DIOGO DEMBOCURSKI

JOELSON GRACIANO FELICIANO

PALOMA PAMELA SIQUEIRA

THAÍS WEBER

AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CAROTENÓIDES SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE

TEMPERATURA E AGITAÇÕES APLICANDO O DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
COMPOSTO.

DISCIPLINA: PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

PROFESSOR: DRº DIVAIR CHRIST

CASCAVEL – PR

2021
 1. INTRODUÇÃO

Na atualidade, diversos estudos tem-se voltado ao âmbito de

microrganismos promotores de biomoléculas, que podem ser enzimas, vitaminas e
até mesmo carotenóides. O uso de fontes limpas para a geração de um produto de
interesse na indústria trás um conceito inovador a produção.

Os microrganismos são um grande grupo de diversos organismos

microscópicos que podem realizar seus processos metabólicos de crescimento,
geração e reprodução de energia, independentemente de outras células (MADIGAN
et al., 2003). Para utilizá-los, em primeiro momento é necessário isolar cepas
capazes de produzir o produto almejado. Para isto, é necessário um trabalho
intenso de seleção e testes de várias cepas diferentes para identificar aquelas com
as propriedades desejáveis (KUMAR e TAKAGI, 1999).

Biomoléculas podem ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e

microbiológicas, sendo a última abrange as bactérias, fungos, microalgas e
leveduras, que apresentam vantagens como pequena área de cultivo, rápido
crescimento, fácil escalonamento e adaptação a várias fontes de açúcar e nitrogênio
(PANDEY et al., 2005; VENIL et al., 2013).

Estudos sobre leveduras apontam que as mesmas podem produzir

compostos bioativos importantes para uso industrial e na agricultura, tais como
aminoácidos, enzimas e vitaminas (MUKHERJEE e SEN, 2015). Leveduras do
gênero Rhodotorula têm sido relatadas como produtoras de carotenóides
especificamente a Rhodotorula mucilaginosa apresenta carotenóides de grande
potencial antioxidante, além de suportar altas concentrações de metal pesado (YOO
et al., 2016; IRAZUSTA et al., 2013).

Os carotenóides são pigmentos naturais com propriedades antioxidantes,

amplamente utilizados como corante em alimentos, aditivos cosméticos e alimentos
saudáveis (CHENG e YANG, 2016). Atualmente, existe um grande interesse da
indústria pelos carotenóides, mas o mercado brasileiro necessita importar-los,
devido à baixa produção local, o que indica a necessidade de aumentar a produção
em diversas fontes (MESQUITA, TEIXEIRA e SERVULO, 2017; MACHADO et al.,
2019).

Além da R. mucilaginosa ser fonte de carotenóides, de forma geral, como

toda levedura, possui a vantagem de ser uma fonte protéica e de crescimento em
substratos de baixo custo. Porém, qual produto resultará e a quantidade relativa
produzida é dependente das condições de temperatura, taxa de aeração,
luminosidade, entre outros (HAYMAN et al., 1974; MENG et al., 2009).

Dentre os delineamentos padrões, o Delineamento Composto Central (DCC)

é considerado um delineamento ótimo. De acordo com Atkinson e Donev (1992), os
delineamentos compostos pertencem a uma família de delineamentos eficientes, os
quais requerem poucos ensaios para sua realização. Sabendo-se que o
delineamento composto central (DCC) possibilita ao pesquisador, para um
determinado número de fatores, escolher entre os tipos ortogonais, não ortogonais
e/ou rotacionais permitindo ainda a sua divisão ortogonalmente em blocos, bem
como se poder trabalhar com um número bem menor de combinações entre fatores
com seus respectivos níveis do que os fatoriais completos. Mateus et al, (2001).

Batista (1976) verificou que os experimentos fatoriais constituídos por muitos

tratamentos proporcionam maior número de graus de liberdade para a estimativa do
desvio do modelo, o qual, na maioria das vezes, não é significativo.

2. OBJETIVO

Avaliar a produção de carotenóides sob diferentes temperaturas e agitações.

Determinar os efeitos dos fatores que influenciam na produção de carotenóides para
otimização da mesma pelo delineamento experimental.
 3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Ativação da levedura

A levedura Rhodotorula mucilaginosa URM 7409 foi cedida pelo Departamento de

Engenharia e Tecnologia de Alimentos da UNESP câmpus São José do Rio Preto,
São Paulo. Foram coletados materiais de forma aleatória no solo, árvores e folhas.
Para o crescimento e determinação da cepa, o material coletado permaneceu em
meio YM (3 g/L de extrato de levedura, 3 g/L de extrato de malte, 5 g/L de peptona e
10 g/L de glicose), incubadas a 25 °C e 150 rpm. Para isolar a cepa ideal da
levedura, o material anterior foi repicado em meio YEPG sólido (10 g/L de extrato de
levedura, 20 g/L de glicose, 20 g/L de peptona, 20 g/L de ágar bacteriológico e 1 L
de água destilada).

Para sua conservação, a R. mucilaginosa foi mantida em meio de cultura inclinado

com ágar GYMP (2 g/L de glicose, 1 g/L de extrato de malte, 0,5 g/L de extrato de
levedura, 0,2 g/L de NaH2PO4 e 1,8 g / L de ágar) e óleo mineral, sob refrigeração a
4 °C (LOPES et al., 2017).

3.2 Levedura em produção

Depois de ser isolada unicamente a levedura de interesse, crescida em meio sólido

YEPG, foi levada novamente ao meio YM para produção. Este meio é a fonte de
energia ideal para a levedura crescer e produzir carotenóides.

3.2.1 Temperatura e agitação

A produção de carotenóides pode oscilar entre 7 à 30 ºC (AKSU e EREN,

2005). Para a levedura Sporidiobolus johnsonii, também produtora de compostos
secundários, a agitação a 150 rpm por 10 dias obtém os melhores resultados
(WEBER et al., 2021), enquanto para a R. mucilaginosa 130 rpm tem sido mais
utilizado (MACHADO et al., 2019).
3.3 Determinação da produção de carotenóides

A concentração de carotenóides totais nos extratos foi determinada em

espectrofotômetro a 448 nm (CABRAL et al., 2011), expressa como seu principal
carotenóide (β-caroteno em éter de petróleo), conforme Equação 2 (DAVID, 1976).

TC = A * V * 10.10 6 / A1%lcm * 100 * m sample

onde TC é a concentração total de carotenóides (μg/g); A é a absorbância; V é o

volume (mL); m sample é a massa celular seca (g) e 1% 1cmA é a absortividade
específica de 2592. Para calcular a concentração volumétrica de carotenóides totais
(μg/L) utilizando o resultado obtido para a concentração de carotenóides totais (μg /
g) e a concentração de biomassa (g/L), foi realizada uma conversão de unidades.

4. Delineamento Experimental

O delineamento experimental será constituído em análise das condições

operacionais do processo, análise preliminar dos fatores que influenciam o
comportamento de Rhodotorula mucilaginosa e determinar os efeitos dos fatores na
produção de carotenóides para otimização e validação subsequente das condições
operacionais do processo.

Os níveis adotados para o planejamento foram definidos por testes

preliminares e resultados de outras pesquisas (IYER et al., 1980; ABU-
GHANNAM; McKENNA, 1997; ZIMMERMANN et al., 2009).

Os níveis reais para os fatores que serão analisados no experimento são

apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 Matriz do planejamento e níveis estabelecidos para os fatores

selecionados na produção de caretenóides
Fatores Niveis
 -α (-1,41) -1 0 +1 +α
(1,41)
Velocidade de agitação (rpm) 101,8 110 130 15 158,2
0
Temperatura (ºC) 22,95 2 30 35 37,05
5

Na Tabela 2 apresenta-se a matriz do planejamento composto central

rotacional, definido para a primeira etapa da pesquisa, com os seus valores
codificados e reais.
Serão realizados no laboratório, também de forma aleatória, oito ensaios
principais, seis ensaios nos pontos axiais e quatro repetições no ponto central.

Tabela 2 Matriz do planejamento experimental DCCR 2 ² com os valores

codificados e reais entre parênteses dos fatores utilizados na
produção dos caretenóides

Velocidade de agitação(RPM) Temperatura (ºC)

01 -1 (110) -1 (25)
02 1 (150) -1 (25)
03 -1 (110) +1 (35)
04 1 (150) +1 (35)
09 -1,41 (101,8) 0 (30)
10 1,41 (158,2) 0 (30)
13 0 (130) -1,41 (22,95)
14 0 (130) 1,41 (37,05)
15 0 (130) 0 (30)
16 0 (130) 0 (30)
17 0 (130) 0 (30)
18 0 (130) 0 (30)

5. Análise estatística dos dados

Para a análise estatística será utilizado o software computacional

Statistica, versão 12 (STATSOFT INC, 2005). Os dados obtidos, após a
realização do planejamento DCCR 2 3 serão analisados de maneira a calcular os
 efeitos principais e de interações das variáveis sobre as respostas,
determinando-se quais os fatores significativos (p<0,1) e ajustando-se um
modelo de segunda ordem para correlacionar as variáveis e suas respostas. Os
coeficientes significativos do modelo serão avaliados por meio do teste “t”
(BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2010). Os dados obtidos serão
submetidos à análise de variância (ANOVA), na qual será possível verificar a
validade estatística e a capacidade de predição dos modelos matemáticos
obtidos para as respostas, pelo valor da relação entre F calculado /F tabelado.
Quanto maior é o F calculado, em relação ao F tabelado, melhor é o ajuste do
modelo matemático aos dados experimentais. O valor F da falta de ajuste (média
quadrática da falta de ajuste /média quadrática do erro puro) também será
comparado ao F tabelado (FFA /Ftab) e, neste caso, quanto menor o valor,
menor é a falta de ajuste do modelo matemático aos dados experimentais
(CHRIST, 2006).

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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