AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIOXIDANTE DE CAROTENOIDES PROVENIENTES DE

BACTÉRIAS SIMBIÓTICAS DE CORAIS Mussismilia braziliensis e Montastraea

cavernosa EM ZEBRAFISH (Danio rerio)

Caroline Corrêa de Aguiar

O estresse oxidativo tem origem na produção excessiva de espécies reativas de

oxigênio (ROS). A geração dos ROS é um processo contínuo e fisiológico, que cumpre
funções biológicas importantes (VIZZOTO, E., 2017).
As espécies reativas são moléculas ou íons derivados do oxigênio, que em sua maioria
possuem alta reatividade e constituem três classes de compostos: espécies reativas de
oxigênio (ROS), espécies reativas de enxofre (EREs) e espécies reativas de nitrogênio
(ERNs). As espécies reativas podem ainda ser divididas em grupo dos radicais livres e
grupo dos compostos não radicalares (MAGDER, S., 2006; CAROCHO, M., 2013), onde
os principais radicais livres são: hidroxila (OH•), superóxido (O2∙-), peroxil (HOH•) e
superóxido (O2-•); e os principais não-radicalares são: peróxido de hidrogênio (H2O2) e
ácido hipocloroso (HClO), oxigênio singlete (¹O2) (BARREIROS A. L. B. S., 2006)
Os radicais livres são moléculas que possuem pelo menos um elétron desemparelhado
em seus orbitais externos. Isso permite a transferência de elétrons com moléculas
vizinhas, podendo agir como aceptores ou doadores de elétrons, criando alterações no
ambiente molecular ao seu redor. Os compostos não radicalares, não possuem elétrons
livres, sendo portanto menos instáveis que os radicais livres, mas também podem reagir
com moléculas à sua volta (MAGDER, S., 2006; CAROCHO, M., 2013).
A formação de espécies reativas (reações de oxi-redução ou reação redox) pelo
organismo em condições normais é inevitável, pois além de outros processos, estão
envolvidos na respiração celular que ocorre nas mitocôndrias, a fim de gerar a energia na
forma de adenosina trifosfato (ATP), sua produção, em proporções adequadas, possibilita
a fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular, imunidade, defesa
celular e síntese de substâncias biológicas, fertilização do óvulo, ativação de genes, e
participação de mecanismos de defesa durante o processo de infecção (VIZZOTO, E.,
2017)
Durante os processos metabólicos, as espécies reativas de oxigênio atuam como
mediadores para a transferência de elétrons nas várias reações bioquímicas, com o
aumento da sua produção na ocorrência de lesões teciduais causadas por traumas,
infecções, parasitas, hipóxia, toxinas e exercícios extremos (BARREIROS A. L. B. S.,
2006), levando o organismo a desenvolver uma série de mecanismos de defesa
antioxidante para limitar os níveis intracelulares e impedir a indução de danos. (RAHMAN
et al., 2006).
A similaridade entre sistemas antioxidantes de peixes e mamíferos permite que sejam
realizados estudos realistas da avaliação de substancias quanto aos potenciais efeitos
protetores ou tóxicos (MASSARSKY et al, 2017). Para este fim o modelo experimental
zebrafish (Danio rerio) vem sendo utilizado na pesquisa científica de forma crescente
devido às vantagens atribuídas à espécie, entre elas, a alta fecundidade, o rápido
desenvolvimento, transparência óptica durante a embriogênese, baixo custo, facilidade de
manutenção no laboratório e sua capacidade de absorver compostos dissolvidos em água
(WILSON; BUNTE; CARTY, 2009).
O desequilíbrio entre as espécies oxidantes e antioxidantes, em favor da geração
excessiva de espécies reativas ou, em detrimento da velocidade de remoção desses pelo
sistema de defesa antioxidante, leva ao estresse oxidativo, favorecendo a ocorrência de
danos oxidativos às biomoléculas. Diante disso, os danos crônicos às biomoléculas
desencadeados pelo estresse oxidativo tem sido associado à etiologia de diversas
patologias, incluindo câncer, doença cardiovascular, isquemia cerebral, doenças
neurodegenerativas, além do envelhecimento. Por isso, é necessário que exista um
equilíbrio entre a produção e a eliminação destas espécies reativas. (BARREIROS A. L. B.
S., 2006)
Alguns antioxidantes são capazes de interceptar as ROS geradas pelo metabolismo
celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os lipídeos, os aminoácidos
das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poliinsaturados e as bases do DNA,
evitando a formação de lesões e perda da integridade celular. Ainda que em alguns
tecidos estejam presentes em baixas concentrações, são capazes de atrasar ou inibir as
taxas de oxidação e sequestrar radicais livres de maneira eficaz. (VASCONCELO, T. B.,
2014)
Os agentes antioxidantes podem ser enzimáticos e não enzimáticos. Os enzimáticos de
maior importância são a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e as enzimas do
ciclo redutor da glutationa, glutationa peroxidase (GSHPx) e glutationa redutase (GR).
Entre os antioxidantes não enzimáticos, encontram-se os compostos antioxidantes de
origem dietética, entre os quais destacam-se o tocoferol e o ácido ascórbico, compostos
fenólicos e carotenoides, pois são capazes de fazer a intercepção das espécies reativas
de oxigênio (KRINSKY, N. I., 1989; RAMEL, F., et al.,2012).
Os carotenoides são pigmentos naturais responsáveis pelas cores amarela, laranja e
vermelha utilizados nas indústrias alimentícia (como corantes e no enriquecimento de
alimentos), farmacêutica, de cosméticos e ração (NIIZU, P. Y., 2003). Sua utilização se
deve às suas atividades pró-vitamina A, atividade antioxidante e pró-oxidante, que
resultam em possíveis funções biológicas benéficas à saúde (NIIZU, P. Y., 2003), como
prevenção de doenças associadas aos processos de estresse oxidativo. (câncer, catarata,
arteriosclerose e retardo do processo de envelhecimento) (RIBEIRO & SERAVALLI, 2004;
CUARESMA et al., 2011; VENIL et al., 2013, ESTEBAN et al., 2015). Além disso, podem
capturar eficientemente radicais de oxigênio singlete e radicais peroxila, sendo os mais
eficientes inativadores naturais do oxigênio singlete, atuando de duas formas diferentes:
uma via física, que ocorre pela transferência de energia das moléculas de oxigênio
singlete aos carotenoides; e uma via química, que constitui aproximadamente 0,5% do
total da inativação do oxigênio singlete. Sequestram radicais peroxila por interação
química. Os carotenoides possuem caráter lipofílico, atuando como antioxidante sobre as
lipoproteínas LDL e HDL (PODSEDEK A., 2007)
A produção biotecnológica de carotenoides vem se destacando com a possibilidade
de utilização de substratos de baixo custo para a bioprodução (SILVA, M. C.,2004). Há
algumas décadas, as condições ambientais e os estimulantes da carotenogênese vêm
sendo examinados, a fim de melhorar a produção de carotenoides e avaliar os
microrganismos produtores de pigmento como microalgas, fungos e bactérias (AKSU, Z.,
2005). As bactérias simbióticas de coral que compõem a estrutura dos holobiontes de
coral, por exemplo, produzem pigmentos ainda pouco conhecidos. Esses pigmentos
podem contribuir para a fotossíntese, fotodegradação, nutrição e proteção contra danos
oxidativos causados por espécies reativas de oxigênio. A fisiologia e os fatores ambientais
do recife como as tensões térmicas levam à superprodução de ROS, o que pode levar a
dano oxidativo ao holobionte. Contudo, pigmentos produzidos por bactérias simbióticas
presentes nos holobionte podem oferecer uma linha de defesa (GIERZ SL., et al., 2017;
WEIS VM. ,2008).
Em estudos recentes, no Instituto de Biologia da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, realizados por TOOBA V., et al, pigmentos bacterianos foram isolados de
Fabibacter, Paracoccus e Pseudoalteromonas, obtidas dos corais Mussismilia braziliensis
e Montastraea cavernosa no Banco de Abrolhos no Brasil, para análise mais detalhada
sobre a saúde dos holobiontes. Segundo o estudo, as culturas desses simbiontes
bacterianos produziram forte atividade antioxidante (catalase e peroxidase). Os principais
pigmentos carotenoides foram isolados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(HPLC) e espectrometria de massa.
Para o presente estudo utilizaremos o peixe teleósteo zebrafish (Danio rerio), como
modelo experimental, por seu conhecido emprego em estudos mutagênicos,
farmacêuticos e toxicológicos, uma vez que oferece, ainda, a vantagem de ser mais
próximo, evolutivamente, aos seres humanos do que a mosca Drosophila. O zebrafish
possui 26.000 genes sequenciados sendo que 70% destes possuem homólogos nos
humanos (ARMILIATO,2014; BENDER, 2011; LAWRENCE, 2007; SEIBT, 2009).

Objetivo

O objetivo desse projeto é analisar os impactos do tratamento in vitro e in vivo com

o extrato de carotenóides provenientes das bactérias simbióticas de corais, com o intuito
de avaliar o potencial antioxidante mediante indução ao estresse oxidativo induzido por t-
BHP (hidroperóxido de terc-butila)

Estratégias Experimentais

Para a avaliação da ação antioxidante do extrato de carotenoides provenientes do

cultivo das bactérias simbióticas de corais Mussismilia braziliensis e Montastraea
cavernosa, a estratégia experimental será avaliar a concentração segura para o
tratamento com o extrato de carotenoide, primeiramente, in vitro em cultura celular de
fibroblastos murinos. Após a realização dos ensaios de toxicidade in vitro os testes
passarão para o modelo in vivo com a utilização das larvas de zebrafish (Danio rerio)
expostas à solução t-BHP (hidroperóxido de terc-butila)para indução de estresse
oxidativo. Posteriormente, as serão tratadas com extrato de carotenoides nas diferentes
concentrações determinadas pelo ensaio in vitro e através da mensuração da expressão
de GSH com a utilização de sonda CellTracker TM Green CMFDA será feita a avaliação
da ação antioxidante do extrato.
Fluxograma da Estratégia Experimental

CULTIVO DE BACTÉRIAS
SIMBIÓTICAS DE CORAIS EXTRAÇÃO DO COMPOSTO
Mussismilia braziliensis e CAROTENÓIDE
Montastraea cavernosa

EXPOSIÇÃO DAS LARVAS DE

CULTIVO DE CÉLULAS DE
ZEBRAFISH AO t-BHP
FIBROBLASTOS MURINOS PARA
(hidroperóxido de terc-butila)
DETERMINAÇÃO DAS
PARA INDUÇÃO AO ESTRESSE
CONCENTRAÇÕES
OXIDATIVO

UTILIZAÇÃO DO EXTRATO DE MENSURAÇÃO DA EXPRESSÃO

CAROTENÓIDES EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES
EM GRUPOS DE LARVAS DE
ZEBRAFISH APÓS A INDUÇÃO
AO ESTRESSE OXIDATIVO
DE GSH COM A UTILIZAÇÃO DE
SONDA CELLTRACKER TM
GREEN CMFDA PARA
AVALIAÇÃO DA AÇÃO
ANTIOXIDANTE DO EXTRATO.

De acordo com o estudo de Lackmann C., et al. de 2018, os tipos de sonda sondas
fluorescentes mais amplamente utilizadas para detecção de estresse oxidativo são as H 2
DCFDA, CM-H 2 DCFDA, CellTracker TM Green CMFDA. (CHEN et al., 2010; ZIELONKA
E KALYANARAMAN, 2010) e o reagente MitoSOX ™ Red de alvo mitocondrial (WANG et
al., 2013). Em seu estudo, Lackmann C. et al., teve como objetivo desenvolver
procedimentos simples, eficazes e confiáveis, que permitissem a avaliação da ocorrência
de estresse oxidativo em larvas vivas de peixe-zebra sem o uso de linhagens de peixes
transgênicas. Tendo em vista a utilização do mesmo modelo experimental e mediante os
protocolos desenvolvidos pelo estudo, foi determinada a utilização da sonda CellTracker
TM Green CMFDA como método de escolha para avaliar a produção de espécies reativas
de oxigênio em embriões de zebrafish após exposição ao extrato de carotenóides
provenientes de cianobactérias, a fim de verificar seu o potencial poder antioxidante.
A utilização de modelos animais alternativos, como os embriões de zebrafish permite
que esses estudos sejam feitos. Além da transparência e o fato de não serem
considerados animais de laboratório (até 120 horas pós fertilização), permite que o
monitoramento in vivo da produção de ROS e GSH seja relativamente simples e
eticamente correto.
Para isso, o protocolo orienta a utilização de grupos de larvas suspensas em solução
de t-BHP (hidroperóxido de terc-butila) 1, 1,5 ou 2 mM preparada em meio embrionário
com exposição de 30 min, 1h ou 2h e duas lavagens posteriores com meio embrionário e
incubação com a sonda CellTracker ™ Green CMFDA. Diante disso é possível fazer uma
avaliação qualitativa da produção de GSH in vivo em larvas de peixe-zebra após a
exposição ao t- BHP usando a sonda fluorescente.
A avaliação consiste na detecção visual sob um estereomicroscópio de fluorescência e
observação do padrão de fluorescência produzido como consequência da indução do
estresse oxidativo nos corpos das larvas do peixe-zebra.

Resultados esperados

Ao comparar o grupo submetido ao estresse oxidativo sem tratamento com o extrato de

carotenoides ao grupo submetido ao estresse tratado com o extrato de carotenoides, é
esperado que seja identificado o potencial antioxidante do extrato de carotenoides através
da menor fluorescência no grupo tratado, quando comparado ao grupo controle
, pois indicaria um menor estresse oxidativo e com isso menor expressão de glutationa.
Tal resultado seria sugestivo de que carotenoides provenientes de pigmentos de bactérias
simbióticas possuem poder antioxidante, sendo capazes de diminuir o estresse oxidativo.
 Figura1: detecção visual de GSH em larvas de zebrafish sob um estereomicroscópio de
fluorescência. Retirada e modificada de Novel procedures for whole organism detection and
quantification of fluorescence as a measurement for oxidative stress in zebrafish (Danio rerio)
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APRESENTADA COMO REQUISITO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR PELO PROGRAMA DE
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