Artigo 2- Caracterização enzimática de um complexo NDH ativo de

Thermosynechococcus elongatus

1. Introdução
Complexos cianobacterianos NAD(P)H desidrogenase (NDH) tipo 1 estão envolvidos em
uma variedade de reações bioenergéticas, incluindo respiração, transporte cíclico de elétrons
ao redor do fotossistema I (PS I) e captação de CO 2. Das 14 subunidades do complexo I em
Escherichia coli, apenas 11 subunidades ndh foram identificadas em cianobactérias e em
cloroplastos, três subunidades (NuoE, NuoF e NuoG) envolvidas na aceitação de elétrons do
NADH em E. coli estão ausentes do NDH cianobacteriano e cloroplástico. Por outro lado, com
base no estudo proteiômico com vários mutantes de NDH, Battchikova et al. especulam que
NdhL-O compreende um domínio de função desconhecida específico para cianobactérias e
cloroplastos, e propõem designá-lo como domínio OPS (Oxygenic Photosynthesis- Specific). No
entanto, até agora, o doador de elétrons e a entrada de elétrons para NDH cianobacteriano e
cloroplástico ainda são discutíveis. Usando membranas tilacóides isoladas do tipo selvagem e
mutante defeituoso de NdhB M55 de Synechocystis PCC 6803, foi demonstrado que NADPH,
mas não NADH, doa elétrons para o pool de plastoquinona (PQ) via NDH. Além disso, foi
alcançada uma reconstituição do fluxo de elétrons cíclico dependente de NADPH e ferredoxina
(Fd) em torno de PS I. Depois disso, vários NDHs NADPH-ativos foram identificados usando
coloração de atividade para NADPH-NBT oxidorredutase combinada com Western blot. A
atividade de um supercomplexo de NDH é proporcional ao fluxo de elétrons PSI cíclico. Para
estudar as propriedades bioquímicas dessas enzimas complexas, o NDH ativo deve ser
purificado. No entanto, isso apresenta um desafio técnico considerável devido à instabilidade
do complexo. Berger et al. descreveram pela primeira vez o isolamento de um subcomplexo
NDH de extratos de células Synechocystis 6803 tratadas com Triton X-100 por cromatografia
de imunoafinidade usando um anticorpo específico de NdhK acoplado a Proteína A Sepharose.
Os autores monitoraram a purificação com anticorpos específicos para NdhK e NdhJ e
medições da atividade oxidante de NADH e concluíram que o subcomplexo era funcionalmente
inativo. Mais tarde, Matsuo et al. descreveram um subcomplexo de NDH hidrofílico ativo de
380 kDa a partir de um extrato celular de Synechocystis 6803 tratados com CHAPS. A enzima
parecia ser substrato específico para NADPH, mas não foi inibida pela rotenona, um inibidor
clássico do Complexo I na mitocôndria. Deng et al. usaram métodos cromatográficos
convencionais para purificar outro subcomplexo NDH-1 ativo NADPH de aproximadamente
230–250k Da a partir de células cultivadas sob condições de baixo CO 2. Esses autores
mostraram ainda que um complexo contendo a subunidade hidrofóbica NdhA oxidou
especificamente o NADPH. Os complexos NDH foram isolados de Synechocystis 6803 e
Thermosynechococcus elongatus usando técnicas de His-tag. Um complexo principal de
aproximadamente 460k Da foi isolado de Synechocystis 6803, e dois complexos de
aproximadamente 450 e 490k Da foram isolados em T. elongatus, mas nenhum desses
complexos apresentou atividade de NADPH-K3Fe(CN)6 oxidorredutase. Nowaczyk et al. isolou
o complexo NDH-1L e identificou duas pequenas subunidades novas, NdhP e Q de
Thermosynechococcus elongatus. Até o momento, como todas as abordagens de isolamento
descritas acima foram insuficientes para obter um único complexo purificado ou NDH ativo, as
propriedades bioquímicas do NDH ainda precisam ser elucidadas. Recentemente, é relatado
que a eliminação de um novo NdhS identificado em Arabidopsis thaliana (também conhecido
como CRR31) e em Synechocystis 6803 causou a ativação da atividade da via NDH. De acordo
com a similaridade da estrutura do NdhS com o PsaE, os autores sugeriram que o NdhS pode
se ligar ao Fd, que pode ser um doador de elétrons para o NDH. Aqui, relatamos as
propriedades enzimáticas de um complexo NDH ativo purificado de aproximadamente 170k Da
que contém subunidades hidrofílicas e hidrofóbicas. Descobrimos que Fd e Fd-NADP +
oxidorredutase (FNR) foram co-eluídos com o NDH ativo, fornecendo evidências bioquímicas
para interação de Fd com NDH de cianobactérias e doação de elétrons de NADPH para NDH via
FNR. Além disso, a atividade é inibida competitivamente pela rotenona.

2. Materiais e Métodos

2.1. Organismos e Condições

As células Thermosynechococcuselongatus-BP1 foram cultivadas a 50ºC em meio BG-11

tamponado com Tris-HCl (5mM, pH 8,0) borbulhado com 2% (v/v) CO 2 em ar sob iluminação
contínua por lâmpadas fluorescentes (60 uEm -2 s-1).

2.2. Purificação da Proteína

As células cultivadas por 4 dias (A730 = 0,6-0,8) foram colhidas por centrifugação (5000x g
por 5 min a 4ºC). As células de 10 l de cultura foram suspensas em 40 ml de meio A (ácido N-2-
hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico 10 mM (HEPES)-NaOH, fosfato de sódio 5 mM (pH
7,5), MgCl2 10 mM e NaCl 10 mM) suplementado com glicerol a 25% e armazenado a -80ºC. Os
tilacóides foram isolados conforme descrito por Gombos et al., com algumas modificações. A
suspensão foi misturada com esferas de vidro na proporção de 1:1 (v/v) e interrompida por 5
pulsos de 20 s com um batedor de esferas Biospec (Biospec, Japão) seguido de 3 min em
cubagem no gelo. O homogenato foi centrifugado a 5000xg por 5 min a 4ºC para remover
células intactas e detritos, e o sobrenadante foi ultracentrifugado a 150.000xg por 40min. As
membranas no pellet foram ressuspensas e solubilizadas em 1% (p/v) n-dodecil-b-D-
maltosídeo (DM) com anel de agitação magnética em gelo por 1 mão e depois
ultracentrifugadas a 150.000 xg por 40 min. O sobrenadante foi imediatamente submetido a
separação cromatográfica.