ALEXANDRE BARBOZA DE LEMOS

ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO DE SUPERFÍCIE DO TITÂNIO NA

COLONIZAÇÃO BACTERIANA

CAMPINAS
2015

 
 ALEXANDRE BARBOZA DE LEMOS

ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO DE SUPERFÍCIE DO TITÂNIO NA

COLONIZAÇÃO BACTERIANA

Tese de pesquisa apresentada ao centro

de pós-graduação/CPO São Leopoldo
Mandic, para obtenção do título de Doutor
em Odontologia
Área de Concentração: Implantodontia
Orientadora: Elizabeth Ferreira Martinez

CAMPINAS
2015

 
 AGRADECIMENTO

Agradeço `a Deus, pois Ele define nossa vitória e o momento que ela acontecerá
Agradeço a meus pais, que com esforço puderam me orientar no caminho do estudo
e da ética
Agradeço aos meus filhos Maria Clara, João Pedro e Miguel que mesmo na minha
ausência sempre souberam que meu amor é infinito
Agradeço a Profa, orientadora e amiga Elizabeth Martinez pelo carinho, amizade,
dedicação e exemplo de simplicidade e a quem devo sempre me espelhar pela
sabedoria e até pelos puxões de orelha, professora a Sra é demais.
Agradeço ao Prof. Marcelo Napimoga que me estimulou a realizar este curso e pelo
apoio ao longo dele
Agradeço a todos os professores do programa de doutorado da SLMandic/Campinas
que puderam contribuir com minha formação e crescimento profissional
Agradeço aos meus amigos de doutorado pelos momentos de alegria e relaxamento
mas também de aprendizado
Agradeço em especial ao amigo Ricardo Marçal, que sem me conhecer me amparou
e esteja certo que jamais irei esquecer
Agradeço ao amigos e professores da Especialização da SLMandic/RJ que na
minha ausência realizaram as tarefas que precisariam ser realizadas
Agradecimento especial ao Prof Carlos Nelson Elias que com sua amizade e
brilhantismo me ajudou, sendo fundamental nas pesquisas e me abrindo as portas
do IME/RJ
Agradeço as funcionárias da SLMandic/Campinas Poly, Gilka e Vanessa que com
simpatia e alegria me ajudaram no desenvolvimento do trabalho
Agradeço ao funcionário civil Joel, do IME/RJ, que abdicou de momentos de folga
para fazermos as imagens do trabalho
Agradeço a empresa Conexão Sistema de Prótese, que disponibilizou as amostras
para a realização desta pesquisa
Agradeço a todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram com esse
projeto e com seu desenvolvimento.

 
 RESUMO

A colonização bacteriana tem papel fundamental na patogenia da inflamação peri-

implantar podendo ser influenciada pelas características da superfície do titânio. O
objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a colonização bacteriana em superfície de
duplo ataque ácido com discreta deposição cristalina de íons flúor (NANO),
comparado com superfícies duplo ataque ácido (DAA) e polida (P), bem como, a
molhabilidade (Mo) e rugosidade (Ra) da três superfícies analisadas. Foram
selecionados discos de titânio comercialmente puro, com respectivos tratamentos e
analisados a Mo e Ra por meio de um goniômetro e perfilômetro, respectivamente.
Para análise e quantificação de bactérias aderentes, uma cepa de Streptococcus
mutans (ATCC 25175) foi incubada (37oC, 4h, 1X106 UFC/ml) utilizando-se a técnica
de fluorescência com kit de viabilidade Live/Dead Baclight. As áreas contendo
bactérias viáveis (fluorescência verde) e não-viáveis (fluorescência vermelha) foram
mensuradas por meio do programa ImageJ e os resultados submetidos à análise
estatística (ANOVA e Tukey). As medidas de Ra/Mo foram 0,20µm/69,13º,
0,53µm/92,82º e 0,56µm/94,33º para P, DAA e NANO, respectivamente. A contagem
de bactérias viáveis e não viáveis foi significativamente influenciada pelos
tratamentos de superfície. A superfície polida apresentou contagem de bactérias
viáveis significativamente menor em relação à superfície nano (p=0,007). A
contagem de bactérias não viáveis foi maior na superfície NANO (p < 0,001) quando
comparado às superfícies P e DAA. Portanto, pode-se concluir que o tratamento de
superfície e a composição química podem influenciar a adesão e a viabilidade
bacteriana.
Palavras-Chave: Peri-implantite, Superfície de Implantes, Adesão Bacteriana,
Biofilme, Microbiologia

 
 ABSTRACT

The bacterial colonization plays a key role in the pathogenesis of peri-implant

inflammation and this may be influenced by the titanium surface characteristics. The
aim of this in vitro study was to evaluate bacterial colonization on dual acid etched
surface with discrete crystalline deposition of fluoride ions (NANO), compared with
both dual acid etched surface (DAA) and smooth surface (P), as well as evaluate the
surface wettabilty (Mo) and surface roughness (Ra) of all surfaces. Commercially
pure titanium discs were selected, with their treatments and analyzed the SFE and R
using a sessile drop method and profilometer, respectively. For analysis and
quantification of adherent bacteria was incubated (37°C, 4h, 1x106 CFU/ml) A
Streptococcus mutans strain (ATCC 25175) using the fluorescence technique
viability kit Live/Dead Baclight. The areas containing viable bacteria (green
fluorescence) and non-viable (red fluorescence) were measured using the ImageJ
program and the results submitted to statistical analysis (ANOVA and Tukey). The
Ra/Mo measures were 0,20µm / 69,13º, 0,53µm / 92,82º and 0,56µm / 94,33º to P,
DAA and NANO, respectively. The counting of viable and non-viable bacteria was
significantly influenced by the surface treatments. The smooth (P) surface had
significantly lower counts of viable bacteria in relation to surface nano (p=0.007). The
viable bacteria count was not higher in the surface NANO (p <0.001) when compared
to the surfaces P and DAA. Therefore, it can be concluded that the surface treatment
and the chemical composition can influence the adhesion and bacterial viability.

Keywords: Peri-implantitis, Implant Surfaces, Bacterial Adhesion, Biofilm,

Microbiology

 
 SUMÁRIO

01 Introdução Pag 01
02 Revisão da literatura Pag 04
03 Preposição Pag 27
04 Materiais e Métodos Pag 28
05 Resultados Pag 34
Alexandre Barboza 3/7/15 09:56
06 Discussão Pag 49 Formatted: None, Indent: Left: 0 cm,
Don't keep with next, Don't keep lines
07 Conclusão Pag 57 together

Referências Bibliográficas Pag 58

Anexos Pag 75

 
 1. INTRODUÇÃO

A implantodontia é uma ciência multidisciplinar envolvendo a cirurgia,

periodontia, prótese e a ciência dos materiais (Mouhry et al., 2012). Como material

de escolha, o titânio tem sido largamente utilizado como biomaterial em implantes na

odontologia, devido a sua excelente resistência a corrosão e sua biocompatibilidade,

tornando um material seguro no uso de substituição de dentes perdidos devolvendo

função e estética (Liao et al., 2010; Yeniyol et al., 2014).

Com a utilização cada vez maior dos implantes de titânio osseointegráveis

para substituir elementos dentários perdidos, e em muitos casos em pacientes com

histórico de doença periodontal, além das infecções peri-implantares, torna-se muito

importante novos modelos de tratamento de superfície que visam diminuir a

colonização bacteriana na superfície do implante (Caous et al., 2013).

Na cronologia da doença peri-implantar, a aderência e colonização

bacteriana tem papel inicial e fundamental na patogenia da inflamação, que pode ser

considerada uma das causas para a perda dos implantes osseointegráveis

(Rodriguez Y Baena et al., 2012).

Assim, as características físico-químicas das superfícies do material são

conhecidas por influenciar significativamente o processo de aderência bacteriana

(Subramani et al., 2009; Bürgers et al. 2010). Modificações nessas características

podem ter efeitos significativos na aderência do biofilme bacteriano sobre esta

superfície, visto que tal aderência bacteriana é dependente da rugosidade da

superfície, bem como da composição química e da energia de superfície (Hauslich et

al., 2011; Chang et al. 2013).

Muitos protocolos clínicos têm sido sugeridos para o tratamento da peri-

implantite, porém nenhum destes tratamentos têm sido considerados completamente

 
satisfatórios (Mouhry et al., 2012). Assim o futuro das superfícies serão as que tem

capacidade anti-microbiana que possam bloquear a formação do biofilme ou tornar a

superfície com uma ação bio-reativa após a formação do biofilme e ainda promover

a re-osseointergração com selamento de tecido queratinizado (Norowski &

Bumgardner, 2009).

A incorporação de agentes anti-bacterianos têm sido utilizados em

implantes metálicos e podem ser classificados em dois grupos: orgânico e

inorgânico. Os agentes orgânicos contem antibióticos e anticorpos humanos,

enquanto os inorgânicos incluem íons de prata, carbono, zinco, cobre, alguns

óxidos, nitreto, porém o principal requisito de ambos grupos não afetar a integração

do material com os tecidos vivos (Chang et al., 2013).

Com o aumento de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos, torna-se

necessário agentes anti-bacterianos alternativos para a prevenção e controle da

doença peri-implantar (Yeniyol et al., 2014), e a incorporação de íons na superfície

dos implantes tem sido sugerida com o objetivo de otimizar a aderência de

osteoblastos, bem como produzir uma superfície anti-bacteriana pela deposição

anódica destes íons (Della Valle et al., 2012).

Modificações na superfície do implante de titânio podem potencialmente

reduzir a ocorrência de peri-implantite e, consequentemente aumentar a longevidade

do tratamento, sendo o mais importante nessas modificações desenvolver

superfícies capazes de reduzir o numero de bactérias aderidas inicialmente,

minimizando assim o subseqüente infiltrado inflamatório (Größner-Schreiber et al.,

2009).

Baseado na potencial importância das infecções peri-implantares para o

sucesso dos implantes osseointegráveis e de sua relevância influência para

 
longevidade dos implantes, este estudo teve como objetivo avaliar a aderência, bem

como a influência na viabilidade bacteriana entre três diferentes tipos de tratamento

de superfície de implantes osseointegráveis da empresa Conexão Sistema de

Prótese®: Superfície Polida, Superfície com Duplo Ataque Ácido (Porous®) e a

Pouros com Escala Nanométrica com Discreta Deposição Cristalina de íons flúor

(Nano-Porous®) em um tipo de liga titânio grau 4 Hard, correlacionando com as

características da superfície.

 
2. REVISÃO DA LITERATURA

O advento da osseointegração, definida como “o contato direto entre osso

vivo e uma superfície de implante sob cargas funcionais sem interposição de tecido

mole ao nível da microscopia óptica” foi um marco para a Odontologia Mundial

(Branemark et al., 1969).

Desde então, diferentes métodos de tratamento de superfícies de

implantes têm sido desenvolvidos visando aprimorar os resultados dos tratamentos

com implantes dentais (Wennerberg & Albrektsson, 2009). Diversos estudos têm

sido conduzidos buscando avaliar os efeitos de modificações na superfície dos

implantes neste microambiente, sendo observado que estas modificações são

métodos capazes de acelerar e melhorar a qualidade da osseointegração,

resultando em maior deposição óssea e redução do período de reparo (Lai et al.,

2009; Lang et al., 2011; Wennerberg & Albrektsson, 2009).

Pesquisas evidenciam uma aceleração no processo de osseointegração

e aumento da resistência da interface osso-implante em fixações de superfícies mais

rugosas quando comparadas às superfícies relativamente lisas (Cho, 2003; Sul et

al., 2008).

Em uma revisão sistemática quatro níveis de rugosidade (Ra) foram

classificadas por Wennerberg & Albrektsson (2009), polida com rugosidade menor

que 0,5µm, com rugosidade mínima (0,5µm<Ra<1,0µm), rugosidade moderada

(1,0µm<Ra< 2,0µm) e superfícies muito rugosas com Ra>2,0µm ,que se mostrou ter

pouca adesão óssea.

A rugosidade ideal para haver a osseointegração tem sido sugerida ser

1,5µm, entretanto a rugosidade ideal pode diferir entres os diversos tipos de

tratamento de superfície (Fröjd et al., 2012).

 
 Quando em contato com a superfície dos implantes, as células

precursoras de osteoblastos seguem uma sequência de diferenciação celular

resultando na formação de osteoblastos maduros, sintetizadores de matriz

extracelular tais como colágeno tipo 1, fosfatase alcalina, osteopontina, sialoproteína

óssea e osteocalcina (Aubin, 1998; Malaval et al. 1999). Através da avaliação dos

níveis de RNAm, Liu et al. (2003) detectaram certos estágios transitórios durante a

diferenciação celular, onde inicialmente há um aumento de colágeno tipo 1, seguido

de uma subseqüente expressão de fosfatase alcalina e transcrição de proteínas da

matriz óssea não-colagênica.

Na última década, foram realizados trabalhos com o objetivo de alterar as

propriedades físico-químicas das superfícies do titânio e suas ligas, com o objetivo

de aumentar a bioatividade dos implantes. O aumento da bioatividade da superfície

acelera as reações com o meio biológico, reduz o tempo de cicatrização, acelera o

processo de osseointegração e forma uma interface mais resistente através da

obtenção de maior área de contato osso-implante, e uma possível união química da

superfície com o tecido ósseo (Sul, 2004).

Em contraste com as superfícies maquinadas ou outras superfícies

polidas, as superfícies de implantes com micro e nano tratamentos tem mostrado um

aumento da interface osso-implante com melhor nível de osseointegração (Stübinger

et al., 2010). Portanto, diferentes tratamentos de superfície têm sido realizados com

objetivo de melhorar a topografia e a composição química da superfície do implante,

visando melhorar a osseointegração e aumentar as taxas de sucesso clínico dos

implantes (Annunziata et al., 2011; Al-Radha et al., 2012).

A composição física e química da superfície, bem como as propriedades

iônicas, a sua rugosidade e energia de superfície são parâmetros de grande

 
importância na interação entre osso/implante. Dependendo da composição química

e do tipo de tratamento, as superfícies podem ser diferentes, e com isso alterar a

adsorção de proteínas e adesão celular. Por exemplo, a composição química altera

as características hidrofílicas de um superfície e uma superfície muito hidrofílica são

mais desejáveis do que as hidrofóbicas devido as interações com os fluidos

biológicos, células e tecidos (Junker et al. 2009).

Tredwin et al. (2013) avaliaram a influência da adição de fluoreto em

superfícies com hidroxiapatita, substituindo a estrutura hidroxila formando flúor-

apatita e flúor-hidroxiapatita. Foi realizada análise química da superfície e não foram

encontrados níveis de flúor podendo estar relacionado à não presença difusa deste

íon no interior da estrutura estequiométrica do titânio. Os autores concluíram que a

adição de fluoreto na estrutura da apatita aumentou significativamente a força de

adesão da apatita ao titânio.

Essas alterações de superfície que visam promover uma melhor área de

contato entre o osso e o implante, contudo podem promover também um ambiente

favorável à colonização, aderência e agregação bacteriana (Rodriguez Y Baena et

al., 2012). Falhas biológicas são associadas ao biofilme bacteriano e à infecção

bacteriana (Norowski & Bumgardner, 2008).

Devido os implantes serem utilizados em contato com vários tecidos, é

necessário uma superfície de ótima compatibilidade com o tecido ósseo do

hospedeiro, tecido epitelial e tecido conjuntivo subjacente. Em adição, os implantes

osseointegráveis estão parcialmente expostos a cavidade oral, sendo assim

importante que essa superfície exposta seja capaz de estar livre de biofilme

(Yoshinari et al., 2000).

 
 Bundy et al. (1980) e Leonhardt et al. (1995) observaram que o titânio têm

sido descrito como tendo efeito bacteriostático mesmo sozinho, porém estas

observações permanecem ainda controversas (Bunetel et al., 2001).

Assim a adesão bacteriana na superfície do implante é frequentemente o

primeiro passo para a infecção peri-implantar e essa infecção é chamada de peri-

implantite (Yeo et al., 2012).

2.1 PERI-IMPLANTITE

Peri-implantite foi um termo introduzido nos anos 80 para descrever o

processo inflamatório destrutivo que afeta os tecidos mole e duro ao redor dos

implantes osseointegrados (Mombelli et al., 1987). É importante salientar que peri-

implantite não é sinônimo de implante perdido ou implante falho (Mombelli A., 2002)

Em 2008, Zitzmann & Berglundh definiram a peri-implantite com sendo

um processo inflamatório ao redor do implante caracterizado pela inflamação do

tecido mole e perda do tecido ósseo de suporte.

Mouhry et al., em 2009, definiram a peri-implantite como sendo a doença

da osseointegração, sendo caracterizada por perda óssea do suporte em forma de

pires clinica e radiograficamente associada a uma reação inflamatória do tecido mole

circundante.

Em 2009, Norowski & Bumgardner mencionaram que peri-implantite é um

processo inflamatório que afeta os tecidos moles e duro ao redor do implante

osseointegrado, acarretando em rápida perda de tecido ósseo de suporte associado

a supuração e sangramento.

 
 Já Yeo et al., em 2012, definiram peri-implantite como sendo o processo

inflamatório que afeta os tecidos circundantes do implante osseointegrado,

resultando em perda óssea.

Apesar de inúmeras definições da peri-implantite faltam referências de

grau de perda óssea para caracterizar a patologia, por isso Renvert et al., em 2013

definiram peri-implantite como tendo perdas ósseas maior que 2mm do nível da

plataforma.

Estudos clínicos relatam um incidência baixa (0.31-14,4%) de peri-

implantite e que a maior incidência ocorre no primeiro ano. Porém acredita-se que

este número pode ser subestimado devido a escassos testes de diagnóstico

(Norowski & Bumgardner, 2009).

Ji et al. (2015) mencionaram a ocorrência de 28-56% dos pacientes (12-

40% dos sítios) apresentavam peri-implantite. Åstrand et al. (2000) relataram uma

taxa de 7,2% de incidência de peri-implantite e que 25% dos implantes perdidos

foram decorrentes desta patologia.

A interpretação dos dados, a variação de parâmetros examinados como a

profundidade de bolsa ou perda óssea, métodos de diagnóstico variáveis como a

utilização de radiografias que por uma angulação pode influenciar na altura da crista

óssea, bem como as diferentes definições tornam a incidência da peri-implantite

apresentar uma elevada variação (Mombelli, 2002).

A peri-implantite apresenta patologia multifatorial, e sua origem pode

inicialmente ser relatada com muitos fatores de risco, que podem ser reunidos em

quatro categorias: ausência ou lesão do tecido mole circundante, presença de

espécies bacterianas agressivas, estresse biomecânico excessivo e corrosão. Se

 
somente um desses fatores der inicio à cadeia de lesões, eles geralmente tem papel

fundamental no agravamento dos outros fatores (Mouhry et al., 2012).

O tecido mole aderido atua como uma barreira para os tecidos duros que

sustentam o implante, contudo essa barreira é frágil e na sua ausência ou uma vez

ocorrida uma lesão ocorre uma contaminação bacteriana que muito rapidamente

levará a uma perda óssea (Mouhry et al., 2012).

A adesão e colonização bacteriana possuem função crucial da patogenia

da peri-implantite, sendo considerada como causador da perda dos implantes

osseiontegrados (Rodriguez Y Baena et al., 2012; Yeo et al., 2012).

O biofilme formado promove um mecanismo de proteção às espécies

bacterianas, tornando-as muito mais resistentes aos agentes microbianos (Yeo et

al., 2012).

Embora existam mais de 500 espécies bacterianas na cavidade oral,

apenas algumas espécies são as colonizadoras pioneiras, tais como S. mitis, que

tornam favorável o ambiente para a colonização tardia de espécies mais

patogênicas (Al-Radha et al., 2012). Tal adesão inicial e colonização bacteriana na

superfície do implante são considerados como papel fundamental na patogenia da

infecção relacionada ao biomaterial, estando bem relatado que cada diferente

material de implante pode promover uma aderência seletiva durante a formação do

biofilme (Größner-Schreiber et al., 2009).

No processo de formação do biofilme na superfície de substratos sólidos

incluindo dente, implante e materiais restauradores, a aderência inicial de

colonizadores preliminares da superfície é o passo critico (Lee et al., 2011), e os

micro-organismos associados são a Aggregatibacter actinomycetemcomitans,

 
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum (Mouhry

et al., 2012).

Entretanto, outras espécies bacterianas colonizadoras iniciais podem

estar envolvidas, tais como Streptococcus e Actinomyces sp (Fürst et al., 2011; Ji et

al. 2015), e também possuem papel fundamental na formação do biofilme, pois

facilitam a colonização tardia por espécies mais virulentas, formando uma interface

entre a película adquirida e essas espécies. Isso cria a necessidade de se ter uma

superfície que impeça essa adesão inicial por esses agentes colonizadores e a

consequência de eventos posteriores (Größner-Schreiber et al., 2009; Yeo et al.

2012). Sabe-se que tal colonização ocorre apenas 30 minutos após a exposição do

implante a cavidade bucal com a colocação do cicatrizador conforme observaram

Fürst et al. (2011). Contudo essa colonização inicial pode ser influenciada por outros

fatores como por exemplo se o paciente é totalmente ou parcialmente edêntulo, de

acordo com van Winkelhoff et al. (2000) e sua microflora pode ser diferente do perfil

bacteriano da periodontite crônica, e que a presença do biofilme demonstra que

certamente os micro-organismos estão envolvidos no processo de doença entretanto

não comprova que eles realmente são a origem dessa condição (Mombelli et al.,

2011).

Outro aspecto importante é a energia livre da superfície da bactéria. S.

aureus, S. epidermidis, E. coli e L. Monocytogenes têm baixa energia de superfície

sendo consideradas hidrofílicas (Absolom et al. 1983). Busscher et al. (1984)

mencionou que bactérias com baixa energia de superfície colonizam

preferencialmente superfícies com baixa energia livre de superfíicie, entretanto

bactérias com alta energia livre de superfície colonizam melhor superfícies com alta

energia livre de superfície. Em 1984, McBride et al. relataram a característica

 
hidrofóbica do S. mutans, mesma observação foi realizada por Weerkamp et al.

(1985) que relataram que S. mutans, S. sanguis, e S. salivarius possuem alta

energia livre de superfície, e que a presença de saliva não modificou a condição

hidrofóbica dessas espécies bacterianas.

Outros fatores podem ser coadjuvantes na instalação da peri-implantite ou

até mesmo serem, isoladamente ou combinados, os causadores da perda óssea

marginal (Quirynen et al., 2001; Qian et al., 2012).

O excessivo estresse biomecânico pode iniciar a peri-implantite através

da ruptura inicial da osseointegração. Quando um implante é submetido a cargas

excessivas ou forças laterais, microfraturas aparecem ao longo da interface

osso/implante e que se agrava pela inevitável contaminação bacteriana na interface

rompida levando ao aparecimento de tecido de granulação em detrimento ao tecido

ósseo. A qualidade do tecido ósseo de suporte pode ter forte influência na evolução

da doença, fato que explicaria uma incidência maior na maxila do que na mandíbula

(Mouhry et al., 2012).

A topografia da superfície parece influenciar no metabolismo do

monócito/macrófago, resultando em aumento da fagocitose, levando à uma elevação

de proteases, proteínas sinalizadoras e citocinas. Dentro desse contexto, pode-se

afirmar que a superfície do implante pode ter alguma influência na natureza do

infiltrado inflamatório dos tecidos peri-implantares (Pongnarisorn et al., 2007).

Finalmente a corrosão, é considerada, em segundo plano, como agente

etiológico da peri-implantite. Contudo, isso pode ocorrer pois a liga de titânio é usada

em contato com o tecido vivo e líquidos corporais. Nesse caso, o acúmulo de

macrófagos é notado e pode contribuir para a destruição do tecido ósseo de suporte

sem a presença bacteriana devido a presença e acúmulo de radicais livres no tecido

 
ósseo de suporte provocando assim uma reação de corpo estranho (Albrektsson et

al. 2014). A corrosão é mais que um agente etiológico, é um fenômeno da

osseointegração e, consequentemente, da peri-implantite. Porém, a colonização

bacteriana acelera o processo de corrosão e a liberação de radicais livres e por isso

é considerada de origem bacteriana (Quirynen et al., 2001; Mouhry et al., 2012).

Técnicas de remoção mecânica do biofilme (curetas de aço, e de titânio,

ultrassom) têm sido preconizadas com intuito de removê-lo da superfície do

implante; contudo com alterações químicas da superfície, podem ocorrer

transferências de íons estanhos para a camada de oxido de titânio e assim levar a

uma redução da bio-compatibilidade do implante e corrosão acentuada do mesmo

(Cho et al., 2015).

2.2 FATORES MODIFICADORES DA SUPERFÍCIE DO IMPLANTE

Parâmetros como rugosidade, energia livre de superfície e composição

química da superfície do implante são encontradas como tendo significante impacto

na osseointegração mas também na formação do biofilme (Teughels et al., 2006;

Pachuari et al., 2014).

As modificações nas superfícies com intuito de influenciar na adesão do

biofilme, são realizadas visando dois aspectos: primeiro inibindo a adesão

bacteriana prevenindo o seu acúmulo e o segundo aspecto visa reduzir a

colonização bacteriana tornando a superfície com atividade anti-bacteriana (Yeniyol

et al. 2014).

A energia livre de superfície e a rugosidade são conhecidas como

fundamentais no processo de formação do biofilme, porém a rugosidade é sugerida

como sendo predominante nesse processo (Bürgers et al., 2010).

 
 Embora muitos estudos possam utilizar todos esses parâmetros

separadamente, algumas vezes até mesmo inter-cambiando tais fatores, é muitas

vezes impossível tratar de cada um isoladamente (Quirynen et al. 1994; Bürgers et

al. 2010), pois por exemplo a propriedade hidrofílica da superfície é influenciada pela

composição química do implante dentário (Pachuari et al., 2014).

a. Energia de Superfície/Molhabilidade

Um parâmetro relevante na análise da superfície desenvolvida é sua

molhabilidade. A relevância desta propriedade está no fato da molhabilidade da

superfície influenciar no contato das células com a superfície do implante. Quanto

maior a molhabilidade, maior a capacidade da liga em ser biocompatível por permitir

o contato das biomoléculas que participam dos eventos iniciais de osseointegração

(Fernandes, 2014).

A técnica da gota tem sido utilizada para se determinar a energia de

superfícies sólidas, e envolve a mensuração do ângulo de contato entre a gota e a

superfície de interesse definindo a molhabilidade.

A molhabilidade tem sido utilizada para verificar a energia livre de

superfície. Por sua característica anisotrópica, a medição da molhabilidade da

superfície do implante pode apresentar grande variação. Superfícies com ângulos de

molhabilidade menores que 90º são considerados hidrofílicos, enquanto as

superfícies com ângulos maiores que 90º são considerados hidrofóbicos e com

baixa capacidade de molhabilidade (Größner-Schreiber et al., 2009).

Busscher et al. (1984) relataram que bactérias com baixa energia de

superfície preferem colonizar superfícies também com baixa energia de superfície e

que superfícies com alta energia de superfície são melhor colonizadas por espécies

 
bacterianas com também energia de superfície alta, e que muitas bactérias do

biofilme possuem alta energia livre de superfície e que sua adesão em superfícies

de baixa energia é desfavorável.

Quirynen et al. (1994) pesquisaram a influência da cobertura de uma

camada de flúor-etilenopropileno (FPE) em conexões protéticas de titânio

comparando com as conexões de titânio puro na formação do biofilme. A cobertura

com FPE visava a redução da energia de superfície que foi observada pelos autores,

porém ocorreu um aumento na rugosidade da superfície. Analisando o biofilme

supragengival, notaram que as conexões cobertas com FPE mostravam maior

quantidade de cocos enquanto as conexões de titânio puro apresentavam maior

quantidade de espiroquetas, porém no biofilme subgengival essa diferença não foi

observada. Os autores concluíram que a energia livre de superfície tem forte

influência na formação do biofilme. Citaram ainda, que a influência da energia livre

de superfície na formação do biofilme reduz quando a rugosidade aumenta. Ainda,

superfícies com baixa energia livre de superfície colaboram na redução da formação

do biofilme, bem como nas características das espécies bacterianas.

Mabboux et al. (2004) analisaram a influência da energia livre de

superfície na adesão bacteriana. Os autores utilizaram uma superfície de titânio pura

e uma liga de titânio (Ti-6Al-4Va) ambas com mesma rugosidade e alta energia livre

de superfície. Foram usadas uma cepa bacteriana hidrofóbica (S. sanguinis) e outra

hidrofílica (S. constellatus) . Não houve diferença de adesão entre o titânio puro e a

liga de titânio, entretanto as bactérias hidrofóbicas aderiram duas vez mais às

superfícies do que as bactérias hidrofílicas.

Bürgers et al. (2010) avaliaram a influência de quatro superfícies na

adesão da C. albicans. Eles utilizaram a superfície de titânio maquinada (MT), titânio

 
jateada (SBT), titânio jateada e depois ataque ácido (SBET) e zircônia (ZC),

correlacionando os achados aos diferentes aspectos físico-químicos (rugosidade -

Ra, energia livre de superfície - SFE e morfologia) de cada amostra. A rugosidade foi

de 1,22µm (SBT), 1,18µm (SBET), 0,19µm (MT) e de 0,15µm (ZC) sendo

consideradas significativamente diferentes entres si. Para SFE, foram encontrados

os seguintes resultados: SBT=69,8 mJm-2; ZC=54,8 mJm-2; SBET=50,6 mJm-2 e

MT=48,7 mJm-2. Os autores concluíram que pouca quantidade de C. albicans estava

aderida a SBT, enquanto de ZC não apresentou redução na adesão fato também

observado na SBET e MT. Concluíram ainda que a influência de SFE parece ser

mais importante que Ra.

Busscher et al. (2010) relataram que a influência da rugosidade sobre o

ângulo de contato desaparece quando a rugosidade é menor que 0,1µm. Os autores

concluíram que a energia livre de superfície tem crucial impacto na adesão inicial de

micro-organismos sobre uma superfície sólida, e que superfícies hidrofóbicas

tendem a aderir uma quantidade menor de biofilme.

Lee et al. (2011) avaliaram a formação do biofilme em diferentes materiais

restauradores utilizados. Os autores avaliaram titânio, zircônia e resina composta. A

rugosidade da resina foi significativamente maior (Ra=0,17µm) do que a do titânio

(Ra=0,05µm) e da zircônia (Ra=0,06µm) contudo ficaram abaixo de 0,2µm e foram

classificadas como polidas. A resina composta apresentou significava maior

aderência bacteriana e não houve diferença significativa entre os demais materiais

analisados, essa maior adesão bacteriana na resina composta pode ser explicada

devido a sua maior características hidrofóbica do que a zircônia e o titânio, uma vez

que a rugosidade foram consideradas sem diferença significativa. Outro fator que

 
pode afetar a adesão bacteriana seria a característica físico-química de cada

material.

Yeo et al., em 2012 analisando adesão bacteriana em três tipos de

tratamento de superfície (maquinado, duplo ataque ácido e jateamento + ataque

ácido), observaram que o tratamento com jateamento mostrou uma energia livre de

superfície muito baixa e uma alta rugosidade. Estes fatores influenciaram para uma

maior adesão bacteriana quando comparado aos demais tipos de tratamento.

Almaguer-Flores et al. (2012) estudaram a colonização bacteriana

utilizando três diferentes tipos de superfície polida (PT) (Ra<0,2µm), uma superfície

com ataque ácido (A) (Ra = 0,8µm) e uma superfície jateada e depois tratada com

ataque ácido (SLA) (Ra = 3,2µm). Os autores prepararam duas outras superfícies

(modA e modSLA) com preparo em nitrogênio livre do ar atmosférico e

armazenamento com solução salina com objetivo de manter elevada a energia livre

da superfície. Os autores observaram que a colonização inicial da superfície pelo

biofilme foi influenciada pela micro-estrutura e pela hidrofilia da superfície pois houve

diferença significativa entre as superfícies. As superfícies com alta energia livre de

superfície (modA e modSLA) apresentaram maior quantidade de bactérias aderidas

quando comparadas as mesmas superfícies (A e SLA). As superfícies SLA

apresentaram maior nível de aderência bacteriana do que a superfície A.

Al-Radha et al. (2012) avaliaram três tipos de superfície de titânio (Titânio

puro -TP, Titânio Jateado com Zircônia-TBZ e Titânio jateado com Zircônia seguido

de ataque ácido-TBZA) além de uma superfície de zircônia pura-TZ. Todas as

amostras tinham rugosidade abaixo de 0,2µm. A molhabilidade das superfícies foi

bastante similiar com exceção da superfícies TBZA que se mostraram ser

fortemente hidrofóbicas. Os autores concluíram que a energia livre de superfície é,

 
juntamente com o tipo do material, os fatores mais importantes na adesão

bacteriana em superfícies maquinadas.

Em 2015, Ávila et al. analisaram a influência físico-química do titânio da

zircônia e do esmalte bovino na adesão do S. mutans e da P. gingivalis. Após

análise das superfícies pode inferir que todas apresentaram características

hidrofóbicas. Os autores observaram que houve adesão bacteriana no esmalte

bovino mas não nas demais superfícies provavelmente pela presença de elementos

polares e não-polares do esmalte.

b. Rugosidade

Dependendo da escala, a rugosidade da superfície pode ser dividida em

três níveis: topografia macro, topografia micro e topografia nano. A substância com

características dimensionais entre 1-100nm é denominada como nanomaterial

(Pachuari et al., 2014).

Quirynen et al. (1993) relataram que superfícies com rugosidade menores

que 0,2µm não apresentam influência sobre a adesão bacteriana uma vez que as

bactérias medem mais que 0,2µm. Concluíram ainda que superfícies com Ra 0,8µm

aderiam mais biofilme com altas proporções de espiroquetas e micro-organismos

móveis quando comparado a superfícies polidas.

Bollen et al. (1996) também demonstraram que a rugosidade da superfície

do implante parece ser mais importante para a adesão bacteriana do que a

composição química da sua cobertura, e que uma rugosidade abaixo de 0,2µm não

mostrou ter maior efeito na composição do biofilme supra ou subgengival.

Quirynen et al. (1996) avaliaram clinicamente a adesão bacteriana em

quatro conexões protéticas de titânio em superfícies com diferentes rugosidades (Ra

 
0,21µm; Ra 0,11µm; Ra 0,13µm e Ra 0,05µm). Seis pacientes receberam próteses

provisórias com as quatro conexões protéticas que após três meses foram retiradas

e levadas para analise microbiológica. Puderam observar que após esse período o

percentual de cocos era de 50%. Concluíram não haver diferença entre as quatro

rugosidades avaliadas e que a presença de uma superfície polida reduz a adesão

bacteriana e com isso a chance de inflamação marginal e posterior perda óssea.

Albrektsson & Wennerberg (2004), em uma revisão sistemática

descreveram três distintos diferentes tipos de rugosidade de superfície presentes em

implantes osseointegráveis: rugosidade mínima (Ra ± 0,5µm) que é característico da

maioria dos implantes fabricados e são chamados de implantes maquinados;

rugosidade moderada (Ra entre 1,0 e 2,0µm) característicos de muitos implantes

fabricados tais como Osseotite®, TiUnite® e SLA®; e os rugosos (Ra>2,0µm) tais

como os tratados com plasma spray de titânio ou implantes com cobertura de

hidroxiapatita. Dentro da cavidade oral, a rugosidade da superfície tem importante

papel na formação do biofilme, pois todos os tecidos duros da cavidade oral atraem

muitas bactérias quando se aumenta a rugosidade, portanto é razoável considerar a

rugosidade da superfície como um co-fator para a longevidade. Os autores

concluíram que pacientes com periodontite agressiva e/ou implantes muito rugosos

(Ra>3,0µm) tem mais susceptibilidade para peri-implantite e perda tardia do

implante.

Teughels et al., em 2006 relataram que o impacto da rugosidade na

formação do biofilme pode ser explicados por três fatores:

- A adesão bacteriana inicial começa preferencialmente em locais onde

elas ficam abrigadas contra as forças de torque e encontram um ambiente

apropriado para a mudança de adesão reversível para a adesão irreversível;

 
 - A rugosidade aumenta a área para adesão bacteriana cerca de 2-3

vezes;

- Superfícies rugosas são mais difíceis de limpar, resultando assim num

ambiente propício para o “re-crescimento” bacteriano por multiplicação ou por

adesão de novas espécies.

Avaliando a natureza do infiltrado inflamatório em implantes de quatro

superfícies de diferentes tipos de transmucosos (Ataque ácido, Ra= 0,31µm,

maquinado, Ra = 0,23µm, maquinado com ranhura circunferencial de 0,4mm, Ra=

0,39µm e Oxidação Anódica, Ra= 0,36µm), Pongnarisorn et al. (2007) observaram

que todos os implantes apresentavam algum grau de infiltrado inflamatório quando

examinados histologicamente, independente do tipo de superfície. Os autores

relataram ainda que no estudo as amostras apresentaram similar distribuição de

Porphyromonas gingivalis, Taenarella forsythia e Fusobacteria nucleatum não sendo

influenciada pelo tipo de superfície.

Em 2010, Bürgers et al. avaliaram a adesão bacteriana in vitro e in vivo

entre a superfície polida e a superfície jateada que depois recebeu tratamento com

ataque ácido. As superfícies apresentaram rugosidade de 0,15µm e 0,96µm

respectivamente. Os autores relataram que a adesão bacteriana foi influenciada pela

rugosidade superficial. Uma grande quantidade de bactérias mortas foi observada

em ambas as superfícies o que afirma a capacidade essencial do titânio

isoladamente provocar a morte bacteriana do biofilme oral.

Ao compararem as superfícies jateada com plasma spray de titânio (TPS)

e a mesma superfície com uma cobertura de nitreto de titânio (TiN-TPS), Annunziata

et al. (2011) observaram que a TPS apresentava uma rugosidade de 6,0µm

enquanto a TiN-TPS apresentava 3,0µm de rugosidade. Com essa mensuração, os

 
autores puderam notar que havia uma menor aderência bacteriana sem entretanto

alterar as vantagens de proliferação de células precursoras ósseas.

Yeo et al., em 2012, demonstraram que enquanto a adesão bacteriana

diminui a rugosidade também reduz, e que superfície com jateamento apresentou

um rugosidade de 1,5µm enquanto a superfície maquinada 0,18µm.

Também em 2012, Fröjd et al., mencionaram que a superfície apenas

maquinada pode ser interessante quando eventuais problemas futuros podem surgir

pela reabsorção óssea e formação do biofilme na superfície do implante. Neste

estudo eles avaliaram rugosidades menores que 0.5µm (maquinadas) e de 1.0 à

2.0µm (Rugosidade moderada) com e sem incorporação de íons de cálcio.

Al-Radha et al.(2012) citam que existe um aumento da adesão bacteriana

quanto maior for a rugosidade, pois isto oferece um abrigo dentro das

irregularidades da superfície.

Já em 2013, Närhi et al. citaram que mesmo sendo a rugosidade maior

que 0,2µm, a superfície do implante após adição de solução salina fosfatada

tamponada para a formação de óxido de titânio, não mostrou ter maior adesão

bacteriana quando comparado a superfície apenas maquinada. Estes resultados

podem ser explicados pelo fato da saliva reduzir a energia livre de superfície e com

isso diminuir a interação da bactéria com a superfície do implante.

Portanto inúmeros estudos, como por exemplo Quirynen et al. (1996), Yeo

et al. (2012) e Hauslich et al. (2013) demonstraram que a adesão bacteriana

depende da rugosidade da superfície e que as rugosas são muitos mais colonizadas

por bactérias quando comparadas a superfícies apenas maquinadas.

c. Composição Química

 
 Em 1995, Leonhardt & Dahlen analisaram a influência antibacteriana do

titânio e do amálgama e dois dos componentes deste: o cobre e o estanho;

comparando com vidro como grupo controle. Os autores utilizaram grânulos desses

materiais sobre colônias de Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis,

Actinomyces naeslundii, Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium spp. e

Prevotella intermedia. Os autores concluíram que o cobre e o amálgama

apresentaram alta citotoxicidade para as bactérias orais, já o titânio apresentou

baixa ação antimicrobiana.

Yoshinari et al. (2000) analisaram a adesão bacteriana utilizando vários

tipos de modificação de superfícies de titânio. Eles utilizaram discos de titânio e

promoveram uma cobertura a seco de íons de cálcio, sódio, flúor por oxidação ou

por cobertura de alumina ou nitreto de titânio e ainda por um feixe de íons (prata,

estanho, zinco, platina). Os discos polidos foram todos lixados e receberam a

cobertura a seco. Os autores observaram que a amostra com cálcio apresentava

uma maior aderência bacteriana e que a cobertura com alumina mostrou uma

redução da adesão bacteriana. A superfície polida modificada com flúor apresentou

significativa redução de colonização bacteriana com redução na viabilidade

bacteriana. A prata foi gradativamente se dissolvendo e tendo uma ação anti-

bacteriana sem causar qualquer efeito citotóxico, efeito similar foi visto nas

superfícies modificadas com zinco.

Bunetel et al. (2001) estudaram a influência do titânio isolado e associado

na potencialização de antibióticos em cepas de Porphyromonas gingivalis. Os

autores concluíram que o titânio isolado não propicia um efeito antibacteriano que ao

contrário aumenta o crescimento bacteriano, porém na presença de metronidazol o

titânio potencializou a ação do anti-microbiano, esse mesmo efeito não foi observado

 
em relação a espirimicina. A potencialização do metranidazol pode ser explicado

pela grande capacidade de redução química do anti-microbiano que é aumentada na

presença do titânio.

Em 2001, Yoshinari et al. investigaram a influência de superfícies polidas

de titânio porém modificadas quimicamente com a implantação de íon F+ na

colonização bacteriana e sua citotoxicidade. Puderam observar que a implantação

de íon F+ revelou uma diferença significativa na inibição do crescimento bacteriano

quando comparado a superfícies apenas polidas sem implantação de F+. Com

relação a citotoxicidade não houve diferença entre as amostras analisadas. Os

diversos mecanismos de ação do flúor no metabolismo bacteriano foram descritos

por Marquis (1995). Neste estudo, o autor descreveu que um dos principais

mecanismos de ação é a acidificação do citoplasma celular bacteriano, reduzindo a

tolerância das bactérias aos ácidos produzidos. Existe um interesse cada vez maior

nas propriedades do flúor e no seu mecanismo de ação (van Loveren, 2001; Phan et

al., 2002).

Superfícies com cobertura de fosfato de cálcio aumentam a rugosidade

dos implantes e são usados para promover a osseointegração, porém tem sido

relatado que também aumentam o risco a falhas devido a doença peri-implantar

(Norowski & Bumgardner, 2009).

Größner-Schreiber et al., em 2009, avaliando a formação do biofilme em

seis diferentes tipos de superfícies (Nitreto de zircônia, titânio polido, titânio lixado

com umidade, vidro coberto com nitreto de zircônia, vidro jateado com titânio e vidro

como controle) observaram que as rugosidades eram similares (Ra<0,2µm), contudo

os ângulos de molhabilidade e energia de superfície eram diferentes, e que as

diferentes superfícies aderiam diferentes espécies bacterianas, entretanto

 
Streptococcos estavam presentes em 45% do volume bacteriano. Concluíram ainda

que as superfícies de titânio formavam consideravelmente mais biofilme quando

comparados à superfície coberta por nitreto de zircônia.

No seu estudo em 2010, Liao et al. compararam a ação anti-microbiana

da superfície de titânio com adição de prata em relação a mesma ação de

superfícies de titânio polida. Após 24h de incubação, observou-se 94,79% do

Aggregatibacter actinomycetemcomitans e mais de 93% da Porphyromonas

gingivalis foram inibidas pela superfície com adição de prata e que a adesão dessas

espécies bacterianas foi marcadamente diminuída nessa superfície quando

comparadas a superfície de titânio polida.

Em 2012, Fröjd et al. não observaram diferenças entre superfícies com

incorporação de cálcio quando analisadas a osseointegração em implantes

maquinados (Ra < 0,5µm) e implantes com rugosidade moderada (Ra entre 1,0 e

2,0µm) , indicando assim a importância da rugosidade nesse caso. Entretanto, ao

comparar implantes com rugosidade moderada (Ra entre 1,0 e 2,0µm) com ou sem

incorporação de cálcio, observaram significativo aumento de torque de remoção nos

implantes com rugosidade moderada e incorporação de cálcio.

Em relação a incorporação de cálcio na superfície, Rodriguez Y Baena

(2012) analisaram a adesão bacteriana em três diferentes tipos de tratamento de

superfície de titânio. Foram usadas superfícies maquinadas, com duplo ataque ácido

(Osseotite®) e duplo ataque ácido com escala nanométrica com discreta deposição

cristalina de fosfato de cálcio (Nanotite®). Os autores notaram uma menor adesão

bacteriana da superfície Nanotite® quando comparadas as demais superfícies.

Wickens et al., em 2012, analisaram a influência de coberturas de prata

em estruturas de aço inoxidável cirúrgico observaram que a cobertura de prata não

 
foi capaz de reduzir a aderência bacteriana, contudo o aumento da concentração de

prata levou a redução significante da sobrevivência bacteriana.

No estudo de Al-Radha et al., em 2012, os autores concluíram que a

zircônia pura e o titânio jateado com zircônia foram mais efetivos em reduzir a

adesão bacteriana e que modificar a superfície do titânio com zircônia propicia ao

titânio as mesmas características da zircônia pura no que se refere a redução de

adesão bacteriana, ou seja, houve uma influência da composição do material.

Hauslich et al., em 2013 analisaram a adesão bacteriana em superfícies

de titânio modificadas. Foram utilizados três tipos de tratamento de superfície

(maquinado, ataque ácido e ataque ácido com jateamento). Foram adicionados

proteínas humanas (albumina ou fibronectina) e íons cálcio nas superfícies

analisadas. As superfícies mais rugosas (ataque ácido e ataque ácido com

jateamento) foram as que aderiram mais bactérias. As superfícies com adição de

proteína mostraram uma menor adesão bacteriana entretanto o cálcio foi encontrado

servindo de ligante entre as bactérias e as superfícies analisadas.

Chang et al., em 2013, avaliaram performance anti-bacteriana do carbono

em coberturas de nitreto de zircônia utilizados em implantes de titânio quando

comparados ao titânio puro, bem como a biocompatibilidade das amostras.

Observaram que o nitreto de zircônia não foi capaz de prevenir o crescimento

bacteriano quando comparado ao titânio puro. Porém, os autores concluíram que a

inclusão de carbono não só aumentou ligeiramente a ação anti-bacteriana do nitreto

de zircônia como também demonstrou melhores resultados de biocompatibilidade

para fibroblastos gengivais humanos.

Em 2013, Gupta et al. investigaram a performance anti-bacteriana do

óxido de titânio e do óxido de titânio com incorporação de prata. Os autores

 
observaram que ambas superfícies tiveram capacidade de reduzir a viabilidade

bacteriana, contudo a incorporação de prata melhorou os resultados.

Avaliando a influência do íon de prata na formação e viabilidade do

biofilme, Yeniyol et al. (2014) estudaram quatro superfícies: titânio puro (Ti),

anodizada com óxido de titânio (TiO2), anodizada com óxido de titânio e adição de

prata (AgTiO2) com estrutura nanotubular e um controle. Os autores testaram a ação

dessas superfícies em três espécies bacterianas (Aggregatibacter

actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia e Campylobacter rectus) e observaram

a superfície AgTiO2 não promoveu maior adesão bacteriana e notaram ainda que as

superfícies TiO2 e AgTiO2 promoveram uma redução da atividade bacteriana,

apresentando as suas superfícies cobertas por bactérias com aspecto morfológico

deteriorado indicando a morte bacteriana, tendo comprovada o aumentado as

propriedades antibacterianas dessas superfícies em relação as superfícies a base

de titânio puro.

Ji et al. (2015) avaliaram a atividade anti-bacteriana do Nitreto de zircônia

(ZrN), do nitreto de titânio (TiN) e do nitreto de titânio e zircônia ((Ti1-xZrx)N)

incorporados ao titânio grau II , bem como a viabilidade de osteoblastos. Amostras

de titânio polido (Ra<0,2µm) foram utilizados como controle e as amostras

apresentavam rugosidade entre 0,26-0,30µm. Os autores observaram que as

amostras de TiN, ZrN e (Ti1-xZrx)N apresentaram atividade anti-bacteriana para S.

mutans porém não para P. gingivalis, demonstrando assim que podem ser efetivos

nos estágios iniciais de aderência bacteriana. Observaram ainda que não houve

influência na viabilidade dos osteoblastos em nenhuma das amostras.

Vários trabalhos têm demonstrado a influência das propriedades físico-

química do titânio na formação do biofilme, porém em 2011, Renvert et al., afim de

 
verificar a influência da superfície do implante no inicio da doença peri-implantar,

realizaram um revisão da literatura usando o banco de dados PUBMED e

COCHRANE. Eles concluíram que faltam estudos que investiguem esta influência e

que baseado nos estudos existentes não é possível responder essa questão, e que

limitadas evidencias apontam para as características da superfície como tendo efeito

na progressão da doença já estabelecida.

As tentativas de produzir um inovador biomaterial realmente com ação

anti-infecciosa confiável, cotam com diferentes estratégias sendo alguns somente

para criar um material repelente bacteriano, enquanto outros visam produzir um

material bio-ativo dotado com propriedades anti-bacterianas, porém os materiais não

podem deixar de ser capazes de apresentar biocompatibilidade estando focada na

cito-compatibilidade e na integração tecidual, portanto componentes antimicrobianos

em alta concentração podem potencialmente afetar a viabilidade da célula do

hospedeiro. Igualmente superfícies muito anti-adesivas podem interferir no processo

de aderência celular do hospedeiro e a integração do implante aos tecidos

circundantes (Campoccia et al., 2012).

O óxido de titânio (TiO2) pode ser encontrado na escala micro e através

da nanotecnologia pode passar para a escala nanométrica, nesta escala o TiO2 é

capaz de alterar as propriedades da superfície e ter uma características foto-

catalítica que pode perdurar por anos, esta característica pode conferir ao material

uma ação anti-bacteriana. Contudo se em grandes concentrações, o TiO2, pode

tornar-se prejudicial, uma que vez exposto a luz ultra-violeta pode assumir até

mesmo características carcinogênicas, isso ocorre devido a sua alta instabilidade,

chamada de excitação, o TiO2 exibe uma forte propriedade de oxi-redução liberando

grande quantidade de O2- (Bogdan et al., 2015)

 
3. PROPOSIÇÃO

O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a adesão e viabilidade

bacteriana em superfície de duplo ataque ácido com discreta deposição cristalina de

íons flúor (NANO), comparado com superfícies duplo ataque ácido (DAA) e polida

(P), correlacionando com as características físico-química destas superfícies.

 
4. MATERIAIS E MÉTODOS

As análises das características do material foi realizado no Instituto Militar

de Engenharia, Laboratório de Engenharia de Materiais (Rio de Janeiro) e as

análises microbiológicas no Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic

(Campinas, São Paulo).

4.1 Grupos Amostrais

Foram utilizados 48 discos de titânio grau 4 com 6mm de diâmetro e 2mm de

espessura, sendo 16 discos por superfície, tendo estes recebidos as seguintes

caracterizações de superfície: Polida (16 discos), Duplo Ataque Ácido (Porous®) e

Duplo Ataque Ácido Nanométrico com Discreta Deposição Cristalina de Íons Flúor

(Pourus Nano®), obtidos pela empresa Conexão Sistema de Prótese® (São Paulo,

Brasil).

4.2 Engenharia das Superfícies

Foram avaliadas e realizadas medição da rugosidade (Ra), avaliação de

composição química (EDS), molhabilidade (Mo) e morfologia ultraestrutural nas

diferentes superfícies a serem comparadas.

4.2.1 Ensaio de rugosidade

A rugosidade das superfícies foi calculada usando a Ra que é a média

aritmética dos valores absolutos das ordenadas dos afastamentos dos pontos do

perfil de rugosidade, em relação à linha média.

As rugosidades das superfícies (Ra) foram medidas em 4 discos de cada

superfície com os mesmos tratamentos usados nos implantes e com emprego de um

 
perfilômetro de contato (Mitutoyo, modelo Surftest SJ200, Brasil, Suzano). Foram

realizadas 4 mensurações lineares em cada amostra de acordo com o padrão DIN

ISO 1302, sendo calculada a média aritmética dos valores absolutos para cada disco

(Ra), e a média aritmética do valor da superfície analisada sendo a média entre

todas medias isoladas de cada disco (R2).

4.2.2 Ensaio de molhabilidade

O ângulo de molhabilidade (Mo) foi medida com o uso de um goniômetro

Ten Angstron modelo F100. Foi dispersado 1µL de água deionizada sobre a

superfície da amostra e através do software Fta32 vídeo 2.0, o ângulo interno entre

a gota e a superfície foi calculado. Foram realizadas duas medições em cada disco,

utilizando os mesmos 4 discos usados para mensuração da rugosidade. A média

aritmética de cada superfície foi calculada. Para ângulos menores que 90º a

superfície foi considerada hidrofílica e para ângulos maiores que 90º hidrofóbicas.

4.2.3 Ensaio ultraestrutural (Microscopia eletrônica de varredura) e

Composição química (EDS)

Foram utilizados 3 discos, sendo um disco de cada amostra para análise

estrutural e química. As amostras foram observadas ao Microscópio Eletrônico de

Varredura (MEV) QUANTA FEG 250 FEI Holanda, Eindhoven, para observar a

topografia e morfologia das rugosidades. A composição química das amostras foi

efetuada com a microssonda EDS acoplada ao MEV (QUANTA FEG 250 FEI

Holanda, Eindhoven).

4.3 Ensaio de adesão bacteriana

 
 Para o presente estudo foram utilizadas cepas-padrão ATCC (American Type

Culture Collection, EUA) de Streptococcus mutans (ATCC 25175) isoladas e

mantidas no laboratório de Microbiologia do Instituto e Centro de Pesquisas São

Leopoldo Mandic (Campinas, SP).

Streptococcus mutans foi utilizada neste estudo, por ser considerada

bactérias colonizadoras iniciais e por representarem 45% das espécies bacterianas

no biofilme inicial (Größner-Schreiber et al., 2009).

Estas cepas foram mantidas congeladas, para posterior ativação em meio de

cultura caldo BHI (Brain Heart Infusion, Himedia, India), sendo mantidas por 24

horas em estufa bacteriológica a 37ºC, em condições de microaerofilia. Após este

período, com o auxílio de uma alça de platina, foi coletada uma porção do meio de

cultura e feito repique em placa de Petri contendo Ágar BHI, para que houvesse o

crescimento da cepa a ser estuda, nas condições descritas anteriormente, em estufa

bacteriológica.

Das colônias crescidas overnight foram obtidos caldos contendo uma

densidade final de 15x108 células/ml, correspondendo ao fator n. 5 da escala de

McFarland (Nefelobac, Escala Nefelométrica de McFarland, Brasil).

Para determinar a adesão e viabilidade bacteriana em cada superfície, a

cepa de S. mutans foi cultivada em cada amostra para cada superfície e incubadas

por 4h a 37ºC em condições de microaerofilia, conforme descrito anteriormente.

Como controle positivo da viabilidade bacteriana, S. mutans foi cultivado em

lamínulas de vidro. Como controle negativo, as culturas foram tratadas com álcool

isopropílico e plaqueadas em lâminas de vidro.

As amostras foram delicadamente lavadas com solução salina estéril (0,9%) e

um kit de viabilidade BacLight LIVE/DEAD (Sonda Molecular, OR, EUA) foi utilizado.

 
O Kit inclui dois ácidos nucléicos fluorescentes: SYTO9 e Iodeto de Propidium. O

SYTO9 (fluorescência verde) identifica as bactérias viáveis, enquanto o Iodeto de

Propidium (fluorescência vermelha) identifica bactérias não viáveis.

Para avaliação da viabilidade, 1µL de solução de cada área foi adicionado a

3mL de solução salina estéril (0,85%) e depois misturada. 70µL da solução foi

dispensada sobre cada superfície e incubada por 15 minutos no escuro em

temperatura ambiente. As colônias bacterianas foram examinadas no microscópio

de fluorescência (Zeiss, Alemanha) usando objetiva de imersão a óleo (100X). A

excitação e emissão do comprimento de onda do SYTO9 e iodeto de propidium foi

de 488nm e 525nm, respectivamente. Para cada amostra foi realizada dez imagens

em posições padronizadas de cada ponto da curva de calibração. Para determinar a

viabilidade das espécies bacterianas aderidas para cada tipo de liga e tratamento de

superfície, será medida a razão entre as zonas verdes (células viáveis) e a área total

da imagem (Figura 01), utilizando-se o programa ImageJ (National Institute of

Health, NIH, EUA).

Os experimentos foram realizados em triplicatas, sendo feito duplicatas a

cada experimento para cada espécie bacteriana.

 
Figura 1. Imagens representativas da cepa de S. mutans cultivadas nas diferentes
superfícies. Em A: bactérias coradas com SYTO9 (fluorescência verde), em B:
bactérias coradas com iodeto de propidium (fluorescência vermelha), em C: merged
(fluorescência verde + vermelha). Aumento original 100X.

4.4 Análise da morfologia ultraestrutural (MEV)

A cepa bacteriana plaqueada nas diferentes superfícies nas mesmas

condições descritas anteriormente, foram fixadas com solução de glutaraldeido v/v a

2,5% em 0,1M de tampão cacodilato (pH 7,2) por 1h a 4ºC, sendo lavado em

seguida na mesma solução tampão à 0,05M, seguida da desidratação com

concentrações crescentes de álcool etílico.. As amostras foram montadas em

suportes de alumínio (stubs), e colocadas em um metalizador (Leica EM ACE600,

procdenciia) afim de receberam cobertura com platina com espessura de 8nm e

depois examinados ao Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) (QUANTA FEG

250).

4.5 Análise estatística

As abordagens estatísticas foram conduzidas adotando-se o nível de

significância de 5%, no programa SPSS 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). A análise

entre os grupos foi realizada utilizando One-way (ANOVA), seguido de Tukey A

verificação de correlação entre o percentual de área apresentando bactérias viáveis

 
e não viáveis aderidas e a contagem desses micro-organismos foi realizada por

meio de testes de Pearson.

 
5. RESULTADOS

5.3 Análise Físico-química das Amostras

Análises das características físico-químicas das amostras foram

realizadas previamente com objetivo de avaliar a influência da rugosidade,

molhabilidade e a composição química na aderência e viabilidade bacteriana.

Os valores da rugosidade estão mostrados na tabela 1 e no Gráfico 1.

Observa-se que a superfície polida apresentou valores menores de rugosidade

(0,20±0,02) em relação à superfície DAA (0,53±0,07) e NANO (0,56±0,04), com

diferença estatisticamente significante(*) entre a superfície polida e as demais

superfícies (F=69,39 e p<0,0001), já as superfícies rugosas foram consideradas

estatisticamente similares entre si (p=0,49).

Polida DAA DAA Nanométrica (NANO)

Média da Superfície (R2) 0,20* 0,53 0,56

Desvio Padrão 0,02 0,07 0,04

Tabela 1: Média da rugosidades da superfícies em µm (R2) p<0,05

Fonte: Autoria própria

 
 b
b
Rugosidade  (Ra)  em  

Gráfico 1: Representação das médias das rugosidades (Ra) em µm. Letras

diferentes indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,01). Teste
de Comparação Múltipla de Tukey.

Fonte: Autoria Própria.

Após análise da rugosidade, os discos de cada superfície foram

preparados para mensuração da molhabilidade da superfície afim de se verificar as

características de hidrofilicidade das amostras estudas. Os valores da molhabilidade

estão mostrados na tabela 2 e no Gráfico 2.

Observa-se que a superfície polida apresentou valores menores de

molhabilidade (69,13±2,43) em relação à superfície DAA (92,82±5,33) e NANO

(94,33±4,55), foi utilizado então o teste Tukey para análises múltiplas e notou-se que

superfície polida diferia das demais (p=0,0001*), entretanto as superfícies rugosas

foram consideradas estatisticamente similares (p=0,61). Notou-se portanto que a

superfície polida se apresentou hidrofílica (Ø<90º) enquanto as demais (DAA e

NANO) se mostraram hidrofóbicas (Ø>90º).

 
 Polida DAA NANO

Angulo de Molhabilidade da Superfície (°) 69,13°* 92,82° 94,33°

Desvio Padrão 2,43 5,33 4,55

Tabela 2: Ângulos de molhabilidade das superfícies (Mo). O símbolo * representa

diferença estatística significante. p<0,05
Fonte: Autoria própria

Ângulo  de  Molhabildade  em  graus  (°) b

b

Gráfico 5: Representação das médias dos ângulos de molhabilidade

em graus (Mo). Letras diferentes indicam diferença estatisticamente
significante (p < 0,01). Teste de Comparação Múltipla de Tukey
Fonte: Autoria Própria.

A análise ultraestrutural da topografia das superfícies estão demonstradas

na Figura 2.

 
 As amostras polidas apresentam ranhuras unidirecionais sendo

observados em aumentos de 1000x e 20000x (figura 2A e 2B).

A" B"

C" D"

E" F"

Legenda: Fotomicrografia ultraestrutural das superfícies polida (A e B), DAA (C e D)

e NANO (E e F). Barra= 100 μm (A, C e E) e 5μm (B, D e F).

 
 G"
Legenda: Fotomicrografia ultraestrutural da superfície NANO. Barra= 500 nm.

A superfície DAA apresenta rugosidades uniformes com presença de

crateras microscópicas (figura 2C e 2D), já a superfície NANO apresenta com

rugosidade no interior da rugosidade micro sendo ainda mais regulares em

aumentos de ate 1000x (figura 2E) e em aumentos maiores (20000x figura 2F) as

rugosidades estão mais uniformes e possuem escala nanométrica dentro das

rugosidades microscópicas (461nm) como pode ser notado no aumento de 100000x

da figura 2G. Observar que algumas rugosidades medem menos que 100nm, por

isso sendo consideradas nanométricas.

Sob a análise da microsonda EDS, a composição química das amostras foi

realizada e está demonstrada na Figura 3 e mostrou haver predominância de titânio.

Na análise de composição química da amostra não se pode observar a

presença do íon flúor em nenhuma da amostras pesquisadas.

 
 Alexandre Barboza 6/7/15 20:09
Deleted: ... [1]

A"

B"

C"

Legenda: Fotomicrografia ultraestrutural e EDS das superfícies polida (A),

DAA (B) e NANO (C). Barra= 7 μm.

 
 Os resultados representativos da contagem e porcentagem das áreas

com cepas vivas e mortas para cada superfície estão apresentadas na tabela 3 e

gráfico 6.

A análise de variância a um critério revelou que a contagem de bactérias

viáveis foi significativamente influenciada pelos tratamentos de superfície (p= 0,007).

Pelo teste de Tukey identificou-se que na superfície polida, a contagem de bactérias

viáveis foi significativamente menor em relação àquela verificada na superfície com

duplo ataque ácido nanométrico com deposição de flúor (NANO). Já na superfície

com duplo ataque ácido (DAA), a contagem de bactérias foi intermediária, não

diferindo significativamente daquela observada nas duas outras superfícies

investigadas .

Tabela 3 – Valores médios e desvios padrão da contagem e do percentual de área

apresentando bactérias viáveis e não viáveis aderidas (%), segundo o tratamento de
superfície.

Bactérias viáveis Bactérias não viáveis

Superfície
Contagem (UA) Área (%) Contagem (UA) Área (%)

Polida 3.855 (965) a 8,34 (2,48) a 317 (83) a 0,68 (0,18) a

DAA 4.808 (666) ab 12,79 (1,55) b 386 (76) a 0,75 (0,21) a

NANO 5.564 (1.529) b 11,76 (3,95) b 646 (167) b 1,95 (0,70) b

ANOVA p = 0,007 p = 0,004 p > 0,001 p > 0,001

Legenda: DAA: duplo ataque ácido (Porous®); NANO: duplo ataque ácido
nanométrico (Porous Nano®). ANOVA: análise de variância. Médias seguidas por
letras distintas dentro de uma mesma coluna diferem significativamente entre si.
Fonte:Autoria própria.

 
 Gráfico 6 – Diagrama de colunas da contagem de bactérias viáveis e não

viáveis, segundo o tratamento de superfície.

8000

7000
Contagem total de bactérias (UA)

6000 646

5000 386

4000 317

3000

2000

1000

0
Superfície polida Superfície com duplo ataque Superfície com duplo ataque
ácido ácido nanométrico

Bactérias viáveis Bactérias não viáveis

Fonte: Autoria própria.

A análise de variância a um critério (p = 0,004) e o teste de Tukey

revelaram que o percentual de área em que as bactérias estavam aderidas foi

significativamente menor na superfície polida. Não houve diferença significativa

entre as superfícies com duplo ataque ácido nanométrico (NANO) ou duplo ataque

ácido (DAA) quanto ao percentual de área em que as bactérias estavam aderidas

(tabela 3 e gráfico 7).

Gráfico 7 – Diagrama de colunas do percentual de área em que as

bactérias viáveis e não viáveis estavam aderidas, segundo o tratamento de

superfície.

 
 20

18
Área total de adesão bacteriana (%)
16

14
0,75
1,95
12

10
0,68
8

0
Superfície polida Superfície com duplo ataque Superfície com duplo ataque
ácido ácido nanométrico

Bactérias viáveis Bactérias não viáveis

Fonte: Autoria própria.

Análises de variância também indicaram que a contagem de bactérias

não viáveis (p < 0,001) e o percentual de área em que essas bactérias estavam

aderidas (p < 0,001) foram afetadas pelo tipo de tratamento de superfície. Por testes

de Tukey constatou-se que tanto a contagem quanto o percentual de área ocupado

por bactérias não viáveis foram significativamente maiores quando a superfície

apresentava duplo ataque ácido nanométrico com deposição de flúor (NANO).

Também foi verificado que não existiu diferença significativa entre as superfícies

polidas e com duplo ataque ácido (DAA) em termos de contagem e percentual de

área em que bactérias não viáveis estavam aderidas (tabela 3 e gráficos 6 e 7).

Testes de Pearson indicaram a existência de correlação positiva e

moderada entre o percentual de área em que bactérias viáveis estavam aderidas e a

contagem dessas bactérias (p = 0,002; r2= 0,538). Já para as bactérias não viáveis,

 
houve correlação positiva e forte (p < 0,001; r2= 0,896) entre o percentual de área

em que esses micro-organismos estavam aderidos e sua contagem (gráfico 8).

Gráfico 8 – Diagrama de dispersão do percentual de área em que

bactérias viáveis e não viáveis estavam aderidas em função da contagem desses

micro-organismos.

8000

7000
Contagem de bactérias (UA)

6000

5000

4000

3000

2000

1000

0
0 5 10 15 20 25
Adesão bacteriana por área (%)

Bactérias viáveis Bactérias não viáveis

Fonte: Autoria própria.

As fotomicrografias ultraestruturais das superfícies colonizadas são

apresentadas nas Figuras 4 a 6 e demonstram a característica da rugosidade e a

penetração bacteriana nas rugosidades das superfícies tratadas.

 
 A B C
 
Figura 4. Fotomicrografia ultraestrutural da colonização bacteriana na superfície

polida. Barra: A=50µm, B=10µm, C=3µm.

A B C

Figura 5. Fotomicrografia ultraestrutural da colonização bacteriana na superfície

DAA. Barra: A=50um, B=10um, C=3µm.

A B C

Figura 6. Fotomicrografia ultraestrutural da colonização bacteriana na superfície

NANO. Barra: A=10um, B=2um, C=1µm.

 
6. DISCUSSÃO

Apesar do uso cada vez maior dos implantes osseointegráveis, poucos

são os estudos que avaliam a relação entre aderência bacteriana e a natureza físico-

química das superfícies do implante (Yoshinari et al., 2000).

Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a adesão e

viabilidade bacteriana em superfície de duplo ataque ácido com discreta deposição

cristalina de íons flúor (NANO), comparado com superfícies duplo ataque ácido

(DAA) e polida (P), correlacionando com as características físico-química destas

superfícies.

Mesmo sendo outras espécies bacterianas características da doença peri-

implantar, tais como P. gingivalis, P. intermedia, C. rectus (Pongnarisorn et al., 2007,

Mouhri et al. 2012; Yoniyol et al. 2014), utilizou-se no presente estudo o S. mutans,

pois conforme Fürst et al. (2011) e Ji et al. (2015) essa espécie bacteriana é

considerada colonizadora inicial das superfícies de diferentes biomateriais, incluindo

o titânio (Teughels et al., 2006; Größner-Schreiber et al., 2009; Yeo et al., 2012) e

esta colonização inicial proporciona condições favoráveis para a colonização por

patógenos relacionados a doença periodontal e peri-implantar (Lee et al. 2011 e

Rodriguez Y Baena et al. 2012). Além disso, o S. mutans é a espécie mais

prevalente no biofilme (Größner-Schreiber et al., em 2009). Portanto redução do

número de bactérias colonizadoras iniciais aderidas à determinada superfície é um

importante mecanismo de atividade anti-bacteriana da superfície do implante (Ji et

al. 2015). Campoccia et al. (2012) mencionaram ainda, que esta espécie tem sido a

mais utilizada por serem o mais prevalente agente etiológico utilizado em estudos

em aplicação de medicamentos específicos.

 
 A energia livre de superfície tem sido relatada como outro fator que pode

influenciar na adesão bacteriana (Yeo et al., 2012; Rodriguez Y Baena et al., 2012),

contudo esse parâmetro não é relevante em superfícies com rugosidades menores

que 0,1µm (Busscher et al.,1984). A molhabilidade tem sido utilizada para verificar a

energia livre de superfície, onde ângulos de molhabilidade menores que 90º são

considerados hidrofílicos, enquanto as superfícies com ângulos maiores que 90º são

considerados hidrofóbicos e com baixa capacidade de molhabilidade (Größner-

Schreiber et al., 2009). No presente estudo, a superfície polida apresentou ângulo de

69,13° (±2,43), sendo portanto considerada hidrofílica enquanto para as superfícies

com rugosidade DAA e NANO os ângulos encontrados foram 92,82° (±5,33) e

94,33° (±4,55), respectivamente, sem diferenças estatísticas entre as mesmas.

Estes valores de molhabilidade, aliado à topografia de superfície

apresentam importância para a seletividade e na quantidade da adesão bacteriana

(Quirynen et al. 1994; Almaguer-Flores et al. 2012). Bactérias hidrofóbicas colonizam

melhor superfícies também hidrofóbicas e a mesma relação se observa para

bactérias e superfícies hidrofílicas (Busscher & Dahlen, 1984). No presente estudo

foi utilizado o S. mutans que é considerado micro-organismo hidrofóbico (McBride et

al., 1984; Weerkamp et al.,1985), portanto era de se esperar uma maior adesão

bacteriana nas superfícies rugosas, o que de fato pôde ser observado. Uma área

menor da superfície polida hidrofílica foi colonizada (9,02%) quando comparado com

as superfícies hidrofóbicas avaliadas neste estudo (DAA=13,54% e NANO=13,71%).

Esta diferença pode estar relacionada às características hidrofóbicas da espécie

bacteriana utilizada neste estudo..

A presença da película adquirida tem sido relatada como relevante para a

adesão bacteriana (Bürgers et al., 2010), além de poder alterar a propriedade físico-

 
química da superfície podendo aumentar a energia de superfície do titânio e com

isso influenciar na formação do biofilme (Hauslich et al., 2013). Estas alterações na

superfície devem-se ao fato de adsorção de macromoléculas, podendo atrair ou

repelir micro-organismos (Teughels et al., 2006). Contudo, cepas de S. mutans não

são significativamente influenciadas pela presença ou ausência da película adquirida

(Weerkamp et al., 1985 e Närhi et al., 2013), não sendo utilizada no presente estudo.

Existe uma correlação positiva entre rugosidade e energia livre de

superfície, altos valores de energia livre de superfície estão em superfícies rugosas

o que pode causar uma maior adesão bacteriana (Ericsson et al., 1992), entretanto

a adesão bacteriana inicial pode afetar a micro-estrutura da superfície e

consequentemente a sua energia livre de superfície (Almaguer-Flores et al., 2012).

Neste estudo também houve uma correlação positiva entre a rugosidade e a

molhabilidade quando comparamos a superfície polida com as rugosas. Porém era

esperado que superfícies mais rugosas apresentem ângulos de molhabilidade

menores visando maior superfície de contato com os líquidos corpóreos e com as

proteínas plasmáticas (Junker et al. 2009). No presente estudo esta relação não foi

observada, corroborando com estudo de Fernandes (2014); porém este fato pode

ser explicado por dois fatores: primeiro a possibilidade de ocorrer bolhas de ar

aprisionadas no interior das rugosidades que impediriam a penetração da água,

alterando assim o ângulo de molhabilidade, e o segundo fator deve-se ao fato de

existirem modelos matemáticos que prevêem correções no ângulo de contato em

função de alterações na rugosidade do material, que segundo o modelo de Wenzel

que prevê a existência de um fator de rugosidade (r) para correção entre o ângulo de

contato aparente observado por medições experimentais e o ângulo verdadeiro.

 
 No presente estudo, a rugosidade variou entre a superfície polida

(0,20µm) e as demais superfícies rugosas (DAA=0,53µm e a NANO=0,56µm) sendo

estatisticamente significante (p=0,0001). Estes valores indicam que as superfícies

DAA e NANO apresentam rugosidade mínima (Wennerberg & Albrektsson, em

2009). Yeo et al. (2012), em seu estudo obtiveram uma rugosidade para as

superfícies polidas de 0,18µm, valor muito próximo ao encontrado no presente

estudo (Ra=0,20µm), já Rodriguez Y Baena et al.(2012), encontraram os valores de

rugosidade para superfícies polidas de Ra=0,34µm.

Rodriguez Y Baena et al. (2012) analisando o mesmo tipo de tratamento

porém com deposição discreta de cálcio, encontraram valores de Ra= 1,127 para a

superfície com tratamento de duplo ataque ácido e Ra= 0,662µm para o tratamento

com deposição de cálcio, esses valores foram bem acima dos encontrados em

nosso estudo. Vários estudos indicam que quanto maior foi a rugosidade maior será

a adesão bacteriana (Quirynen et al.,1996; Teughels et al., 2006, Yeo et al., 2012;

Hauslich et al., 2013). Segundo Bollen et al. (1996), rugosidades abaixo de 0,2µm

não teriam mais efeito sobre a aderência bacteriana, contudo Narhi et al. (2012)

afirmaram que superfícies com rugosidade acima de 0,2µm poderiam ser menos

propensas a adesão bacteriana desde que fossem realizadas modificações na

energia de superfície ou na composição química desta superfície.

No presente estudo houve um aumento no número total de colônias

bacterianas aderidas nas superfícies mais rugosas (DAA e NANO) quando

comparamos a superfície polida (P), sendo estatisticamente significativa (p=0,004),

fato também observado com Hauslich et al. (2013) e também relatadas por Yeo et

al., (2012) em sua revisão de literatura. Contudo Rodriguez Y Baena et al., em 2012,

demonstraram que a superfícies rugosas apresentaram uma menor contagem de

 
colônias na superfície rugosa, esse fato observado por esses autores pode dever-se

ao curto período (2h) de incubação das amostras. Entretanto, em nosso estudo,

entre as duas superfícies rugosas estudadas não houve diferença estatística entre

elas (p=0,06), pelo provável fato das rugosidades serem similares estatisticamente.

É possível afirmar que superfícies rugosas são mais difíceis de serem

descontaminadas um vez colonizadas, pois como observamos no presente estudo

utilizando a MEV, as células bacterianas estavam alojadas no interior das

rugosidades, sendo tal dificuldade de remoção das bactérias também relatado por

Renvert et al. (2011), entretanto a presença de rugosidades demonstram maior

osseointegração do que as superfícies polidas (Sul et al., 2008), desta forma

reduzindo a chance de perda óssea inicial e futura colonização bacteriana da

superfície do implante (Mombelli, 2002; Mombelli et al., 2011; Qian et al., 2012).

Outro fator que pode afetar a colonização bacteriana é o tipo de

tratamento aplicado na superfície do implante. No presente estudo o tipo de

tratamento aplicado nas superfícies foi o duplo ataque ácido que tem sido descrito

como um tratamento que proporciona menor aderência bacteriana quando

comparado as superfícies jateadas (Yoshinari et al., 2000, Hauslich et al., 2011 Yeo

et al., 2012 e Almaguer-Flores et al. 2012). Pongnarisorn et al. (2006) relataram não

haver diferenças na colonização bacteriana entre superfícies com ataque ácido,

polida e com oxidação anódica média.

Além destes, a composição química do implante tem sido relatada como

sendo um dos fatores que podem influenciar a adesão e viabilidade bacteriana

(Teughels et al., 2006; Rodriguez Y Baena et al., 2012). Varias modificações com

diferentes métodos tem sido descritos na literatura (Pachuari et al., 2014).

 
 Bunetel et al. (2001) observaram que o titânio puro não apresenta

nenhuma capacidade antibacteriana pois em sua pesquisa só ocorreu a inibição

bacteriana quando o titânio estava conjugado com espirimicina. Entretanto uma

pequena capacidade antibacteriana foi observada neste presente estudo, pois

superfícies polidas de titânio comercialmente puro apresentaram 317 colônias de

bactérias não-viáveis sendo significativamente menor (p<0,001) que as superfícies

com adição cristalina com flúor, corroborando os achados de Leonhardt & Dahlen

(1995) que analisaram in vitro a influência do titânio em bactérias orais e observaram

que o titânio possuía uma baixa capacidade antibacteriana quando comparados a

outros metais. Essas observações foram também confirmadas por Bundy et al., 1980

e Bürgers et al., em 2010, que concluíram que o titânio tem influência na inibição

bacteriana no processo de formação do biofilme.

Diferentes alterações químicas no titânio com adição de vários íons tem

sido descritos para promover a modificação da superfície do titânio melhorando a

osseointegração mas também visando menor colonização bacteriana (Yoshinari et

al., 2000).

Por exemplo Rodriguez Y Baena et al., 2012 utilizaram implantação de

fosfato de cálcio e demonstraram melhores resultados na adesão e viabilidade

bacteriana nas superfícies com este tipo de tratamento com menor adesão de

bactérias. Entretanto, estudos de Yoshinari et al. (2000, 2001) evidenciaram que

superfícies com adição do íon cálcio apresentam um aumento da adesão bacteriana

e que o íon cálcio atua com um ligante entre a película adquirida, por sua

capacidade bivalente aumentando desta forma a ligação do biofilme tornando a

superfície mais atrativa para a colonização bacteriana (Hauslich et al., 2013).

Norowski & Bumgardner, 2008 observaram que a adição de fosfato de cálcio

 
aumenta a rugosidade e com isso aumenta o risco de peri-implantite, pela maior

aderência bacteriana observada nesse estudo.

Íons de prata têm sido utilizado em diversos estudos (Norowski &

Bumgardner, 2008; Liao et al., 2010; Della Valle et al., 2012, Wickens et al., 2012,

Gupta et al., 2013, Yeniyol et al., 2014). A ação antibacteriana da prata não é

totalmente compreendida mas é sugerido que as nanopartículas de prata podem

penetrar na parede celular bacteriana e atacar a cadeia respiratória e causar a morte

da bactéria (Yeniyol et al., 2014). A ação antimicrobiana do íon de prata pode ser

confirmada nos estudos de Yoniyol et al. (2014), podendo levar a inibição da

aderência de 94% de A. actinomycetemcomitans e de mais de 93% de P. gingivalis

(Liao et al., 2010). Estes resultados também foram demonstrados por outros estudos

como Della Valle et al. (2012) e Wickens et al. (2012).

Outras alterações químicas têm sido sugeridas como o uso de zircônia

(Lee et al., 2011; Al-Radha et al., 2012), nitreto (Annunziata et al., 2011; Ji et al.,

2015), magnésio (Sul et al., 2008) e também a inclusão de antimicrobianos como

metronidazol, ocorrendo uma redução na adesão ou na viabilidade celular

bacteriana.

No presente estudo a superfície foi modificada através da deposição

cristalina de íon flúor criando rugosidades nanométricas e alterando a composição

quimica da superfície. O flúor também tem sido utilizado para aumentar a força de

união entre as coberturas de apatita ao titânio (Tredwin et al., 2013).

Dessa forma, há atualmente um interesse renovado pela elucidação dos

efeitos antibacterianos do fluoreto e a necessidade de novas pesquisas (van

Loveren, 2001). Marquis et al. (1995) descreveram que um dos principais

mecanismos de ação do flúor é a acidificação do citoplasma celular bacteriano,

 
reduzindo a tolerância das bactérias aos ácidos produzidos, levando a morte

bacteriana, agindo desta forma como agente antibacteriano, como largamente vêm

sendo utilizado na odontologia com grande efetividade como agente anti-

cariogênico. A capacidade do fluoreto em agir como um condutor de prótons

transmembrana causa prejuízo a muitos sistemas enzimáticos citoplasmáticos

sensíveis à acidificação. Um exemplo relevante é o que acontece na respiração e

metabolismo de estreptococos orais (Phan et al. 2002).

No presente estudo houve uma relação entre a superfície com discreta

deposição de flúor nas superfícies com duplo ataque ácido e as bactérias não-

viáveis (p=0,001), mostrando que nesta superfície havia um número maior de

bactérias não-viáveis do que nas superfícies P e DAA, não havendo entretanto

diferença estatística entre estas duas superfícies. Como as superfícies com duplo

ataque ácido (DAA) e a superfície com duplo ataque ácido com discreta deposição

de flúor (NANO) foram consideradas sem diferença estatística no que tange a

rugosidade e molhabilidade da superfície e o único ponto que as diferem é a sua

composição química pela presença do flúor pode-se inferir que este íon influenciou

de forma importante na viabilidade bacteriana, fato corroborado por estudo de

Yoshinari et al., em 2001.

Portanto, os resultados do presente estudo evidenciam que as

características físico-químicas da superfície do implante, incluindo a rugosidade,

molhabilidade e composição quimica influenciaram na adesão bacteriana.

 
 7. CONCLUSÃO

Através da presente pesquisa pode se concluir que:

• a rugosidade e a composição química da superfície influenciou na colonização

bacteriana;

• a superfície com deposição cristalina de flúor (NANO) apresentou menor

colonização, bem como, viabilidade bacteriana quando comparada às demais

superfícies estudadas.

 
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1

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