anti-sense (10pmol/µL Invitrogen, Escócia), água DNAase/RNAase free,
enzima Taq DNA polimerase (Promega, WI, EUA) e 5 L do cDNA das amostras de HAV.
O protocolo utilizado para a amplificação da região VP1 foi de acordo com o descrito por
Costa-Mattiolli e colaboradores (2002).
A reação foi submetida a variações de temperaturas para amplificação do material
genético. Para as regiões amplificadas foram feitos 2 rounds de PCR (nested-PCR), com
oligonucleotídeos e temperaturas específicas conforme a metodologia descrita por Costa-
Mattioli e colaboradores (2002) para a amplificação da região VP1 e conforme Paula e
colaboradores (2001) para a região VP1/2A.

4.5.4. Eletroforese
Para confirmação da amplificação, foi feito um gel de eletroforese (agarose 1,5%
com 0,5% de brometo de etídio), onde foram aplicados em cada orifício do gel, 8,0 L do
produto da reação de PCR e 2,0 L do tampão da amostra (50% de glicerol, 0,4% de azul
de bromofenol, 0,4% de xileno cianol) e 10 L padrão de peso molecular 100pb (para
VP1/2A) e 1Kb (para VP1)(GIBCO, NI, EUA).
O produto amplificado foi visualizado em luz ultravioleta no transiluminador após
corrida em gel de eletroforese na presença de brometo de etídio para a visualização das
bandas de DNA de 243bp para VP1/2A e 1119bp para VP1. Em seguida, o produto do PCR
foi armazenado à –20ºC.
 21
4.6. Detecção do HBV e Amplificação dos Isolados
Foi realizado PCR qualitativo para detecção do material genético viral de HBV. Foi
amplificada a região Pré-S/S (1200 pb) do vírus da hepatite B, esta região codifica a proteína
small de superfície, e é utilizada para a identificação dos genótipos virais. Para tal, foi
necessária a extração e a amplificação do material genético.

4.6.1. Extração do DNA viral em amostras de soro (Kit l Qiamp DNA mini, Qiagen)
Em cada tubo de 1,5 ml devidamente identificado, foram adicionados 10L de
proteinase K. Posteriormente, foram adicionados 200 L de cada amostra em seu respectivo
tubo. Foram adicionados, então 200L de tampão AL (para lise). As amostras foram, então,
homogeneizadas e ficaram em incubação por 10 minutos a 56ºC. Em seguida, as amostras
foram brevemente centrifugadas e adicionados 200 L de etanol 96% aos tubos. Esta
solução foi transferida, após homogeneização e centrifugação, para a coluna do kit e
submetida à centrifugação a 8.000rpm por 1 minuto a 4ºC. Após a centrifugação, os tubos
coletores da coluna foram descartados e novos tubos foram recolocados. Em seguida, foram
aplicados 500 L solução de lavagem AW1 a cada coluna e posteriormente foram
centrifugadas a 8.000 rpm por 1 minuto. O mesmo passo foi feito com o tampão de lavagem
AW2, mas a centrifugação ocorreu a 14.000 rpm por 3 minutos. As colunas foram
transferidas para um novo tubo de eluição e foram adicionados 200 L de tampão AE para
eluir o DNA. As colunas foram, então, submetidas a centrifugação a 8.000 rpm por 1 minuto
a 4°C. A coluna foi removida e descartada. O DNA foi armazenado a -20°C.

4.6.2 PCR qualitativo (Reação em cadeia da polimerase)

Para detecção da região pré-S/S do HBV, no PCR convencional, foram utilizados
pares de oligonucleotídeos específicos para amplificação do material genético. Para cada
reação foi identificado um tubo de 0,5 mL da respectiva amostra. Para cada amostra foram
adicionados: dNTP (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) (1,25mM- Invitrogen, CA, EUA),
tampão de reação da enzima Taq DNA polimerase 10x (Promega, WI, EUA), MgCl2 (50
mM, Promega, WI, EUA), primer sense (10pmol/µL Invitrogen, Escócia), primer anti-sense
(10pmol/µL Invitrogen, Escócia), água DNAase/RNAase free, enzima Taq DNA
polimerase (Promega, WI, EUA) e 1L do DNA extraído para HBV.

A reação foi submetida a variações de temperaturas para amplificação do material

genético. Foram realizados 2 rounds de PCR (nested-PCR), com oligonucleotídeos e
 22
temperaturas específicas para a amplificação da região Pré-S/S do HBV, conforme
metodologia descrita por Motta-Castro e colaboradores (2005).

4.6.3. Eletroforese
Para confirmação da amplificação, foi feito um gel de eletroforese (agarose 1,5%
com 0,5% de brometo de etídio), onde foram aplicados em cada orifício do gel, 8,0 L do
produto da reação de PCR e 2,0 L do tampão da amostra (50% de glicerol, 0,4% de azul
de bromofenol, 0,4% de xileno cianol) e 10 L padrão de peso molecular 1Kb (GIBCO, NI,
EUA).
O produto amplificado foi visualizado em luz ultravioleta no transiluminador após
corrida em gel de eletroforese na presença de brometo de etídio para a visualização das
bandas de DNA de 1200bp para Pré-S/S. Em seguida, o produto do PCR foi armazenado à –
20ºC.

4.7. Sequenciamento de DNA

Os amplicons com um tamanho esperado de 243 pb para o VP1/2A do HAV, 1119
pb da VP1 do HAV e 1200 pb para Pré-S/S do HBV foram purificados utilizando o kit
QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções
do fabricante.
O sequenciamento direto dos nucleotídeos foi realizado em ambas as direções (senso
e antissenso) com oligonucleotídeos a 3,2 pmol/ul utilizando o kit BigDye terminator 3.1
cycle sequencing no sequenciador Gen Amp PCR system 9700 pela Plataforma de
Sequenciamento PDTIS, Fiocruz (Fundação Oswaldo Cruz). Os produtos do
sequenciamento foram analisados no programa BioEdit e MEGA 5.1. As sequências
nucleotídicas foram também comparadas a outras sequências depositadas no GenBank.

4.8. Construção de Dendograma

A construção do Dendograma para determinação dos genótipos virais foi realizada
com a utilização do software MEGA 5.1, no qual foi realizado Model Test, que determinou
o parâmetro de construção a ser seguido. As amostras foram avaliadas pelo modelo de
reconstrução de Máxima Verossimilhança com correção de TN93+I+G (modelo Tamura
Ney 1993 com distribuição gama incorporando sítios invariáveis).
 23
5. RESULTADOS
Neste estudo 167 amostras foram analisadas. A tabela 1 mostra a relação a
distribuição das amostras e o quadro clínico dos pacientes com Hepatite A e B.

Tabela 1: Relação entre amostras coletadas e genotipagem realizada para cada quadro de hepatite A e
B.
Pacientes N
Hepatite A aguda 113
Hepatite A fulminante 7
Hepatite B aguda 17
Hepatite B crônica 26
Hepatite B fulminante 4
Total 167

5.1. HAV
Abaixo, a tabela de comparação entre as amostras de HAV amplificadas para as
regiões VP1/2A e VP1. Ao todo, 66 amostras foram genotipadas com sucesso para a região
VP1/2A do HAV e 11 para a região VP1.

Tabela 2: Amostras amplificadas para região VP1 e VP1/2A do HAV. 84 amostras foram
amplificadas apenas para a região VP1/2A e 19 foram amplificadas para a região VP1.

VP1/2A + VP1/2A - Total

VP1 + 19 0 19

VP1- 65 31 96

Total 84 31 115

Para confirmar essa amplificação do HAV, eletroforese foi realizada. A seguir,

imagens 10 e 11 mostram exemplos de bandas amplificadas para região VP1/2A e VP1,
respectivamente.
 24

Figuras 12 e 13: Gel de agarose mostrando bandas amplificadas de HAV para região VP1/2A, com
peso molecular de 500 pb, amostras (bandas não assinaladas), controles negativo (CN) e positivo
(CP) (12). Gel de agarose mostrando bandas amplificadas de HAV para região VP1, com peso
molecular de 1 kb, amostras (bandas não assinaladas), controles negativo (CN) e positivo (CP) (13).

As amostras amplificadas passaram por sequenciamento para a determinação do

genótipo do vírus presente em cada amostra. Dendograma foi construído a partir das
sequências obtidas das amostras amplificadas para as regiões VP1/2A (Fig. 14) e VP1 (Fig.
15).
 25

IA

IB

Figura 14: Dendograma construído a partir das amostras de HAV amplificadas para a região VP1/2A
com 243 pb. Os genótipos 1A e 1B foram detectados. Em azul, as amostras de genótipo IA, em verde
as de genótipo IB, em preto, amostra de genótipo I e subgenótipo não definido. As amostras
fulminantes estão destacadas em vermelho.
 26

IA

Figura 15: Dendograma construído a partir das amostras de HAV amplificadas para a região VP1
com 1119 pb. O genótipo 1A foi detectado, concordando com as amostras que amplificaram também
para a região VP1/2A. Em azul, as amostras de genótipo IA encontradas. Estas amostras também
foram genotipadas para a região VP1/2A, havendo concordância entre os genótipos encontrados.

A partir dos genótipos de HAV obtidos, pode ser realizada a comparação entre os
genótipos das amostras e o quadro clínico dos pacientes para determinar se há relação entre
eles.
 27
Tabela 3: Relação entre os quadros clínicos dos pacientes infectados com hepatite A e os genótipos
detectados.
Tipos de amostras/ Genótipos 1A 1B Total

Hepatite A Aguda 54 (82%) 8 (12%) 62 (94%)

Hepatite A Fulminante 4 (6%) 0 (0%) 4 (6%)

Total 58 (88%) 8 (12%) 66 (100%)

5.2. HBV
Em relação às amostras de HBV, houve a amplificação da região Pré-S/S. 47
amostras coletadas, entre elas, 20 foram testadas para a região Pré-S/S. Ocorreu a
amplificação de 17 destas amostras e a genotipagem de 6 amostras de HBV com sucesso,
como pode ser observado na tabela 4.

Tabela 4: Relação entre número de amostras coletadas, amplificadas, sequenciadas e genotipadas de

HBV.
Amostras N

Coletadas 47

Amplificadas 20

Sequenciadas 17

Genotipadas 6

Para confirmar essa amplificação do HBV, eletroforese foi realizada. A seguir, a

imagens 16 e 17 mostram exemplos de bandas amplificadas para região Pré-S/S.
 28

Figuras 16 e 17: Géis de agarose mostrando bandas amplificadas de HBV para região Pré-S/S, com
peso molecular de 1 kb, amostras (bandas não assinaladas), controles negativo (CN) e positivo (CP) .

As amostras amplificadas passaram por sequenciamento para a determinação do

genótipo do vírus presente em cada amostra. Dendograma foi construído a partir das
sequências obtidas das amostras amplificadas para a regiões Pré-S/S. Dentre as amostras
amplificadas, 6 obtiveram seu genótipo definido, como pode ser observado abaixo na
Dendograma construído a partir destas amostras (Fig. 18).
 29

A2

D2
D3

Figura 18: Dendograma construído a partir das amostras de HBV amplificadas para a região Pré-S/S
com 1200 pb. Os genótipos A2, D2 e D3 foram detectados. Em roxo, as amostras de genótipo A2,
em verde a amostra de genótipo D2 e em azul, a amostra de genótipo D3.

A partir dos genótipos de HBV obtidos, a comparação entre os genótipos das

amostras e o quadro clínico dos pacientes pode ser realizada, conforme mostra a tabela 5.
 30
Tabela 5: Relação entre os quadros clínicos dos pacientes infectados pelo vírus da Hepatite B e os
genótipos detectados.

Tipos de amostras/ Genótipos A2 D2 D3 Total

Hepatite B Aguda 4 (67%) 1(16,5%) 1(16,5%) 6 (100%)

Hepatite B Crônica 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Hepatite B Fulminante 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Total 4 (67%) 1(16,5%) 1(16,5%) 6 (100%)

 31
6. DISCUSSÕES

As doenças transmissíveis endêmico-epidêmicas constituem um problema de saúde

pública no Brasil. Entre essas doenças, podem ser destacadas as Hepatites Virais, cujo
comportamento tem sofrido grandes mudanças nos últimos anos, não só no Brasil, mas
também no mundo (DONALÍSIO, 2002). A América Latina e o Brasil apresentam
endemicidade intermediária de hepatites virais com variações de região para região (EL
KHOURYA et al., 2012).
A hepatite A ainda é uma causa de infecção de maior importância no mundo (KIM &
LEE, 2010).
A infecção pelo Vírus da Hepatite A (HAV) é geralmente autolimitante e pode
produzir uma larga gama de efeitos, desde hepatite assintomática à morte por hepatite
fulminante (HADLER et al., 1980).
Os genótipos I e III os mais prevalentes em humanos, segundo BROWN e
colaboradores (1989), enquanto no presente estudo, houve prevalência do genótipo IA sobre
o genótipo IB, e nenhuma amostra do genótipo III foi encontrada.
Neste estudo, tanto os casos agudos quanto os casos fulminantes de hepatite A foram
causados pelo mesmo genótipo, o genótipo I. Entre as amostras genotipadas, todos os casos
fulminantes foram causados pelo genótipo IA do vírus, assim como a maioria dos casos
agudos, mostrando maior prevalência deste genótipo. Conforme estudos anteriores que
também relatam a cocirculação dos genótipos IA e IB no Rio de Janeiro (PAULA et al.,
2002) (AMADO et al., 2011) (SANTOS et al., 2008) (VILLAR et al., 2006). Não foram
encontradas amostras de caso fulminante causadas pelo genótipo IB, sendo todos os casos de
falência hepática fulminante (FHF) por HAV causados pelo genótipo IA do vírus, o que
pode ter ocorrido devido ao baixo número de amostras genotipadas.
Fujiwara e seus colaboradores, em 2003, utilizaram a região VP1/2A apenas para a
determinação dos genótipos do vírus da hepatite A e sua associação com o quadro clínico da
doença. Das 47 amostras estudadas, 44 apresentaram o genótipo IA, 2 apresentaram o
subgenótipo IB e 1 apresentou o subgenótipo IIIA. Assim como o presente estudo, não
foram encontradas evidências de que exista essa relação entre os genótipos virais de HAV e
o desenvolvimento da doença.
Nos estudos de Santos et al. (2009), todos os casos de hepatite A fulminante também
foram associados ao genótipo IA, de acordo com o autor, em áreas de maior prevalência do
genótipo IA, ele é o responsável por quadros tanto agudo quanto fulminantes.
 32
Além disso, no estudo em questão, foram analisadas 66 amostras sequenciadas com
sucesso para a junção VP1/2A e apenas 11 para a região VP1. Assim, é posssível observar
que somente a região VP1/2A pode ser utilizada para a determinação do genótipo viral.
Mesmo com menor número de pares de base, a junção VP1/2A é uma região de mais fácil
ser amplificação e sequenciamento do que a VP1, que contém um número bem maior de
pares de bases. Paula et al. (2002), Villar et al. (2006), Santos et al. (2008), Santos et al.
(2009), Amado et al. (2011) e Hussain et al. (2011) utilizaram apenas da região VP1/2A
para a determinação de genótipos de HAV em seus estudos e obtiveram sucesso.
O Vírus da Hepatite B (HBV) tem alta prevalência em todo o mundo, com cerca de
400 milhões de indivíduos apresentando infecção crônica por HBV, representando 5% da
população mundial, com mais de meio milhão de mortes por ano devido a cirrose hepática e
carcinoma hepatocelular, consequentes dessa infecção crônica (TIBBS & SMITH, 2001)
(HUANG & LOK, 2011).
O genótipo A é sempre detectado em estudos brasileiro, sendo predominantemente
associado ao genótipo D (REZENDE et al., 2005), porém, também pode ser encontrado
associado ao genótipo F (CASTRO et al., 2001). Nos estudos de Mello e seus colaboradores
(2007), foi relatada a cocirculação dos genótipos A, D e F, com prevalência do genótipo A
entre as amostras, mostrando que a prevalência do genótipo D pode ocorrer em apenas
algumas regiões do Brasil. Além disso, Mello descreve também que no Sudeste, há maior
prevalência do genótipo A, corroborado pelo estudo em questão.
De acordo com Mayerat e colaboradores (1999), haveria associação entre o genótipo
D e a infecção aguda e o genótipo A e a infecção crônica por HBV, conforme dados obtidos
em um estudo com 65 pacientes na Suíça.
Kao e seus colaboradores (2000), em um estudo realizado em Taiwan, sugeriram que
o genótipo C do HBV estaria relacionado a quadros mais graves da doença e que o genótipo
D estaria associado ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. Outros estudos
realizados na Ásia por Lindh et al. (1999), Chu et al. (2002),Kobayashi et al. (2002) e outros
autores, também demonstraram esta relação entre o genótipo C e quadros clínicos mais
graves da infecção por HBV.
Fung e Lok (2004) sugerem que há evidência crescente de que exista correlação entre
o genótipo do HBV e o quadro crônico da doença e a resposta ao tratamento com Interferon.
O motivo exato dessas associações não é claro, mas é possível que diferentes genótipos
apresentem diferentes alterações no processo de replicação e expressão de epítopos imunes.
 33
Garfein e colaboradores (2004) sugerem que a associação do genótipo D com o
quadro fulminante da infecção por HBV, em um estudo de surto de hepatite B com 21
pacientes, em que 10 deles apresentaram FHF. Dessas 10 amostras de HBV com FHF, 7
foram genotipadas e todas apresentaram o mesmo genótipo D, porém afirmam a necessidade
de mais estudos para fortalecer esta teoria, uma vez que dados apontaram que os pacientes
tiveram a mesma fonte de infecção.
Nabuco e colaboradores (2012) analisaram amostras de pacientes da cidade do Rio
de Janeiro. Estes pacientes não passaram por tratamento e observada inflamação hepática
mais leve em pacientes infectados pelo genótipo D.
Santos e colaboradores (2009) encontraram os genótipos A e D como responsáveis
por causar FHF em pacientes infectados com o HBV. Como estes genótipos são os mais
encontrados no Brasil e também os maiores causadores do quadro agudo da infecção, Santos
sugere que eles tenham causado os casos fulminantes devido a sua alta prevalência no país.
Em divergência do presente estudo, Santos encontrou maior prevalência do genótipo D entre
suas amostras em relação ao genótipo A.
Em relação a influência dos genótipos de HBV na resposta ao tratamento, segundo os
estudos de Lin e Kao (2007), os genótipos de HBV não interferem no tratamento com
Análogos de Nucleotídeos mas influenciam a resposta ao tratamento com IFN, sugerindo
que a utilização de terapias baseadas em IFN para infecções pelo genótipo A teriam maior
eficiência que quando utilizadas para combater infecção pelo genótipo D.
Zhang e colaboradores (1996) também sugerem essa influência dos genótipos na
resposta ao tratamento com IFN, confirmando que essas terapias tem maior eficiência
quando utilizadas contra infecção pelo genótipo A e menor eficiência quando utilizados
contra os genótipos D e E de HBV.
Devido ao baixo número de amostras obtido até o momento, com genótipo definido,
apenas 6 amostras, não é possível definir a relação entre os genótipos virais de HBV com a
severidade e evolução da doença, uma vez que apenas amostras de casos agudos foram
genotipadas.
Assim, neste estudo, a associação entre os genótipos dos vírus das hepatites A e B e
os padrões clínicos de infecção dos pacientes não foi determinada. Quanto aos genótipos de
HAV, é possível que, em áreas de alta prevalência do genótipo IA ou em que haja apenas
genótipo I circulante, este seja responsável tanto pelos casos agudos quanto fulminantes.
Entre as amostras, esta relação não foi observada com amostras agudas e fulminantes sendo
causadas pelos mesmos genótipos de HAV. Quanto à HBV, devido ao baixo número de
 34
amostras genotipadas, não foi possível determinar a relação entre genótipo e severidade da
infecção por HBV. Desse modo, mais estudos são necessários com um número maior de
amostras. Além disso, a partir desta pesquisa, foi possível concluir que tanto a região VP1
quanto a região VP1/2A podem ser utilizadas para a determinação de genótipos de HAV,
embora a utilização da região VP1/2A seja mais indicada pela facilidade de sua amplificação
e sequenciamento em relação a região VP1.
O presente trabalho é um estudo preliminar, desta forma, como não foram
observadas as associações entre genótipos dos vírus das hepatites A e B, é possível que haja
relação entre os fatores do hospedeiro e a gravidade das infecções.
 35
7. CONCLUSÕES
 Para as amostras genotipadas de HAV, os genótipos IA e IB foram encontrados para
58 e 8 amostras, respectivamente.

 Para as amostras genotipadas de HBV, os genótipos A2 (amostras) D2 (1 amostras) e

D3 (1 amostra).

 Para as amostras genotipadas de HAV do genótipo IA, 51 eram provenientes de

pacientes em quadro agudo, 3 de pacientes em quadro agudo grave e 4 amostras
provenientes de pacientes em quadro de FHF por HAV.

 Não foi encontrada associação entre os genótipos dos vírus das hepatites A e B e o
padrões de infecção viral entre as amostras estudadas.
 36
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9- Anexos:
9.1. Anexo 1: Aprovação do Comitê de Ética.
 44

9.2. Anexo 2: Termo de consentimento livre e esclarecido.