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Jornal Internacional de
Ciências Moleculares
Análise
Azul da Prússia: uma nanozima com propriedades catalíticas versáteis
Joan Estelrich 1,2,* e M. Antónia Busquets
Citação: Estelrich, J.; Busquets, MA
Azul da Prússia: Uma nanozima com
propriedades catalíticas versáteis. Int. j.
Mol. ciência 2021, 22, 5993. https://
doi.org/10.3390/ijms22115993
Editor Acadêmico: Raghvendra
Singh Yadav
Recebido: 14 de maio de 2021
Aceito: 28 de maio de 2021
Publicado: 1º de junho de 2021
Nota do editor: MDPI permanece neutro
em relação a reivindicações jurisdicionais
em mapas publicados e afiliação institucional
ições.
Direitos autorais: © 2021 pelos autores.
Licenciado MDPI, Basel, Suíça.
Este artigo é um artigo de acesso aberto
distribuído nos termos e
condições do Creative Commons
Licença de atribuição (CC BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
Int. J. Mol. ciência 2021, 22, 5993. https://doi.org/10.3390/ijms22115993
1,2
1
Departamento de Farmácia e Tecnologia Farmacêutica e Físico-Química, Faculdade de Farmácia e Ciências
Alimentares, Universidade de Barcelona, Avda Joan XXIII, 27-31, 08028 Barcelona, Catalunha, Espanha;
mabusquetsvinas@ub.edu Instituto de Nanociência e Nanotecnologia (IN2UB), Universidade de Barcelona,
2
Avda. Diagonal 645, 08028 Barcelona, Catalunha, Espanha * Correspondência: joanestelrich@ub.edu
Resumo: As nanoenzimas, nanomateriais com atividades semelhantes às enzimas, estão se tornando concorrentes
poderosos e potenciais substitutos para as enzimas naturais devido ao seu excelente desempenho. As nanozimas
oferecem melhor estabilidade estrutural em relação às suas respectivas enzimas naturais. Consequentemente, as
nanozimas exibem aplicações promissoras em diferentes campos, como o setor biomédico ( diagnóstico e
terapêutica in vivo ) e o setor ambiental (detecção e remediação de poluentes inorgânicos e orgânicos). As
nanopartículas de azul da Prússia e seus análogos são estruturas metal-orgânicas (MOF) compostas de ferros
férricos e ferrosos alternados coordenados com cianetos. Tais nanopartículas se beneficiam de excelente
biocompatibilidade e biossegurança. Além de outras propriedades importantes, como uma estrutura altamente
porosa, as nanopartículas de azul da Prússia apresentam atividades catalíticas devido ao átomo de ferro que atua
como sítios metálicos para a catálise. Os diferentes estados de oxidação são responsáveis pelas atividades
multicatalíticas dessas nanopartículas, ou seja, atividades semelhantes a peroxidase, catalase e superóxido
dismutase. Dependendo do desempenho catalítico, essas nanopartículas podem gerar ou eliminar espécies reativas
de oxigênio (ROS).
Palavras-chave: Análogos do azul da Prússia; nanopartículas híbridas; atividade multicatalítica; eliminação de ROS;
geração de ROS; atividade do tipo superóxido dismutase; atividade tipo catalase; potencial redox
1. Introdução
Nanozimas são um tipo de materiais com tamanhos em nanoescala (1-100 nm) e
propriedades catalíticas enzimáticas. O termo "nanozima" pode abranger dois tipos diferentes de
materiais: (1) enzimas ou grupos catalíticos enzimáticos que são imobilizados em nanomateriais
e (2) nanomateriais que possuem propriedades catalíticas enzimáticas inerentes [1]. No presente,
a nanozima é especificamente referida como nanomateriais com propriedades catalíticas intrínsecas [1-3].
O primeiro nanomaterial encontrado com propriedades enzimáticas foram as nanopartículas de óxido
de ferro em 2007 [4]. Desde esta descoberta, os avanços significativos que a nanotecnologia, a
biotecnologia e a ciência dos nanomateriais experimentaram permitiram o surgimento de um grande
número de estudos sobre enzimas artificiais baseadas em nanomateriais.
As nanoenzimas superam as desvantagens que caracterizam as enzimas naturais, ou seja,
alto custo de preparação e purificação, baixa estabilidade operacional, sensibilidade da atividade
catalítica às condições ambientais e dificuldades de reciclagem e reutilização. Em comparação
com enzimas naturais e enzimas artificiais convencionais, as nanozimas têm vantagens como
baixo custo, fácil produção em larga escala e alta estabilidade e durabilidade. No entanto, a
vantagem mais importante das nanozimas é a sua atividade dependente do tamanho/composição.
Parece que as atividades enzimáticas das nanozimas estão intimamente relacionadas ao seu tamanho,
rede de superfície, modificação de superfície e composição [5]. Isso permite o design de materiais com
uma ampla gama de atividade catalítica simplesmente variando a forma, estrutura e composição.
Dadas essas vantagens, é fácil entender o amplo interesse que as nanozimas têm
gerado e que estão se tornando concorrentes poderosos e potenciais substitutos
https://www.mdpi.com/journal/ijms
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para enzimas naturais. Desta forma, as nanozimas têm sido utilizadas para uso prático em pesquisa
científica, biotecnologia e indústrias alimentícias, agricultura, tratamento ambiental, biossensoriamento,
diagnóstico e tratamento de doenças, agentes antibacterianos e crioproteção contra biomoléculas na
célula.
De acordo com Huang et al. [1], as nanozimas podem ser divididas em duas
categorias: (1) oxidoredutases (oxidase, peroxidase, catalase, superóxido dismutase e
nitrato redutase) e (2) hidrolases (nuclease, esterase, fosfatase, protease e silicateína).
Até o momento, muitos nanomateriais demonstraram possuir notáveis atividades semelhantes a
enzimas. Por exemplo, nanopartículas de metais nobres e transientes, nanopartículas de carbono
(nanofolhas de óxido de grafeno, nanotubos de carbono e fulereno), óxidos metálicos, sulfetos e
teluretos metálicos, nitreto de carbono, pontos quânticos, nanomateriais 2D com átomos confinados de
metais e não metais, nanopartículas de polipirrol , micelas de hemina e nanopartículas de azul da
Prússia (PB) (PBNPs) [3].
Nesta revisão, vamos nos concentrar nas propriedades semelhantes a enzimas de PBNPs e
suas aplicações neste campo para o desenvolvimento da biomedicina. Os PBNPs têm o potencial
de imitar várias enzimas em um sistema natural semelhante a uma cascata (peroxidase (POD);
catalase (CAT); e superóxido dismutase (SOD)). Além disso, a capacidade de mimetizar as três
enzimas antioxidantes indicadas torna os PBNPs excelentes necrófagos de espécies reativas de
oxigênio (ROS) e, ao contrário, em várias condições determinadas, os PBNPs podem gerar EROs
por meio de uma reação de Fenton.

2. Nanopartículas de Azul da Prússia

PB é um tipo de estrutura metal-orgânica (MOF) composta de ferros férricos e ferrosos
alternados coordenados com cianetos [6]. PB é uma forma agregada de ~ 10 nm
nanopartículas (PBNPs) [7]. Uma formulação usual de PB (a forma insolúvel) é FeIII
4(FeII(CN)6)3·x H2O, onde a extensão da hidratação varia de 10 a 16. Os análogos de PB
polímeros com a fórmula geral AMa(Mb(CN)6) 2/3 (PBA) são coordenação ·x H2O,onde, A é um
NH4+ ) íon alcalino, e Ma e Mb são cátions no estado de oxidação +2 ou +3. O PB é um corante
comumente usado (foi o primeiro dos pigmentos modernos, descoberto por Diesbach em 1706 [8]),
mas suas aplicações não se limitam ao campo artístico, mas afetam muitos outros campos [9]. O
desenvolvimento de nanopartículas de PBNPs envolveu um aumento de seu uso em uma miríade
de aplicações biomédicas [10]. Alguns deles são baseados nos efeitos fototérmicos dessas
nanopartículas. Recentemente, características antibacterianas interessantes de PBNPs provenientes
deste problema foram descritas [11]. Tais nanopartículas se beneficiam de excelente
biocompatibilidade e biossegurança, uma vez que a forma insolúvel do PB foi aprovada pela Food
and Drug Administration (FDA) para o tratamento de exposição com íons de césio e tálio. Além
disso, encontra-se na Lista de Medicamentos Essenciais da Organização Mundial da Saúde [12].
Além das excelentes propriedades adsortivas [13], facilitadas pela estrutura mesoporosa, os PBNPs
têm mostrado atividades catalíticas, devido aos átomos de ferro que atuam como sítios ativos de
metal para catálise. Os diferentes estados de oxidação são responsáveis pelas propriedades
multicatalíticas dessas nanopartículas: pode-se encontrar uma forma totalmente oxidada do azul da
Prússia (o chamado amarelo da Prússia, PY), uma forma parcialmente oxidada (verde de Berlim,
BG) e uma forma reduzida (Prussian white, PW) (Figura 1 ).
A conversão de uma forma em outra ocorre por meio das reações:

PB + 4 eÿ + 4 K+ ÿ PW (1)

PB ÿ BG + 3 eÿ + 3 K+ (2)
PB ÿ PY + eÿ + K+ (3)

Cada estado de oxidação fornece uma cor diferente. No espectro visível, PB e BG (K1/3
Fe(FeIII(CN)6)2/3(FeII(CN)6)1/3) possuem duas bandas de absorção em 700 e 480 nm; PW
(K2FeIIFeII(CN)6) não possui banda óbvia, e PY (FeIIIFeIII(CN)6) apresenta uma banda em 420 nm.
As atividades multienzimáticas de PBNPs (SOD, POD e CAT) [2] são causadas pelos abundantes
potenciais redox de suas diferentes formas (Figura 2). Nesse aspecto, esses
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as nanopartículas são únicas, pois podem exibir simultaneamente as três atividades miméticas
enzimáticas indicadas. Além disso, os PBNPs apresentam algumas vantagens ausentes em outras
nanoenzimas. Desta forma, os PBNPs podem proteger neurônios lesionados por isquemia em um
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modelo de rato devido à atividade antioxidante de PBNPs que pode eliminar espécies reativas de
oxigênio (ROS) em excesso [15].

Figura 1. Diferentes formas de azul da Prússia dependendo do estado de oxidação. Cada

forma possui um potencial redox característico, que afeta os mecanismos de reação catalítica.
Reproduzido, após modificação, com permissão de [14].

Cada estado de oxidação fornece uma cor diferente. No espectro visível, PB e BG (K1/3
Fe(FeIII(CN)6)2/3(FeII(CN)6)1/3) possuem duas bandas de absorção em 700 e 480 nm; PW
(K2FeII FeII(CN)6) não possui banda óbvia, e PY (FeIIIFeIII(CN)6) apresenta uma banda em 420
nm. As atividades multienzimáticas de PBNPs (SOD, POD e CAT) [2] são causadas pelos
abundantes potenciais redox de suas diferentes formas (Figura 2). Nesse aspecto, essas
nanopartículas são únicas, pois podem exibir simultaneamente as três atividades miméticas enzimáticas indica
deNela
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Figura
Cada
estão ocorre
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Cada potencial
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Figura
formas
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1. um
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nanoenzimas.
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Prússia
formas
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PBNPs azul os mecanismos
da Prússiaque
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apresentam afeta osde
dependendo
algumas mecanismos
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oxidação.
do estado
que
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reação catalítica. Reproduzidos,
lesionados por que posteriormente
isquemia em umde
modelo , os
dePBNPs podem
rato devido proteger
aopermissão
antioxidante
(ROS)
produzido,
[14].
[15].
atividade
após modificação,
de PBNPs compode
permissão
eliminar espécies
[14]. modificação,
reativas excessivas
com de oxigênio
de

Cada estado de oxidação fornece uma cor diferente. No espectro visível, PB e BG (K1/3
Fe(FeIII(CN)6)2/3(FeII(CN)6)1/3) possuem duas bandas de absorção em 700 e 480 nm; PW
(K2FeII FeII(CN)6) não possui banda óbvia, e PY (FeIIIFeIII(CN)6) apresenta uma banda em 420
nm. As atividades multienzimáticas de PBNPs (SOD, POD e CAT) [2] são causadas pelos
abundantes potenciais redox de suas diferentes formas (Figura 2). Nesse aspecto, essas
nanopartículas são únicas, pois podem exibir simultaneamente as três atividades miméticas enzimáticas indi
Além disso, os PBNPs apresentam algumas vantagens ausentes em outras nanoenzimas. Desta forma,
os PBNPs podem proteger neurônios lesionados por isquemia em um modelo de rato devido à atividade
antioxidante de PBNPs que pode eliminar espécies reativas de oxigênio (ROS) em excesso [15].

Figura
por PB 2. Diagrama
mimetizadas
e Figura 2.
por PB esquemático
Diagrama
e PBA. das
esquemático
A SOD reações
catalisa catalisadas
das reações
alternativamenteporaoxidoredutases
catalisadas dismutação do mimetizadas
por oxidorredutases
superóxido em
oxigênio e perox e
em oxigênio deperóxido
hidrogênio PBA. A SODid;catalisa
de hidrogênio; alternativamente
POD decompõe a dismutação
o peróxido do superóxido
de hidrogênio na água;
e CAT quebra
quebra de peróxido
o peróxido de hidrogênio
de hidrogênio POD quebra
em oxigênio de peróxido
e água. oxigênio de hidrogênio na água; e CAT
e água.

Existem
relativamente várias maneiras
fáceis, relativamente
Existem várias de
baratos obter
maneiras PBNPs
e ecologicamente
de obter[16-18].
PBNPs Alguns
corretos.
[16–18].deles
Conforme são indicado,
Alguns fáceis,
deles sãoo
tamanho
Conforme
superior ade
10tais
indicado, nmonanopartículas
[7].
tamanho
Recentemente, é geralmente
de tais nanopartículasbarato
foi relatado que ePBNPs
ambientalmente
é geralmente relatadoamigável.
ultrapequenos como~ 3,4
nmdiâmetro
nm de de diâmetro
polivinil têm
pirrolidona
foram mais preparados
de 10usando
preparados
sendo nm [7]. Recentemente,
usando
uma mistura
uma mistura PBNPs
de etanol/água ultrapequenos
de etanol/água
como solvente
como ~ 3,4e
solvente
estabilidade
de e polivinil
capeamento
das de pirroli
nanopartículas (PVP)
superfície de como
[19].
PB agente de capeamento
Aouestabilidade
PBA desempenha feito superficial
das nanopartículas
(PVP) comode [19] . APBA
PBagente
ou
Figura 2.por
mimetizadas
utilização Diagrama
potencial.
PB e um esquemático
Na papel
maioria das
fundamental
das reações
aplicações, catalisadas
na determinação
desempenha por
daum oxidorredutases
adequação
papel fundamental
para
na
peroxdeterminação
PBA.
citoplasmaSOD
de hidrogênio da
celular em adequação
alternativamente
PBNPs
organismos para
catalisa
são dispersos utilização
a
vivos , emPBNPs potencial.
dismutação
um meio de Na
são dispersos maioria
superóxido
líquido como em
em meiodas aplicações
oxigênio
sangue líquido
e e
como
sangue
e e citoplasma
organismos
coloidal
organismos
é de especialde celular
peróxido em
de ide; POD
hidrogênio decompõe
de o
decomposição peróxido
vivos. importância para qualquer tipo de nanopartícula, exceto CAT de . hidrogênio
A na
estabilidade água;
A estabilidade
vez
significativa
maneira
oxigênio
enzimáticas
agregação coloidal
que adeagregação
eobter
daágua.
que
dos
atividade
dis
pode élevar
PBNPs, de
noestável
das
caso éespecial
catalítica.
partículas
das
Existem
acrucial,
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propriedades
Uma
perda
uma
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significativa
maneiras
enzimáticas
que de,amasqualquer
obter
partícula
dedano
obter tipo
atividade
dispersões
dos
caso
ag
PBNPs
PBNPs,
das
podede nanopar
catalítica.
propriedades
estáveis
[16–18].
levar é em
é crucial,
à Uma
perda
auma

Alguns deles são fáceis, relativamente pela modificação da superfície da

nanopartícula.
modificação
é barata e da A modificação
ecologicamente
superfície da superfícieAde PBNPs tem dasido persões é PBNPs
pela
Conforme indicado, o tamanhodadenanopartícula.
correta.
tais nanopartículas modificação
é usualmente superfície
realizadodecom
com
proteínas
polietilenoglicol,
nm
de uma
polietilenoglicol,
Um[7]. Recentemente,
etapa
nativas
simples , proteínas
e
poli(cloreto
foi macromoléculas
poli(cloreto
PBNPs
preparado nativas
de dialildimetilamônio),
ultrapequenos
dee dialildimetilamônio),
de
macromoléculas
poli(vinilpirrolidona)
~3,4 nm
quitosana,
de de
além
poli(vinilpirrolidona)
diâmetro
[20].
detem
Quitosana
ser sido
superior
possuem
realizado
simples
[20].
a 10
solução
superfície
aquosacomde uma
polivinil deusando
rotapirroli parauma
solução mistura
preparar
aquosa de etanol/água
PBNPs
passo passo paracomo
abiocompatíveis, solvente
preparar
revestindo
PBNPsesua
nivelamento
biocompatíveis,
[19]. revestindo sua superfície (PVP) como a superfície agente de
A estabilidade
ácido
ácido dooxálico
ácido carboxílico de férricos
nanopartículas de PB ou PBA , nomeadamente
Oscarboxílico,
cítrico
íons
determinação
ou
férricosnomeadamente
[21]. Os iões
são complexos
da adequação
ácido cítricosão
e desempenham
para utilização
ou oxálico
complexados
potencial.um
[21].
Napapel
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na um
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uma
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de
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mais
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PB/PBA.
a
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ferro,
proteínas
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da denanopartícula.
nativas
polietilenoglicol,
de atividade
e poli(vinilpirrolidona)
A modificação
semelhante
biocompatíveis
[20]. Uma rotaéde revestir
solução sua
aquosa
superfície
simples de uma etapa para preparar PBNPs
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diminuiu na presença de cloreto de guanidina (GuHCl) [22]. Neste caso, supõe-se que o GuHCl
interaja diretamente com os átomos de ferro do óxido de ferro, resultando em uma mudança na
densidade de elétrons do ferro. Uma vez que PB/PBA também contém átomos de ferro, a
existência de inibidores não pode ser excluída.

3. Atividade semelhante à peroxidase

As peroxidases são um grupo de enzimas (EC 1.11.1.x) que normalmente catalisam
uma reação na forma ROOR + 2eÿ + 2H+ ÿ ROH + ROH. Por exemplo, na presença de
H2O2, POD pode efetivamente catalisar os substratos de peroxidase em seus substratos
oxidados. Além disso, POD pode decompor espécies reativas de oxigênio (ROS), que estão
envolvidas em várias reações oxidativas importantes [23]. PB e PBA mostram atividade
semelhante a POD em meio ácido devido à grande área de ferro férrico e ferroso disponível.
Esses compostos exibem boa atividade de imitação de POD induzida por H2O2 , incluindo a
oxidação de múltiplas biomoléculas, como 3,5,3',5'- tetrametilbenzidina (TMB), ácido 2,2'-
azino-di(3-etilbenztiazolina-6-sulfônico ) (ABTS), O-fenilenodiamina (OPD), glicose, dopamina,
luminol, guaiacol e NADH [24]. O substrato natural da POD geralmente utilizado é o TMB
que, quando oxidado na presença de H2O2, apresenta dois picos de absorção em 369 nm e
652 nm. A intensidade dos picos é proporcional ao substrato e à concentração da enzima.
Semelhante às enzimas naturais, o comportamento cinético catalítico de PBNPs seguiu a
equação de Michaelis-Menten e dependeu da concentração do substrato, temperatura e pH.
A atividade do nanomaterial é frequentemente comparada à enzima natural, peroxidase de rábano (H
A cinética de Michaelis-Menten é um dos modelos mais conhecidos de cinética enzimática.
O modelo assume a forma de uma equação que relaciona a taxa de reação (v) (taxa de formação do produto) com a
concentração de substrato, [S]

[S]
v = vmax (4)
km + [S]

onde vmax representa a taxa máxima alcançada pelo sistema, ocorrendo na concentração
de saturação do substrato. O valor de KM é numericamente igual à concentração de
substrato na qual a taxa de reação é metade de vmax. KM aproxima a afinidade da
enzima pelo substrato, e quanto menor o KM, maior a afinidade.
PB exibe alta atividade semelhante a POD para a redução de peróxido de hidrogênio devido à alta eletroatividade.
Como dito acima, o TMB oxidado absorve a 652 nm. Na presença de PB, tal absorção pode ser mascarada pela enorme
banda de PB (pico de absorção em ~700 nm). Nesse caso, a atividade catalítica pode ser monitorada em 450 nm, banda
de absorção da forma totalmente oxidada do mediador TMB2+ [24]. A atividade do tipo enzimática foi observada em PB
(e PBA) sozinho ou combinado com outras substâncias formando compósitos híbridos.

3.1. Azul da Prússia e Análogos do Azul da Prússia

Embora o grupo liderado por Gu e Zhang tenha relatado pela primeira vez que nanopartículas
de ÿ-Fe2O3 modificadas por PB tinham atividade semelhante a POD [25], o primeiro estudo sobre
o uso de PB sozinho como nanozima foi realizado por Zhang et al. [26], que observaram uma
atividade catalítica para a oxidação mediada por peróxido de hidrogênio do substrato clássico da
peroxidase ABTS para produzir um produto colorido. A catálise seguiu a cinética de Michaelis-
ÿ

Menten e mostrou uma forte afinidade por H2O2. Cunderlová

cúbicos de PB
et al.
de[27]
15 nm
determinaram
de diâmetroque cristais
apresentavam uma alta atividade catalítica do tipo POD. O valor estimado de KM para TMB foi de
0,76 mmol Lÿ1 e para H2O2 foi de ,840 mmoldeLÿ1
valores (para
0,147 os mesmos
e 790 mmol Lÿ1 substratos, HRP apresentou
, respectivamente). Além
disso, neste estudo, a superfície de PBNPs foi biotinilada. Esses nanocristais
mostraram seu uso emmodificados
ensaios baseados
na afinidade competitiva de biotina e albumina de soro humano. É importante ressaltar que as
biotina-PBNPs retiveram sua atividade catalítica para TMB e H2O2. Como tendência diferencial, a
dependência da taxa de redução de H2O2 (vH2O2) da concentração de TMB não se ajustou ao
modelo de Michaelis-Menten. Uma explicação poderia ser a taxa limitante de difusão do TMB
através da superfície biotinilada.
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Vázquez-González comparou a atividade semelhante a POD de quatro aglomerados inorgânicos

formados por PB e PBA. Eles observaram a geração de quimioluminescência na presença de luminol e
H2O2, a oxidação catalisada de dopamina a aminocromo e a oxidação catalisada de NDPH a NAD+ por
H2O2 [28]. As atividades catalíticas foram diferentes em cada composto mostrando a importância da
estrutura química nas propriedades intrínsecas das nanoenzimas. Os PBNPs foram os mais eficientes
para a oxidação de dopamina e NADH por H2O2, enquanto que para a geração de quimioluminescência,
o mais eficiente foi o PBA formado por Ma = Fe, Mb = Co (PBCoFe). Komkova et ai. sintetizou PBNPs na
maior atividade catalítica reduzindo a mistura dos reagentes formando PB usando peróxido de hidrogênio
ou um polímero condutor, como a polianilina [24]. Os autores observaram que a velocidade inicial da
reação de redução de H2O2 , catalisada por PBNPs, era linearmente dependente da concentração de
peróxido de hidrogênio, que nunca havia sido descrita nem para nanozimas tipo POD nem para POD
natural. Esse fato apontou que a ativação do H2O2 pelas nanopartículas ocorreu muito mais rapidamente,
mesmo em comparação com a enzima natural. Por outro lado, na ausência de H2O2, não foi registrada
oxidação do TMB. Assim, os PBNPs empregados não apresentaram atividade semelhante à oxidase
(redução do oxigênio molecular). Ao contrário, Wang et al. usaram nanogaiolas de PBA que imitam a
atividade semelhante à oxidase para a detecção contínua de sulfeto de hidrogênio [14]. Um PBA descrito
anteriormente (PBCoFe) [28] foi empregado para catalisar a oxidação de L-tirosina em dopacromo na
presença de ácido L-ascórbico/H2O2. [29].

Na primeira etapa, a L-tirosina é hidroxilada para formar L-DOPA e, posteriormente, é

oxidada a dopacromo. A mistura ácido L-ascórbico/H2O2 é básica para provocar a
hidroxilação da L-tirosina. O PBA também catalisou a oxidação da L-fenilalanina a
dopacromo. Um estudo conduzido por Farka et al. conjugaram PBNPs diretamente com
anticorpos e aplicaram essas nanopartículas em ensaio imunossorvente ligado a nanozimas (NLISA)
O método consistiu na leitura colorimétrica da cor gerada pelo TMB oxidado (Figura 3). Esta
técnica foi utilizada para detecção de albumina sérica humana na urina para diagnóstico de
albuminúria, bem como para detecção de Salmonella typhimurirum em leite em pó, como
exemplo de antígeno microbiano. Quando os mesmos anticorpos foram usados em formatos
ELISA de sanduíche padrão com enzima HRP natural, foram obtidos parâmetros de ensaio
semelhantes. Isso sugeriu que o ensaio dependia principalmente da afinidade dos anticorpos
para o analito alvo e não da etapa de detecção. A fácil síntese a partir de precursores
baratos e a maior estabilidade das PBNPs em comparação com as enzimas naturais
confirmaram a adequação das PBNPs para serem usadas como substitutos enzimáticos.
Muitas propriedades dos nanomateriais são dimensionalmente dependentes, o que é considerado
como efeitos de tamanho. A atividade catalítica das nanoenzimas se apresenta de maneira dependente do
tamanho, pois, para o mesmo volume, nanoenzimas com tamanho pequeno expõem mais sítios ativos. De
acordo com isso, foi demonstrado que PBNPs ultrapequenos possuem a maior atividade semelhante a POD
[ 19]. A atividade catalítica dessas nanopartículas foi uma ordem de grandeza superior à dos PBNPs obtidos
pelos métodos convencionais. Os valores vmax e KM dessas nanopartículas foram 2,5 µM sÿ1 e 0,22 mM,
respectivamente, muito maiores do que os PBNPs relatados na literatura (ou seja, 0,22 µM sÿ1 e 0,34 mM
[31]).

3.2. Nanopartículas Híbridas Formadas por PB/PBA

Como indicado acima, o grupo liderado por Gu e Zhang relatou pela primeira vez que um compósito
híbrido formado por nanopartículas de ÿ-Fe2O3 modificadas por PB tinha atividade semelhante a POD [25].
Observou-se que a atividade semelhante a POD aumentou à medida que a proporção de PB aumentou.
Esse resultado pode levar a que mais PB forneça mais íons ferrosos como centros de catálise para
interagir com os substratos. A atividade catalítica foi alta, três ordens de grandeza maior que a das
nanopartículas de magnetita de tamanho semelhante. Com tais nanocompósitos, um modelo de
imunoensaio enzimático foi estabelecido. Neste ensaio, a proteína A estafilocócica foi conjugada na
superfície da nanopartícula e a nanossonda serviu para detectar IgG imobilizada em placas de 96 poços.
Mais tarde, este grupo estudou as aplicações de nanopartículas de ferritina modificadas por PB na detecção
biológica [32]. O mesmo grupo sintetizou PB e nanocompósitos de poliestireno modificados com ouro
(PS@Au@PB) [33]. Em um estudo posterior, eles observaram
 Machine Translated by Google

Int. J. Mol. ciência 2021, 22, 5993 6 de 16

que PBNPs mostraram fraca atividade POD sob condições neutras [31]. Além disso, em um
ambiente alcalino, eles eram quase inativos. Mais recentemente, esse grupo inferiu que as
PBNPs podem atuar como nanoenzimas relacionadas ao ácido ascórbico, que podem catalisar a
oxidação do ácido ascórbico sem produzir H2O2 [34]. Como a oxidação do ácido ascórbico pelas
2021, 22, x FOR PEER REVIEW atividade
PBNPs
além da
também
atividade
podesemelhante
ser realizada
à peroxidase
na presença
do de
ácido
H2O2,
ascórbico.
as PBNPs possuem Int.6 J.
deMol.
17 ciência

Figura 3.revestida
Esquema pordeanti-captura
sanduíche NLISA
Figura baseado
3. Esquema em PBNPs.
de NLISA A sanduíche
placa de microtitulação é
à base de PBNPs. A placa
de microtitulação
antígeno
de
permissão
TMB de
(Ag) é
colorimétrica
. (Ag)
Ade
H2O2.
leitura
e[30]. revestida
eformação
formação pelo
colorimétrica
Reproduzido
é baseada
do corpo
dosanduíche
sanduíche
écom
na de
baseada captura
oxidação
permissão
com
comna
oos (Ab1),
catalisada
anticorpo
oxidação
de
PBNPs seguida
[30]. catalisada
de
na
por(Ab1
proteção
presença
PBNPs da ligação
), seguida
por
do
-marcador
dePBNPs
rótulo
H2O2 específica
da PBNPs-Ab2
ligação
de
. Ab2 do
Reproduzido
TMB deantígeno
. Aespecífica
na
leitura
presença
detecção
comdo

3.2. Nanopartículas Híbridas Formadas por PB/ PBA

Cui et al. prepararam um nanocompósito crescendo PB na estrutura metalorgânica
Como indicado acima,
microporosa o grupo liderado
MIL-101(Fe) porvalores
[35]. Os Gu e Zhang relatou
de KM pela primeiraPB/MIL101(Fe)
do compósito vez que um compósito
em relação a
TMB epor
híbrido formado H2O2 foram 0,127
nanopartículas e 0,0058
de ÿ-Fe2O3 mM, inferiores
modificadas por PBaos deatividade
tinha MIL-101(Fe) para aosPOD
semelhante mesmos
[25].
substratos
Observou-se (0,490 semelhante
que a atividade e 0,620 mM, respectivamente).
a POD aumentou à medida A diferença foi atribuída
que a proporção ao fato de que a
de PB aumentou.
presença
Esse resultado pode de PBa no
levar quecompósito envolve
mais PB forneça maismais
íons sítios ativos
ferrosos comopara substratos
centros depara
de catálise peroxidase.
interagir
Yang
com os substratos. e outros.catalítica
A atividade nanocubos detrês
foi alta, PB ordens
modificados com Co3O4,
de grandeza maior do um
que tipo
parade óxido de metal de
nanopartículas
transição
de magnetita que exibe
de tamanho similar.uma
Comatividade catalítica em
tais sites nanocompo, umsubstratos de HRP [36].enzimático
modelo de imunoensaio Tais nanopartículas
foi
(PB@Co3O4)
estabelecido. exibiram
Nesse ensaio, atividades
a proteína intrínsecas
A estafilocócica de oxidase
foi conjugada e peroxidase,
na superfície ou seja, elas
da nanopartícula e a poderiam
oxidar
nanossonda rapidamente
serviu para detectarTMB com ou sem
IgG imobilizada em H2O2
placas em condições
de 96 ácidas.
poços. Mais tarde, Desta forma,
este grupo foi desenvolvido
estudou as
aplicaçõesum
de método colorimétrico
nanopartículas para
de ferritina a detecção
modificadas por de
PB glutationa
na detecção(GSH) utilizando
biológica nanopartículas
[32]. O mesmo grupo de
sintetizou PB@Co3O4 como imitadores
PB e nanocompósitos de oxidase
de poliestireno . GSH
modificados comproduziu o desbotamento
ouro (PS@Au@PB) [33]. Emda
umcor gerada pelo
estudo
posterior, TMB
eles reoxidado
He et al (redução
prepararamdacompósitos
absorbância em 652
híbridos nm). por PB e Ti3C2Tx, em que este último
formados
marcou
agente que
atuou como umalcalino, elesPBNPs
redutor,
eram apresentaram
e aquase
nanoestrutura fraca
inativos. 2D
Mais atividade depoderia
multicamada
recentemente,POD
esteem condições
inferiu neutras
efetivamente
grupo manter o[31].
em Além
as nanopartículas disso,
um ambiente
de PB
nanozimaslonge da[37].
glicose agregação.
relacionadasde ao
ácido O
ácido compósito
ascórbico
ascórbico,
semfoi
queusado como
produzir
podem H2O2um sensor
catalisar
[34].
aComocolorimétrico
oxidação
a oxidação que
para detecçãoos PBNPs
do ácido podem
deascórbico
H2O2, poratuar
dopamina
PBNPscomo
e
também pode ser realizada na presença de H2O2, os PBNPs possuem
do ácido ascórbico, além da atividade semelhante à da peroxidase do ácido ascórbico. atividade semelhante à da oxidase

Cui et al. prepararam um nanocompósito crescendo PB na estrutura metalorgânica microporosa

MIL-101(Fe) [35]. Os valores de KM do compósito PB/MIL101(Fe) em relação a TMB e H2O2 foram 0,127 e
0,0058 mM, inferiores aos de MIL-101(Fe) para o mesmo
Machine Translated by Google

Int. J. Mol. ciência 2021, 22, 5993 7 de 16

Em um estudo conduzido por Sahar et al., foi preparado um hidrogel híbrido orgânico/
inorgânico, que tem o potencial de imitar múltiplas enzimas (POD, SOD e CAT) em um sistema
natural em cascata [38]. O PB foi parcialmente oxidado a verde de Berlim (BG) e este foi
misturado com trioxovanadato de sódio (NaVO3) na presença de polivinilpirrolidona (PVP).
Após agitação e aquecimento, formou-se um hidrogel híbrido (análogo de VOxBG ). Este
hidrogel foi usado como um sistema tipo cascata na detecção de glicose, fotolitografia de
hidrogel, oxidação de dopamina e degradação oxidativa fotocatalítica de substratos
recalcitrantes em meio aquoso.
Um aumento na atividade enzimática foi obtido em nanogaiolas de PBA dopadas com
molibdênio [14]. Esta dopagem adaptou com sucesso o tamanho, morfologia, composição e
estrutura complexa da nanogaiola. A atividade semelhante a POD associada foi aumentada em
mais de 37 vezes em comparação com o PBA original.
A atividade semelhante a POD de PB/PBA tem sido usada para a detecção de várias
substâncias , como glicose, glutationa, peróxido de hidrogênio ou etanol. Em alguns PBA, que
também possuem atividade semelhante à oxidase, isso é usado para detectar glutationa ou
sulfeto de hidrogênio (Tabela 1). Na maioria dos casos, esses ensaios são baseados na
oxidação de um substrato por peróxido de hidrogênio. Por exemplo, a oxidação aeróbica da
glicose na presença da glicose oxidase (GOx) produz ácido glucônico e H2O2. A oxidação de
um substrato por H2O2 dá um produto geralmente legível por espectrofotometria. Na pesquisa
de Vázquez-González et al. [28], após a oxidação da glicose, a oxidação do luminol como
substrato gera uma luz de ~428 nm, fornecendo um sinal de leitura quantitativa para a
concentração de glicose (Figura 4).

Tabela 1. Nanopartículas de azul da Prússia usadas como sensores. LOD = limite de detecção.

nanopartículas Tamanho/nm Analito Faixa Linear LOD Ref.

PB <50 Glicose 0,1–50 µM 0,03 µM [26]

PB <50 Peróxido de
0,05–50 µM 0,031 µM [26]
hidrogênio
Humano
PB biotinilado 15 sérum 0,35–??? 0,27 µg/mL [27]
albumina
PBA (FeCo) 100–200 Glicose Não indicado Não indicado [28]

60 Sulfato de 33 nM
nanogaiolas PBA 0,1–15 µM [14]
hidrogênio
Humano
PB modificado por anticorpo 24 sérum 1,2–1000 ng/mL 1,2 ng/mL [30]
albumina
PS@Au@PB 20 Glicose 15,6–250,0 µM [33]
3,9 µM 0,021 µM [36]
PB modificado por Co3O4 ~200 Glutationa 0,1–10 µM

PB-T13C2Tx Peróxido de
2–240 µM 0,4667 µM [37]
hidrogênio
PB dopamina Não indicado 5– Não indicado [37] 3,36 µM
PB-T13C2Tx dopamina 120 µM 10– [37] 6,52 µM [37] 0,046
µM
PB-T13C2Tx Glicose 350 µM 1–50 [38] 40 µM [39] 1,41
µg/
VOxBG hidrogel 250 Glicose µM 0,05–7,3 mL [40]
PB oco ~20 Glicose mM 2–500 µg/
Nanocubos PB ocos 80 Etanol mL
Peróxido de
PB/polipirrol 5–2775 µM 1,6 µM [41]
hidrogênio
 . ,
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glicose oxidase (GOx) produz ácido glucônico e H2O2. A oxidação de um substrato por
H2O2 dá um produto geralmente legível por espectrofotometria. Na pesquisa de Vázquez-
Gon zález et al. [28], após a oxidação da glicose, a oxidação do luminol como substrato
Int. J. Mol. ciência 2021, 22, 5993
gera uma luz de ~ 428 nm, fornecendo um sinal de leitura quantitativa para a concentração
8 de 16
de glicose (Figura 4).

Figura Figura 4. Acoplamento

4. Acoplamento do sistema de do sistema
geração de geração de catalisada
de quimioluminescência quimioluminescência catalisada
por PBFeCo à oxidação por
aeróbica PBFeCo
mediada por à
GOx deoxidação
glicose em aeróbica mediada
ácido glucônico e H2O2 por
paraGOx de glicosede
o desenvolvimento em
umácido
sensorglucônico e H2O2 para
de glicose. Reproduzido o desenvolvimento
com permissão de [28]. de
um sensor de glicose. Reproduzido com permissão de [28].

A Figura 5 ilustra as principais reações implicadas no uso de PBNPs como nanozimas do

tipo POD. Apesar de muitos nanocompósitos baseados em PB/PBA com atividade semelhante
a POD terem sido relatados até agora, seus mecanismos catalíticos raramente foram investigados.
Chen et ai. provaram pela primeira vez, comparando sua atividade do tipo POD com a de uma
série de PBA, na qual os átomos de Fe foram substituídos por Ni, Cu e Co [42]. Eles
demonstraram que as propriedades do tipo catalítico podem ser atribuídas ao FeNx (x = 4-6).
9 de 17
Int. J. Mol. ciência 2021, 22, x PARA REVISÃO POR PARES
Inspirados na estrutura plana quadrilateral do heme, eles propuseram que o mecanismo
catalítico também era semelhante ao das enzimas heme (HRP, citocromo P450).

Ao lado,
Figura 5. Reações dos principais analitos detectados usando a estrutura
PB/PBA como daPorbanda
nanozimas tipo POD. FeNx
dentro, a estrutura conforme
da FeNx [42];
Figura 5. Reações as bandas
dos principais azuis
analitos detectados usandorepresentam
PB/PBA como nanozimaso
do tipo POD.

macrocíclica de quatro N ÿ macrocíclico C no mesmo como plano.banda conjunto de acordo

de quatro com N [42];
ÿ C no asmesmo
bandasplano. azuis representam a montagem

Do exposto, é evidente que PBNPs, como uma nanozima tipo POD, podem ser usados como
um veículo
PBNPs comouniversal para
sensores, taisconstruir cascatas
nanopartículas de reações
devem atendercatalíticas. Para umacomo
a alguns requisitos ação alta
eficiente das
superfície/
volume Catalases (EC 1.11.1.6) são enzimas comuns que catalisam a decomposição da razão hy,
compatibilidade com as demais enzimas presentes na reação (em reações em tandem), peróxido de
drógeno emenzimas
ambas as água e oxigênio (2 H2O2
e os mesmos ÿ H2O químicos
substratos + O2). Emque
consequência, o pH catalítico
as enzimas naturais. ótimo da
A atividade para
CAT
pode ser analisada quantitativamente medindo a concentração de oxigênio produzida. Por ser o
H2O2 o principal indicador de inflamação, a avaliação do gene 4. Catalase-Like Activity ated O2 é
importante para evidenciar qualquer processo inflamatório, como o produzido após Catalases (EC
que as
alto. 1.11.1.6)
água são enzimas
nanozimas
e oxigênio comuns
apresentem
(2 H2O2 H2Oque
ÿatividade catalisam
+ O2).
semelhantea decomposição
Em consequência,
à POD emapH de terapia
atividade
baixo fototérmica.
peróxido
semelhante É comum
de hidrogênio
a CAT em em
pH
Assim, dependendo
nanoenzimas,
analisada de
indicador das condições
quantitativamente
inflamação,
e este fato determina de
a avaliação
medindo pH,
o da
seu H2O2 pode
a concentração
atividade ser atividade
oxigêniocatalítica.
produzido.
de adsorvido
Devidocatalítica
ouao de
decomposto CAT
H2O2 ser ona pode ser das
principal
superfície

O grupo liderado por Zhang e Gu demonstrou que os PBNPs podem servir como
candidatos promissores de CAT de maneira dependente do estado redox sob condições
neutras (pH ideal = 7,4) [31]. Este grupo observou que após incubar PBNPs com H2O2 em
um ambiente alcalino, as nanopartículas eram inativas, no que diz respeito à atividade POD-like, ma
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O O2 gerado é importante para evidenciar qualquer processo inflamatório, como o produzido após a
terapia fototérmica. É comum que as nanoenzimas apresentem atividade semelhante a POD em pH
baixo e atividade semelhante a CAT em pH alto. Assim, dependendo das condições de pH, o H2O2
pode ser adsorvido ou decomposto na superfície das nanoenzimas, fato que determina sua atividade
catalítica.
O grupo liderado por Zhang e Gu demonstrou que os PBNPs podem servir como
candidatos promissores de CAT de maneira dependente do estado redox sob condições
neutras ( pH ideal = 7,4) [31]. Esse grupo observou que após a incubação das PBNPs com
H2O2 em meio alcalino as nanopartículas ficaram inativas quanto à atividade POD-like, mas
apareceram bolhas de oxigênio na solução. A quantidade de gás aumentou em níveis de pH
mais elevados. O grupo verificou que a atividade CAT-like era linearmente dependente da
concentração de PBNPs. Este estudo é extremamente importante porque demonstrou porque
PB pode apresentar atividade semelhante a POD ou semelhante a CAT em função do pH. O
PB, como eficiente transportador de elétrons, pode apresentar uma ou outra atividade
enzimática dependendo dos potenciais redox. Por exemplo, em pH mais alto, o potencial
redox de H2O2/O2 é muito baixo e H2O2 pode ser mais facilmente oxidado em O2. O mesmo
grupo evidenciou o efeito do pH na atividade enzimática dos nanocompósitos PS@Au@PB
[33]. Enquanto a atividade do tipo POD foi máxima em pH 5,2, a atividade do tipo CAT foi notável em u
A incorporação de um elemento químico pode modificar a dependência do pH da atividade
CATlike do PB. Desta forma, nanocubos de PB dopados com platina preparados por redução in situ
2ÿ de PtCl6 na superfície de PB mostraram atividade semelhante a CAT em pH 6,5: a
concentração
PBdecom
O2 alto
dissolvido
teor emaumentou
Pt [43]. de 4,41 mg/L para PB sozinho para 38,25 mg/ L para um

É interessante citar o estudo realizado por Zhou et al. [44]. Eles projetaram um nanocompósito
responsivo a redox direcionado ao tumor que pode combinar a terapia de inanição do tumor e a
terapia fototérmica de baixa temperatura para o tratamento de tumores privados de oxigênio.
O nanossistema foi preparado carregando PBNPs ocos porosos com GOx. Depois disso, sua
superfície foi revestida com ácido hialurônico, permitindo assim que o nanocarreador se ligasse
especificamente às células tumorais superexpressas no tumor. Uma vez que o nanossistema foi
introduzido na célula por endocitose, a GOx foi liberada e oxidou a glicose. Como o crescimento
dos tumores é altamente dependente do suprimento de glicose, isso provoca a inanição do tumor.
No entanto, a concentração de oxigênio na maioria dos tumores sólidos é significativamente menor do
que nos tecidos normais, o que limitaria severamente a eficiência catalítica da GOx. Consequentemente,
a atividade semelhante à catalase dos PBNPs pode ser usada para catalisar o H2O2 intratumoral para
uma rápida reoxigenação, o que pode ajudar a contornar os tecidos relacionados à hipóxia tumoral.
O oxigênio produzido pela catálise dos PBNPs tem sido utilizado em algumas aplicações para o
diagnóstico de doenças. Yang e outros. desenvolveram um nanogerador de bolhas de oxigênio para
imagens de ultrassom (US) e ressonância magnética (RM) [45]. Primeiro, os PBNPs decompuseram H2O2
em O2 em condições neutras; então, as moléculas nucleadas de O2 poderiam atuar como agentes de
contraste de bolhas de gás para US. Quando a concentração de oxigênio atingia a supersaturação nos
tecidos, as bolhas podiam ser observadas e uma imagem de ultrassom aprimorada também podia ser
detectada por um sistema de medição acústica. Além disso, as bolhas paramagnéticas de oxigênio
poderiam encurtar o tempo de relaxamento T1, atuando como um agente de contraste para ressonância
magnética. Em resumo, os PBNPs podem ser uma excelente sonda de imagem de dupla modalidade de
ultrassom (US) e ressonância magnética (RM) para diagnóstico in vitro e in vivo de H2O2 com excelente sensibilidad
A atividade do tipo CAT tem sido usada para melhorar a quimioterapia/terapia fototérmica.
Dessa forma, uma possível sinergia entre a atividade catalítica explorada como ferramenta fotodinâmica
e os efeitos fototérmicos poderia ser gasta. Conforme indicado acima, quando um tumor cresce, existem
algumas porções do tumor com regiões onde a concentração de oxigênio é significativamente menor do
que em tecidos saudáveis. Esses microambientes hipóxicos em tumores sólidos são resultado do consumo
de oxigênio disponível pelas células tumorais em rápida proliferação . Além disso, as células cancerígenas
produzem grandes quantidades de lactato, e esse ambiente ácido promove a invasão das células tumorais
do tecido não canceroso adjacente. A hipóxia indicada em tumores sólidos limita extremamente o
antitumoral da terapia fotodinâmica. No entanto, o tumor
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O microambiente também apresenta altos níveis de H2O2, podendo ser uma fonte de O2. A
atividade semelhante a CAT de PBNPs pode fornecer oxigênio ao tumor. O O2 gerado pode
apoiar a terapia fotodinâmica de tumores e reduzir o crescimento tumoral [46].
Peng e outros. prepararam uma nanopartícula de PB/dióxido de manganês (PBMn) revestida por
membrana eritrocitária para transportar doxorrubicina e prolongar o tempo de circulação in vivo [47]. O
oxigênio gerado a partir do H2O2 sob a catálise do PBMn aliviou a hipóxia dos tumores, e sua expansão
rompeu a membrana eritrocitária revestida na superfície do PBMn, o que acelerou a liberação de
doxorrubicina das nanopartículas. Isso tornou essas nanopartículas um nanossistema de liberação de
drogas ativadas responsivo a H2O2 e melhorou a quimioterapia por PBMn. Além disso, o PBMn, como
qualquer PB/PBA, possui forte absorção na região do infravermelho, com alta eficiência de conversão
fototérmica, podendo ser utilizado como um agente terapêutico fototérmico ideal [48].

Semelhante à atividade semelhante a POD observada, a atividade semelhante a CAT também é dependente do tamanho.
PBNPs ultrapequenos tendem a ser mais eficazes e exibem maior atividade catalítica tipo enzima do que
PBNPs de tamanho maior [19]. A taxa catalítica inicial das nanopartículas ultrapequenas foi de 5,3 mg L-1
min-1 em comparação com 0,77 mg L-1 min-1 de PBNPs [31].

5. Atividade semelhante à superóxido dismutase

A superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) é uma enzima que catalisa a dismutação do
radical superóxido (O2 •ÿ) em oxigênio molecular comum e peróxido de hidrogênio, duas
•ÿ
espécies menos prejudiciais. A reação é: 2 O2 + 2 H+ ÿ como
O2 + H2O2.
um subproduto
O superóxido
do metabolismo
é produzido
do oxigênio e, se não for regulado, causa muitos tipos de danos celulares [49].

Conforme indicado, os PBNPs exibem atividade do tipo SOD [14]. Além disso, o H2O2
produzido pelo desproporcionamento do superóxido pode ser transformado em H2O ou O2 por
PBNPs agindo como nanoenzimas POD ou CAT-like. Os valores de potencial redox padrãoO2/ O2
de •ÿ
(0,73 V) e O2 •ÿ/ H2O2 (1,5 V) indicam que os PBNPs são capazes de catalisar as seguintes
meias-reações (consulte a Figura 1):

2HO2 • + 2H+ + PB+ 2eÿ ÿ 2H2O2 + BG (5)

2HO2 • + BG ÿ 2O2 + 2H+ + PB + 2eÿ (6)

•
2HO2 + 2H+ + BG + 2eÿ ÿ 2H2O2 + PY (7)

HO2 • + PY ÿ O2 + H+ + BG + eÿ (8)

A capacidade dos PBNPs de sofrer a dismutação dos íons do radical superóxido pode ser avaliada
pelo ensaio de Fridovich [50]. Neste ensaio, a oxidação da xantina pela xantina oxidase gera íons radicais
superóxido. Esses íons radicais reduzem nitroblue tetrazolium (NBT) dando diformazan. Desta forma, a
redução do NBT, de cor amarela, pelos íons do radical superóxido gerados implica na formação do
diformazano de cor azul. Na presença de PB/PBA, os radicais gerados são total ou parcialmente eliminados
reduzindo a quantidade de diformazan e, portanto, a intensidade da cor azul. Essa redução pode ser
monitorada espectrofotometricamente (Figura 6) [20].

Outra maneira de verificar a capacidade de PBNPs para eliminar ânions superóxido é

usando o sistema xantina/xantina oxidase com 5-terc-butoxicarbonil 5-metil-1- pirrolina-N-óxido
(BMPO) como um spin trap para formar o aduto BMPO /OOH• . Na presença
de SOD ou PBNPs, o sinal do espectro de ressonância de spin eletrônico (ESR) diminuiu [31,51].
Em um estudo, o PB foi imobilizado em partículas de látex de poliestireno (AL)
funcionalizadas com amidina [20]. A habilidade dos materiais PB e PB-AL na dismutação de
íons radicais superóxido foi determinada colorimetricamente [49]. O PB não perdeu a atividade
da SOD com a imobilização no AL. No entanto, devido ao inevitável impedimento de alguns
sítios catalíticos nas superfícies de PBNPs após a ligação à superfície AL, os valores máximos
de inibição diminuem para PB-AL. Desta forma, KM = 2,19 mM para PB em comparação com
2,92 mM para PB-AL, e vmax = 6,71 × 10ÿ6 M sÿ1 para PB e 4,09 × 10ÿ6 M sÿ1 para PB-AL. Como
Machine Translated by Google A capacidade dos PBNPs de sofrer a dismutação dos íons do radical superóxido pode ser avaliada pelo
ensaio de Fridovich [50]. Neste ensaio, a oxidação da xantina pela xantina oxidase gera íons radicais superóxido.
Esses íons radicais reduzem nitroblue tetrazolium (NBT) dando diformazan. Desta forma, a redução do NBT, de cor
amarela, pela geração 11 de 16
Int. J. Mol. ciência 2021, 22, 5993
iões radicais superóxido erados implica a formação do diformazano de cor azul. Na presença de PB/PBA, os
radicais gerados são total ou parcialmente eliminados reduzindo a quantidade de diformazan e, portanto, a
intensidade da cor azul. Essa redução pode ser uma vantagem importante dessas nanopartículas híbridas, indicam
os autores seu alto monitoramento espectrofotométrico (Figura 6) [20]. estabilidade coloidal.

Figura 6. A conversão de xantinaxantina

e O2 aeácido
O2 emúrico e H2O2
ácido úrico epor XODpor
H2O2 gera radicais
XOD superóxido.
gera ânions O superóxido
superóxido reduzem Figura 6. A conversão
o nitroazul de a um
tetrazólio [NBT]
produto formazano colorido que absorve radiação em 560 nm. radicais PBNPs . Os ânions superóxido reduzem o nitroazul tetrazólio [NBT] a um
ânion superóxido de eliminação de
nm.formazan colorido
Os PBNPs , reduzindo
eliminam assim
os ânions a taxa dereduzindo
superóxido, formaçãoassim
de formazan.
a taxa deproduto quede
formação absorve radiação em 560
formazan.

O análogo de VOxBG acima mencionado [38] possui múltiplos estados de oxidação e isso lhe confere uma
atividade multienzimática. A atividade semelhante a SOD deste análogo foi determinada. Outra maneira de verificar
axantina
capacidade decom
oxidase PBNPs para eliminar ânions
5-terc-butoxicarbonil superóxido
5-metil-1-pir As énanopartículas
pela transformação
de PBde NBT. usando
dopadas o sistema
com platina xantina/
apresentaram
um aumento da atividade enzimática em rolina-N-óxido (BMPO) como um spin trap para formar o aduto
BMPO/OOH•. Na presença de comparação com nanopartículas de PB simples [42]. A atividade foi aumentada com
o aumento de Pt SOD ou PBNPs, o sinal do espectro de ressonância de spin eletrônico (ESR) diminuiu [31,51].
contente. Sob a PB
Em um estudo, mesma condição, em
foi imobilizado as nanopartículas de Pt apresentaram
látex de poliestireno uma leve
(AL) funcionalizado com atividade
amidina, semelhante a SOD.
o que contribuiu para
o aumento da atividade semelhante a enzima de nanopartículas de PB dopadas com Pt. partículas [20]. A habilidade
dos materiais PB e PB-AL na dismutação de íons radicais superóxido foi determinada colorimetricamente [49]. O
PB não perdeu a atividade SOD após im 6. Mobilização da atividade de eliminação de ROS ou geração de ROS
em AL. Node
livres derivados
AL, o ânionentanto, devido
superóxido
oxigênio ao obstáculo
reativos,
de inibição
como
máximainevitável
hidroxila
(O2(OH• de),óxido
•ÿ ), alguns sítios(NO•
nas superfícies
nítrico catalíticos
de
) ePBNPsO termo
peroxil (RO2ROS
após ligação descreve
• ), assim comoradicais
à superfície
os
valores
= não
derivados
6,71·10–6 radicais
reativos dediminuem
M s-1 paraoxigênio,para
comoPB-AL.
PB e 4,09·10-6
H2O2. Desta
M s-1 paraforma,
ROS uma KM
éPB-AL.faca=de
Como2,19
um mM
dois para porque,
PBsistema
importante
gumes em comparação
embora paracom
antioxidante 2,92emM
PB-AL,
biológico de
vmax
controla os níveis de ROS, um excesso deles leva a vantagem dessas nanopartículas híbridas, os autores indicam
sua alta estabilidade coloidal. dano e disfunção do estresse oxidativo relacionados a muitas doenças humanas
(doença de Alzheimer, doença de Parkinson e diabetes). No entanto, as ROS também podem desempenhar um
papel positivo, uma vez que podem induzir a ativação da apoptose em células cancerígenas.

PB e PBA podem gerar ou eliminar ROS dependendo de suas propriedades catalíticas. Dessa
forma, PB/PBA com atividade semelhante a POD ou oxidase gera EROs abundantes; PB/PBA
com atividade semelhante a CAT e/ou SOD pode remover ROS. Em ambos os casos, pode-se
encontrar importantes aplicações biomédicas, como será indicado a seguir.
A formação de ROS por PBNPs segue a reação de Fenton [51]. O processo Fenton
convencional está associado à transferência de elétrons de Fe2+ para H2O2 para gerar
OH ativo• , altamente que é capaz de atacar efetivamente os poluentes alvo e decompô
-los em espécies inofensivas. O caminho da reação pode ser ilustrado pelas seguintes
equações:
Fe2+ + H2O2 ÿ Fe3+ + OHÿ + OH• (9)
Fe3+ + H2O2 ÿ Fe2+ + OOH• + H+ (10)
OH• + substratos ÿ intermediários ÿ CO2 + H2O (11)
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Ao longo dos anos, várias abordagens foram realizadas para usar PB/PBA como reagentes
de Fenton para quebrar vários contaminantes orgânicos [52-56]. Por exemplo, Liu et al. empregou
PB como um reagente semelhante a foto-Fenton e investigou sua alta eficiência catalítica para
degradação de rodamina B (RhB) sob irradiação visível em condições neutras [52]. Li et ai.
Int. J. Mol. ciência 2021, 22, x PARA REVISÃO POR PARES 13 de 17
realizaram microcompósitos de PB/TiO2 como um catalisador foto-Fenton heterogêneo para
aumentar a melhoria do Fe (II) na destruição de contaminantes orgânicos [53]. Além disso, o
mesmo grupo também preparou dois tipos de PBA, baseados em Co e Fe, com diferentes estados
60 mindee valência
PB-hpds aumentam
de ferro epara 97,1% nas
examinou mesmas
seu mecanismocondições. O PB-hpss
catalítico também apresentou
foto-Fenton heterogêneodesempenho
e seu uso na
catalítico superiorde
oxidação em relação ao
bisfenol PB-cubBu
[54,55]. e outros
et al. intermediários do PB.
utilizaram nanofolhas ultrafinas de PB para conseguir a
O motivo foram as altas
degradação áreasde
do azul demetileno
superfície (MB),
específica
um edosa exposição
corantesadequada dos sítiosem
mais utilizados ativos de coordenação
diversas indústrias [56].
FeIII-NC
Nestede PB-hpds
estudo,everificou-se
PB-hpss. que, por meio da atividade do complexo análogo de BG peroxidase-like
O explorado
No hidrogel híbrido
como umconstitutivo de VOxpara
potencial catalisador incorporado , 73%
a degradação do MB foi
fotocatalítica de removido em 1 minuto
poluentes orgânicos para ona presença de
mesmo
estudo,
de oáguas
PB cúbico removeu
residuais apenas
[38]. Ao 25%de
contrário dooutros
MB. Esses estudos preliminares
fotocatalisadores, elucidaram
este complexo os propósitos
hidrogel PB/PBA sãodo alternativas
tratamento
promissoras
de geração
aos metais
de radical
de transição
OHÿ, que convencionais
neste caso para
e óxidos
uma catálise
metálicos
maisseguidos
eficiente.deMais
um mecanismo
recentemente,
catalítico
o estudo
incomum
de Wang
et al. como
concentrou-se
buracos aprisionados
no controle estrutural
em vez de e no
radicais
designlivres
de micro/nanocristais
no sistema de reação.
e investigou
Essa habilidade
a função entre
de relacionamento
estrutura e
desempenho
ÿ contribuiu
hexápodes dodesempenho
para por
uma PB [57].
série Paraalítico
multicat este fim,VOxBG.
superior
de os microcristais
de autores sintetizaram
ajustandoPBa com um acompanhado
concentração
evolução de ácidopela
morfológica geração
cloroplatínico
de simultânea
microtubos
no sistemade
deOOÿ
para estrelas
reação (Figura 7).

Figura 7. Imagens
Figura SEM SEM
7. Imagens de cristais PB dePB
de cristais diferentes morfologias
de diferentes obtidas
morfologias aumentando
obtidas a concentração
aumentando a concentração de
de ácido cloroplatínico. a) Filhotes PB: microcubos; b) PB-mcts: filhotes de PB com cantos
ácido cloroplatínico. (a) Filhotes PB: microcubos; (b) PB-mcts: Filhotes PB com cantos truncados; c) (c)
truncados;
PB-mtes: filhotes de PB com bordas truncadas; d) PB-mpfs: Filhotes PB com faces protrusivas; e) PB-
PB-mtes: filhotes de PB com bordas truncadas; (d) PB-mpfs: Filhotes PB com faces protrusivas; (e) PB-
hpds: hexápodes; e f) PB-hpss: estrelas hexápodes. Reproduzido com permissão de [57].
hpds: hexápodes; e (f) PB-hpss: estrelas hexápodes. Reproduzido com permissão de [57].

Ao modular a produção
mostraram de ROS, de
que a eficiência o PB/PBA podede
degradação serRhB
explorado
estava para a terapêutica
intimamente de doenças.
relacionada Os resultados
à mor Por exemplo,
gerando cataliticamente ROS abundantes seletivamente em uma microambiente tumoral de
primitivos representam apenas 16,6% da remoção de RhB dentro de 60 ronment, PB /PBA pode ser PB, onde os filhotes de PB
usado para
terapêutica antitumoral, uma vez que o lev min intracelular excessivo e os PB-hpds aumentam para 97,1%
condições. PB-hpss também apresentou els de ROS que podem danificar lipídios, proteínas e DNA. No entanto, onas mesmas
efeitoPB.
antitumoral
O motivopode ser um
revertido desempenho
pelo próprio PB catalítico
em algumas superior em comparação
condições. Sabe-se que com o PB-cub
o ácido e outros
ascórbico (AA)intermediários
é capaz de, do
devido às altas
morte áreas de
de células superfície específicas
cancerígenas, melhorando e exposição adequada
o nível intracelular dede ativos
ROS deEmbora
[58]. coordenação
o ferroFeIII-NC
seja local, induzir a
de PB-hpds
e PB-hpss. considerados capazes de reforçar o efeito anticancerígeno do AA via reação de Fenton, os PBNPs, apesar
de serem um
O nanomaterial à baseconstituindo
hidrogel híbrido de ferro, podem inibir o efeito
o complexo anticancerígeno
análogo do AA. Zhang ao
de BG incorporado et ai.
VOxinferiram que os
foi explorado
como
PBNPs umatuar
podem potencial catalisador
como uma nanozimapara a degradação
relacionada ao AA quefotocatalítica
pode catalisar de poluentes
a oxidação orgânicos
do AA paraH2O2
sem produzir fins
de tratamento
[34]. Além de águas
disso, este estudo residuais
mostrou que os [38].
PBNPsAopodem
contrário de outros
catalisar fotocatalisadores,
a oxidação este
de AA na ausência e nahidrogel
presença de
complexo
H2O2, indicando seguiu um mecanismo
que os PBNPs catalítico
possuem atividade incomum
semelhante deoxidase
à da geração de radicais
do ácido OH•,
ascórbico, que
além da neste caso
atividade
funcionam
semelhante como buracos
à da peroxidase aprisionados
do ácido ascórbico. em vez de radicais livres no sistema de reação. este

Ambas as atividades enzimáticas são eliminadoras de ROS.

As PBNPs, após serem captadas pelas células, podem ser encontradas em diferentes microambientes
intracelulares, onde podem exercer atividades diferenciais semelhantes a enzimas. PBNPs funcionam principalmente
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a habilidade acompanhada pela geração simultânea de OO•ÿ contribuiu para um desempenho

multicatalítico superior do VOxBG.
Ao modular a produção de ROS, o PB/PBA pode ser explorado para a terapêutica de doenças.
Por exemplo, ao gerar cataliticamente ROS abundantes seletivamente em um microambiente tumoral ,
PB/PBA pode ser usado para terapia antitumoral, uma vez que níveis intracelulares excessivos de ROS
podem danificar lipídios, proteínas e DNA. No entanto, o efeito antitumoral pode ser revertido pelo
próprio PB em algumas condições. Sabe-se que o ácido ascórbico (AA) é capaz de induzir a morte de
células cancerígenas, melhorando o nível intracelular de ROS [58]. Embora o ferro seja considerado
capaz de reforçar o efeito anticancerígeno do AA via reação de Fenton, os PBNPs, apesar de serem
um nanomaterial à base de ferro, podem inibir o efeito anticancerígeno do AA. Zhang et ai. inferiram
que os PBNPs podem atuar como uma nanozima relacionada ao AA que pode catalisar a oxidação do
AA sem produzir H2O2 [34]. Além disso, este estudo mostrou que os PBNPs podem catalisar a oxidação
de AA na ausência e na presença de H2O2, indicando que os PBNPs possuem atividade semelhante à
da oxidase do ácido ascórbico, além da atividade semelhante à da peroxidase do ácido ascórbico.
Ambas as atividades enzimáticas são eliminadoras de ROS.
As PBNPs, após serem captadas pelas células, podem ser encontradas em diferentes
microambientes intracelulares , onde podem exercer atividades diferenciais semelhantes a enzimas.
Os PBNPs funcionam principalmente como miméticos de SOD, miméticos de CAT de alta atividade e
miméticos de POD de baixa atividade quando distribuídos no citosol. Nos lisossomos, os PBNPs, ao
contrário de outras nanopartículas à base de ferro, podem inibir a produção de OH• [31]. Sem a reação
de Fenton, os PBNPs poderiam efetivamente eliminar ROS, como peróxido de hidrogênio, radicais
hidroxila (OH• ) e radicais superóxido (OH• ). Com esses desempenhos únicos, os PBNPs têm grande
potencial como agente antiinflamatório para proteger as células dos danos causados pelas ROS. Para
demonstrar a capacidade de eliminação de ROS de PBNPs, Zhang et al. estabeleceu um modelo de
inflamação in vivo [31]. Camundongos com inflamação induzida por lipoproteínas foram tratados com
PBNPs. Os resultados mostraram que os PBNPs podem proteger os animais do dano oxidativo e
retardar a resposta inflamatória. Zhao et ai. também mostraram a capacidade de eliminação de ROS
de PBNPs quando camundongos com doença inflamatória intestinal foram tratados com PBNPs administrados po
Zhao et ai. desenvolveram um PBA (baseado em Mn) para tratar a doença inflamatória intestinal em camundongos
com colite induzida [60]. O PBA preparado acumulou-se nos locais inflamados após a administração oral . O PBA
melhorou significativamente a colite por meio de um efeito primário na via de sinalização do receptor toll-like, sem
causar efeitos colaterais adversos.
Zhang et ai. estudaram a capacidade do PB oco de sequestrar ROS e espécies reativas de
nitrogênio , como óxido nítrico (NO• ) e peroxinitrito (ONOOÿ), em um modelo de acidente vascular
cerebral isquêmico em ratos [15]. Além de atenuar o estresse oxidativo, o PB também suprimiu a
apoptose e neutralizou a inflamação in vitro e in vivo, contribuindo assim para aumentar a tolerância
cerebral à lesão isquêmica com efeitos colaterais mínimos.
A redução do tamanho dos PBNPs obtidos pelo uso de uma mistura de água e etanol [17] aumentou a
capacidade de quebrar H2O2 para gerar oxigênio, sequestrando radicais livres e protegendo as células da oxidação.
A capacidade de eliminação foi relacionada aos resultados da atividade catalítica da nanozima. Essa atividade
aumentou reduzindo o tamanho das nanopartículas devido ao fato de que a atividade catalítica é dependente do
tamanho. A atividade catalítica de PBNPs emana principalmente da transferência de elétrons entre íons Fe com
diferentes valências [31], e uma vez que esses sítios catalíticos estão situados principalmente no FeNx (x = 4-6
unidades), a redução do tamanho dos resultados PBNPs no aumento de sua área de superfície específica e permite
a maximização dos sítios FeNx expostos.

7. Conclusões e Perspectivas Futuras

PBNPs e seus análogos têm reunido crescente interesse de pesquisa desde sua primeira
descoberta como nanoenzimas há pouco mais de dez anos [25,26] porque exibem propriedades
catalíticas como peroxidase, catalase e superóxido dismutase. Nesta revisão, resumimos
sistematicamente as atividades semelhantes a enzimas e as aplicações catalíticas de PB e
PBA. Em comparação com as enzimas naturais, as PBNPs superam suas principais
desvantagens, como o alto custo de produção e purificação. Além disso, os PBNPs oferecem maior toler
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condições adversas e maior estabilidade. Os PBNPs têm um valor agregado: seus diferentes
estados de oxidação podem ser alterados pela regulação de potenciais externos (PB apresenta
baixos potenciais redox) e este fato é responsável por suas propriedades multicatalíticas.
Dependendo do tipo de atividade semelhante à enzimática, o PB/PBA pode ser usado para
remover o excesso de ROS do corpo para tratar doenças relacionadas a ROS e decompor o
H2O2 em oxigênio para superar a hipóxia de tumores sólidos. No entanto, o mesmo PB/PBA pode
gerar EROs abundantes e essa propriedade serve para a remediação de poluentes ambientais.
Embora grande progresso tenha sido feito, o desenvolvimento de PB/PBA como nanoenzimas
com propriedades desejadas ainda é limitado por alguns desafios, e uma compreensão aprofundada
dos princípios fundamentais dessas nanopartículas como nanoenzimas permanece limitada. Ainda
é necessário definir exatamente a influência do tamanho, como a modificação da superfície afeta
as propriedades semelhantes a enzimas além de atuar como um estabilizador, que é a densidade
e espessura máxima da camada de revestimento para evitar que a interação entre as nanopartículas
e o substrato é mascarado, quais elementos são ótimos para dopar a estrutura química e assim
por diante. Finalmente, apesar da segurança do PB, a preparação de novos análogos, ou novos
nanocompósitos híbridos, deve ser acompanhada de estudos sobre a potencial nanotoxicidade
desses nanossistemas em seres vivos, bem como a toxicidade no meio ambiente.

Contribuições do autor: Conceitualização, redação—preparação do rascunho original JE; redação—revisão e edição, MAB
Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Esta pesquisa não recebeu financiamento externo.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado: Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados: Não aplicável.

Conflitos de Interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesse.

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