1.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas durante o metabolismo

respiratório promovem acúmulo de prejuízos oxidativos ao DNA, proteínas e
lipídeos (Poli et al.,2004). Essas EROs possuem papel importante não somente
na transdução de sinais fisiológicos mas também na patogênese de várias
doenças humanas tais como aterosclerose, doenças neurodegenerativas,
desordens metabólicas, envelhecimento e câncer (Valko et al.,2007).

Sendo assim os organismos desenvolveram mecanismos de defesas

antioxidantes, que consiste de uma série de enzimas antioxidantes e de
numerosos compostos antioxidantes endógenos e presentes na dieta que reagem
com as EROs e as inativam ( Roberts & Sindhu, 2009).

O processo de envelhecimento pode ser definido como um declínio

progressivo das funções fisiológicas de um organismo após a fase reprodutiva da
vida. Com isso vários estudos mostram que células e organismos ao longo de
suas vidas acumulam altos níveis de danos oxidativos ao DNA (Beckman &
Ames,1998).

O supressor tumoral p53 é uma importante molécula envolvida na

regulação da resposta celular ao prejuízo oxidativo ao DNA por agentes
genotóxicos tais como radiação ultravioleta ou radiação ionizante, EROs e certas
drogas antitumorais (Achanta & Huang, 2004).

Genes supressores de tumores previnem a morte prematura por inibirem o

desenvolvimento de câncer; por isso, também são classificados como “genes de
longevidade” (“longevity assurance genes”), reduzindo o processo de
envelhecimento (Barzilai & Shuldiner, 2001).

1.2 – Espécies reativas de oxigênio (EROs) e estresse oxidativo.

A formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) é uma

conseqüência inevitável em um organismo aeróbio. O oxigênio é uma molécula
oxidante que é utilizada como aceptor final de elétrons durante a última etapa da

1
cadeia transportadora de elétrons no processo de respiração aeróbica (Halliwell &
Gutteridge, 1984). Porém, se a redução do oxigênio for incompleta formam-se
espécies reativas desta molécula (Ma, 2010). Os subprodutos normais da
respiração incluem o peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical superóxido (O2•) e o
radical hidroxila (OH•) (Cabiscol et al.,2000; Karihtala & Soini,2007). As EROs
podem ser resultados de fatores externos e ambientais, tais como reação as
drogas, aos metais pesados e radiação. No entanto, a maioria das EROs são
produzidas pela cadeia respiratória na mitocôndria (Cabiscol et al.,2000).

As EROs são uma variedade de moléculas derivadas, portanto, do

oxigênio molecular (O2), enquanto que os radicais livres são espécies com um ou
mais elétrons não pareados. Apesar do oxigênio molecular conter dois elétrons
desemparelhados na camada exterior não é muito reativo uma vez que ambos os
elétrons têm a mesma rotação (Herrero et al., 2008). A reatividade e toxicidade
destas espécies reativas de oxigênio aumentam de acordo com o recebimento de
um, dois ou três elétrons formando respectivamente o radical superóxido (O2•) , o
peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH•) ( figura 1). Destas
espécies reativas de oxigênio, os radicais superóxido e hidroxila são
freqüentemente denominados de radicais livres por apresentarem um elétron não
pareado em sua órbita mais externa. (Halliwell et al Gutteridge, 1984).

As EROs desenvolvem papel duplo, podendo ser prejudiciais ou

benéficas. Os efeitos benéficos envolvem funções fisiológicas nas respostas
celulares, como por exemplo, na defesa contra agentes infecciosos, sinalização
celular e indução de resposta mitogênica (G. Poli et al, 2004). Em contraste, em
altas concentrações, as EROs causam danos a estruturas celulares devido à
oxidação de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos (DNA e RNA), (Franco et al.,
2008; Klauning & Kamendulis, 2004), ocasionando freqüentemente a perda da
viabilidade celular (figura 2). As células desenvolveram mecanismos de defesa
enzimáticos e não enzimáticos para evitar os danos causados pelo estresse

2
oxidativo nas células (Gabriel et al., 2009). Sem estes mecanismos de defesa,
EROs não seriam eliminadas e, conseqüentemente, inúmeras biomoléculas
juntamente com a viabilidade celular seriam comprometidas (Gabriel et al, 2009).
Alguns exemplos de não enzimáticos são vitamina E, vitamina C, ubiquinonas,
flavonóides e glutationa (GSH), e alguns enzimáticos são catalase, peroxidases,
superóxido dismutase e glutaredoxinas (Martindale & Holbrook,2002). O estresse
oxidativo ocorre quando os níveis de oxidantes são maiores do que os níveis de
antioxidantes, podendo ser causado pelo aumento dos níveis de EROs ou
diminuição de antioxidantes ou ambos (Ott et al., 2007). O estresse oxidativo tem
sido associado a doenças cardiovasculares, neurodegenerativas (por exemplo,
Parkinson, e Alzheimer) e câncer, bem como ao processo de envelhecimento
(Knight, 1998; Toyokuni S, 1999).

3
 Figura 2: As fontes de EROs e as respostas celulares. (adaptado de Finkel
& Holbrook, 2000)

4
1.3. Envelhecimento e EROs

O envelhecimento pode ser descrito como a capacidade reduzida de

células ou tecidos de se auto-renovarem de forma adequada e responder a vários
tipos de estresse (Gerstein et al., 1993).

Se o estresse oxidativo e a habilidade de responder eficazmente a ele são

importantes para o processo de envelhecimento, então os fatores que aumentam
a resistência a este estresse deveriam também aumentar a longevidade celular.
Diversos estudos em diversos modelos (nematódeo, inseto e até mamífero)
mostram exatamente isto, fortalecendo a hipótese da correlação entre estresse
oxidativo e envelhecimento (Finkel & Holbrook, 2000).

Existem vários fatores que sugerem que a formação de EROs pode

ser a principal causa para o envelhecimento: (1) EROs são produzidas
permanentemente pela atividade celular normal; (2) EROs são moléculas
altamente reativas que podem gerar vários danos, o que explicaria a variedade
das alterações relacionadas à idade avançada; (3) manipulação do funcionamento
da cadeia respiratória teve grandes efeitos na longevidade, como seria esperado
se EROs regularem o tempo de vida; (4) manipulação das defesas antioxidantes
teve efeitos severos na longevidade; (5) a restrição calórica prolonga o tempo de
vida e causa uma diminuição na produção de EROs acompanhada de uma
superexpressão das defesas antioxidantes; (6) muitas vias regulatórias que
prolongam o tempo de vida também afetam o abastecimento de substratos para a
cadeia respiratória e/ou para a proteção contra danos induzidos por EROs (Dufour
& Larsson, 2004).
Novas teorias surgem baseadas em aspectos chaves das teorias
antecessoras como, por exemplo, a “Teoria Mitocondrial” do envelhecimento que
consiste de três componentes principais: aumento na produção de EROs,
acúmulo de danos no DNA mitocondrial e disfunção progressiva da cadeia de
transporte de elétrons (Dufour &Larsson, 2004; Alexeyev et al., 2004).

5
 Os efeitos deletérios ao acaso dos radicais livres produzidos durante o
metabolismo aeróbico pode causar danos ao DNA, lipídios e proteínas, se
acumulam ao longo do tempo (M. Valko et al., 2006).

1.4. Sistema antioxidante: SOD e catalase.

Dada a grande diversidade de produção de EROs, as células

eucarióticas desenvolveram mecanismos elaborados de defesa celular. Duas
enzimas antioxidantes se destacam: a superóxido dismutase (SOD) e catalase
(CAT) (Roberts & Sindhu, 2009).

1.4.1. Superóxido dismutase (SOD)

Um dos mecanismos de defesa antioxidante enzimático intracelular

mais eficaz é da superóxido dismutase (SOD). Esta catalisa a dismutação do
ânion superóxido (O•) gerando O2 e peróxido de hidrogênio (H2O2) ( figura 3)
(Culotta et al., 2006; Fridovich, 1995; Herrero et al., 2008; M. Valko et al., 2006).
Na realidade a superóxido dismutase constitui uma família de proteínas com a
mesma função, porém com localização e constituição dos centros ativo diferentes.
Em mamíferos e leveduras, a enzima Cu2+ Zn2+-superóxido dismutase
(Cu/ZnSOD) é codificada pelo gene SOD1 (Culotta et al., 2006; Herrero et al.,
2008).

( figura 3)

Esta enzima em mamíferos também se encontra no espaço

extracelular, diferindo da Cu/ZnSOD citoplasmática dimérica, por ser tetramérica e
glicosilada (Fridovich, 1995; G.N. Landis, J. Tower, 2005). A justificativa da

6
existência de uma SOD extracelular está na necessidade das células se
defenderem de fontes exógenas de O2• (McCord et al.,1973; Fridovich, 1995).

Em eucariontes, a Mn2+-superóxido dismutase (MnSOD) é codificada

pelo gene SOD2, tem localização mitocondrial e é responsável pela eliminação do
radical O2• que é produzido nesta organela. O radical superóxido tem como
característica não ser permeável a membranas biológicas, ocorrendo assim a
necessidade da presença de SODs distintas no citossol, mitocôndria e no espaço
extracelular das células (Fridovich, 1995; Henrrero et al.,2008).

Apesar das enzimas SODs possuírem uma posição de prestígio no

combate as ERO, temos que levar em consideração que um de seus produtos
ainda representa um perigo para os constituintes celulares como é o caso do
peróxido de hidrogênio. Recentemente foi observado que resíduos de
aminoácidos da enzima Cu/ZnSOD podem sofrer carbonilação pelo seu produto
tóxico, o H2O2. Desta forma, a necessidade de eliminar o H2O2 fez com que as
células desenvolvessem uma forma de destruí-las, o que de fato é realizado pela
enzima catalase. Esta proteína é amplamente distribuída na natureza. Esta
hemoproteína é capaz não só de catalisar a decomposição do peróxido de
hidrogênio a água e oxigênio molecular como também de oxidar vários compostos
doadores de hidrogênio, através de peróxido de hidrogênio.

1.4.2. Catalase (CAT)

São enzimas peroxidase tetramérica que converte H2O2 a água e

oxigênio molecular ( figura 4) (Herrero et al., 2008; Valko et al.,2006).

( figura 4)

7
 Em S. cerevisiae observa-se a presença de duas catalases, com as
mesmas propriedades de mamíferos, no entanto em compartimentos distintos. A
catalase A é uma proteína localizada no peroxissoma, codificada pelo gene CTA1,
enquanto que a catalase T é citossólica, sendo codificada pelo gene CTT1
(Moradas-Ferreira et al.,1996; Herrero et al., 2008).

A proteína citossólica, catalase T, em geral apresenta-se em sua

forma solúvel predominando em todas as condições fisiológicas, enquanto que a
proteína peroxissomal, catalase A, tem sua síntese afetada dramaticamente pela
repressão catabólica causada pela glicose (Izawa et al.,1996). A deficiência
nestas enzimas também leva a danos graves como hipersensibilidade ao H2O2 e
ao choque térmico (Izawa et al., 1996; Davidson et al., 1996).

1.5. p53

Nas últimas décadas, a p53 é provavelmente uma das proteínas mais

estudada, devido seu papel crucial na tumorgêneses, na morte celular e na
sobrevivência. p53 é um fator de transcrição que medeia resposta celular a vários
danos prejudiciais, através de uma complexa rede de sinalização ( Levine A,
1997).

Em resposta a estresses celulares que levam a danos ao DNA, a proteína

p53 do tipo selvagem promove a transcrição de numerosos genes e direcionada
as células para uma parada do ciclo celular, senescência ou apoptose via
ativação diferencial de genes alvo (Liu & Chen, 2006), impedindo a propagação
de danos no DNA (Lime et al., 2007). p53 é considerado como um fator de
transcrição em resposta ao estresse oxidativo. Muitos estudos têm sido dedicados
às mutações na p53, causada por ação direta de ERO ou por metais
cancerígenos (J. Renzing et al., 1996).

8
 Dado que tanto as EROs como a proteína p53 possam participar de vários
processos celulares, deve haver interação entre ERO e p53 e interseções entre
as suas vias de sinalização (Liu et al., 2008). ERO tem sido relacionada com
apoptose mediada por p53 (K. Polyak et al., 1997). Após a supressão de p53, os
níveis de ERO e a inibição de ERO pelos antioxidantes inibem a apoptose em
células musculares lisas (M. Valko, 2006).

Além da geração de EROs, p53 induz a expressão da p85, que pode

funcionar como uma molécula sinalizadora durante a apoptose dependente de
p53 mediada por EROs (M. Valko, 2006).

Metais afetam mecanismos de p53. Um desses mecanismos, os metais

afetam p53 através da substituição de zinco que é essencial para ligação de p53
ao DNA. Metais substituindo o zinco pode inativar p53 (M. Valko, 2006).

Sob condições normais ou de pequeno estresse, p53 parece ter um papel

antioxidante que protege as células dos danos oxidativos ao DNA e, apesar deste
efeito depender da concentração de p53, outros fatores celulares provavelmente
participam do destino celular final (Tomko et al., 2006).

1.6. A levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo.

Leveduras são organismos eucarióticos, unicelulares do reino Fungi,

considerados bons modelos para o estudo de organismos mais complexos, como
os pluricelulares.

Várias são as vantagens apresentadas por este sistema biológico;

meio de cultivo simples e barato, rápida proliferação celular, fácil manipulação
genética para expressar genes humanos, disponibilidade de técnicas para análise
genômica, ortologia com genes humanos (incluindo de algumas doenças), são
alguns fatores que posicionam S. cerevisiae como um excelente modelo de
estudo de organismos eucarióticos. É importante ressaltar que os mecanismos de
sinalização celular a agentes citotóxicos, incluindo o sistema de defesa

9
antioxidante, são semelhantes aos existentes em células de mamíferos (Costa &
Moradas Ferreira,2001; Simon & Bedalov,2004).

As leveduras também têm sido utilizadas para a expressão de

proteínas heterólogas por apresentar inúmeras vantagens em relação a
Escherichia coli. Por exemplo, vários promotores fortes e constitutivos de
leveduras estão disponíveis para controlar a expressão da proteína de interesse,
como os promotores da álcool desidrogenase 1 (ADH1) e do fosfoglicerato
kinase-1 (PGK1). Além destes, há também os promotores induzíveis que
permitem que se controle o tempo de expressão da proteína de interesse,
principalmente as que potencialmente podem ser tóxicas para a célula. Entre
estes, incluem-se os promotores GAL1-10 (induzidos por galactose) e o promotor
PHO5 (induzido por baixos níveis extracelulares de fosfato inorgânico) (Ton &
Rao, 2004)

Outra característica interessante destes microorganismos se deve ao fato

de que células de S. cerevisiae são anaeróbicas facultativas. Desta forma, elas
podem realizar tanto o metabolismo fermentativo como o respiratório para a
produção da energia necessária para o seu crescimento. Leveduras crescendo na
presença de elevadas concentrações de glicose sofrem um fenômeno complexo
conhecido como repressão catabólica. Esta repressão é exercida pela glicose e
assim, as células somente são capazes de realizar o processo de fermentação
alcoólica para a produção de energia. Portanto, os genes que codificam enzimas
e proteínas responsáveis pela biossíntese e funcionamento das mitocôndrias e do
processo de respiração se encontram reprimidas quando altas concentrações de
glicose são encontradas no meio de cultivo (Watt & Piper, 1997).

Mais interessante ainda é o fato de que crescendo em metabolismo

fermentativo, estas leveduras possuem o seu sistema de defesa antioxidante
pouco desenvolvido. Sendo assim, as células vão sintetizar suas moléculas
protetoras em decorrência: (i) de estímulos que podem ser dados por variadas
condições de estresse ou (ii) da transição do metabolismo fermentativo para o
respiratório quando as leveduras passam a utilizar o etanol como fonte de
carbono produzido durante a fermentação. Quando leveduras crescem na

10
presença de fontes de carbono não repressoras (maltose, lactose, glicerol, etanol,
entre outros) elas respiram e possuem o seu sistema de defesa antioxidante
desenvolvido desde o início do seu crescimento (Jamieson, 1998; Moradas-
Ferreira et al., 1996).

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido bastante usada como

modelo de estudo para modulação da longevidade. Dois tipos de envelhecimento
podem ser medidos em S. cerevisiae: cronológico e replicativo (Reverter-Branchat
et al., 2004; Sinclair & Guarente, 1997; Harris et al., 2003; Fabrizio & Longo,
2003). O envelhecimento replicativo é medido pelo número de ciclos mitótico
concluído antes de entrar em uma fase terminal de parada do crescimento
(Mortimer & Johnston, 1959). O envelhecimento cronológico é medido na fase
estacionária do crescimento, na qual a taxa de reprodução é baixa, ou
submetendo as células a condições não proliferantes após sua retirada do meio
de cultura (Sinclair et al., 1998). Sob essas condições, as células senescem
gradualmente de uma forma que pode ser relacionada com o nível de EROs
(Longo et al., 1996; Longo et al., 1999). Células de levedura nessa fase são um
excelente modelo para o estudo do envelhecimento de células somáticas de
eucariontes superiores, uma vez que ambas são células pós-mitóticas (células
que saíram do ciclo celular e entraram na fase Go) e dependem da respiração
mitocondrial para manter a viabilidade (Longo et al, 1999).

11
2. Objetivo geral

Avaliar o efeito do estresse oxidativo na mutação de p53 durante o

envelhecimento celular.

Objetivos específicos

• Avaliar o envolvimento da mutação de p53 na ausência dos

sistemas de defesa antioxidantes Sod1 e Ctt1, durante o
envelhecimento.

• Avaliar danos oxidativos na ausência do sistema de defesa

antioxidante Sod1 e Ctt1.

12
 3. Metodologia

3.1- Microrganismos utilizados no estudo

Tabela 1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae

Cepas Genótipos Fonte

yIG397 MATa ade2-1 leu2-3, 112trp1-1 1

his3-11, 15can1-100 ura3-1 URA3
3xRGC::pCYC1::ADE2 + pLS76 ( ADH1-
p53hum, LEU2, Amp)

∆sod1 Isogênica da yIG397 exceto 2

SOD1::KanMX4

∆ctt1 Isogênica da yIG397 exceto 2

CTT1::KanMX4

1- Cepa de levedura cedida pelo Dr. Richard Iggo do “Swiss Institute for
Experimental Cancer Research” - ISREC, Suíça.

2- Mutantes construídas durante o estágio de Patrícia Neves Fernandes no

Instituto de Biologia Molecular e Celular (IBMC) da Universidade do Porto –
Portugal. Patrícia obteve seu título de doutorado no Programa de Bioquímica, IQ,
UFRJ, sob orientação da Profa Elis Eleutherio

3.2- Vetor utilizado

O vetor utilizado para a expressão de p53 de humanos em células de S.

cerevisiae foi o plasmídeo pLS76 que apresenta um fragmento referente à
proteína p53 humana na forma “wild-type” (DNAc) sobre o controle do promotor
ADH1, o gene LEU2 como marcador nutricional em levedura e gene que confere
resistência a ampicilina para seleção bacteriana (Ishioka et al., 1993). Este

13
plamídeo também foi cedido pelo Dr. Richard Iggo do “Swiss Institute for
Experimental Cancer Research” - ISREC, Suíça. Patrícia inseriu pLS76 nas cepas
selvagem e mutantes de levedura

Figura 5. Plasmídeo pLS76 contendo gene que codifica p53 de

humanos (Ishioka et al., 1993).

3.3- Meios de cultura

A cepa controle yIG397 (selvagem) e as cepas mutantes sod1 e ctt1, todas

contendo o plasmídeo pLS76, foram cultivadas em meio mínimo SD2% (2% de
glicose, 0,6% de base nitrogenada sem aminoácidos e 0,01% de histidina e
tripitofano). O meio sólido continha 2% de Agar. O cultivo em meio líquido foi
realizado a 28°C com uma agitação constante de 160 rpm em agitador rotatório.

14
 3.4- Simulação de envelhecimento cronológico

As células foram cultivadas até a primeira fase exponencial do crescimento

celular, coletadas por centrifugação e lavadas duas vezes com água destilada.
Após a última lavagem, o centrifugado era resuspenso em água destilada estéril e
transferido para um Erlenmeyer estéril. Com isso foi incubado a 37°C em um
agitador rotatório ajustado para 160 rpm pelo tempo necessário do experimento (
Mannarino et al., 2008).

3.5- Análise de viabilidade

A viabilidade celular foi realizada por plaqueamento em meio sólido SD2%

contendo adenina 200µg/mL. Foi realizado após diluições apropriadas para
contagem das colônias e em triplicata. As placas foram incubadas a 28°C por 72
horas e o número de colônias contado. A porcentagem de sobrevivência foi
calculada a partir da relação entre o número de colônias obtidas após e antes da
exposição ao envelhecimento (Mannarino et al., 2008).

3.6- Análise de mutação p53 usando a técnica do FASAY adaptada

A análise foi realizada por plaqueamento em meio sólido SD2% contendo

ou não adenina (200 µg/mL). As cepas utilizadas contêm um plasmídeo
integrativo contendo o gene ADE2 sob o controle da proteína p53. Quando esta
proteína está na forma “wild-type”, as células expressam ADE2, assim produzindo
adenina, crecendo normalmente em meio de cultivo ausente em adenina. Porém,
células contendo p53 mutante falham para expressar ADE2 e, consequentemente
não conseguem crescer em meio sem adenina (Flaman et al., 1995) figura 6.

15
 Figura 6. Ensaio de mutação em p53. Adaptado de Flaman e col., Proc.
Natl. Acad. Sci., 1995)

3.7- Western blot

3.7.1- Eletroforese em gel obtenção do extrato protéico

Cinqüenta miligramas de células foram coletadas por centrfugação, lavadas

duas vezes com água gelada. As células foram lisadas por agitação em agitador
mecânico, as células foram transferidas para um tubo de parede grossa contendo
1,5g de pérolas de vidro, ressuspensas em 0,5mL de tampão fosfato 50mM pH
7,0 e levadas à agitação por 3 períodos de 1 minuto intercalando com 1 minuto no
gelo. O sobrenadante foi transferido e as pérolas lavadas com 0,4mL de tampão
fosfato e foi centrifugado a 13000rpm por 5min, e logo recolhido o sobrenadante e
adicionado 20µL de inibidor de protease.

Foi realizado o Stickland (dosagem de proteína). O ensaio foi feito com

200µL de amostra, 4,9mL de água, 0,9mL de NaOH 20% e 150µL de CuSO4

16
25%. Sendo o branco 5,0mL de água mais todos os reagentes. Eram
homogeneizada, centrifugadas e lido a absorvância de 550nm.

3.7.2- Gel de corrida (Gel Running)

O gel de corrida era feito misturando-se 3mL de acrilamida-bisacrilamida,

1,125 mL de tris HCl 2M pH 8.85, 0.8mL de água destilada, 1mL de SDS, 6µL de
TEMED e 60µL de PSA 10% (persulfato de amônia). A mistura era agitada
suavemente e adicionada entre as placas de vidro do sistema de eletroforese.

3.7.3- Gel de empilhamento (Gel Stacking)

Após a polimerização do gel de corrida, sobre este gel era adicionada a

solução do gel de empilhamento composta por 0,331mL de acrilamida-
bisacrilamida, 0,25mL 1M tris HCl pH 6.8, 0,869mL de água destilada, 0,25mL
SDS, 2µL de TEMED e 20µL de PSA 10%.

3.7.4-Condições da eletroforese

As amostras eram preparadas, fervidas por 5min a 100°C, e depois aplicas

no gel. Após a aplicação da amostra o gel era posicionado na cuba de
eletroforese, preenchida com o tampão do eletrodo. A eletroforese era realizada
com uma corrente de 30mA com voltagem de 300V durante aproximadamente 3h.

3.7.5-Transferência das proteínas para o papel de nitrocelulose

Era cortado um pedaço de papel de nitrocelulose, de tamanho aproximado

ao gel. Este papel era banhado em tampão de transferência. Após o término da
eletroforese, o sistema era desmontado, o canto superior esquerdo era cortado
para macacão da posição das amostras e o gel era submerso em tampão de
transferência. Usando-se luvas para evitar contaminação do sistema, o papel de
nitrocelulose era colocado três papeis absorvente previamente tratado com
tampão de transferência e em seguida o gel era posto em contato com a
superfície do papel de nitrocelulose. Era colocado sobre o gel de eletroforese três
papeis absorvente umedecido em tampão de transferência e o sistema era
fechado.

17
 3.7.6-Condições de transferência das proteínas para o papel de
nitrocelulose

Depois de fechar o sistema os fios eram conectados de forma correta (fio

vermelho no pólo positivo e o fio preto no pólo negativo) e a transferência se dava
a 5 Volts, 200mA a 1:30h.

3.7.7-Identificação das proteínas reconhecidas especificamente pelo

soro imune

3.7.7.1-Bloqueio dos sítios livres do papel de nitrocelulose

Após o termino da transferência o papel era cortado na parte superior

esquerda para poder identificar o lado correto da transferência das proteínas, logo
o papel de nitrocelulose era transferido para um recipiente contendo 100mL de
tampão bloqueador e incubado por no mínimo 24h.

O tampão de bloqueio era preparado com 5g de leite em pó desnatado e

0,2mL de Tween20 dissolvidos em 100mL de PBS+Azida.

3.7.7.2-Incubação com anticorpo primário

O papel de nitrocelulose bloqueado como descrito anteriormente, era

transferido para outro recipiente onde se adicionava tampão de bloqueio na
proporção de 0,1mL de tampão por cm2 de papel. O soro imune purificado para
p53 (anti-p53), era adicionado na diluição de 1:500, respectivamente. Desta forma
o recipiente era selado e o papel incubado por 2h a temperatura ambiente com
agitação suave. Ao término da incubação, a solução contendo os anticorpos era
descartada e o papel de nitrocelulose lavado por 3 vezes com tampão bloqueador
(em cada lavagem eram usados 10mL de tampão por 5min).

3.7.7.3-Incubação com anticorpo secundário

O papel de nitrocelulose submetido ao tratamento descrito anteriormente,

era lavado 3 vezes (5min cada) com 10mL de tampão Tris.Cl 50mM pH7.5,
contendo 150mM de NaCl. Depois da última lavagem, a solução era drenada e o

18
papel rinsado 2 vezes com o mesmo tampão acrescido de leite em pó desnatado
5% e de Tween 20 0.2% (tampão bloqueador livre de azida). Ao papel eram então
adicionados 5mL deste tampão a qual era misturada uma alíquota apropriada do
anticorpo secundário (anti-mouse), com uma proporção de 1:1000. o recipiente
era selado e incubado por 1h, com agitação suave e a temperatura ambiente. Ao
término da incubação, o papel de nitrocelulose era lavado 3 vezes, cada uma com
10mL do tampão bloqueador livre de azida, por 5min e então com 3 vezes com
10mL do tampão Tris.Cl 50mM, pH7.5 contendo 150mM de NaCl.

3.7.7.4-Revelação do papel de nitrocelulose

O substrato cromogênico, preparado alguns minutos antes do uso,

consistia de 9.0mg de diaminobenzidina, dissolvidos em 13.0mL tris.Cl 0.01M,
pH7.6. A essa solução eram adicionados 1.5mL de solução aquosa de CoCl2
0.3% e 15µL H2O2 30%. Após muito bem misturado, a solução era jogada sobre o
papel de nitrocelulose e a reação enzimática desenvolvida, no escuro, a
temperatura ambiente. Quando as bandas atingiam a intensidade desejada
(geralmente após 30 segundos), a reação era interrompida pela lavagem do papel
com água destilada. O papel de nitrocelulose era estocado 8°C até ser
fotografado.

3.8- Peroxidação lipídica

Cinqüenta miligramas de células, submetidas ou não a condição de

estresse (envelhecimento) , foram coletadas por centrifugação, lavadas duas
vezes com água gelada e rompidas, sob agitação vigorosa (6 ciclos de 20s no
agitador e 20s no gelo), com 0,5mL de TCA 10% (ácido tricloro-acético) na
presença de 1,5g de pérolas de vidro. Após lise celular, os extratos foram
centrifugados a 4000rpm e o sobrenadante coletado para as análises de
peroxidação lipídica. O ensaio para a determinação da peroxidação lipídica foi
baseado no método descrito por Steels et al., 1994, método de TBARS, que
consiste na dosagem dos níveis de MDA (malondialdeído)
espectrofotometricamente através da reação entre o MDA e o ácido
tiobarbitúrico. Esta reação foi medida em um comprimento de onda de 532nm

19
(Steels et al., 1994) e os valores de MDA obtidos expressos em pmoles de
MDA/mg de células.

20
4. Resultados e Discussão

4.1-Envelhecimento e a viabilidade celular

Inicialmente acompanhou-se a longevidade das diferentes cepas, através

da medida da viabilidade celular por plaqueamento (Fig 7). Para tal as células
foram cultivadas em meio SD2%, suplementado com histidina e triptofano,
coletadas por centrifugação, lavadas e ressuspensas em água a 37°C para
envelhecer. Observou-se que nas primeiras 24 h de envelhecimento todas as
cepas apresentaram uma pequena queda na viabilidade. Após 48 h as taxas de
sobrevivência caíram para cerca de 50% mas as deficiências em Sod1 ou Ctt1
não prejudicaram a longevidade celular.

120%
T0
a a a
Sobrevivência (%)

T24 hs
b b
b T48 hs
80%

c
c c

40%

0%
yIGcont yIGsod1 yIGctt1

Figura 7. Efeito do envelhecimento na viabilidade celular. As células

coletadas na metade da 1ª fase exponencial do crescimento em glicose foram submetidas
ou não a simulação de envelhecimento cronológico a 37ºC em água. Os resultados estão
representados sob a forma de média aritmética ± desvio padrão de pelo menos 3
experimentos independentes. Aplicado o teste estatístico Tukey-Kramer com α=0,05,
letras diferentes indicam resultados significativamente diferentes.

21
4.2-Envelhecimento e mutação de p53

Juntamente com a análise de mutação de p53, foi verificado ainda a

associação do processo de envelhecimento ao estresse oxidativo usando-se
mutantes sod1 e ctt1.

A mutação de p53 foi verificada por plaqueamento em meios sem

adenina (ADE-) e com adenina (ADE+). Em meio ADE- somente as células que
estavam expressando p53 na forma wt cresciam, pois não eram dependentes de
adenina devido a expressão de ADE2 direcionada por p53. Já em meio ADE+ as
células tanto com p53 na forma wt como na forma mutante cresciam devido a
suplementação de adenina. Desta forma a porcentagem de mutação de p53 foi
calculada como mostrado a seguir:

% mutação= ( colôniasADE+ - colôniasADE- / colôniasADE+ ) x 100

Pela análise de mutação em p53 usando a técnica do FASAY adaptada

pode-se notar que o envelhecimento foi capaz de causar mutação na p53. No
tempo de 24h de envelhecimento nota-se que as três cepas sofreram mutação
de quase 40%, sendo que ao sofrer um estresse maior, o envelhecimento de
48h, houve um aumento na taxa de mutação de 50% a 60%, como mostra a
figura 8.

22
 80%
T0
d d
Taxa de Mutação (%) T24 hs
60% T48 hs
c
b b
40% b

20%

a a a
0%
yIGcont yIGsod1 yIGctt1

Figura 8. Efeito do envelhecimento na taxa de mutação de p53. As células

coletadas na metade da 1ª fase exponencial do crescimento em glicose foram submetidas
ou não a simulação de envelhecimento cronológico a 37ºC em água. Os resultados estão
representados sob a forma de média aritmética ± desvio padrão de pelo menos 3
experimentos independentes. Aplicado o teste estatístico Tukey-Kramer com α=0,05,
letras diferentes indicam resultados significativamente diferentes.

As cepas que não possuem o sistema de defesa antioxidante superóxido

dismutase e catalase tiveram um aumento da taxa de mutação maior que a cepa
controle (a qual possui ambos sistemas), cerca de 60%. Então pode-se dizer que
o aumento da taxa de mutação de p53 pode estar relacionado com a deficiência
desses sistemas de defesa antioxidante (Sod1 e Ctt1).

4.3-Expressão de p53

Pensando que a dependência em adenina, poderia ser causada por

mutação em outras regiões do plasmídeo pLS76, o que impediria a produção de
p53 e, consequentemente, a expressão de ADE2. Para garantir que a
dependência em adenina se deu pela mutação gênica em p53 e não pela falta de
expressão, verificou-se a síntese da proteína por Western blot.

23
 De acordo com os resultados da figura 9, em todas as cepas, p53 foi
expressa, significando que a dependência de adenina se devia a mutação no
gene de p53. .

wt t0 wt24h sod1t0 sod124h ctt1t0 ctt124h

Figura 9. Western blot. cepas wild-type, superóxido dismutase e catalase,

submetidas ao tempo 0h e 24h de envelhecimento, para análise de expressão da
p53.

Poder-se-ia questionar que a falta de expressão de ADE2 não seria devido à

mutação gênica em p53 e sim na proteína em si, pois EROs causam danos à
proteínas. No entanto, a mutação em p53 foi analisada por plaqueamento. Desta
forma, só um problema gênico passaria de uma célula para outra.

4.3-Dosagem de peroxidação lipídica

O processo global de peroxidação lipídica é constituída por três fases:

propagação, iniciação e terminação. Uma vez formado, radicais peroxil (ROO •)

24
podem ser rearranjados através de uma reação de ciclização a endoperóxidos
(precursores de malondialdeído) com o produto final do processo de peroxidação
sendo malondialdeído (MDA) ( Marnett, 1999). Os principal produto aldeidíco da
peroxidação lipídica diferente do malondialdeído é o 4-hidroxi-2-nonenal (HNE). O
MDA é mutagénico em células bacterianas e de mamíferos e cancerígenos em
ratos. Hidroxinonenal é fracamente mutagênico, mas parece ser o principal
produto tóxico da peroxidação lipíca. Além disso, HNE tem efeitos poderosos
sobre vias de transdução de sinal, que por sua vez, têm um grande efeito sobre
as características fenotípicas das células ( M. Valko et al., 2006).

Como vimos na figura 8, pela deficiência do sistema antioxidante a taxa de

mutação aumenta conforme as exposições ao estresse. Isso pode ser pelo
acumulo de EROs na célula devido a falta do sistema de defesa antioxidante
durante o envelhecimeto, causando assim danos oxidativos à célula, o estresse
oxidativo.

A peroxidação lipídica foi analisada através da dosagem dos níveis de

malondialdeído (MDA) que é um dos produtos finais da oxidação de lipídios. Para
isto foi realizado pelo ensaio TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico).
Neste ensaio o MDA, produto da oxidação dos lipídios, reage com o ácido
tiobarbitúrico e o produto desta reação é lido espectrofotometricamente. A
determinação dos níveis de MDA é uma medida importante de oxidação dos
ácidos graxos poliinsaturados visto que este produto é altamente tóxico para as
células. Os resultados obtidos foram expressos em pmoles de MDA/ mg de
células.

Com isso podemos ver que os níveis de peroxidação lipídica após o

envelhecimento de 24h e 48h das três cepas foram iguais ou menores aos níveis
encontrados aquelas que não sofreram o estresse. Vendo o que estava
acontecendo notou-se que durante o tempo de 24h e 48h, os produtos da
peroxidação lipídica poderiam estar sendo metabolizados dentro da célula durante
o período de envelhecimento (muito longo). Tendo em vista isso, decidiu-se
diminuir o tempo do estresse (envelhecimento), para um período de 3h. Como
visto na figura 9, após o período de 3h os níveis de peroxidação lipídica

25
aumentaram, sendo maiores que os de 24h e 48h e das células que não sofreram
o estresse. Nas cepas sem o sistema de defesa antioxidante (Sod1 ou Ctt1), os
níveis de peroxidação lipídica foram maiores como mostra a figura 10.

200
T0
pmoles MDA / mg céls

d
d
160 T3 hs
T24 hs
b
120 a a T48 hs
a
a
80 c c
c
c c
40

0
yIGcont yIGsod1 yIGctt1

Figura 10. Efeito do envelhecimento nos níveis de peroxidação lipídica. As

células coletadas na metade da 1ª fase exponencial do crescimento em glicose foram
submetidas ou não a simulação de envelhecimento cronológico a 37ºC em água. Os
resultados estão representados sob a forma de média aritmética ± desvio padrão de pelo
menos 3 experimentos independentes. Aplicado o teste estatístico Tukey-Kramer com
α=0,05, letras diferentes indicam resultados significativamente diferentes.

Assim podemos ver que o aumento da peroxidação lipídica e a taxa de

mutação foram maiores nas cepas sem o sistema de defesa antioxidante
superóxido dismutase e catalase, que sofreram envelhecimento. Essa mutação

26
pode estar relacionada com o aumento dos níveis de peroxidação lipídica formado
pelo envelhecimento.

27
5- Conclusões

1- Pela analise de viabilidade celular observou que a deficiência em

Sod1 e Ctt1 não prejudicaram a longevidade celular.

2- As cepas deficientes no sistema de defesa antioxidante Sod1 e Ctt1

tiveram um aumento na taxa de mutação de p53 de cerca de 60% comparada
com a controle.

3- Observou que mutação que ocorria em p53, era mutação gênica e

não mutação na proteína em si.

4- Os níveis aumentados de peroxidação e da taxa de mutação

causadas pelo envelhecimento, foram maiores nas cepas sem o sistema de
defesa antioxidante, Sod1 e Ctt1.

5- O envelhecimento leva ao aumento do estresse oxidativo que leva ao

aumento de danos celulares, como visto através da dosagem de peroxidação
lipídica.

Contudo envelhecimento celular foi capaz de promover danos em p53,

sendo que nas cepas deficientes no sistema de defesa antioxidante de Sod1 e
Ctt1 estes danos foram maiores, sugerindo que a mutação envolve estresse
oxidativo.

28
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