Quim. Nova, Vol. 29, No.

1, 113-123, 2006 ESTRESSE OXIDATIVO: RELAO ENTRE GERAO DE ESPCIES REATIVAS E DEFESA DO ORGANISMO Andr L. B. S. Barreiros e Jorge M. David* Instituto de Qumica, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador-BA Juceni P. David Faculdade de Farmcia, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador-BA Recebido em 1/7/04; aceito em 18/5/05; publicado na web em 24/8/05

OXIDATIVE STRESS: RELATIONS BETWEEN THE FORMATION OF REACTIVE SPECIES AND THE ORGANISMS DEFENSE. This work describes the mechanism of action of some reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in the oxidative stress of the human body, and their consequences on damage to DNA, RNA, proteins and lipids. It also illustrates the defense system of our organism against these ROS and RNS species. The action of nonenzymatic protection systems is reported, with emphasis on micromolecules like Q10 coenzyme, vitamin C, -tocopherol, carotenoids and flavonoids. The importance of flavonoids is also emphasized, and their body protection mechanism is detailed. Keywords: oxidative stress; antioxidants; reactive species.

INTRODUO Atualmente existe um grande interesse no estudo dos antioxidantes devido, principalmente, s descobertas sobre o efeito dos radicais livres no organismo. A oxidao parte fundamental da vida aerbica e do nosso metabolismo e, assim, os radicais livres so produzidos naturalmente ou por alguma disfuno biolgica. Esses radicais livres cujo eltron desemparelhado encontra-se centrado nos tomos de oxignio ou nitrognio so denominados ERO ou ERN1-4. No organismo, encontram-se envolvidos na produo de energia, fagocitose, regulao do crescimento celular, sinalizao intercelular e sntese de substncias biolgicas importantes. No entanto, seu excesso apresenta efeitos prejudiciais, tais como a peroxidao dos lipdios de membrana e agresso s protenas dos tecidos e das membranas, s enzimas, carboidratos e DNA5. Dessa forma, encontram-se relacionados com vrias patologias, tais como artrite, choque hemorrgico, doenas do corao, catarata, disfunes cognitivas, cncer e AIDS, podendo ser a causa ou o fator agravante do quadro geral6. O excesso de radicais livres no organismo combatido por antioxidantes produzidos pelo corpo ou absorvidos da dieta. De acordo com Halliwell3 Antioxidante qualquer substncia que, quando presente em baixa concentrao comparada do substrato oxidvel, regenera o substrato ou previne significativamente a oxidao do mesmo. Os antioxidantes produzidos pelo corpo agem enzimaticamente, a exemplo da GPx, CAT e SOD 2 ou, noenzimaticamente a exemplo de GSH, peptdeos de histidina, protenas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), cido diidrolipico e CoQH2. Alm dos antioxidantes produzidos pelo corpo, o organismo utiliza aqueles provenientes da dieta como o a-tocoferol (vitamina-E), -caroteno (pro-vitamina-A), cido ascrbico (vitaminaC), e compostos fenlicos onde se destacam os flavonides e poliflavonides4,7. Dentre os aspectos preventivos, interessante ressaltar a correlao existente entre atividade antioxidante de substncias polares e capacidade de inibir ou retardar o aparecimento de clulas cancergenas, alm de retardar o envelhecimento das clulas em geral8. Outro interesse ligado aos antioxidantes a sua

aplicao na indstria, para a proteo de cosmticos, frmacos e alimentos, prevenindo a decomposio oxidativa desses pela ao da luz, temperatura e umidade9. O ESTRESSE OXIDATIVO O organismo humano sofre ao constante de ERO e ERN geradas em processos inflamatrios, por alguma disfuno biolgica ou provenientes dos alimentos. As principais ERO distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO), superxido (O2), peroxila (ROO) e alcoxila (RO); e os no-radicalares: oxignio, perxido de hidrognio e cido hipocloroso. Dentre as ERN incluem-se o xido ntrico (NO), xido nitroso (N2O3), cido nitroso (HNO2), nitritos (NO2), nitratos (NO3) e peroxinitritos (ONOO)10. Enquanto alguns deles podem ser altamente reativos no organismo atacando lipdios, protenas e DNA, outros so reativos apenas com os lipdios. Existem ainda alguns que so pouco reativos, mas apesar disso podem gerar espcies danosas. O radical HO o mais deletrio ao organismo, pois devido a sua meia-vida muito curta dificilmente pode ser seqestrado in vivo. Estes radicais freqentemente atacam as molculas por abstrao de hidrognio e por adio a insaturaes. Nos experimentos de laboratrio o HO pode facilmente ser seqestrado in vitro por inmeras molculas, devido a sua alta reatividade. No entanto, para que os resultados in vitro se reproduzam in vivo, necessrio ministrar alta concentrao do antioxidante para que este alcance o local onde o radical HO est presente em concentrao suficiente para suprim-lo. Existem duas maneiras de controlar a presena do radical HO: reparar os danos causados por ele ou inibir sua formao. O radical HO formado no organismo principalmente por dois mecanismos: reao de H2O2 com metais de transio e homlise da gua por exposio radiao ionizante6 (Equao 1). A incidncia de radiao no ultravioleta, radiao e raios X podem produzir o radical HO nas clulas da pele. O ataque intensivo e freqente deste radical pode originar mutaes no DNA e, conseqentemente, levar ao desenvolvimento de cncer em seres humanos no perodo de 15 a 20 anos. H2O
luz UV

*e-mail: jmdavid@ufba.br

HO + H

Divulgao
(1)

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O perxido de hidrognio isoladamente praticamente incuo, porm pode se difundir facilmente atravs das membranas celulares como, por ex., a membrana do ncleo. Devido ao fato da clula possuir metais de transio, ocorre gerao do radical HO em seu interior5 (Equao 2). Mn+ + H2O2 M(n+1)+ + HO + HO (2)

Em nosso organismo, os metais de transio mais importantes para a ocorrncia dessa reao so Cu1+ e Fe2+. Nesse sistema, a importncia do ferro mais pronunciada devido a sua maior biodisponibilidade e, no organismo, na maior parte do tempo ele encontra-se complexado com protenas de transporte (ex. transferrina), e armazenamento (ex. ferritina e hemosiderina). A reao do Fe2+ com o H2O2 (reao de Fenton) pode ser representada de maneira simplificada na Equao 3 ou de forma mais complexa na Equao 4. Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO + HO (3)

com as bases pricas por adio a C-4 e C-8, e em menor proporo com C-5, gerando 2,6-diamino-4-hidroxi-5formamidopirimidina (FapyG) (6), 4,6-diamino-5-formamidopirimidina (FapyA) (7), 8-oxo-7,8-diidro-2-desoxiguanosdeo (8oxoG) (8), 8-oxoA (9)11 (Figura 1). O ataque s bases pirimidnicas d-se por adio ligao dupla 5,6, e produz os radicais livres em C-6 e C-5 nas propores aproximadamente de 70 e 30%, respectivamente (14 e 15), gerando 5-hidroxi-6-hidrocitosina (16), 6-hidroxi-5-hidrocitosina (17), 5-hidroxi-6-peroxicitosina (20), 6-hidroxi-5-peroxicitosina (21), 5-hidroxi-6-oxocitosina (22) e 6hidroxi-5-oxocitosina (23). Os radicais peroxila (18 e 19) podem decompor-se gerando citosinaglicol (24) como produto majoritrio. A timina sofre a adio do radical ligao dupla 5,6, formando os radicais livres em C-5 e C-6 (25 e 26), e em menor teor o radical decorrente da abstrao de um prton da metila em C-5 (27), que gera 5-hidroxi-6-hidrotimina (28), 6-hidroxi-5hidrotimina (29), 5-hidroxi-6-oxotimina (36) e timinaglicol (37) como principais produtos10. A fragmentao completa da citosina e da timina mostrada na Figura 2.

(4) O radical hidroxila causa danos ao DNA, RNA, s protenas, lipdios e membranas celulares do ncleo e mitocondrial. No DNA ele ataca tanto as bases nitrogenadas quanto a desoxirribose (Figura 1). O ataque ao acar pode ser realizado por abstrao de um dos tomos de hidrognio (1-3) e quase sempre leva ruptura da cadeia de DNA10. O mecanismo dessa ruptura tem como principais produtos 5-8-ciclo-2-desoxiadenosina 8OHdA (4) e 58-ciclo-2-desoxiguanosina 8OHdG (5). A eletrofilicidade do HO possibilita sua interao com as bases nitrogenadas por adio s insaturaes em stios de alta densidade eletrnica. Assim, reage

Figura 2. Fragmentao oxidativa das bases pirimidnicas

Figura 1. Principais produtos da oxidao do DNA por ERO e ERN

Nos aminocidos e protenas, HO pode reagir na cadeia lateral, onde ataca preferencialmente cistena, histidina, triptofano, metionina e fenilalanina, e, em menores propores, arginina e asparagina11. Os ataques aos aminocidos que compem as protenas podem gerar danos como clivagens de ligaes com ou sem gerao de fragmentos e ligaes cruzadas, o que pode ter como

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conseqncia perda de atividade enzimtica, dificuldades no transporte ativo atravs das membranas celulares, citlise e morte celular. O ataque ocorre por adio do radical ou por abstrao de hidrognio. Todos os aminocidos podem sofrer abstrao do hidrognio do carbono C -COO ligado ao carboxilato e ao grupo amino. Essa abstrao, com exceo da glicina, leva perda de CO2 e formao de carbono radicalar11. Na Figura 3 so mostrados os principais produtos dessas reaes, destacando-se o tiohidroperxido (42), cistina (43)12, 2-oxo-histidina (44) em equilbrio com a 2-hidroxi-histidina (45)13, metionina sulfxido (46), metionina sulfona (47)14, derivados da arginina, lisina e prolina (48, 49 e 50), nitroacetato (51), oxima (52), hidroxilamina (53)14, oxalato (54)11 e derivados da tirosina (55-60).

4-oxo-2-nonenal (67) e 4,5-epxi-2(E)-decenal (68). Aldedos ,insaturados so conhecidos por sua ao genotxica, pois em presena do 2-desoxiguanosdeo e do 2-desoxiadenosdeo sofrem adio gerando heptanona-eteno-desoxiguanosdeo (69), heptanonaeteno-desoxiadenosdeo (70), eteno-desoxiadenosdeo (71), etenoadenosdeo e hexanol-1,N-2-propano-desoxiguanosdeo (72). A decomposio dos cidos graxos com trs ou mais insaturaes gera como produto adicional o aldedo malnico (73), que pode se adicionar ao 2-desoxiguanosdeo gerando pirimidol-[1,2a]purin-10ona desoxiguanosdeo (74)15 (Figura 4).

Figura 4. Compostos genotxicos produzidos pela oxidao dos lipdios por ERO e ERN, e produtos resultantes de seu ataque ao DNA

Figura 3. Principais produtos da oxidao dos aminocidos e protenas por ERO e ERN

O exemplo mais comum do ataque de radicais hidroxila a lipdios a ao deste nos lipdios de membrana. Os radicais livres centrados no oxignio (HO) atacam a cadeia lipdica em stios susceptveis como o grupo metilnico allico, convertendo-o em novo centro de radical livre. O carbono radicalar facilmente adiciona oxignio gerando o radical lipdio-peroxila, que pode facilmente atacar as protenas de membrana, produzindo danos nas clulas A Figura 6 traz exemplos dessa atuao. Os cidos graxos poliinsaturados so mais susceptveis ao ataque por radicais livres, devido ao carbono metilnico bis-allico. O radical formado pela abstrao do hidrognio gera os cidos decadienicos HPODE, 13Z,E-HPODE (61), 9-E,Z-HPODE (62), 9-E,E-HPODE (63) e 13E,E-HPODE (64) e a decomposio destes gera os aldedos ,insaturados 4-hidroperoxi-2-nonenal (65), 4-hidroxi-2-nonenal (66),

A forma mais deletria do oxignio ao organismo o oxignio singleto (1O2), pois a causa ou o intermedirio da toxicidade fotoinduzida do O2 em organismos vivos. O seu tempo de meiavida depende muito do meio onde se encontra. Em meio aquoso, sua meia-vida muito pequena, pois ele se choca com as molculas de H2O transferindo sua energia, desativando-se e retornando forma de oxignio tripleto. Em meio orgnico mais comum a ocorrncia de choque com transferncia de energia, sem reao qumica, seguida da dissipao dessa energia na forma de calor. Esse tipo de choque denominado quenching colisional e representa a forma como a gua desativa o 1O2. Porm, em meio orgnico, a meia-vida do oxignio singleto maior e, portanto, pode causar algumas reaes qumicas com determinados aceptores por incorporao do O2. O oxignio singleto reage com algumas classes de biomolculas e, em geral, essas reaes so do tipo eno (Equao 5) e dieno (reaes de Diels-Alder) (Equao 6). Os compostos naturais mais reativos frente ao 1O2 so os carotenides, devido as mltiplas insaturaes conjugadas. Assim, o 1O2 reage mais lentamente com os cidos graxos que com o -caroteno, e quanto maior o nmero de insaturaes presentes

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nos cidos graxos, mais rapidamente eles iro reagir. Essa reao se d por incorporao do oxignio cadeia com conseqente migrao da ligao dupla, formando cidos hidroperxidos como os HPODE16 (Figura 4).

(HOO) mais reativo (Equao 13). 2O2 + 2H+ O2 + H+ H2O2 + O2 HOO (12) (13)

(5)

(6)

O radical nion superxido (O2 ) participa de certos processos qumicos importantes no contexto biolgico. O principal deles auxiliar na produo de radical HO, atravs da reduo de quelatos de Fe (III) (Equao 14), formando Fe+2. Assim, o HO pode ser obtido atravs da reao de Haber-Weiss6,20 (Equao 15). Fe3+ + O2 [Fe3+ O2
Fe

Fe2+ O2]

Fe2+ + O2 (14) (15)

Na Figura 3 esto representados os produtos da reao do O2 com os aminocidos cistena, metionina, triptofano, tirosina e histidina27. A reao do oxignio singleto com os cidos nuclicos significativa apenas para a base guanina, que origina 8OHG (8). O perxido de hidrognio (H2O2) pouco reativo frente s molculas orgnicas na ausncia de metais de transio. No entanto, exerce papel importante no estresse oxidativo por ser capaz de transpor as membranas celulares facilmente e gerar o radical hidroxila. Ele somente oxida protenas que apresentem resduos de metionina ou grupos tiol muito reativos, GSH por ex. O H2O2 gerado in vivo pela dismutao do nion-radical superxido (O2 ) por enzimas oxidases ou pela -oxidao de cidos graxos. As mitocndrias so importantes fontes de O2 e, como a presena deste nion-radical pode causar srios danos, elas so ricas em SOD que o converte em H2O2. O perxido de hidrognio gerado ento parcialmente eliminado por catalases, glutationa peroxidase e peroxidases ligadas tioredoxina, mas como essa eliminao tem baixa eficincia, grande parte do H2O2 liberado para a clula18. O H2O2 tambm pode ser encontrado em bebidas como chs e principalmente caf instantneo e, rapidamente se difunde pelas clulas da cavidade oral e do trato gastrintestinal. Pode tambm ser produzido por bactrias presentes na boca, sendo utilizado pela peroxidase salivar para oxidar o tiocianeto (SCN) em tiocianato (OSCN), um produto txico para certas bactrias. Ele utilizado pelos fagcitos na produo de cidos hipoalogenosos, que so oxidantes muito efetivos no combate a vrus, bactrias e outros corpos estranhos, mas que por outro lado apresentam efeitos deletrios quando expostos s molculas biolgicas14,18. A maior fonte de energia para os organismos aerbicos est na terceira etapa da respirao, que ocorre no interior da mitocndria, onde uma molcula de O2 reduzida a duas molculas de H2O, com consumo de 4 eltrons (Equao 7). Nas equaes seguintes (Equaes 8-11) esto descritas as etapas da reduo de O2, formao de radical hidroxila e a segunda molcula de gua (Equao 11)19. O2 + 4e + 4H+ O2 + e O2 + e + 2H+ H2O2 + e + H+

O2 + H2O2
2+

HO + HO + O2

Alm disso, o radical nion O2 possui a habilidade de liberar Fe das protenas de armazenamento e de ferro-sulfoprotenas, tais como ferritina e aconitase, respectivamente. O radical nion O2 tambm reage com o radical HO produzindo oxignio singleto 1O2 (Equao 16) e com o xido ntrico (NO) produzindo peroxinitrito (ONOO) (Equao 17). O2 + OH NO + O2
1

O2 + HO

(16) (17)

ONOO

A atuao do radical nion superxido (O2 ) como oxidante direto irrelevante. Dentre os aminocidos, o nico que sofre oxidao com o radical O2 a cistena. A partir dessa reao formase um superxido (42) e o tio-radical (43) (Figura 3)18. Alm disso, o radical nion superxido O2 presente no organismo eliminado pela enzima superxido dismutase, que catalisa a dismutao de duas molculas de O2 em oxignio e perxido de hidrognio (Equao 12). Este ltimo, quando no eliminado do organismo pelas enzimas peroxidases e catalase, pode gerar radicais hidroxila18. Apesar destes efeitos danosos, o radical O2 tem importncia vital para as clulas de defesa e sem ele o organismo est desprotegido contra infeces causadas por vrus, bactrias e fungos. O radical O2 gerado in vivo por fagcitos ou linfcitos e fibroblastos durante o processo inflamatrio, para combater corpos estranhos. Os fagcitos o produzem com auxlio da enzima leuccito NADPH oxidase, que catalisa a reduo por um eltron do O2 com gasto de uma molcula de NADPH (Equao 18)18,19. 2O2 + NADPH 2O2 + NADP+ + H+ (18)

2H2O O2 H2O2

(7) (8) (9) (10) (11)

OH + H2O

OH + e + H+

H2O

O radical nion superxido (O2 ) ao contrrio da maioria dos radicais livres inativo. Em meio aquoso, sua reao principal a dismutao, na qual se produz uma molcula de perxido de hidrognio e uma molcula de oxignio (Equao 12). Ele tambm uma base fraca cujo cido conjugado, o radical hidroperxido

O radical nion superxido formado bactericida fraco, capaz de inativar protenas ferro-sulfurosas das bactrias, porm gera alguns produtos que possuem forte atividade antimicrobiana, tais como cido hipocloroso (HOCl), perxido de hidrognio (H2O2) e peroxinitrito (ONOO ) que so os principais responsveis pelo combate a corpos estranhos. Em alguns casos o radical nion O2 age como antioxidante, reduzindo semiquinonas para que elas possam retomar suas atividades metablicas na clula. Um exemplo a reduo da ubiquinona para ubiquinol, no interior da mitocndria18,19. Por fim, o radical nion superxido funciona como sinalizador molecular atravs da sua capacidade de oxidar grupos SH em ligaes dissulfeto (Equao 19), podendo ativar e desativar enzimas que contenham metionina. 2O2 + 2RSH 2HOO + RSSR (19)

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O radical xido ntrico (NO) pode ser produzido no organismo pela ao da enzima xido ntrico sintase a partir de arginina, oxignio e NADPH, gerando tambm NADP+ e citrulina21. Esse radical tambm pode ser produzido em maiores quantidades atravs dos fagcitos humanos, quando estimulados10,18. O nitrato pode transformar-se em nitrito, que reage com os cidos gstricos gerando o cido nitroso (HNO2). O xido nitroso (N2O3) tambm precursor do HNO2 atravs da sua reao com a gua. O HNO2 promove a desaminao das bases do DNA que contm grupo NH2 livre que so citosina, adenina e guanina, formando-se uracila, hipoxantina (11) e xantina (12), respectivamente (Figura 1)10. O xido ntrico NO no suficientemente reativo para atacar o DNA diretamente, mas pode reagir com o radical nion superxido O2, produzido pelos fagcitos, gerando peroxinitrito. Esse ltimo, por sua vez, pode sofrer reaes secundrias formando agentes capazes de nitrar aminocidos aromticos, a exemplo da tirosina gerando nitrotirosina (59) e as bases do DNA, em particular a guanina, na qual o produto principal a 8-nitroguanina (13)10,18,22. A presena do tampo CO2/HCO3 contribui para a nitrao de biomolculas pois o carbonato ao ser protonado forma o radical HCO3 e este oxida anis aromticos, produzindo bicarbonato (HCO3) e o radical aromtico correspondente, facilitando a entrada do radical NO2 23. A PROTEO AO ORGANISMO CONTRA O ESTRESSE OXIDATIVO Os radicais livres promovem reaes com substratos biolgicos podendo ocasionar danos s biomolculas e, conseqentemente, afetar a sade humana. Os danos mais graves so aqueles causados ao DNA e RNA. Se a cadeia do DNA quebrada, pode ser reconectada em outra posio alterando, assim, a ordem de suas bases. Esse um dos processos bsicos da mutao e o acmulo de bases danificadas pode desencadear a oncognese. Uma enzima que tenha seus aminocidos alterados pode perder sua atividade ou, ainda, assumir atividade diferente. Ocorrendo na membrana celular, a oxidao de lipdios interfere no transporte ativo e passivo normal atravs da membrana, ou ocasiona a ruptura dessa, levando morte celular. A oxidao de lipdios no sangue agride as paredes das artrias e veias, facilitando o acmulo desses lipdios, com conseqente aterosclerose, podendo causar trombose, infarto ou acidente vascular cerebral. As protees conhecidas do organismo contra as ERO e ERN abrangem a proteo enzimtica ou por micromolculas, que podem ter origem no prprio organismo ou so adquiridas atravs da dieta. As macromolculas so representadas pelas enzimas e podem atuar diretamente contra as ERO e ERN ou, ainda, reparar os danos causados ao organismo por essas espcies. Um exemplo a catalase (CAT) que converte o perxido de hidrognio em H2O e O2. Outras so capazes de eliminar a molcula ou a unidade dessa que se encontra danificada, como por ex., as enzimas responsveis pela exciso das bases nitrogenadas danificadas e substituio por outras intactas 10,19. So conhecidos trs sistemas enzimticos antioxidantes: o primeiro composto por dois tipos de enzimas SOD, que catalisam a destruio do radical nion superxido O2, convertendo-o em oxignio e perxido de hidrognio. A decomposio do radical nion superxido O2 ocorre naturalmente porm, por ser uma reao de segunda ordem, necessita que ocorra coliso entre duas molculas de O2, de forma que h necessidade de maior concentrao do radical nion superxido. A presena da enzima SOD favorece essa dismutao tornando a reao de primeira ordem, eliminando a necessidade da coliso entre as molculas. A ao desta enzima permite a eliminao do O2 mesmo em baixas

concentraes. Existem duas formas de SOD no organismo, a primeira contm Cu2+ e Zn2+ como centros redox e ocorre no citosol, sendo que sua atividade no afetada pelo estresse oxidativo. A segunda contm Mn2+ como centro redox, ocorre na mitocndria e sua atividade aumenta com o estresse oxidativo19. O segundo sistema de preveno muito mais simples, sendo formado pela enzima catalase que atua na dismutao do perxido de hidrognio (H2O2) em oxignio e gua19 (Equao 20). (20) O terceiro sistema composto pela GSH em conjunto com duas enzimas GPx e GR. A presena do selnio na enzima (selenocistena) explica a importncia desse metal e sua atuao como antioxidante nos organismos vivos. Esse sistema tambm catalisa a dismutao do perxido de hidrognio em gua e oxignio, sendo que a glutationa opera em ciclos entre sua forma oxidada e sua forma reduzida19. A GSH reduz o H2O2 a H2O em presena de GPx, formando uma ponte dissulfeto e, em seguida, a GSH regenerada (Equaes 21-23). (21) (22) (23) Dentre os antioxidantes biolgicos de baixo peso molecular, podem ser destacados os carotenides, a bilirrubina, a ubiquinona e o cido rico. Porm, as mais importantes micromolculas no combate ao estresse oxidativo so os tocoferis e o cido ascrbico (vitamina C)19. Vitamina C no ciclo oxidativo O cido ascrbico ou vitamina C comumente encontrado em nosso organismo na forma de ascorbato (75). Por ser muito solvel em gua, est localizado nos compartimentos aquosos dos tecidos orgnicos. O ascorbato desempenha papis metablicos fundamentais no organismo humano, atuando como agente redutor, reduzindo metais de transio (em particular Fe3+ e Cu2+) presentes nos stios ativos das enzimas ou nas formas livres no organismo24. Por ser um bom agente redutor o ascorbato pode ser oxidado pela maioria das ERO e ERN que chegam ou so formadas nos compartimentos aquosos dos tecidos orgnicos. Sua oxidao produz inicialmente o radical semidesidroascorbato (76), que pouco reativo. Esse radical pode ser reconvertido em ascorbato, ou duas molculas dele podem sofrer desproporcionamento originando uma molcula de desidroascorbato (77) e regenerando uma molcula de ascorbato. O desidroascorbato pode ser ento regenerado para ascorbato atravs de um sistema enzimtico, ou ser oxidado irreversivelmente gerando oxalato (78) e treonato (79)19,24 (Figura 5). Tendo em vista que o ascorbato converte as ERO e ERN em espcies inofensivas e que os derivados do ascorbato so pouco reativos, esse age como antioxidante in vivo. Devido a estas propriedades, muitos autores sugerem a ingesto diria de doses maiores de ascorbato, para proteo contra o desenvolvimento de doenas crnicas, cardiovasculares e de alguns tipos de cncer24. O ascorbato possui tambm propriedades pr-oxidantes pois os ons Fe2+ e Cu1+ reagem com o perxido de hidrognio (reao de Fenton, Equao 3) gerando o radical hidroxila. Indiretamente, o ascorbato pode induzir as reaes de radicais livres.

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Figura 5. Ciclo oxidativo do ascorbato

Porm, em funo do Fe encontrar-se, na maior parte do tempo, ligado a protenas de transporte ou armazenamento, em situao normal, as propriedades antioxidantes do ascorbato suplantam suas propriedades pr-oxidantes24. O ascorbato pode atuar contra a peroxidao de lipdios de duas maneiras: no plasma sanguneo, atua na preveno atravs da reao com as ERO e ERN presentes, ou na restaurao doando hidrognio ao radical lipdio (80). Isso explica seu papel na preveno de doenas cardiovasculares, devido ao fato de que sem a formao dos radicais lipdio-peroxila (81) no ocorre o ataque s protenas das paredes dos vasos e artrias sanguneos, causando o acmulo de lipdios nessas paredes e, conseqentemente, seu entupimento. Por outro lado, nas membranas celulares ele atua em parceria com o -tocoferol (82). O radical livre normalmente abstrai um prton do carbono metilnico allico, e o radical lipdio formado (80) rapidamente adiciona oxignio tripleto gerando o radical lipdio-peroxila (81). Nesta etapa, o tocoferol (82) age doando um hidrognio para esse radical formando o lipdio-hidroperxido (83) e o radical tocoferoxila (84). O ascorbato (75) na interface da membrana celular regenera o tocoferol doando um hidrognio, transformando-se em semidesidroascorbato (76) (Figura 6). As enzimas fosfolipase A2, fosfolipdio hidroperxido glutationa peroxidase, GPx e cido graxo coenzima A restauram o lipdio25.

O papel do ascorbato na proteo oxidao do DNA e, conseqentemente, sua ao preventiva no cncer ambguo. Estudos indicam que o consumo de ascorbato inferior ao recomendado (4060 mg/dia), por ex., consumo de 5 mg/dia aumentou os nveis de 8OHdG (5) em 91%. O consumo de 60 mg/dia reduziu os nveis de 8OHdG e 8OHG (8) no organismo reduzindo-se, assim, o risco de cncer. Foi verificado que uma suplementao superior a 500 mg/dia de ascorbato fez com que os nveis de 8OHdG e 8OHG decrescessem ainda mais, porm ocorrendo aumento nos nveis de 8OHA (9), Fapy-A (7) e Fapy-G (6). Mesmo com o aumento dessas espcies, o processo pode ser considerado benfico, pois o 8OHdG e o 8OHG tm maior poder mutagnico que 8OHA, FapyA e Fapy-G. No est estabelecido se a queda nos nveis de 8OHdG e 8OHG conseqncia direta da ao do ascorbato como antioxidante ou da sua atuao como cofator das enzimas de reparo. Alm disso, os nveis de 8OHA, Fapy-A e Fapy-G s aumentam expressivamente quando a concentrao de ascorbato no plasma sanguneo est acima de 70 M. Como a ingesto de 100 mg/dia promovia uma concentrao de 60 M no plasma, recomendou-se uma ingesto entre 100-200 mg/dia, para otimizar suas propriedades antioxidantes sem causar danos ao DNA24. A vitamina E no ciclo oxidativo A vitamina E constituda principalmente por quatro tocoferis, e secundariamente por quatro tocotrienis, sendo o -tocoferol (82) o mais ativo26. Estudos comprovam que a vitamina E um eficiente inibidor da peroxidao de lipdios in vivo. Estas substncias agem como doadores de H para o radical peroxila, interrompendo a reao radicalar em cadeia. Cada tocoferol pode reagir com at dois radicais peroxila e, nesse caso, o tocoferol irreversivelmente desativado. Para que eles no se desativem, necessitam do mecanismo de regenerao sinergtico com o ascorbato nas membranas celulares e com a ubiquinona na membrana mitocondrial25,27 (Figura 6). A reao de doao do H radicalar fenlico para os radicais peroxila acelerada pela presena de um grupo metoxi em para, pois este estabiliza o radical formado por ressonncia, e grupos metila em orto ou em orto e meta que apresentam pequeno impedimento estrico. Ao mesmo tempo, essa reao retardada quando a hidroxila fenlica se encontra estericamente impedida por grupos alquila maiores em orto, ou quando em presena de um grupo retirador de eltrons em para. Deste modo, no possvel prever qual dos tocoferis tem maior atividade. No entanto, estudos cinticos realizados in vitro

Figura 6. Ataque membrana celular e proteo pelo tocoferol e ascorbato. Esquema baseado na ref. 25

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Essa diferena de atividade justificada por uma distribuio mais uniforme na bicamada lipdica das membranas, que leva interao mais eficiente do anel cromano com os radicais lipdicos e maior eficincia na reciclagem do radical cromanoxila26. O papel dos carotenides e da vitamina A no ciclo oxidativo Dentre os carotenides, o -caroteno a mais importante fonte de vitamina A29. Eles formam um tipo incomum de agentes redutores biolgicos, pois reduzem melhor os produtos de oxidao a baixos nveis de oxignio. Altos nveis de oxignio levam destruio dos carotenides. Na maioria dos tecidos biolgicos, o nvel de oxignio baixo, de modo que os carotenides adquirem importncia como antioxidantes. Os carotenides agem in vivo como desativadores do oxignio singleto ou como seqestradores dos radicais peroxila, reduzindo a oxidao do DNA e lipdios, que est associada a doenas degenerativas, como cncer e doenas cardacas29. A principal atividade antioxidante dos carotenides a desativao do oxignio singleto, sendo que a velocidade para essa reao superior dos tocoferis. A desativao do 1O2 pode se dar de duas formas, pela transferncia fsica da energia de excitao do 1 O2 para o carotenide e pela reao qumica do carotenide com o 1 O2. Em condies normais no organismo, 95% da desativao do 1 O2 fsica, restando somente 5% para reagir quimicamente, o que torna os carotenides antioxidantes mais efetivos. Os produtos destas reaes so apresentados na Figura 8 29,30.

Figura 7. Representao das estruturas dos radicais 4-metoxifenoxil, TMMP e PMHC com os orbitais dos tomos de oxignio. Reproduzido da ref. 28, com permisso da American Chemical Society

demonstram que o -tocoferol possui uma constante de velocidade grande (k= 235 50 M-1 s-1) para a transferncia do H para um radical peroxila. Essa constante maior que para a maioria dos antioxidantes sintticos e ligeiramente superior aos outros tocoferis: -tocoferol (k= 166 33 M-1 s-1), -tocoferol (k= 159 42 M-1 s-1) e -tocoferol (k= 65 13 M-1 s-1). Esses resultados esto em acordo com o observado em testes in vivo28. As observaes do efeito cintico em -tocoferol com a hidroxila fenlica marcada com deutrio confirmam que a reatividade reside na poro fenlica da molcula. Com base nessa observao foram avaliadas as constantes de velocidade de doao do H para o 2,3,5,6tetrametil-4-metoxifenol (TMMP) (85) e o 2,2,5,7,8-pentametil-6hidroxicromano (PMHC) (86). Observa-se que a constante de velocidade para o TMMP (k= 21 2 M-1 s-1) representa apenas 9% da atividade do a-tocoferol, enquanto que para o PMHC (k= 214 81 M-1 s-1) aproximadamente idntica atividade do -tocoferol. Esta aparente incoerncia pode ser explicada por efeitos estricos. A presena do grupo metoxi em para nos fenis (87) aumenta a velocidade de doao do H radicalar. Isso devido ao fato que o eltron no ligante do oxignio metoxlico pode se deslocalizar migrando para o oxignio do radical fenxido (88) formando o on fenolato, que estabilizado por sua deslocalizao com o anel aromtico. O radical TMMP no apresenta esse aumento de velocidade na doao do H, devido ao impedimento estrico dos grupos metila. Esses grupos promovem o deslocamento da metoxila por efeito estrico para fora do plano do anel aromtico, de modo que o orbital p com o seu par de eltrons fique no plano do anel aromtico, inviabilizando a migrao do eltron. Com o PMHC e os tocoferis ocorre o aumento da velocidade de doao do H. Esse fato explicado pela presena de um segundo anel com o oxignio, que impede o giro do grupo e mantm o orbital p perpendicular ao anel aromtico. Assim, torna-se possvel a migrao do eltron no ligante do oxignio do anel para o orbital semipreenchido do oxignio radicalar (89). Embora o -tocoferol e o PMHC apresentem atividades semelhantes in vitro, o PMHC apresenta pouca ou nenhuma atividade in vivo. Esse fato explicado pela cadeia carbnica lateral dos tocoferis que aumenta sua solubilidade nas biomembranas, stio onde eles atuam28. Com base em observaes estruturais de se esperar que os tocotrienis apresentem atividade semelhante dos tocoferis perante as ERO e ERN. Porm a atividade do -tocotrienol contra a peroxidao de lipdios maior que a do -tocoferol, assim como a atividade dos tocotrienis maior que a dos respectivos tocoferis.

Figura 8. Principais produtos do ciclo oxidativo do -caroteno

Uma outra atividade recentemente estudada do seqestro de radicais peroxila. Os radicais peroxila adicionam-se dupla ligao 5-6, 5-6 ou 15-15 da cadeia do caroteno. Estudos de mecanismo revelaram a preferncia pela adio em 5,6 ou 5,6, geran-

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do o radical altamente estabilizado por ressonncia (93). Esse radical sofre, ento, uma substituio homoltica intramolecular, originando os teres cclicos (91 e 92), interconversveis em meio cido, alm do radical alcoxila30 (Figura 8). O processo completo de oxidao dos carotenides pode ser dividido em duas etapas. Na primeira, ocorre a formao de teres cclicos e compostos carbonlicos. Na segunda etapa os produtos primrios so convertidos em compostos carbonlicos de cadeias menores, com liberao de CO2 e cidos carboxlicos. O processo completo descrito por Woodall et al.30,31. Os mecanismos propostos esclarecem a atividade dos carotenides frente ao oxignio singleto e aos radicais peroxila, porm no esclarecem a atividade contra outros radicais e se esses so capazes de interromper a reao radicalar em cadeia. Observa-se tambm a menor atividade antioxidante para os carotenides que possuem substituio em 4 e/ou 4, em relao aos outros. Essas observaes podem ser explicadas pela presena de carbonos metilnico em 4 e 4 vizinhos s insaturaes conjugadas, que doam um hidrognio para os radicais livres, devido ao fato do radical gerado ser extremamente estabilizado por ressonncia (94)31. Outro aspecto da atividade dos carotenides diz respeito polaridade. Aqueles que possuem grupos polares nos anis A e B so efetivos na preveno da oxidao das membranas. Essa polaridade os localiza de maneira tal que esto em contato mais prximo com a fase aquosa, reagindo com os radicais que penetram a membrana. Os apolares, tais como o licopeno e o -caroteno so mais regeneradores que preventivos, combatendo os radicais formados com mais eficincia no interior da membrana31. Os retinides (vitamina A) possuem grupos polares que os localizam na membrana celular na regio prxima fase aquosa. No entanto, eles apresentam atividade antioxidante cerca de cinco vezes menor que a do caroteno sendo, provavelmente, a menor extenso da conjugao29,31. Coenzima Q10 no ciclo oxidativo A coenzima Q10 uma ubiquinona lipossolvel que possui uma cadeia longa isoprenide lateral. A ubiquinona o nico lipdio endogenamente sintetizado que apresenta funo redox32. Embora de forma diferenciada e bem especfica essa biossintetizada por todas as clulas, o que a torna o maior constituinte da membrana mitocondrial interna, membrana do complexo de Golgi e membrana dos lisossomos. Por outro lado, apenas poucas molculas so encontradas na membrana do LDL. Essa variao na distribuio sugere funes diferentes para diferentes membranas biolgicas. A ubiquinona ingerida como suplemento alimentar distribui-se principalmente entre o fgado e o plasma sanguneo, no sendo absorvida pelas membranas com concentrao elevada desta substncia. Nos humanos, sua biossntese muito ativa at os 30 anos de idade, poca que ocorre a estagnao de sua produo e, a partir desta idade, os nveis de ubiquinona comeam a decrescer. Estudos indicam que a administrao de suplementos de ubiquinona possui efeito benfico no tratamento de doenas do corao, degenerao muscular e outras doenas degenerativas 33 . Sua forma reduzida ubiquinol-10 (CoQH2) uma hidroquinona que ocorre predominantemente no corao, rins e fgado e a forma oxidada ubiquinona (CoQ10) abundante no crebro e no intestino34. A principal funo da ubiquinona acontece na membrana mitocondrial interna, onde participa da cadeia de transporte de eltrons e translocao de prtons H+ na mitocndria, juntamente com os citocromos e as desidrogenases mitocondriais. As desidrogenases oxidam os NADH, NADPH e FADH2 e transferem prtons e eltrons para a ubiquinona, convertendo-a em ubiquinol. Este por sua vez transfere prtons para a matriz mitocondrial e eltrons para os citocromos. Dessa

forma, citocromos reduzem o O2 para H2O com esses eltrons e prtons da matriz. Todo esse processo indispensvel para produo de ATP33. O ciclo redox da ubiquinona, porm, tambm capaz de transferir eltrons desemparelhados para aceptores que no participam da cadeia respiratria. A oxidao do ubiquinol d-se pela doao de hidrognio para um radical livre, gerando a respectiva semiquinona. O prosseguimento da oxidao leva formao da ubiquinona com a desativao final de dois radicais livres. Dessa maneira, essa substncia possui grande poder antioxidante atravs do seqestro de radicais livres, bem como se mostra eficiente na interrupo de reaes radicalares em cadeia. Tal atividade est limitada ao meio lipossolvel, devido a sua longa cadeia lateral16,33. Outra importante funo da ubiquinona a regenerao do tocoferol na membrana mitocondrial, onde exerce a mesma funo regenerativa que o ascorbato exerce na membrana celular. O ubiquinol (101) doa um hidrognio radicalar para o radical tocoferil (84), gerando ubiquinona semiquinona (102) e -tocoferol (82). O prosseguimento dessa reao gera ubiquinona e regenera mais uma molcula de -tocoferol25,27,35 (Figura 9).

Figura 9. Regenerao do tocoferol pelo ubiquinol

A ubiquinona tambm exerce papel considervel na desativao do radical nion superxido, pois este aps ser gerado na mitocndria prontamente oxidado pela ubiquinona formando oxignio e a forma reduzida ubiquinol 18,19. A cadeia lateral da ubiquinona e ubiquinol tambm exerce funo importante na atividade desses, uma vez que suas insaturaes participam na desativao do oxignio singleto 1O2, tanto por desativao fsica colisional quanto por adio s insaturaes16. Uma ltima atividade relevante da ubiquinona na mitocndria a reduo do nitrito (NO2-) a xido ntrico (NO), que um agente bioregulador33. Toda essa atividade antioxidante est favorecida na mitocndria devido estabilizao do radical livre intermedirio (102) pelos seus pares redox, atravs do fluxo de eltrons da cadeia respiratria. Em pH = 6,0 da mitocndria esse radical encontra-se predominantemente na forma desprotonada. Nesse estado, sem a presena de seus pares redox ele se desestabiliza em presena de oxignio, gerando ubiquinona e radical nion superxido O2. Porm, em situaes de acmulo de NADH e/ou NADPH, tal como na isquemia, ou em outras membranas que no possuem tal estabilizao, o acmulo da forma desprotonada aumenta a reao de formao do radical nion superxido. Como o ubiquinol possui atividade anloga SOD, o superxido dismutado gerando H2O2. O contato da ubiquinona semiquinona desprotonada com o perxido de hidrognio ou o radical peroxila desastroso, gerando radicais hidroxila (HO) e alcoxila (RO), respectivamente. Na membrana dos lisossomos a atividade apresentada pela

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ubiquinona diferente. Esta membrana muito rica em ubiquinona, com a peculiaridade de que a espcie dominante a CoQ9, que se encontra 70% na forma reduzida desprotonada. Sua funo o transporte de H+ para o interior do lisossomo, alm de ter uma funo prooxidante. Nesse caso, a gerao de radicais livres auxilia na funo do lisossomo33,34. Nas outras membranas e no plasma, o papel da ubiquinona fundamentalmente de antioxidante. Como no h a presena dos pares redox da mitocndria para estabilizar as ubiquinonas semiquinonas, elas so controladas por desproporcionamento onde duas molculas de semiquinonas geram uma molcula de ubiquinol e uma de ubiquinona. Outra forma de eliminao do excesso de semiquinonas sua regenerao pelo ascorbato, gerando ubiquinol e semidesidroascorbato. Os efeitos deletrios das semiquinonas so eliminados em condies normais. Isso favorece os efeitos benficos da ubiquinona, tornando-a til como antioxidante para o organismo33,34. cido rico no ciclo oxidativo O cido rico a principal forma de excreo de nitrognio das aves e dos rpteis. Nos mamferos, produto secundrio de excreo, derivado das bases purnicas. Na maioria dos tecidos orgnicos encontra-se na forma de nion urato (pKa1=5,4). Somente a partir dos anos 80 foi demonstrado que um antioxidante efetivo nos sistemas biolgicos, capaz de proteger o DNA e lipdios de ERO e ERN. A alta polaridade do cido rico restringe sua atividade ao meio aquoso. A sua concentrao nos compartimentos aquosos do organismo encontra-se muito prxima do limite de solubilidade (300 M). Indivduos com aterosclerose podem apresentar nvel elevado de cido rico no sangue, que indicativo da existncia de um mecanismo compensatrio encontrado pelo organismo para controlar o estresse oxidativo16,36. O mecanismo antioxidante do urato (103) pode ser resumido pela reao com a maioria dos agentes oxidantes em velocidade superior a das outras purinas (Figura 10). Nessa reao, h formao do radical urato (104) estabilizado. Devido ao baixo pKa=3,1 do radical urato, esse se encontra na forma de nion radical urato (105), o que facilita a doao de um prton em conjunto com o eltron. O pKa de segunda ionizao de 9,5 no permite que o radical urato se encontre na forma de um dinion no organismo36.

nion superxido (O2 ), perxidos (ROOH) e perxido de hidrognio (H2O2). Sozinho no capaz de desativar o oxignio singleto 1 O2, porm no meio biolgico ele causa indiretamente sua desativao atravs da desativao de outras espcies excitadas. Sua reao mais importante com os radicais peroxila (ROO) e NO2 (gerando NO2). Essa grande atividade contra os radicais peroxila a base do seu efeito antioxidante protetor do DNA e lipdios. Como ocorre em meio aquoso, o urato reage com os radicais peroxila antes desses penetrarem a membrana e iniciarem seus danos. O urato capaz de recuperar estruturas j atacadas que se tornaram radicais livres atravs da doao de um eltron e um prton. Ele tambm responsvel pela estabilizao do ascorbato no plasma sanguneo, inibindo a reao de Fenton16,36 atravs de sua capacidade de quelar ons metlicos como Fe+3, Fe+2, Cu+2 e Cu+ (106 e 107) (Figura 10). O nion radical urato pode ser regenerado a urato pelo ascorbato, gerando semidesidroascorbato. Porm, o urato no capaz de regenerar a vitamina E. A decomposio oxidativa irreversvel do urato leva formao inicialmente da alantona (108) e prossegue gerando o cido alantonico (109), cido cianrico, cido parabnico, cido oxlico e cido glioxlico36. O papel da hemoglobina no ciclo oxidativo A degradao da hemoglobina libera o grupo heme no organismo. A ferroporfirina ou grupo heme da hemoglobina liberada no bao, originria das clulas vermelhas mortas. A sua degradao libera Fe+3 e produz a biliverdina, um intermedirio tetrapirrolico linear, que reduzido pelo NADPH sob ao da enzima biliverdina redutase a bilirrubina, que pode se apresentar na forma lactmina ou lactmica. O heme no diretamente transportado pelo sangue devido sua atividade prooxidante. Devido ao Fe central, esse capaz de reagir com perxidos ROOH ou H2O2 originando vrios radicais livres (Equaes 24-28). ROOH + Heme-Fe+3 ROO + Heme-Fe+2 + H+ (24) (25) (26) (27) (28)

ROOH + Heme-Fe+2 RO + Heme-Fe+3 + HO 2ROOH ROO + RO + H2O RS + Heme-Fe+2 + H+ Heme-Fe+3 + O2

RSH + Heme-Fe+3 Heme-Fe+2 + O2

Figura 10. Sumrio das reaes envolvendo a atividade antioxidante do cido rico

O urato reage rapidamente com o radical hidroxila HO, no entanto, o urato inerte s espcies superxido (HOO), radical

Tanto a biliverdina quanto a bilirrubina possuem propriedades pr e antioxidantes, alm de propriedades txicas in vitro e in vivo. O aumento da biliverdina detectado em indivduos com necrose heptica e pode ampliar a atividade de certos oncogenes do fgado, ocasionando cncer. No entanto, em condies normais a atividade antioxidante da bilirrubina suplanta sua atividade prooxidante38. A atividade antioxidante da bilirrubina ocorre principalmente quando se encontra ligada albumina srica, sendo esse complexo considerado um dos antioxidantes naturais dos fluidos extracelulares. Essa atividade acontece principalmente devido sua grande reatividade com radicais peroxila (ROO). No entanto, ela tambm reage com radicais superxido a 1/10 da velocidade do ascorbato. A reao da bilirrubina com o oxignio singleto varivel, podendo ser tanto um gerador a partir do oxignio tripleto, quanto um desativador fsico efetivo. Por ltimo, essa exerce o papel de regeneradora do -tocoferol, embora com menor importncia que outros regeneradores, tais como o ascorbato (75) e a CoQ10 (101)16,38.

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Flavonides como antioxidantes De modo geral, os polifenis e em particular os flavonides possuem estrutura ideal para o seqestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos que as vitaminas C e E. A atividade antioxidante dos flavonides depende da sua estrutura e pode ser determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e eltrons, estabilidade do radical flavanoil formado, reatividade frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar metais de transio e solubilidade e interao com as membranas. A atividade de seqestro est diretamente ligada ao potencial de oxidao dos flavonides e das espcies a serem seqestradas. Quanto menor o potencial de oxidao do flavonide, maior sua atividade como seqestrador de radicais livres. Flavonides com potencial de oxidao menor que o do Fe+3 e Cu+2 e seus complexos podem reduzir esses metais, sendo potencialmente prooxidantes, tendo em vista que o Fe+2 e o Cu+ participam da reao de Fenton geradora de radicais livres39. Quanto maior o nmero de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de H e de eltrons40. Flavonides monoidroxilados apresentam atividade muito baixa, por ex. a 5-hidroxi-flavona tem atividade abaixo dos limites de deteco. Flavonas possuindo apenas uma hidroxila em 3, 6, 3 ou 4, assim como flavanonas apresentando apenas uma hidroxila em 2-OH, 3-OH, 4-OH, 6-OH tambm mostram fraca atividade. A 7-hidroxi-flavanona representa uma exceo, que pode ser justificada pela tendncia maior da 7-OH em doar H devido estabilizao do radical formado por deslocalizao com a carbonila em C-4 (110 e 111) (Figura 11).

Figura 11. Flavonides antioxidantes e mecanismo da estabilizao eltron desemparelhado

Entretanto, apesar dessa exceo, para proteger os lisossomos e outras membranas contra o estresse oxidativo foi constatada a necessidade de no mnimo duas hidroxilas fenlicas no flavonide, demonstrando que os monoidroxiflavonides no so efetivos. Entre os flavonides diidroxilados, destacam-se aqueles que possuem o sistema catecol (3,4-diidroxi) no anel B. Os flavonides com mltiplas hidroxilas como a miricetina (118), quecertina (117), luteolina (119), fustina (120), eriodictiol (121) e taxifolina (122) possuem forte atividade antioxidante quando comparados ao -tocoferol, cido ascrbico, -caroteno, glutationa, cido rico e bilirrubina40,41 (Figura 11). A estabilidade do radical livre flavanoil formado depende da habilidade do flavonide em deslocalizar o eltron desemparelhado. A presena de hidroxilas em orto o principal fator que auxilia nessa deslocalizao. Os outros fatores so a presena de insaturao no anel C e hidroxila em C-4 em B conjugada com a carbonila; ngulo do anel B do flavonide e do radical formado em relao ao restante da estrutura, sendo que esse ngulo regulado pela presena ou ausncia de hidroxila em C-3; presena de duas insaturaes em C; conjugao da carbonila em C-4 com hidroxila em C-5 e, presena de hidroxila em C-7 42. A doao do H ocorre principalmente nas posies 7-OH > 4-OH > 5-OH, seguindo a seqncia das constantes de dissociao42. Os flavonides, devido ao seu carter fracamente cido encontram-se, em geral, parcialmente ionizados, o que aumenta a estabilidade na posio C-4 e favorece a deslocalizao do eltron desemparelhado do radical formado entre os anis A, B e C [por ex., quercetina parcialmente ionizada em C-4 (112)]. A doao do H radicalar para o radical livre ocorre principalmente nas posies C-4 (113) e C-7 (114). Ambos os radicais livres formados podem ter seu eltron deslocalizado pela estrutura, com maior estabilidade para os radicais 113, 115 e 116, devido estabilizao resultante das ligaes de hidrognio4,42,43. A remoo de metais de transio livres no meio biolgico fundamental para a proteo antioxidante do organismo, visto que esses catalisam as reaes de Fenton (Equao 3) e de HaberWeiss (Equao 15). Para a atividade de quelao de metais de transio fundamental a presena de grupos orto-difenlicos, onde o mais comum o sistema 3,4-diidroxi, unidade catecol em B e/ou estruturas cetol como 4-ceto-3-hidroxi e 4-ceto-5hidroxi. A substituio de qualquer uma das hidroxilas envolvidas na quelao de metais reduz essa atividade devido, principalmente, ao impedimento estrico provocado. Outros sistemas ortodifenlicos em flavonides menos comuns tambm podem quelar os metais de transio, como por ex. o 6,7-diidroxi ou 7,8diidroxi 4,39,43. O ltimo fator importante que influencia a atividade antioxidante dos flavonides a sua interao com as biomembranas. A lipofilicidade do flavonide indica a incorporao desse pela membrana, que alvo da maioria das ERO e ERN. Assim, deve haver uma concentrao mnima do flavonide por cido graxo, de modo a assegurar a presena de uma de suas molculas prxima ao stio de ataque do radical44. Flavonides que possuem uma cadeia de acares ligada em sua estrutura so muito polares, no sendo assimilados pela membrana, porm, nesta forma eles podem ser armazenados em vesculas, possuindo um tempo maior de permanncia no organismo. Os flavonides que so assimilados pelas membranas exercem a funo de moduladores de fluidez. Restringindo essa fluidez os flavonides geram um impedimento fsico para a difuso das ERO e ERN, de modo que decresce a cintica das reaes responsveis pelo estresse oxidativo. Esse tipo de atividade antioxidante similar ao relatado para o -tocoferol e o colesterol45.

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CONSIDERAES FINAIS O organismo humano est sujeito ao estresse oxidativo causado por ERO e ERN provenientes do meio ambiente ou geradas pelo prprio organismo. Entre as biomolculas alvo dessas espcies encontram-se as que compem membranas celulares, protenas DNA e RNA. Hoje em dia sabe-se que a ao de espcies oxidantes sobre o DNA responsvel por mutao ou mesmo oncognese. No entanto, o organismo protegido em parte por macro e micromolculas de origem endgenea ou obtidas diretamente da dieta. A proteo enzimtica baseia-se quase que exclusivamente na decomposio de nion superxido ou dismutao de perxido de hidrognio, agentes oxidantes brandos. Cabe s micromolculas, tais como tocoferis, carotenides e flavonides entre outros, o papel de impedir o ataque de ERO e ERN ou regenerar os danos causados em sistemas biolgicos essenciais. O mecanismo complexo de atividade anti e pr-oxidante destas substncias alvo de extensos estudos cientficos contemporneos, tendo em vista que o sucesso destas investigaes est diretamente relacionado com a melhoria da qualidade de vida do ser humano. AGRADECIMENTOS Ao CNPq, FAPESB e ao IMSEAR pelas bolsas e auxlios. LISTA DE ABREVIATURAS 8OHdA 5-8-ciclo-2-desoxiadenosina 8OHdG 5-8-ciclo-2-desoxiguanosina 8-oxoA 8-oxo-7,8-diidro-2-desoxiadenosdeo 8-oxoG 8-oxo-7,8-diidro-2-desoxiguanosdeo AG-CoA cido graxo coenzima A CAT - Catalase ERN Espcies Reativas de Nitrognio ERO Espcies Reativas de Oxignio FapyA 4,6-diamino-5-formamido-pirimidina FapyG 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina GPx Se-glutationa peroxidase GR Glutationa Redutase GSH Glutationa HPODE cido hidroperoxioctadecadienico PMHC 2,2,5,7,8-pentametil-6-hidroxicromano SHi Substituio Homoltica Intramolecular SOD Superxido dismutase TMMP 2,3,5,6-tetrametil-4-metoxifenol REFERNCIAS
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