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Biologia Comptes Rendus

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Biologia e patologia vegetal/Biologie et pathologie ve´ge´tales

Diversidade genética do patógeno da murcha bacteriana Ralstonia

solanacearum usando um marcador RAPD
Sayeda Nishat a , Islam Hamim a , b M. Ibrahim Khalil , Md. Ayub Ali
a
,
Muhammed Ali Hossain a a
, M. Bahadur Meah , Md. Rashidul Islam a, *
aDepartamento de Patologia Vegetal, Universidade Agrícola de Bangladesh, Mymensingh 2202, Bangladesh
b
Divisão de Patologia Vegetal, Instituto de Agricultura Nuclear de Bangladesh, Mymensingh, Bangladesh

ARTIGOINFO ABSTRATO

Historia do artigo: A murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum é uma doença destrutiva de muitas espécies
Recebido em 9 de abril de 2015 de culturas economicamente importantes. Uma variação significativa na incidência e severidade da
Aceito após revisão em 9 de junho de 2015 murcha em berinjela e batata foi observada entre as áreas de cultivo pesquisadas. Isolados de R.
Disponível online em 21 de agosto de 2015
solanacearum obtidos tanto de berinjela quanto de batata pertencem ao biovar III, enquanto isolados
de berinjela pertencem à raça 1 e isolados obtidos de batata pertencem à raça 3. A técnica de DNA
Palavras-chave: polimórfico amplificado ao acaso (RAPD) foi usada como ferramenta para avaliar a variação genética
Diversidade genética e relação entre sete grupos de isolados de R. solanacearum a saber, RsB-1, RsB 2, RsB-3, RsP-1,
murcha bacteriana
RsP-2, RsP-3 e RsP-4, totalizando 28 isolados. Dos marcadores RAPD utilizados, a amplificação com
R. solanacearum
primers de quatro decâmeros produziu 70 bandas com tamanhos variando de 100 a 1400 pb. Das 70
RAPD
bandas, 68 bandas (97,06%) eram polimórficas e duas bandas (2,94%) eram monomórficas entre o
grupo de sete isolados de R. solanacearum. O dendrograma do método de médias aritméticas não
ponderadas (UPGMA) construído a partir da distância genética de Nei produziu dois agrupamentos
principais dos sete isolados de R. solanacearum. Os isolados RsB-1, RsB-2, RsB-3 e R-4 agruparam-
se no cluster y, enquanto RsP 2, RsP-3 e RsP-4 agruparam-se no cluster yy. O maior índice de
similaridade intravariedade (Si) foi encontrado no isolado RsB-1 (86,35%) e o menor no RsP-2
(56,59%). Os resultados indicaram que níveis relativamente mais altos e mais baixos de variação
genética foram encontrados em RsP-3 e RsB-3, respectivamente. O coeficiente de diferenciação
gênica (Gst) foi de 0,5487, refletindo a existência de um alto nível de variações genéticas entre sete
isolados de R. solanacearum. Distância genética comparativamente maior (0,4293) e menor identidade
genética (0,6510) foram observadas entre as combinações RsB-2 e RsP-4. A menor distância genética
(0,0357) e a maior identidade genética (0,9650) foram encontradas no par RsB-1 vs. RsB-2. Assim, o
RAPD oferece um método potencialmente simples, rápido e confiável para avaliar a análise da
diversidade genética em R. solanacearum.
2015 Académie des Sciences. Publicado por Elsevier Masson SAS. Todos os direitos reservados.

1. Introdução e regiões subtropicais e temperadas do mundo [1,2]. Os patógenos do

solo colonizam o xilema, causando murcha bacteriana em uma ampla
Ralstonia solanacearum é um importante patógeno bacteriano variedade de plantas em potencial [3]. O patógeno tem uma extensa
distribuído em todo o mundo e causador da murcha de plantas gama de hospedeiros, incluindo centenas de espécies de plantas em 50
economicamente importantes, principalmente solanáceas em regiões tropicais. famílias [4]. R. solanacearum pode hibernar em restos de plantas ou
plantas doentes, hospedeiros silvestres, sementes ou órgãos de
propagação vegetativa como tubérculos [5]. As bactérias podem
* sobreviver por muito tempo na água (até 40 anos a 20–25 8C em água
Autor correspondente.
Endereço de e-mail: rasha740177@yahoo.com (MR Islã). pura) e a população bacteriana é

http://dx.doi.org/10.1016/j.crvi.2015.06.009 1631-0691/ 2015

Acade´mie des sciences. Publicado por Elsevier Masson SAS. Todos os direitos reservados.
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758 S. Nishat et ai. / CR Biologies 338 (2015) 757–767
reduzida em condições extremas (temperatura, pH, sais, etc.).
Também pode sobreviver em clima frio e entrar em um estado em
que são viáveis, mas não cultiváveis [6]. R. solanacearum foi
classificado em cinco raças com base nas diferenças na variedade
de hospedeiros [6,7,8] e seis biovares de acordo com sua
capacidade de hexose oxidase versus três álcoois e três
dissacarídeos [2,7,9,10]. Ao contrário de outras bactérias
fitopatogênicas, os sistemas raciais de R. solanacearum não são
baseados em interações gene a gene. Em vez disso, estes são
determinados com base na patogenicidade de cada isolado em diferentes no
Embora a identificação baseada em testes bioquímicos tenha
se mostrado útil e ainda seja aceita como padrão, é trabalhosa e
demorada [2,10]. Para melhorar a compreensão do parentesco
genético entre os complexos de espécies de R. solanacearum, a
análise baseada em DNA tem sido usada nos últimos anos.
Técnicas moleculares, como polimorfismos de comprimento de
fragmento de restrição (RFLP), polimorfismos de comprimento de
fragmento amplificado (AFLP) [12,13] e também DNA polimórfico
amplificado aleatoriamente (RAPD) [4,14,15] foram aplicadas
extensivamente para a diversidade de genótipos análise em cepas
de R. solanacearum. Marcadores RAPD podem ser detectados
pela amplificação aleatória de fragmentos de DNA genômico de
diferentes tamanhos através da reação em cadeia da polimerase
[16]. A técnica RAPD é fácil e confiável e requer pequena
quantidade de DNA (5–20 ng), primers curtos únicos de sequência
arbitrária, a rapidez na triagem de polimorfismos, a eficiência para potencialidade do RAPD como um marcador para analisar a
gerar um grande número de marcadores para mapeamento
genômico e a automação potencial do técnica. Além disso, nenhum
conhecimento prévio da sequência é necessário [17] e é um
método relativamente simples e barato para examinar variações
no genoma total [18]. Embora RAPD tenha algumas limitações,
está sendo usado como uma das técnicas mais poderosas para
estudos genéticos, por exemplo, análise de variação genética em
plantas, fungos e bactérias [19] e construção dos primeiros mapas
de ligação para certas espécies e patógenos [3]. Métodos RAPD
têm sido usados com sucesso para análise de variabilidade
genética [4,14,15].
Produtores de hortaliças de diferentes regiões de Bangladesh
têm se comunicado com a Clínica de Doenças de Plantas,
Departamento de Patologia de Plantas, Universidade Agrícola de
Bangladesh, Mymensingh, para diagnóstico de problemas de
murcha em tomate, batata, berinjela e algumas outras hortaliças e
buscam conselhos para um baixo custo , estratégia de gestão
eficaz e ecológica. A principal estratégia de controle tem sido o uso agricultores para cada área de cultivo foram pesquisados para
de variedades resistentes. No entanto, a estabilidade da resistência registrar a incidência e a severidade da murcha bacteriana. Para
à murcha bacteriana em berinjela, batata e tomate é altamente
afetada pela densidade de patógenos, cepas de patógenos e vários
fatores do solo. Diferentes organizações de pesquisa em
Bangladesh e AVRDC têm trabalhado no desenvolvimento de
variedades resistentes à murcha bacteriana, mas ainda existem
apenas algumas variedades que mostram resistência estável. O
uso de cultivares comerciais susceptíveis à murcha bacteriana
enxertadas em porta-enxertos resistentes à murcha bacteriana
demonstrou ser uma ferramenta de manejo eficaz nas Filipinas e
em Bangladesh [20,21]. No entanto, a enxertia não está ganhando
popularidade no nível do agricultor devido ao alto custo das mudas
enxertadas e nenhum outro benefício de rendimento em relação às
mudas não enxertadas, conforme demonstrado por vários estudos
conduzidos pela AVRDC. Outros métodos de controle, como
correções do solo, rotação de culturas, controle biológico e
saneamento muitas vezes não são eficazes. Como nenhum método
de controle único fornecerá um controle bom e sustentável da
doença, a integração de diferentes métodos de manejo da doença
é obrigatória. Uma caracterização bioquímica recente de isolados
de R. solanacearum causadores de murcha em berinjela e batata
em Bangladesh foi relatada por nosso grupo [22].
Embora a capacidade de prever as propriedades biológicas,
ecológicas e epidemiológicas de cepas de R. solanacearum usando
um sistema de classificação taxonômica significativo possa ajudar
tipos
desenvolvimento
de plantas hospedeiras.
de práticas de manejo bem-sucedidas, é claro
que uma melhor compreensão da estrutura populacional desse
patógeno altamente diverso é necessária para desenvolver
cultivares de berinjela e batata resistentes/tolerantes por meio do
programa de triagem. Apesar da necessidade da correta avaliação
da diversidade genética da população de campo desta bactéria
para traçar um protocolo de diagnóstico eficaz e implantar cultivares
resistentes, no entanto, muito pouco se sabe sobre a extensão da
diversidade genotípica que pode existir em uma população
localizada dessa bactéria no país. Marcadores RAPD foram usados
porque eles têm o potencial de detectar polimorfismo em todo o
genoma em comparação com outras técnicas [23]. Marcadores
RAPD têm sido usados para diferenciação de linhagens [24],
identificação e outras análises genéticas para vários gêneros
bacterianos durante as últimas duas décadas [23,25-28]. Em
conjunto, o presente estudo foi realizado para avaliar a
diversidade de R. solanacearum coletadas em alguns campos de
algumas localidades selecionadas.
2. Materiais e métodos
2.1. Pesquisa e coleta de amostras
Uma pesquisa foi realizada para conhecer a situação da murcha
bacteriana em Bangladesh em termos de sua incidência e
severidade, bem como para coletar os isolados do patógeno da
murcha bacteriana, R. solanacearum. Sete grandes áreas de
cultivo, viz. Pan chagarh, Rangpur, Pabna, Jessore, Jhinaidah,
Jamalpur e Mymensingh, para berinjela, e oito grandes áreas de
cultivo, viz. Jamalpur, Munshigonj, Panchagarh, Bogra, Jessore,
Chandpur e Nilphamari, para batata, foram selecionados para a
pesquisa. Pelo menos três locais em cada área e cinco campos de
um rápido diagnóstico de campo da murcha da berinjela causada
pela bactéria R. solanacearum e para distinguir a murcha bacteriana
da murcha vascular causada por patógeno fúngico e nematóide, a
transmissão bacteriana de material vegetal infectado foi realizada
e confirmada pela transmissão de massas brancas leitosas de
células bacterianas (vaso ). Pelo menos 10 amostras de plantas
doentes foram coletadas de cada uma das áreas pesquisadas e
levadas ao laboratório para o isolamento de diferentes grupos de
isolados de R. solanacearum.
2.2. Avaliação da incidência e gravidade da doença
O status da murcha bacteriana da berinjela foi avaliado com
base na incidência e severidade da murcha. Os dados sobre a
incidência de murcha foram registrados em pelo menos três locais de
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cinco campos agrícolas para cada área de cultivo. Em seguida, a
porcentagem de incidência de murcha foi calculada usando a seguinte fórmula: foram identificadas em meio de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC)
Número de plantas murchas em cada campo
%Wiltincidence ¼
Número total de plantas em cada campo
100
Cinco plantas foram selecionadas aleatoriamente de cada campo do
agricultor em cada local para calcular a severidade da murcha em cada
área de cultivo. A severidade da murcha bacteriana foi registrada com
base na escala de severidade descrita anteriormente por Horita e
Tsuchiya [29]. Resumidamente, 1 = sem sintoma, 2 = folhas novas
superiores murchas, 3 = duas folhas murchas, 4 = quatro ou mais folhas
murchas e 5 = morte da planta.
2.3. Isolamento, identificação e purificação de R.
solanacearum
O isolamento, identificação e purificação de R. solanacearum foram
feitos conforme descrito anteriormente por Rahman et al. [22] e Ahmed
et al. [1]. Resumidamente, exsudados bacterianos saindo da extremidade
cortada de cada amostra foram semeados em Nutrient Agar (NA). As
placas foram então incubadas a 28 8C por pelo menos 24 h. Após o
isolamento, os isolados de R. solanacearum foram purificados semeando
uma única colônia de cada isolado em meio de cloreto de trifenil tetrazólio
(TTC ou TZC), conforme descrito por [ 18]. Para confirmar os isolados
de R. solanacearum, o teste de patogenicidade foi realizado em mudas
com um mês de idade dos respectivos hospedeiros pelo método de
inoculação no solo. Para o teste de patogenicidade, foi selecionada uma
única colônia de R. solanacearum apresentando-se virulenta, fluida,
irregular e branca cremosa com rosa no centro. A suspensão bacteriana
(aproximadamente 108 UFC/mL) de cada isolado representando um
grupo foi injetada nas folhas de plantas de tabaco com idade entre 30 e
40 dias. As suspensões bacterianas foram injetadas no espaço
intracelular da folha com uma seringa hipodérmica. Uma reação de
hipersensibilidade (HR) foi observada diariamente e continuou até 5 dias
da infiltração. Os isolados de R. solanacearum foram preservados em
leite desnatado 10% mantido em geladeira a 20 8C para posteriores
estudos bioquímicos.
2.4. Caracterização bioquímica de R. solanacearum
As virulentas (colônias com coloração rosa ou vermelho claro ou
característico centro vermelho e margem esbranquiçada) e avirulentas
tabela 1
Status da murcha bacteriana da berinjela e da batata em termos de incidência e severidade em algumas áreas de cultivo selecionadas em Bangladesh.
Áreas Levantadas Incidência (%)
Beringela
Panchagarh 20.00a
Cravo 22.52a
Jessore 20.56a
14.36b
Mymensingh
LSD 2.927
a b
Nível de significância
a
Significância ao nível de 5% de probabilidade.
b
Dados de gravidade registrados no momento da pesquisa.
759
(colônias menores, esbranquiçadas e não fluidas) de R. solanacearum
contendo 0,005% de TTC [29]. Vários testes bioquímicos, viz. Reação
de coloração de Gram, teste de solubilidade do hidróxido de potássio,
teste da oxidase de Kovac, teste de Levan e teste de fermentação de
açúcar foram realizados para confirmação dos isolados de R.
solanacearum. Um único isolado de R. solanacearum de cada grupo foi
selecionado aleatoriamente para testes bioquímicos.
2.5. Determinação de biovares e raças de R. solanacearum
Os sete grupos isolados de R. solanacearum foram diferenciados
em biovares com base em sua capacidade de utilizar dissacarídeos
(sacarose, lactose e maltose) e álcoois de açúcar (manitol, sorbitol e
dulcitol) conforme descrito anteriormente por Hayward [2] e He et al . [8].
As biovares foram determinadas em meio mineral (NH4H2PO4 1,0 g,
KCl 0,2 g, MgSO47H2O 0,2 g, Difco Bacto Peptone 1,0 g, ágar 3,0 g e
azul de bromotimol 80,0 mg por litro) contendo 1% de açúcar. Cerca de
200 mL do meio fundido são dispensados nos poços de uma placa de
microtitulação. Os inóculos para cada grupo de isolados foram
preparados adicionando várias alças de bactérias de culturas de 24
horas de idade a água destilada para fazer uma
suspensão contendo cerca de 108 UFC/mL. Em seguida, 20mL da
suspensão bacteriana foram adicionados aos poços da placa de
microtitulação incubada a 28 8C. Os tubos foram então examinados 3
dias após a inoculação para mudança no pH por uma mudança de cor
[30].
As raças dos grupos isolados de R. solanacearum foram identificadas
por teste de patogenicidade em ampla gama de hospedeiros [31]. Mudas
de tomate e pimentão foram cultivadas em bandeja e mudas com 1 mês
de idade (tomate e pimentão) foram inoculadas pelo método de
inoculação no solo. As plantas incubadas foram então mantidas no
galpão-rede até o desenvolvimento dos sintomas. Sete grupos isolados
de R. solanacearum foram coletados de berinjela murcha e plantas de
batata de diferentes locais em Bangladesh (Tabela 1). Para a identificação
dos isolados bacterianos de R. solanacearum, foi realizada uma série
de testes bioquímicos, como coloração de Gram, teste de solubilidade
do hidróxido de potássio, teste da oxidase de Kovac e teste de Levan.
Os isolados foram purificados em meio de cloreto de tetrazólio (TTC)
segundo Kelman [32] e preservados a 20 8C em geladeira em leite
desnatado 10% para estudos posteriores [27]. Finalmente, três grupos
isolados, viz.
RsB-1, RsB-2 e RsB-3 de berinjela e quatro grupos isolados, viz. RsP-1,
RsP-2, RsP-3 e RsP-4 da batata
Gravidade Áreas pesquisadas Incidência (%) Gravidade
(escala de 1 a 5) (escala de 1 a 5)
Batata
3,00 Munshigonj 22.65a 3,80
3,26 Nilphamari 19.98b 3,00
2,93 Jamalpur 9.07c 2,90
3,13 – – –
LSD 1.371
Nível de significância
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plantas foram selecionadas para análise da diversidade genética de R.
solanacearum. O experimento foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia
do Instituto de Agricultura Nuclear de Bangladesh, Mymensingh, Bangladesh.
2.6. Extração e quantificação de DNA genômico
A extração do DNA genômico de cada isolado de R. solanacearum foi
feita de acordo com Chen e Kuo [29]. A concentração de DNA nas amostras
extraídas foi quantificada através da leitura de absorbância usando um
Espectrofotômetro UV a 260 nm. A qualidade do DNA foi verificada por
eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TBE (ácido trisbórico–EDTA).
2.8. Pontuação e análise de dados
A predominância de marcadores RAPD indica que cada banda
representava o fenótipo em um único locus alélico [33]. As bandas amplificadas
foram pontuadas visualmente como presentes (1) e ausentes (0)
separadamente para cada indivíduo e cada iniciador. As pontuações obtidas
foram agrupadas para criar uma única matriz de dados. Os dados calculados
foram usados para estimar loci polimórficos, Nei [34] diversidade genética,
distância genética e um dendrograma UPGMA (Unweighted Pair Group
Method with Arithmetic Means) usando um programa baseado em computador,
POPGENE (versão 1.31) [34,35].

3. Resultados

2.7. Amplificação por PCR e eletroforese
As reações RAPD foram realizadas seguindo o processo de Williams et
al. [16] com algumas modificações [16]. A triagem do primer foi feita com 15
primers decâmeros arbitrários (Bengalore Genei, Índia). Quatro primers
produzindo boas bandas pontuais e reprodutíveis foram selecionados para
análise RAPD subsequente de isolados bacterianos (Tabela 2).
As reações de PCR foram feitas em uma mistura de reação de 10,0 mL
contendo 1 X tampão de PCR (10 mM de tris HCl, pH 8,5; 50 mM de KCl e
15 mM de MgCl2), 10 mM cada de dNTP (Bengalore Genei, Índia), 5 pmol de
primer, 2 U de Taq DNA polimerase (Bengalore Genei), 100 ng de DNA
genômico. A amplificação do DNA foi realizada em termociclador de DNA
(Biometra, Alemanha) no seguinte perfil térmico: desnaturação inicial por 3
min a 94 8C, seguida de 41 ciclos de desnaturação de 1 min a 94 8C,
anelamento de 1 min a 37 8C e extensão a 72 8C por 2 min. Uma etapa final
de extensão a 72 8C por 10 min foi permitida para extensão completa de
todos os fragmentos amplificados. Fragmentos amplificados foram separados
em gel de agarose 1,5% (Invitrogen, Canadá) em tampão 1 X TBE junto com
marcador de peso de DNA de 20 pb (Bengalore Genei, Índia) por 90 min a
100 V. O gel foi corado com brometo de etídio (Fisher Scientific ) (0,1 mgmL1 )
por 15 min em agitador.
Finalmente, o gel foi visualizado sob transiluminador UV e fotografado pelo
Gel Documentation System (Bio metra, Alemanha).
3.1. Variações na incidência e severidade da murcha em algumas áreas de
cultivo selecionadas
Um total de sete grandes áreas de cultivo de berinjela, viz.
Panchagarh, Rangpur, Pabna, Jessore, Jhinaidah, Jamalpur e Mymensingh
foram pesquisados para conhecer a situação da murcha bacteriana da
berinjela em termos de incidência e severidade. No entanto, a infecção por
murcha bacteriana foi notada em quatro áreas de cultivo no momento de
nossa pesquisa, viz.
Panchagarh, Rangpur, Jessore e Mymensingh. Uma variação significativa
foi observada em termos de incidência de murcha bacteriana entre as
principais áreas de cultivo pesquisadas (Tabela 1 e Fig. 1). A maior (22,52%)
murcha bacteriana foi registrada em Rangpur, seguida por Jessore e
Pachagarh, com 20,56 e 20,0% de incidência de murcha, enquanto a menor
(6,12%) incidência de murcha bacteriana foi registrada em Jamalpur.
Uma incidência de murcha bacteriana da berinjela de 14,36% foi registrada
em Mymensingh. Ao contrário, a maior (3,26) severidade da murcha
bacteriana foi registrada em Cravo, enquanto a menor (2,93) severidade da
murcha bacteriana foi registrada em Jessore, seguida por Panchagarh e
Mymensingh, com valores de 3,00 e 3,13, respectivamente (Tabela 1 ) . Um
total de sete distritos produtores de batata selecionados, viz. Jamalpur,
Munshi gonj, Panchagarh, Bogra, Jessore, Chandpur e Nilphamari foram
pesquisados para conhecer a situação da murcha bacteriana da batata em
termos de incidência e severidade. No entanto, a infecção por murcha
bacteriana foi notada em três distritos, ou seja, Munshigonj, Nilphamari e
Jamalpur (Fig. 1). Um significativo

Tabela 2
Testes bioquímicos de grupos de isolados de Ralstonia solanacearum coletados em diferentes áreas de cultivo de berinjela e batata.

Isolar Teste de RH reação oxidase levan Teste de fermentação de açúcar Inferência

Nome patogenicidade e Teste de de Kovac
Solubilidade de KOH teste
teste de cor em mídia TTC teste
coloração de Gram teste

Dextrose Sacarose Manitol Lactose

Beringela
RsB-1 + + + + + + + + + + Ralstonia solanacearum
RsB-2 + + + + + + + + + + Ralstonia solanacearum
RsB-3 + + + + + + + + + + Ralstonia solanacearum
Batata
RsP-1 Ralstonia solanacearum
RsP-2 + + + + + + + + + + Ralstonia solanacearum
RsP-3 + + + + + + + + + + Ralstonia solanacearum
RsP-4 + + + + + + + + + + Ralstonia solanacearum

+: indica reações positivas; : indica reações negativas.

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Fig. 1. (Cor online) Distribuição dos isolados de R. solanacearum analisados neste estudo. Círculos pretos e vermelhos indicam as áreas de pesquisa onde infecções por murcha
bacteriana foram observadas para berinjela e batata, respectivamente.

variação foi observada em termos de incidência de murcha bacteriana
entre as áreas de cultivo selecionadas pesquisadas (Tabela 1). Os
resultados da pesquisa mostraram que a maior (22,65%) incidência de
murcha bacteriana foi registrada em Munshigonj, seguida por Nilphamari
(19,98%), enquanto a menor (9,07%) incidência de murcha bacteriana foi
registrada em Jamalpur (Tabela 1 ) . A escala de severidade foi calculada
para cada local usando cinco plantas selecionadas aleatoriamente de cada
campo do agricultor. A maior (3,80) severidade da murcha bacteriana foi
registrada em Munshigonj, enquanto a menor (2,90) severidade da murcha
bacteriana foi registrada em Jamalpur durante o período da pesquisa.
3.2. Isolamento, identificação e confirmação de isolados de
R. solanacearum
Um total de 51 isolados de R. solanacearum foi obtido a partir de
amostras de berinjela murcha coletadas nas diferentes localidades
pesquisadas. Vinte e quatro isolados foram obtidos de Panchagarh, 15 de
Rangpur, oito de Jessore e quatro de Mymensingh.Atotalof44R.
solanacearumisolates foram obtidos de amostras de plantas de batata
murchas, ou seja, 20 de Munshigonj, 17 de Nilphamari e 7 de Jamalpur.
Embora um número igual de plantas infectadas tenha sido
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coletados em cada uma das áreas pesquisadas, o número de isolados
variou por falha no isolamento da bactéria de todas as plantas infectadas
ou por práticas de manejo dos produtores que podem matar a bactéria.
Todos os isolados de R. solanacearum coletados de plantas murchas
de berinjela e batata produziram colônias de cor creme em meio NA
após 24 h de inoculação. Testes bioquímicos revelaram que todos os
grupos isolados eram R. solanacearum (Tabela 2). Os resultados dos
testes de patogenicidade revelaram que todos os grupos de isolados
de R. solanacearum de berinjela foram capazes de causar sintomas de
murcha em mudas de berinjela e aqueles obtidos de batata só foram
capazes de causar sintomas de murcha em plantas de batata (Tabela
2 ) . Os isolados de R. solanacearum coletados das berinjelas murchas
foram testados quanto à reação de hipersensibilidade ao tabaco. Os
resultados mostraram que todos os isolados foram capazes de causar
a morte rápida de células teciduais locais entre as nervuras das folhas
de tabaco (Tabela 2).
3.3. Diferenciação de isolados de R. solanacearum em biovares e raças
Para avaliar os fenótipos de R. solanacearum, foram determinados
isolados coletados em campo, biovares e raças dos isolados. O biovar
de todos os sete grupos de isolados de R. solanacearum obtidos tanto
de berinjela quanto de tomate foi identificado pela utilização de
dissacarídeos e de hexoses-álcoois. O resultado do teste biovar mostrou
que todos os sete grupos de R. solanacearum isolam dissacarídeos
oxidados (sacarose, lactose, maltose) e álcoois de açúcar (manitol,
sorbitol e dulcitol) em 3 a 5 dias (Tabela 3 ) .
A reação de oxidação foi indicada por uma mudança na cor.
Os resultados revelaram uma mudança de cor azul para amarelo,
indicando a oxidação de açúcares por bactérias isoladas.
Portanto, todos os grupos de isolados de R. solanacearum pertencem
ao biovar III, como mostrado na Tabela 3. Por outro lado, todas as
placas de controle de diferentes açúcares e álcoois de açúcar
permanecem inalteradas.
Não há teste bioquímico para identificação da raça de
R. solanacearum. As raças de R. solanacearum foram identificados por
testes de patogenicidade em uma ampla gama de hospedeiros. O
resultado do teste de patogenicidade mostrou que todos os quatro
grupos de isolados de R. solanacearum obtidos de berinjela testados
no estudo foram capazes de causar sintomas de murcha em plantas
inoculadas de berinjela, tomate e pimenta (Tabela 3). Portanto, todos
os grupos de isolados de R. solanacearum causadores da murcha
bacteriana da berinjela pertencem à raça 1. Por outro lado, nenhum dos
grupos de isolados de R. solanacearum obtidos da batata testada no
estudo foi capaz de causar sintomas de murcha em plantas de berinjela,
tomate e pimenta inoculadas, indicando uma gama estreita de
hospedeiros, mas os isolados produziram o sintoma de murcha em
mudas de batata. Portanto, todos os grupos de isolados de R.
solanacearum causadores da murcha bacteriana da batata coletados
em três áreas de cultivo selecionadas pertencem à raça 3.
3.4. Análises RAPD de isolados de R. solanacearum
Para avaliar as análises de diversidade genética de isolados de R.
solanacearum coletados de berinjela e batata de diferentes áreas de
cultivo, escolhemos um total de 28 isolados de 95 que representam 4
isolados de cada área, que foram agrupados em 7 amostras com base
no local onde os isolados foram coletados.
Embora o número de isolados seja baixo para análises de diversidade
genética, será um primeiro passo descobrir a adequação de marcadores
RAPD para análises de diversidade genética de R. solanacearum em
Bangladesh. Entre os 15 primers inicialmente testados, 67AB10G07,
OPA02, OPB08 e OPB17 produziram um maior número de produtos de
amplificação com alta intensidade, manchas mínimas e boa resolução
(Fig. 2A-D). Quatro primers geraram vários padrões de bandas, o
número de bandas variou de 14 a 21.
O primer 67AB10G07 amplificou um número máximo de bandas
polimórficas. O tamanho dos produtos de amplificação por PCR variou
de 100 a 1400 pb. Os quatro primers geraram 17,5 bandas pontuáveis
por primer e 17 marcadores RAPD polimórficos por primer (Tabela 4).
Os primers RAPD geraram 70 bandas, das quais 68 bandas eram
polimórficas (97,06%) e duas (2,94%) eram monomórficas entre os sete
grupos de isolados de Ralstonia (Tabela 4). Bandas fortes e fracas
foram produzidas nas reações RAPD.
3.5. Índices de similaridade intra-isolados
O maior valor de índice de similaridade intra-isolado (Si) foi
encontrado no isolado RsB-1 (86,35%), seguido pelo encontrado em
RsB-3 e RsB-2. O valor dos índices de similaridade intra-isolados (Si)
foi de 56,59% em RsP-2 (Tabela 5). Os isolados que apresentaram
maior similaridade intra-isolados e menor frequência de locos
polimórficos apresentaram menor heterozigosidade em relação aos que
apresentaram menor similaridade intra-isolados. Em outras palavras, os
isolados com menor similaridade intra-isolado formaram um grupo
menos homogêneo.

Tabela
3 Diferenciação dos grupos de isolados de Ralstonia solanacearum em biovares e raças utilizadas neste estudo.

Isolar Localizações Hospedar Nº de Utilização de carboidratos Biovares corridas

Grupo isolados
Dextrose Maltose Lactose sorbitol manitol Dulsitol

RsB-1 Panchagarh Berinjela 4 + + + + + + III EU

RsB-2 Cravo Berinjela 4 + + + + + + III EU

RsB-3 Jessore Berinjela 4 + + + + + + III EU

RsP-1 Nilphamari Batata 4 + + + + + + III III

RsP-2 Munshigonj Batata 4 + + + + + + III III
RsP-3 Jamalpur Batata 4 + + + + + + III III
RsP-4 Panchagarh Batata 4 + + + + + + III III

Cada grupo de isolados representa o mesmo local e a mesma origem do hospedeiro.

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Fig. 2. Perfis de amplificação RAPD de sete grupos isolados (total de 28 isolados) de R. solanacearum usando os primers A. 67AB10G07, B. OPA02, C. OPB08 e D.
OPB17. M: escada de 20 pb, Faixa 1-4: RsB-1, Faixa 5-8: RsB-2, Faixa 9-12: RsB-3, Faixa 13-16: RsP-1, Faixa 17-20: RsP-2 , Pista 21-24: RsP-3, Pista 25-28: RsP-4 isola grupos de R. solanacearum.

3.6. Frequência de loci polimórficos
O número e a proporção de loci polimórficos foi maior em
RsP-3 (eram 41 e 58,57%, respectivamente, Tabela 6). O nível
mais alto do valor de diversidade genética de Nei [35]
(0,2132) também foi encontrado nesses isolados. Por outro lado,
uma proporção mínima de loci polimórficos (22,86%) e valor de
diversidade gênica de Nei (1973) foi observada em RsB-3 (0,1350).
Com o menor valor de similaridade intravariedade (Si) (56,59%),
o maior valor de diversidade genética (h = 0,2132), o maior

Tabela 4
Primers RAPD com bandas correspondentes pontuadas e sua faixa de tamanho junto com bandas polimórficas observadas em sete grupos isolados de R. solanacearum.

cartilha Sequências (50 -30 ) Nº de bandas pontuadas Tamanho variado (pb) Nº de bandas polimórficas Loci polimórficos (%)

67AB10G07 TTGGCACGGG 21 100-1400 21 100,00

OPA02 TGCCGAGCTG 17 100-1400 15 88,24
OPB08 GTCCACACGG 14 100-1300 14 100,00
OPB17 GACCGCTTGT 18 100-1400 18 100,00
Total 70 68 388,24
Média 17,5 17 97,06
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Tabela 5 de Médias Aritméticas (UPGMA) indicou uma segregação de sete grupos

Compartilhamento de bandas baseado em índices de similaridade percentual entre de isolados de R. solanacearum em dois agrupamentos principais:
indivíduos de sete grupos isolados de R. solanacearum.
agrupamento 1 e agrupamento 2 (Fig. 3). Os isolados RsB-1, RsB-2,
Isola valores de compartilhamento de banda (%) RsB-3 e RsP-1 agruparam-se no cluster y, enquanto RsP-2, RsP-3 e
67AB10G07 OPA02 OPB08 OPB17 Média RsP-4 agruparam-se no cluster yy. O cluster y foi dividido em dois grupos,
RsP-1 sozinho formou um grupo e os isolados coletados da berinjela
RsB-1 81,90 82,90 85,16 95,45 86,35
RsB-2 70,79 91,33 83,21 79,37 81,18 (RsB-1, RsB-2 e RsB-3) formaram outro grupo. Novamente, o cluster yy
RsB-3 84,61 79,01 91,14 79,39 83,54 formou dois grupos, nos quais RsP-2 sozinho pertencia a um grupo. RsP-3
RsP-1 82,76 74,99 75,78 64,80 74,58 e RsP-4 pertenciam a outro grupo. Este estudo indica que RsB-1 e RsB-2
RsP-2 64,49 53,12 40,97 67,77 56,59
mostraram uma relação mais próxima, com uma distância genética mínima
RsP-3 38,68 63,67 61,90 68,95 58,30
RsP-4 41,56 72,01 79,46 77,34 67,59
(0,0357) no cluster y. A maior distância genética (0,4293) foi encontrada
entre RsB-2 e RsP-4.

índice de informação de Shannon (I = 0,3186), e a maior proporção de

locos polimórficos (58,57%), RsP-3 foi diversificado entre os sete isolados.
Por outro lado, RsB-3 foi o menos diversificado, pois compreende o maior
valor de similaridade intravariedade (Si), o menor valor de diversidade
gênica, o menor índice de informação de Shannon (I) e a menor proporção
de locos polimórficos (22,86%), conforme Tabela 4.
3.7. distância genética
Os valores das comparações pareadas da distância genética de Nei
[34] entre os sete grupos de isolados de R. solanacearum variaram de
0,0357 a 0,4293. Comparativamente, uma maior distância genética
(0,4293) foi observada entre os isolados RsB-2 e RsP-4 do que com
outras combinações. A menor distância genética (0,0357) foi encontrada
em RsB-1 vs RsB-2 (Tabela 7).
3.8. Dendrograma mostrando relação entre os isolados de R.
solanacearum
4. Discussão
Neste estudo, uma variação significativa foi observada na incidência
e severidade da murcha bacteriana em diferentes áreas de cultivo de
berinjela e batata, o que indica principalmente uma variação na população
de R. solanacearum, provavelmente devido às diferenças nas respostas
do hospedeiro, bem como à genética diversidade em populações de
patógenos. Diferenças de incidência e severidade da murcha foram
relatadas devido à diversidade de plantas hospedeiras afetadas por este
patógeno, fenótipo e genótipo de R. solanacearum, sua ampla distribuição
geográfica e a variedade de condições ambientais propícias à murcha
bacteriana [36] . Entretanto, a diferenciação de biovares de isolados de R.
solanacearum obtidos de berinjela e batata com base na utilização de
carboidratos revelou que isolados de R. solanacearum que infectam
berinjela e batata pertencem ao mesmo biovar III. Observações
semelhantes foram relatadas anteriormente por Hayward [37], He et al. [8]
e Kumar et al. [38]. Eles observaram que o biovar III oxida tanto
dissacarídeos quanto hexose álcoois, enquanto o biovar I oxida hexose
álcoois, mas não dissacarídeos, o biovar II oxida apenas dissacarídeos e

O dendrograma construído com base na distância genética de Nei

[34] usando o Unweighted Pair Group Method

Tabela 6
Variação genética dos sete grupos de isolados de R. solanacearum medida pelo número e proporção de bandas polimórficas juntamente com a diversidade gênica e índice de Shannon.

Isola Nº de loci polimórficos Proporção de loci polimórficos (%) Diversidade genética Índice de informação de Shannon (I)

RsB-1 17 24,29 0,0911 0,1351

RsB-2 17 24,29 0,1003 0,1459
RsB-3 16 22,86 0,0928 0,1350
RsP-1 28 40,00 0,1455 0,2171
RsP-2 39 55,71 0,1963 0,2958
RsP-3 41 58,57 0,2132 0,3186
RsP-4 26 37.14 0,1390 0,2063

Tabela 7
Valores de identidade genética de Nei (1972) (acima da diagonal) e distância genética (abaixo da diagonal) entre os sete grupos de isolados de Ralstonia solanacearum.

Isola RsB-1 RsB-2 RsB-3 RsP-1 RsP-2 RsP-3 RsP-4

****
RsB-1 0,9650 0,9369 0,8142 0,6847 0,6797 0,6658
****
RsB-2 0,0357 0,9311 0,8421 0,7118 0,6987 0,6510
****
RsB-3 0,0652 0,0714 0,8294 0,7072 0,6968 0,6618
****
RsP-1 0,2055 0,1719 0,1871 0,7865 0,7214 0,7128
****
RsP-2 0,3788 0,3400 0,3465 0,2401 0,8445 0,7546
****
RsP-3 0,3861 0,3585 0,3613 0,3266 0,1690 0,8562
****
RsP-4 0,4068 0,4293 0,4129 0,3386 0,2815 0,1552
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S. Nishat et ai. / CR Biologies 338 (2015) 757–767
Fig. 3. Dendrogramas construídos pelo método de grupo de pares não ponderados com média aritmética (UPGMA) mostrando dissimilaridade entre haplótipos
de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) de grupos isolados de R. solanacearum de berinjela (RsB-1 a RsB-3) e de batata ( RsP-1 a RsP-4).
Aglomerados mostrando a distância genética entre sete grupos isolados de R. solanacearum com a relação entre biovares, raças e sua distribuição geográfica.
biovar IV oxida apenas álcoois. Os dados do RAPD revelaram que
todos os grupos de isolados de R. solancearum pertencentes ao
biovar III estão distribuídos em dois grupos principais. Anteriormente,
também foi observado que o biovar 3 era mais heterozigoto em
comparação ao biovar 4 [39]. Horita e Tsuchiya [40] relataram que
as cepas do biovar III têm baixa similaridade média e se enquadram
em cinco grupos. Além disso, Poussier et al. [41] demonstraram que
as cepas do biovar III se agrupam em dois grupos, o que revelou
seu maior nível de dissimilaridade genética.
A identificação das raças pelo teste de patogenicidade em
tomate, batata, berinjela e pimenta mostrou que os isolados de R.
solanacearum obtidos da berinjela pertencem à raça 1, enquanto os
isolados de R. solanacearum coletados da batata pertencem à raça
3. Denny e Hayward [42] identificaram a raça raças de R.
solanacearum por gama de hospedeiros. Os achados do presente
estudo também são apoiados por Buddenhagen e Kelman [43], que
dividiram R. solanacearum em três raças. A raça 1 infecta muitas
plantas solanáceas, como berinjela, tomate, tabaco, pimenta e outras
plantas, incluindo algumas ervas daninhas.
No entanto, a raça 2 causa murcha de bananeira triplóide (Musa
spp.) e Heliconia spp. A raça 3 afeta a batata e o tomate, mas é
fracamente virulenta em outras culturas solanáceas. Mais tarde,
Aragaki e Quinon [44] relataram a raça 4 de gengibre infectado nas
Filipinas. Ele e outros. [8] relataram a raça 5 de amoreira na China.
Cinco raças foram descritas até agora, mas diferem na variedade
de hospedeiros, distribuição geográfica e capacidade de sobreviver
sob diferentes condições ambientais [45].
Patrice (2008) relatou que R. solanacearum foi inicialmente
subdividido em raças e biovares com base na variabilidade na gama
de hospedeiros. Ele acrescentou que cinco raças foram identificadas
dentro da espécie. Cepas de R. solanacearum também foram
divididas em cinco raças específicas do hospedeiro por Pradhanang
et al. [46]. O dendrograma baseado na distância genética de Nei
[34] usando o Unweighted Pair Group Method of Arithmetic Means
(UPGMA) indicou a segregação de 28 isolados de R. solanacearum
agrupados em sete, que foram agrupados em dois grupos principais:
cluster 1 e cluster 2. Os isolados RsB-1, RsB-2, RsB-3 e RsP-1
agruparam-se no cluster y enquanto RsP-2, RsP-3 e RsP-4 no
cluster yy. Embora seja comum que os isolados do
765
mesmos hospedeiros estão distribuídos no mesmo cluster, um grupo
de isolados, RsP-1, obtido apenas da batata, formou um cluster com
os isolados coletados da berinjela (RsB-1, RsB 2 e RsB-3). Esses
resultados indicam que esse grupo de isolados pode ser o clone dos
isolados de campo introduzidos inicialmente naquela área.
Novamente, o cluster yy é composto por dois grupos, onde RsP-2
sozinho pertence a um grupo e RsP-3 e RsP-4 pertencem a outro
grupo. A ausência de associação entre os agrupamentos genotípicos
e patotípicos também foi proposta por Leung et al. [47]. Eles
assumiram que:
a população do patógeno é fortemente selecionada pelo genótipo
do hospedeiro; a taxa de mutação do patógeno é variável; ou o
patótipo, conforme definido por interações com cultivares
hospedeiras específicas, não é a principal unidade de evolução
do patógeno.
Este estudo indica que RsB-1 e RsB-2 mostraram relação mais
próxima com distância genética mínima (0,0357) no cluster 1 e
RsB-2 e RsP-4 foram distantemente relacionados no cluster 2 com
distância genética máxima (0,4293).
No presente estudo, quatro primers de 15 geraram vários
padrões de bandas com 97,06% de bandas polimórficas e 2,94% de
bandas monomórficas entre os sete grupos de isolados de R.
solanacearum. Todos esses primers produziram um padrão de
bandas altamente polimórfico, confirmando a extrema heterogeneidade
dentro dessa população de campo dessa bactéria do solo. Embora
não se saiba exatamente quando essa bactéria foi introduzida no
país, foi surpreendente encontrar tanta diversidade. A diversidade
genética foi tão alta que foi possível obter o máximo de similaridade
de apenas 41% entre os isolados. De fato, a frequência de tamanho
de fragmento de 58,57% sugere que eles representam regiões
altamente variáveis de um isolado para outro.
Uma menor variabilidade em termos de frequência de banda sugere
que essas regiões particulares do genoma de R. solanacearum
possivelmente desempenham um papel crítico em sua sobrevivência
e são, portanto, resistentes a mudanças. O maior valor de diversidade
gênica de Nei [35] (0,2132) também foi encontrado nesses isolados.
Por outro lado, a proporção mínima de loci polimórficos
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766 S. Nishat et ai. / CR Biologies 338 (2015) 757–767
(22,86%) e o valor da diversidade gênica de Nei (1973) foi observado
em RsB-3 (0,1350). Com o menor valor de similaridade intravariedade
(Si) (56,59%), o maior valor de diversidade genética (h = 0,2132), o
maior índice de informação de Shannon (I = 0,3186) e a maior
proporção de loci polimórficos (58,57%). RsP-3 foi diversificado
entre os sete grupos de isolados. Por outro lado, o RsB-3 foi o
menos diversificado, pois compreende o maior valor de similaridade
intravariedade (Si), o menor valor de diversidade gênica, o menor
índice de informação de Shannon (I) e a menor proporção de locos
polimórficos ( 22,86%). R. solanacearum é uma espécie complexa
heterogênea de bactéria do solo que é extrema em termos de
variabilidade em raças, biovares [37,48], com uma ampla variedade
de hospedeiros. A indisponibilidade de resistência durável junto com
suas complexas raças e biovares juntos indicam a existência de alta
diversidade genética dentro desta espécie.
Recentemente, todo o genoma de R. solanacearum (cepa GMI
1000) foi sequenciado [49], e a existência de vários elementos
móveis, profagos, sequências de inserção, transposons e similares
no genoma fornece pistas para instabilidade genética nesta bactéria,
observado anteriormente por vários trabalhadores [39,40,50-52].
Além disso, existem vários loci no genoma que são considerados
hot spots recombinacionais, sugerindo assim uma evolução rápida
do genoma. DNA em seu genoma [53,54], indicando que a sequência
do genoma publicada pelo grupo pode representar um único
instantâneo de uma estrutura que é variável de isolado para isolado
e dentro de derivados do mesmo isolado. De fato, R. solanacearum
é o único patógeno bacteriano de plantas em que a transferência
horizontal de genes, mesmo de arqueobactérias, foi relatada [55]. A
combinação de transferência lateral de genes, amplificação de
sequência, inativação de genes e, finalmente, mutação podem ser
as razões para a diversidade genética observada na população
natural desta bactéria. Nossos dados indicaram que R. solanacearum
é capaz de criar níveis muito elevados de diversidade genética entre
os isolados obtidos de diferentes regiões, independentemente dos
hospedeiros que foram agrupados em um baixo nível de índice de
similaridade. Isso explica o fato de que a grande variabilidade
observada nessa população de R. solanacearum também pode
estar relacionada à sua natureza de solo. O patógeno tem que lidar
com o ambiente variável no solo durante sua sobrevivência saprófita
[11]. Assim, as propriedades do solo podem desempenhar um papel
importante na diferenciação genética, como foi demonstrado para
outras espécies bacterianas do solo [3]. Ecologistas e geneticistas
de população há muito suspeitam que a estrutura do ambiente está
conectada com a manutenção da diversidade de microrganismos
[56]. Esta bactéria é bem conhecida por sobreviver em diversas
condições ecológicas, interagindo com um meio de fatores bióticos
e abióticos. Essa pode ser a razão para a evolução e manutenção
de maior variabilidade nesta bactéria.
Até onde sabemos, este é o primeiro relatório de avaliação da
diversidade genética entre isolados de campo de R. solanacearum
coletados de diferentes hospedeiros e locais em Bangladesh.
No entanto, para obter uma melhor correlação entre os isolados e
a fonte hospedeira, são necessários mais isolados de várias plantas
hospedeiras. Apesar desses fatos, pelo menos pode ser
concluiu com o presente estudo que os marcadores RAPD podem
estar entre as ferramentas mais sensíveis, simples e eficientes para
análise da diversidade genética entre e dentro de isolados de R.
solanacearum e traçar efetivamente suas relações genéticas. No
entanto, o uso de maior número de isolados bacterianos e mais
primers para RAPD juntamente com o uso de outros marcadores
moleculares na análise da diversidade genética de R. solanacearum
irá desvendar as complexas estruturas populacionais dessa bactéria
de solo no país. A melhor estratégia de manejo da murcha bacteriana
é a resistência do hospedeiro. Informações e conhecimento sobre a
existência de variabilidade na população local de patógenos e
determinação da gama de hospedeiros serão o primeiro passo ao
estabelecer uma estratégia de melhoramento para resistência.
Finalmente, as informações fornecidas por este estudo sobre a
diversidade de cepas de R. solanacearum serão úteis para iniciar e
otimizar análises de populações de patógenos e programas de
melhoramento em Bangladesh.
Reconhecimento
Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por uma bolsa do USDA
para o Prof. Dr. M. Bahadur Meah e uma bolsa de pesquisa UGC-
BAURES para o Prof. Dr. Md. Rashidul Islam.
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