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Sensores e atuadores: B. Chemical 275 (2018) 402–408

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Sensores e Atuadores B: Químico

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Azul da Prússia eletrodepositado em eletrodos descartáveis modificados com negro

T
de fumo para detecção direta de H2O2 livre de enzimas em um modelo in vitro da doença
de Parkinson

Daniel Rojasa, b , Flavio Della Pelea , Michele Del Carloa , Michele d'Angeloc ,
Reyes Dominguez-Benotc , Annamaria Ciminic,d , Alberto Escarpab,ÿ , Dario Compagnonea,ÿ
uma
Faculdade de Biociência e Tecnologia para Alimentos, Agricultura e Meio Ambiente, Universidade de Teramo, 64023, Teramo, Itália
bDepartamento de Química Analítica, Físico-Química e Engenharia Química, Faculdade de Biologia, Ciências Ambientais e Química, Universidade de Alcalá, E
28871 Alcalá de Henares, Madri, Espanha
c
Departamento de Ciências da Vida, Saúde e Meio Ambiente, Universidade de L'Aquila, Itália
d
Instituto Sbarro para Pesquisa do Câncer e Medicina Molecular, Departamento de Biologia, Temple University, EUA

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: Neste trabalho, apresentamos a combinação de Carbon Black (CB) e Azul da Prússia eletrodepositado (PB) coberto com uma camada
Azul da Prússia de Nafion em eletrodos serigrafados (CB/PB-SPE) usados para detecção não enzimática de H2O2 em linhagem celular de Neuroblastoma
negro de carbono
SH -SY5Y. Essas células foram desafiadas com 6-hidroxidopamina (6-OHDA) para modelar a doença de Parkinson. A superfície dos
Peróxido de hidrogênio
eletrodos foi investigada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e caracterizada eletroquimicamente, quanto à eletroatividade e
Eletrodos impressos em tela
estabilidade. A detecção eletroquímica de H2O2 foi realizada em potenciais muito baixos (-50 mV), com um LOD de 0,01 ÿM e faixa
Mal de Parkinson
Culturas de células
linear entre 0,2 e 1000 ÿM, permitindo a detecção livre de interferências de H2O2 na cultura celular selecionada. A concentração de
H2O2 foi totalmente monitorada com sucesso em um modelo experimental da doença de Parkinson. Esses resultados abrem caminho
para um método de monitoramento contínuo de H2O2 em meio de cultura para estudos futuros do papel do H2O2 na doença de
Parkinson.

1. Introdução ROS/RNS está em excesso em relação à capacidade de proteção antioxidante; isso

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são formas reduzidas de oxigênio com
importantes funções fisiológicas e um papel crítico na regulação redox e no
desenvolvimento do estresse oxidativo [1,2] As espécies mais relevantes são o ânion
superóxido (O2 ·ÿ), o radical hidroxila (OH· ) e peróxido de hidrogênio (H2O2) que são
produtos do consumo metabólico normal de oxigênio. As principais fontes de ROS em
células aeróbicas podem estar relacionadas à NADPH oxidase ligada à membrana e à
redução incompleta de oxigênio nas mitocôndrias [3]. No entanto, existem outras vias de
geração de ROS, como radiação ionizante, reação de Fenton e Haber-Weiss de íons de
metais de transição, drogas como antibióticos e quimioterápicos [4].
O Estresse Oxidativo (EO) é descrito como o desequilíbrio entre a produção de oxidantes
(principalmente EROs) e as defesas antioxidantes. Algumas situações podem favorecer
esse desequilíbrio, como por exemplo, disfunção de enzimas antioxidantes, exposição a
algumas substâncias químicas capazes de produzir ERO, diminuição dos níveis ou
produção de antioxidantes de baixa massa molecular e enzimas antioxidantes [5] . Este
estado pode causar interrupção na sinalização redox e/ou danos moleculares. OS ocorre
quando a produção de
causa danos irreversíveis às proteínas, DNA e lipídios. Estas alterações bioquímicas
estão implicadas em vários processos patológicos, como câncer, doença de Parkinson e
Alzheimer, isquemia [6], aterosclerose [7] e, em geral, envelhecimento [8]. No entanto,
pequenas quantidades de ERO são necessárias para o correto funcionamento das
imunodefesas e sinalização redox; este último é denominado como um “eustress
oxidativo” [2].
Portanto, há uma necessidade de métodos analíticos, possivelmente permitindo o
monitoramento contínuo de marcadores ROS em culturas de células para avaliar o nível
de OS nas células com relação a diferentes tratamentos. Dentre as ERO produzidas
celularmente, o H2O2 é o mais representativo em termos de quantidade e meia-vida e,
portanto, o mais estudado.
A doença de Parkinson (DP) envolve uma degeneração irreversível da via
dopaminérgica nigroestriatal, resultando em evidente comprometimento do controle
motor. Embora a etiologia da DP permaneça desconhecida, estudos recentes sugerem
que o estresse oxidativo é um importante mediador nessa patogênese [9]. Supõe-se que
os neurônios dopaminérgicos nigrais sejam expostos a altos níveis de ROS, devido ao
metabolismo da própria dopamina (enzimática e não enzimática), levando ao

ÿ Autores correspondentes.
Endereços de e-mail: alberto.escarpa@uah.es (A. Escarpa), dcompagnone@unite.it (D. Compagnone).

https://doi.org/10.1016/j.snb.2018.08.040 Recebido
em 24 de maio de 2018; Recebido em forma revisada em 31 de julho de 2018; Aceito em 7 de agosto de
2018 Disponível online em 09 de agosto de 2018 0925-4005/ © 2018 Elsevier BV Todos os direitos reservados.
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geração de ROS, incluindo ânion superóxido, peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais
hidroxila. De fato, existem várias observações indiretas, como o aumento dos níveis de
produtos de oxidação de lipídios, proteínas e ácidos nucleares em células negras, que são
indicativos do papel do estresse oxidativo na DP [10] . A hidroxidopamina (6-OHDA) é uma
neurotoxina catecolaminérgica seletiva que tem sido amplamente utilizada para produzir
modelos de DP in vitro e in vivo; induz um estado de toxicidade que imita as características
neuropatológicas e bioquímicas da DP [11]. Foi relatado que 6-OHDA é oxidado rapidamente
por oxigênio molecular para formar o ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e 2-hidroxi-5-
(2-aminoetil)-1,4-benzoquinona (p-quinona) como segue [ 12]:
6-OHDA + O2ÿp-quinona+ H2O2 (1)
É bem conhecido que as ROS geradas a partir de 6-OHDA iniciam o estresse
oxidativo celular. Por outro lado, foi relatado que a p quinona medeia a morte celular
induzida por 6-OHDA [13]. No entanto, os mecanismos exatos de produção de ROS e
indução de neurotoxicidade, particularmente em relação à ativação de caspases, são
menos claramente definidos. Com base na descrição acima, neste trabalho consideramos
importante avaliar a produção de H2O2 após a exposição a 6-OHDA no modelo in vitro de
DP; dessa forma, podemos entender melhor o efeito neurotóxico dessa ERO em diferentes
tempos.
Diferentes estratégias analíticas têm sido propostas para a detecção de H2O2 , como
quimiluminescência [14], fluorescência [15,16] e técnicas eletroquímicas [17]. Dentre
estes, os sensores eletroquímicos são bastante atrativos por sua simplicidade, velocidade,
sensibilidade, miniaturização e custo-benefício [18]. Nas últimas duas décadas, os
biossensores dominaram o cenário de sensores, mesmo no campo de detecção de ROS
[17,19], enquanto na última década os nanomateriais tornaram-se ferramentas úteis de
sensores alternativos/complementares [20-24]. De fato, os sensores nanoestruturados
permitem melhorar a sensibilidade e a seletividade, fornecendo maior área de superfície e
transferências de elétrons mais rápidas em comparação com suas contrapartes [21,25,26].
Portanto, a combinação de nanomateriais e sensores eletroquímicos é muito atraente. A
detecção direta de H2O2 em eletrodos de metal clássicos, como platina ou ouro, é possível,
no entanto, sofre de baixa seletividade devido aos altos sobrepotenciais necessários.
A seleção de um nanomaterial e catalisador adequados pode superar essa desvantagem.
O Azul da Prússia (PB), também conhecido como “peroxidase artificial” [27] é um dos
eletrocatalisadores mais conhecidos e amplamente utilizados para redução de H2O2 . PB
permite detecção de baixo potencial e livre de interferências de H2O2 em meios oxigenados;
no entanto, tem algumas desvantagens, como baixa estabilidade em pH fisiológico e alta
taxa de cristalização, que dificultam o uso potencial em nanocompósitos e aplicação em
meios biológicos [28]. Para superar essas deficiências, a modificação de eletrodos com
moldes macios ou duros, polímeros, materiais carbonáceos ou diferentes metais têm sido
usados em diferentes combinações para construir plataformas analíticas específicas para
cada aplicação [19]. O Negro de Fumo (CB) é um nanomaterial de carbono amplamente
utilizado como material de reforço e como carga na preparação de compostos e compósitos
de borracha e plástico, produzidos por combustão de produtos petrolíferos, pelo que é um
nanomaterial carbonáceo muito barato (cerca de 1€/ Kg). É caracterizada por uma estrutura
primária constituída por partículas esféricas com diâmetro entre 30 e 100 nm e uma
estrutura secundária formada por agregados com dimensões na faixa de 100 a 600 nm
[29]. As dispersões de CB após sonicação, em solventes apropriados, aparecem como
nanopartículas de carbono. Dados recentes relataram que eletrodos modificados baseados
em CB apresentam rápida transferência de carga e alta área eletroativa, comparável a
nanotubos de carbono e grafeno [30]. Estas características em conjunto com o custo
extremamente baixo fazem do CB um candidato promissor para o projeto de sensores
eletroquímicos e biossensores. A este respeito, o CB pode ser claramente considerado
uma boa alternativa aos nanotubos de carbono e ao grafeno. Por estas razões, nos últimos
anos vários trabalhos têm sido relatados sobre a dispersão de CB para modificação de
eletrodos, mostrando propriedades eletrocatalíticas notáveis para várias espécies de
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Sensores e atuadores: B. Chemical 275 (2018) 402–408
interesse analítico [20,30–33], permitindo a realização de novos dispositivos eletroquímicos
[34–36]. Neste trabalho, 'nano CB' foi usado com sucesso como modificador de eletrodo
para a eletrodeposição controlada de PB e posteriormente aplicado para o monitoramento
de H2O2 em culturas de modelos celulares da doença de Parkinson.
2. Experimental
2.1. Materiais
Os experimentos foram realizados com água MilliQ de um sistema Millipore MilliQ
((Millipore, Bedford, MA, EUA). Todos os sais inorgânicos, 6-OHDA, solventes orgânicos e
peróxido de hidrogênio (solução a 30%) foram obtidos com a mais alta pureza da Sigma
-Aldrich. Células SHSY5Y foram obtidas da Sigma (Sigma–Aldrich). Catalase de pó de
fígado bovino, adequado para cultura celular, 2.000–5.000 unidades/mg de proteína foi
adquirida da Sigma-Aldrich (C1345). A concentração de H2O2 foi padronizada
periodicamente por titulação com KMnO4. Eletrodos impressos em tela (SPE) foram
adquiridos da Dropsens SL (ref. DS110). DMEM, L-Glutamina, penicilina/estreptomicina,
tripsina e frasco foram adquiridos da Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY).
2.2. Instrumentação
Todas as medições eletroquímicas foram realizadas no Autolab
Potenciostato PGSTAT 12 da Metrohm (Utrecht, Holanda) conectado a um computador
pessoal. O software utilizado foi o Nova 2.1 (EcoChemie BV). O sistema de injeção em
fluxo (FIA) consistia em uma bomba peristáltica Minipuls 3 (Gilson Inc., Middleton, WI,
EUA), célula de fluxo contínuo (ref. FLWCL) (Dropsens, Espanha). O volume da amostra
foi de 50 ÿL, o potencial do eletrodo de trabalho escolhido foi de -50 mV (vs referência
interna). A solução tampão corrente nos experimentos FIA foi tampão fosfato 0,05 M pH
7,4 contendo 0,1 M KCl. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (HR-SEM)
foi realizada nos materiais usando um Zeiss Auriga HR-SEM. A microscopia eletrônica de
varredura, Zeiss Auriga, FESEM de alta resolução foi utilizada para estudar a morfologia
dos materiais preparados.
2.3. Preparação de eletrodos PB e CB-PB
Uma dispersão de CBNPs de 1 mg/mL em água e dimetilformamida (DMF) (proporção
de 1:1). As dispersões foram obtidas usando um sonicador de banho por 30 min. Além
disso, eletrodos impressos comercialmente em tela (DS110) foram modificados por meio
de drop-casting usando diferentes volumes (de 3,5 ÿL a 35 ÿL). A quantidade de CB foi
otimizada verificando a reversibilidade do par 3ÿ/4ÿ [Fe(CN)6] usando voltametria cíclica e
resistência de transferência de carga (Rct) em espectroscopia de impedância
eletroquímica (EIS). O(Fig.
valor ideal selecionado foi de 10 ÿL fundido por 1 ÿL de cada vez
S.1). A eletrodeposição de Azul da Prússia foi realizada ciclando os potenciais entre +400
e +800 mV (vs int. ref) por diferentes números de ciclos em uma solução contendo solução
contendo 0,1 M KCl, 0,1 M HCl e concentração de 5 mM de Fe3+ e [ Fe (CN)6] 3-. O
potencial do eletrodo de referência interno contra um eletrodo de referência Ag|AgCl|KClsat
foi medido como -120 mV. Os eletrodos foram modificados
com 2 ÿL de solução etanólica de Nafion (0,5% v/v). Nafion é um condutor iônico que
aumenta a estabilidade de eletrodos modificados de PB, permitindo o transporte de
contraíons para manter a eletroneutralidade do PB [37,38].
2.4. Cultura de células
A linha celular de Neuroblastoma SH-SY5Y foi mantida a 37°C em uma atmosfera
umidificada com 5% de CO2 em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino
inativado pelo calor, 2 mM de L-Glutamina, 0,2 mg/ml de penicilina/estreptomicina. O meio
de cultura foi trocado a cada 2 dias até que as células atingissem aproximadamente
70-80% de confluência. As células foram colhidas usando 0,25% de tripsina-0,53 mM de
solução de EDTA e foram
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semeadas a aproximadamente 4 × 104 células/cm2 em frascos de 75 cm2, depois tratadas
com 6 OHDA (50ÿM) por diferentes tempos.
2.5. Viabilidade celular
As células foram semeadas (5.000 células/poço) em uma placa de 96 poços, no dia
seguinte as células foram tratadas com 6 OHDA (50 ÿM) por 24 h enquanto as células
controle receberam apenas DMEM contendo 10% de FBS, todos os tratamentos foram
realizados em quintuplicado. As células foram incubadas por tempos diferentes e no final do
período de incubação a viabilidade celular foi determinada usando Cell Titer One Solution
Cell Proliferation Assay lendo a absorbância a 492 nm, em um leitor espectrofotométrico de
microplacas Infinite F200 (Tecan, Männedorf, Swiss). Os resultados foram expressos como
absorbância registrada a 492 nm.
3 Resultados e discussão
3.1. Preparação e caracterização de eletrodos CB-PBNPs
PB ou ferrocianeto férrico é um dos mais antigos compostos de coordenação conhecidos
com íons férricos coordenados ao nitrogênio e ferrosos coordenados ao carbono em uma
rede cúbica de face centrada. Normalmente, é depositado eletroquimicamente usando uma
3-
mistura de Fe3+ e [Fe(CN)6] onde os íons férricos são reduzidos para formar o Azul da
Prússia. Atenção especial deve ser dada à seleção do potencial utilizado para a
eletrodeposição; de fato, a redução simultânea de ambos os precursores leva a uma
estrutura irregular da camada de Azul da Prússia na superfície do eletrodo [27]. Conforme
mostrado no voltamograma cíclico da Fig. 1A, os picos de redução de Fe3+ e [Fe(CN)6] não
são resolvidos usando SPE simples. Curiosamente, no caso de CB-SPE, o potencial de pico
3-
de Fe3+ é anodicamente deslocado em 280 mV, e a corrente de pico é fator
aumentada
de 1,5,em um
confirmando um comportamento eletrocatalítico de CB em direção à redução de Fe3+ . Por
outro lado, para a redução de [Fe(CN)6] 3ÿ, observou-se apenas um leve aumento da
intensidade de pico, mantendo o potencial de pico no mesmo valor da SPE não modificada.
Assim, a eletrodeposição do PB foi realizada por voltametria cíclica; a janela de potencial e
a taxa de varredura foram selecionadas de acordo com o método desenvolvido por Karyakin
et al [27,39]. Considerando o comportamento eletroquímico relatado da superfície dos
eletrodos, os SPE foram ciclados de + 400 mV a + 800 mV (vs. Ag), permitindo a redução
seletiva de Fe3+ mantendo os [Fe(CN)6] gramas em uma solução contendo 0,1 M HCl e 0,1
M KCl. Um aumento na corrente e área de pico foi observado com o número de ciclos de
eletrodeposição indicando uma maior quantidade de PB na superfície do eletrodo. É
claramente perceptível a maior quantidade eletrodepositada nos eletrodos modificados por
3-
CB em comparação com o SPE
na sua nu.oxidada.
forma A atividade eletrocalítica
A Fig. de SPE-CB/PB
1B relata voltammo cíclicoé relatada na
Fig. S.2A; usando detecção amperométrica, a combinação de SPE-CB e PB resulta em um
sinal mais alto
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Sensores e atuadores: B. Chemical 275 (2018) 402–408
para redução de H2O2 em comparação com SPE-PB e SPE-CB, conforme mostrado na Fig.
S.2B. Em eletrodos à base de carbono, o único princípio de detecção disponível é a oxidação
de H2O2 em alto potencial anódico, onde compostos facilmente oxidáveis geralmente
presentes em meios biológicos provocam o aparecimento de sinais parasitários devido a sua
oxidação. Em contraste, eletrodos baseados em PB permitem a detecção de H2O2 por
redução próxima a 0 V (vs Ag|AgCl), onde outros compostos raramente são eletroativos.
Micrografias SEM confirmaram o crescimento de PB na superfície do eletrodo. Conforme
relatado na Fig. 2, aumentando o número de ciclos de eletrodeposição, o tamanho das
nanopartículas de PB aumenta. Além disso, a quantidade de ferro atômico, obtida dos
espectros de EDS, foi de 0 a 3,55% CB-SPE até 20 ciclos.
A Tabela 1 lista a cobertura da superfície (ÿ) de PB, bem como S·t95% como parâmetro
de estabilidade e sensibilidade do sensor. Alta estabilidade e atividade eletrocatalítica são
altamente desejáveis de se obter. No entanto, não é trivial encontrar um compromisso entre
as duas características. Para este propósito, uma degradação acelerada pode ser realizada
[40]. A estabilidade do sensor é avaliada no momento em que a corrente medida atinge 95%
de seu valor inicial (t95%) sob fluxo contínuo de 500 ÿM H2O2 em Tampão Fosfato pH = 7,4
utilizando célula de jato de parede. A sensibilidade (S) é estimada pela intensidade inicial
dividida pela concentração de H2O2.
Conforme mostrado na Tabela 1, conforme aumentamos a cobertura da superfície (ÿ)
do PB, o parâmetro S·t95% aumenta de 5 para 10 ciclos e diminui ligeiramente de 10 para
20 ciclos. Portanto, considerando os valores de S·t95% o compromisso entre sensibilidade
e estabilidade do sensor é encontrado com 10 ciclos de eletrossíntese.
3.2. Desempenho analítico
O eletrodo selecionado foi utilizado para a detecção eletroquímica de H2O2 em um
sistema de Flow Injection Analysis (FIA). FIA foi escolhido como uma primeira abordagem
para quantificar H2O2 em culturas de células, aproveitando seu alto rendimento, simplicidade
e possibilidade de automação. Para encontrar as condições ótimas de medição, foi realizada
uma otimização da vazão e do potencial empregados na análise. A Fig. 3A mostra o efeito
da vazão na intensidade de pico de uma solução contendo 10 ÿM de H2O2. Um aumento na
taxa de fluxo aumenta a intensidade de pico até atingir um valor constante a uma taxa de
fluxo de 0,6 ml min-1 e acima. Também foram realizados voltamogramas hidrodinâmicos
dos eletrodos CB-PB em tampão fosfato e tampão fosfato contendo 100 ÿM de H2O2 em
solução aerada. Conforme mostrado na Fig. 3B, a corrente na presença de H2O2 atinge a
corrente limite em -50 mV. Além disso, a seletividade dos eletrodos na presença de oxigênio,
uma interferência comum no uso de eletrodos de platina ou ouro, é demonstrada pois temos
corrente desprezível do tampão aerado na região da corrente limite para redução de H2O2 .
O desempenho eletroquímico dos eletrodos foi então testado em análise FIA de peróxido
de hidrogênio em tampão fosfato de hidrogênio
Fig. 1. A) Voltametria cíclica de
soluções contendo, 5 mM Fe3+ e 5
mM [Fe(CN)6] 3- em um SPE nu (azul
e verde, respectivamente) e SPE-CB
(preto e vermelho, respectivamente)
registrados em 40 mV/s. B)
Voltamogramas cíclicos
eletrodepositados PB em SPE nu
(azul) e em SPE-CB (preto) em 0,1 M
HCl e 0,1 M KCl. A seta indica um
número crescente de ciclos de
crescimento (5 e 20). Taxa de
varredura: 50 mV/s. (Para interpretação
das referências a cores nesta legenda
de figura, o leitor deve consultar a versão web des
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Fig. 2. Imagens SEM de A) CB modificado SPE B) CB/PB 5 ciclos C) CB/PB 10 ciclos D) CB/PB 20 ciclos modificado SPE.

Tabela
Além disso, obteve-se boa repetibilidade intraeletrodo e reprodutibilidade intereletrodo
1 Parâmetro de otimização para eletrodos CB-PB.
RSD ÿ 6% (n = 3) e RSD ÿ 10% (n = 5), respectivamente.
Eletrodo ÿ (nmol·cmÿ2 ) S·t95% (A·min·Mÿ1 ·cm-2)
Até onde sabemos, a combinação de CB/PB e SPE para construir um sensor de
CB-PB- 5 ciclos 0,85 1,83
H2O2 foi usada anteriormente apenas por Cinti et al.
CB-PB- 10 ciclos 3,90 4,69
CB-PB- 20 ciclos 6.40 4,59 [41]. Neste trabalho, diferentes combinações de compósitos CB/PB foram sintetizadas
produzindo diferentes tamanhos de nanopartículas de PB; LODs estavam entre 0,3
e 1,0 ÿM e sensibilidades entre 0,15-0,56 A·Mÿ1 cm-2 usando análise de lote de
pH = 7,4. O pH fisiológico não é o pH ideal para sensores baseados em PB; no amperometria. Nosso eletrodo proposto tem um LOD menor e sensibilidade
entanto, obtivemos dados satisfatórios. A Fig. 4A relata a resposta amperométrica melhorada (0,66 A·Mÿ1 cm-2) e tira proveito do sistema de medição FIA que permite
do sensor desenvolvido para a injeção de diferentes concentrações de H2O2 um maior rendimento (70 amostras·hÿ1 ) e melhor repetibilidade. Além disso, o SPE-
variando de 200 nM a 1 mM. A linearidade foi encontrada em 4 ordens de grandeza, CB/PB manteve o desempenho analítico, em termos de sensibilidade, (87% após 3
conforme mostrado na Fig. 4B. A equação da curva de calibração foi: ip = 0039 ± meses em RT) demonstrando uma boa estabilidade a longo prazo.
0007(ÿM)+ 0,66 ± 0,01(A·Mÿ1 cm-2)[H2O2] com R2 = 0,999. O limite de detecção,
calculado como 3ÿ/S, onde ÿ é o desvio padrão de 10 amostras em branco e S a Aplicação à detecção de H2O2 em SHSY5Y diferenciados em culturas de células
sensibilidade, foi de 10 nM. de neurônios

Fig. 3. A) Dependência da corrente de pico com a vazão B) Voltamograma hidrodinâmico (HDV) de uma solução contendo tampão fosfato (pH = 7,4) (quadrados) e tampão
fosfato (pH = 7,4) e 10 ÿM de H2O2 .

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Fig. 4. A) Sinais em um sistema FIA para diferentes concentrações de H2O2 B) Gráfico de calibração para ampla faixa linear. Inset: gráfico de calibração para os pontos mais baixos.
Medições realizadas em tampão fosfato (pH = 7,4) vazão 0,6 ml minÿ1 ; E= -50 mV.
Fig. 5. A) Sinais amperométricos devido à adição de FBS (1), L-Glu (2) e P/S (3) em meio DMEM B) Seletividade do eletrodo para 100 ÿM de H2O2 adicionado na cultura celular sem
células. E=-50 mV vs Ag.
O meio de cultura celular é uma matriz bastante complexa e desafiadora,
pois contém diferentes compostos orgânicos e proteínas necessárias para as
células. O efeito de matriz deve ser cuidadosamente avaliado para produzir
dados quantitativos confiáveis. A matriz da amostra foi enriquecida com
quantidades conhecidas de H2O2 na faixa de concentração de 5 a 50 ÿmol
Lÿ1 . A recuperação foi em toda a faixa ÿ96% com RSD ÿ 4% (n = 3). Esses
Fig. 6. Concentração de peróxido de hidrogênio (preto) e viabilidade celular (azul) no
modelo celular da doença de Parkinson em diferentes tempos de incubação. (Para
interpretação das referências a cores nesta legenda de figura, o leitor deve consultar a
versão web deste artigo.)
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os dados mostram que o procedimento é adequado para detecção de H2O2
em cultura celular. A seletividade das medidas também foi avaliada versus
possíveis interferentes encontrados no caldo de cultura. Para tanto, foi estudada
a influência da Penicilina, Estreptavidina, L-Glutamina e Soro Fetal Bovino.
Conforme relatado na Fig. 5A, nenhuma interferência significativa foi observada.
Além disso, testamos ainda mais a seletividade de nosso eletrodo contra a
redução de H2O2 na matriz complexa. Conforme observado na Fig. 5B, o sinal
devido à adição de 100 ÿM de H2O2 no meio de cultura celular foi completamente
suprimido pela adição de 0,2 mg de Catalase (100 ÿL 2 mg/ml). Deve-se notar
também que o sensor foi capaz de medir na cultura de células DMEM por 1 h
mantendo 80% do sinal inicial na configuração de amperometria em lote,
exibindo uma excelente estabilidade em meios tão complexos; esta característica
notável permite o uso de sensores de baixo custo como o SPE modificado para
um grande número de medições/experimentos com células.
Finalmente, a estratégia proposta foi aplicada com sucesso para monitorar
a produção de H2O2 em cultura celular de Parkinson (por 24 h). As células
foram estimuladas por 6-OHDA, uma neurotoxina catecolaminérgica seletiva,
que tem sido frequentemente usada para criar modelos de DP. O efeito tóxico
da 6-OHDA é mediado por sua captação nas terminações nervosas
catecolaminérgicas por meio do sistema transportador de catecolaminas de alta
afinidade. Vários trabalhos relatam que o 6-OHDA desencadeia a morte celular
através de três mecanismos principais: a) geração de ROS por autoxidação, b)
geração de H2O2 após desaminação pela monoamina oxidase (MAO), c)
inibição direta dos complexos mitocondriais I e IV [42]. No entanto, muitos
estudos recentes relataram que o 6-OHDA não induz toxicidade nem por
inibição mitocondrial direta nem por desaminação enzimática pela MAO, mas por meio de u
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mesa 2
: Comparação do desempenho analítico de sensores de peróxido de hidrogênio aplicados à determinação de peróxido de hidrogênio liberado por células.
Eletrodo Potencial de detecção (mV) LOD (M) Faixa linear (M)
Au-PB-PDA +100 vs Ag/AgCl ÿ200 1,0 × 10ÿ7 4,0 1,0 × 10ÿ6 -8,0 × 10-4 5,0 ×
SPE-Cu-NWs g- vs Ag ÿ50 vs Ag|AgCl, × 10ÿ7 1,3 × 10ÿ7 -8,0 × 10-4 2,5 × 10ÿ8
CNTs/PB MCs sat KCl ÿ50 vs Ag|AgCl, 3 M 10ÿ8 3,0 × -1,6 × 10-3 RAW 264,7 células 1,0 × 10ÿ6 -1,0 × 10-3
Pd/Au NWs KCl ÿ200 vs Ag|AgCl 10ÿ7 2,0 × HL-1 células 2,0 × 10ÿ9 -2,5 × 10-3 Raw
PtPb/Grafeno 10ÿ9 1,3 × 10-3 Células epiteliais normais HBL100,
CuO@MnAl LDHs ÿ850 vs SCE 10ÿ7 células de câncer cerebral glioma U87
PdPt NCs@SGN/GCE ÿ100 vs SCE 3,0 × 10ÿ7 1,7 3,0 × 10ÿ6 -3,0 × 10-4 5,0 ×
Ag NSs/GCE ÿ500 vs Ag|AgCl, sat KCl ÿ50 × 10ÿ7 1,0 × 10ÿ6 -6,0 × 10-3 2,0 × 10ÿ7
SPE-CB-PB-Nafion mV vs Ag 10ÿ8 -1,0 × 10-3
mecanismo [11,43]. A análise da amostra foi realizada em um sistema de injeção
de fluxo com o Eletrodo Impresso em Tela Modificado Azul da Prússia/Preto de
Carbono otimizado como sistema de detecção e usando o seguinte procedimento: 1)
injeção de uma amostra padrão conhecida (triplicata) 2) Injeção de amostra
( triplicado). As injeções padrão nos permitem normalizar a minimização do sinal,
qualquer efeito de matriz ou alteração dos eletrodos na configuração FIA. A
quantidade de H2O2 encontrada na cultura celular aumenta em função do tempo de
incubação, atingindo uma região de platô em 20 h (Fig. 6). As faixas de concentração
foram de 15,2 ± 0,8 ÿM em 15 min a 51,9 ± 0,3 ÿM em 24 h, que estão de acordo
com os valores encontrados na literatura para o modelo 6-OHDA [44] . Neste
experimento preliminar, demonstramos a relação entre uma superprodução de H2O2
após o tratamento com 6-OHDA com a alta mortalidade avaliada com o ensaio de
viabilidade MTS (Fig. 6). De fato, observamos um aumento da mortalidade celular
ligada à concentração de H2O2 .
O desempenho analítico de outros sensores eletroquímicos baseados em
nanomateriais usados para medição de peróxido de hidrogênio em cultura celular é
relatado na Tabela 2. O eletrodo desenvolvido apresentou desempenho analítico
melhor ou comparável em comparação com trabalhos encontrados na literatura em
termos de LOD e faixa linear, mesmo comparados com sensores baseados em
metais nobres. É importante observar que o eletrodo desenvolvido consiste em um
SPE que apresenta vantagens inerentes em relação ao eletrodo sólido clássico,
como descartabilidade, facilidade de uso e baixo consumo de amostra. Quando
comparado com outros SPE (SPE-Cu-NWs), encontramos menor LOD, faixa linear
mais ampla e o potencial de detecção mais próximo de 0 mV (vs Ag/AgCL). Além
disso, até onde sabemos, esta é a primeira vez que o H2O2 é medido e quantificado
no modelo 6-OHDA para a doença de Parkinson usando sensores eletroquímicos.
4. Conclusões
Uma plataforma de detecção eletroquímica livre de enzimas foi proposta com
sucesso para a quantificação de H2O2 liberado por células SHSY5Y.
Essas células desafiadas com 6-OHDA representam um modelo para estudar a
doença de Parkinson, que é amplamente conhecida por ser afetada pelo estresse
oxidativo. Até onde sabemos, esta é a primeira vez que um sensor eletroquímico PB/
CB é aplicado para detectar H2O2 diretamente em culturas de células. O sensor
descrito apresentou limite de detecção na faixa nanomolar e apresentou excelente
seletividade em um ambiente complexo como o meio de cultura utilizado, permitindo
a determinação seletiva de quantidades muito baixas de H2O2 sem interferências.
Além disso, neste trabalho H2O2 foi quantificado em vez de seguir sua liberação
quase instantânea de células desafiadas a um estressor em contraste com [45] e [46].
Esses resultados podem abrir caminho para uma melhor compreensão do efeito
neurotóxico de ROS usando um modelo in vitro da doença de Parkinson.
Reconhecimentos
Este trabalho é apoiado pelo financiamento do programa de pesquisa e inovação
Horizon 2020 da União Europeia sob o contrato de concessão Marie Skÿodowska
Curie nº 713714 e cofinanciamento da Universidade de Teramo e da região de
Abruzzo.
407
Sensores e atuadores: B. Chemical 275 (2018) 402–408
Inscrição Ref.
Células Hep G2 [45]
Células HK-2 renais humanas tratadas com cisplatina [24]
[46]
6,0 ×264,7
10ÿ6 células
-22 × [47]
de mama
células
MCF-7
de câncer
e [48]
[49]
células Hela [50]
Células HeLa e células SH-SY5Y [51]
Linhagem celular de neuroblastoma SH-SY5Y Este trabalho
Apêndice A. Dados suplementares
O material complementar relacionado a este artigo pode ser encontrado, no
versão online, em doi:https://doi.org/10.1016/j.snb.2018.08.040.
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Daniel Rojas é bacharel em Química e mestre em Eletroquímica. Atualmente, ele é Pesquisador Inicial no
Programa de Doutorado Rep-Eat e aluno de doutorado em Ciência dos Alimentos na Universidade de
Teramo e Química na Universidade de Acalá. Seu atual interesse de pesquisa é a caracterização e aplicação
de novos nanomateriais para (bio)marcadores de estresse oxidativo e detecção de polifenóis.
Flavio Della Pelle é pesquisador de pós-doutorado na Universidade de Teramo e obteve seu doutorado em
Ciência de alimentos e química analítica na Universidade de Teramo e na Universidade de Alcalá,
respectivamente. Ele é autor de 22 publicações no campo da química analítica. O seu interesse de
investigação centra-se no desenvolvimento de metodologias analíticas alternativas robustas e simples
baseadas em nanomateriais, para a 'avaliação da qualidade e segurança alimentar'.
Michele Del Carlo é PhD em Química Analítica (Universidade de Florença, Itália) e Mestre em Ciências em
Biossensores (Universidade de Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Ele é Professor Associado de Química
Analítica na Faculdade de Biociências da Universidade de Teramo; seus principais interesses de pesquisa
são na área de sensores eletroquímicos e biossensores para segurança e qualidade alimentar. Nesta área,
ele publicou mais de 65 artigos revisados por pares.
Michele d'angelo é doutoranda em biotecnologia molecular e celular. Seu principal interesse são as doenças
neurodegenerativas e os modelos in vitro e in vivo. Além disso, ele trabalhou com células cancerígenas de
glioblastoma, dissecando a via molecular e celular para entender melhor o mecanismo da patologia e estudar
um potencial tratamento terapêutico.
Reyes Dominguez-Benot é bacharel em farmácia e mestre em genética. Atualmente ela é Pesquisadora
Inicial no Rep-Eat Doctoral Program e doutoranda em Biotecnologia Celular e Molecular na Universidade de
L'Aquila.
A parte recente de sua pesquisa é dedicada a entender tanto o início quanto a progressão de tumores do
sistema reprodutivo e o papel do extrato de folha de oliveira no câncer de mama e ovário e seu efeito no
ciclo celular.
Annamaria Cimini é Professora Titular de Biologia Celular no Departamento de Ciências da Vida, Saúde e
Meio Ambiente da Universidade de L'Aquila; seus principais interesses de pesquisa estão no campo das
Neurociências, com particular atenção às doenças neurodegenerativas e ao câncer cerebral. Nesta área,
ela publicou mais de 85 artigos revisados por pares. Ela é co-inventora de 3 patentes.
Alberto Escarpa é professor de Química Analítica na Universidade de Alcalá desde 2003. Sua atividade de
pesquisa está focada em microfluídica, biosensoriamento, nanomateriais e micro motores. Ele é co-autor de
mais de 110 artigos revisados por pares em periódicos internacionais, gerando um índice h de 37, e é o
editor de dois livros. Ele deu mais de 20 palestras convidadas em reuniões altamente internacionais sobre
microfluídica e miniaturização da química analítica. Ele também é Editor Associado da Microchimica Acta,
RSC Advances and Electrophoresis e membro do Conselho Editorial de Electroforese, Food Chemistry,
Applied Materials Today e Microchimica Acta. Ele também é membro da Royal Society of Chemistry desde
2016.
Dario Compagnone coordenou nos últimos 10 anos o grupo de química analítica da Faculdade de Biociências
da Universidade de Teramo. É autor de mais de 160 artigos em revistas científicas internacionais. Seus
interesses de pesquisa estão focados no desenvolvimento de estratégias de sensoriamento e
biosensoriamento para a detecção rápida de marcadores de qualidade e segurança de alimentos.