UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

EMMANUEL DUARTE BARBOSA

DESCRIÇÃO BIOQUÍMICA QUÂNTICA DO BOLSÃO DE

INTERAÇÃO DO ÍON Zn2+ NA ENZIMA ALAD HUMANA

NATAL-RN
Junho, 2016
 EMMANUEL DUARTE BARBOSA

DESCRIÇÃO BIOQUÍMICA QUÂNTICA DO BOLSÃO DE

INTERAÇÃO DO ÍON Zn2+ NA ENZIMA ALAD HUMANA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Bioquímica da Univer-
sidade Federal do Rio Grande do Norte
como requisito para obtenção do título de
Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Profa Dra Viviane Souza do
Amaral.

Natal-RN
Junho, 2016
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB

Barbosa, Emmanuel Duarte.

Descrição bioquímica quântica do bolsão de interação do ÍON
Zn2+ na enzima ALAD humana / Emmanuel Duarte Barbosa. - Natal,
2016.
55 f.: il.

Orientadora: Profa. Dra. Viviane Souza do Amaral.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande
do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica.

1. Enzima ALAD - Dissertação. 2. Energia de ligação -

Dissertação. 3. MFCC - Dissertação. I. Amaral, Viviane Souza do.
II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 577.15

 RESUMO

A enzima Delta Aminolevulínico Desidratase (ALAD) é uma metaloproteína citosólica

essencial em vários processos biológicos, uma vez que é responsável pelo segundo
passo da catálise enzimática na formação de porfobilinogênio, um precursor dos tetra-
pirrólicos (heme, clorofila). Esta enzima é bastante sensível a metais pesados e tem
sido classicamente usada como um marcador na intoxicação por chumbo. Sua inibi-
ção se dá pela substituição desses metais pesados no sítio de ligação a metais. Na
ALAD humana, o Zinco (Zn2+ ) ocupa funcionalmente este sítio sendo essencial para
a coordenação das cadeias de ácido aminolevulínico durante a catálise enzimática.
Embora muitos ensaios in vitro, in vivo e in sílico já tenham demonstrado a importân-
cia do Zn2+ nesse sítio, não se tinha conhecimento de nenhum estudo baseado em
abordagem quântica com o intuito de elucidar esta interação de forma mais detalhada.
Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar as mutações missense
que acometem o sítio de ligação ao zinco e descrever através de métodos quânticos a
energia de interação entre a enzima e o zinco com maior acurácia utilizando o método
do Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC), quantificando energe-
ticamente os resíduos de aminoácidos posicionados até uma distância de 8,5 Å do
centroide do ligante. Foi identificado as alterações bioquímicas na estrutura monomé-
rica dos mutantes, as quais resultam na diminuição da atividade enzimática. Foram
identificados um total de 30 resíduos com valores energéticos variados que interagem
com o zinco no bolsão de ligação. Aqueles que apresentaram valores significativos
(de atração ou repulsão) e estão relacionados funcionalmente à atividade enzimática
foram: Lis199, Lis252, Arg 209, Arg 174, Cis122, Cis124 e Cis132; e aqueles que de-
monstraram relevância para a permanência do íon no sítio de ligação foram: Asp169,
Gli130, Gli133, Asp120 e Ser168. A partir disso, pôde-se concluir que além dos gru-
pos nucleófilos (grupos tiolatos) dos resíduos Cis122, Cis124 e Cis132, os resíduos
Asp169, Asp120 e Ser168 são fundamentais na composição do bolsão, uma vez que
demonstraram grande quantidade de energia de interação atrativa com o íon Zn2+ .

Palavras-chave: ALAD, Energia de ligação, MFCC, DFT.

 ABSTRACT

The enzyme Delta Aminolevulinic Dehydratase (ALAD) is a cytosolic metalloproteinase

essential in several biological processes since it participates in the second step in
porphobilinogen formation pathway, a tetrapyrrolic precursor of heme and chlorophyll.
This enzyme is very sensitive to heavy metals and has traditionally been used as a bi-
omarker in lead poisoning. Its inhibition occurs when these heavy metals are replaced
inside the metal binding site. In human ALAD, Zinc (Zn2+ ) functionally occupies this site
and it is essential for coordination of two chains of aminolevulinic acid for the enzymatic
catalysis. Although many in vitro, in vivo and in silico works have already demonstrated
the importance of Zn2+ at that site, to the best of our knowledge, there isn’t any studies
on literature based on quantum approach in order to elucidate this interactions in more
details. Therefore, the aim of the present study was to analyse the missense mutations
that affect the zinc binding site and describe through quantum methods the energy in-
teraction between zinc and ALAD with greater accuracy using the method of Molecular
fractionation with conjugated caps (MFCC) by quantifying amino acid residues’ energy
positioned at 8.5 Å of distance with the ligand centroid. It was identified biochemical
changes in the monomeric structure of mutants, which result in decreased enzyme
activity. It were identified a total of 30 residues with a wide range of energy values.
The residues with significant (atractition or repulsion) values and functionally related to
enzymatic activity were: Lys199, Lys252, Cys122, Cys124 and Cys132; and those that
demonstrated relevance to the ion permanence inside the binding site were: Asp169,
Gly130, Gly133, Asp120 and Ser168. Thus, it could be concluded that in addition to
the nucleophilic groups (thiolates groups) from Cys122, Cys124 and Cys132, others
residues such as Asp169, Asp120 and Ser168 are fundamental in the catalytic pocket
composition, since they showed high attractive interaction energy with Zn2+ ion.

Keywords: ALAD, binding energies, MFCC, DFT.

 Lista de figuras

1 Esquema da via de biossíntese do heme. Abreviaturas: ALAS, Ácido

aminolevulínico sintase; PBGD, Porfibilinogênio desaminase; URO3S,
Uroporfirinogênio III sintase; UROD, Uroporfirinogênio descarboxilase;
CPO, Coproporfibirinogênio oxidase; PPO, Proporfibirinogênio oxidase;
FECH, Ferroquelatase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2 Estruturas tridimensionais das conformações octamérica (de alta ati-

vidade) e hexamérica (de baixa atividade) da ALAD humana. a- Dí-
mero octamérico (à esquerda) e estrutura quaternária (à direita) (código
PDB 1E51); b- Dímero hexamérico (à esquerda) e estrutura quaternária
hexamérica (código PDB 1PV8). N e C representam as extremidades
amino e carboxil terminais, respectivamente. Modificado de BREINIG et
al., 2003. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3 Sítios de ligação ao zinco na enzima ALAD. O ZnA, coordenado pela

Histidina 131 e pela cisteína 223 e o ZnB, localizado no sítio ativo coor-
denado pelas cisteínas 122, 124 e 132 e o. Modificado de (JAFFE et al.,
2001) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4 Mecanismo catalítico da enzima ALAD. A ilustração é baseada na es-

trutura dos cristais de leveduras de código PDB 1H7O e 1OHL com
condensação assimétrica de dois ALA (cadeia A em vermelho e cadeia
P em azul) ligados covalentemente a resíduos de lisina (K210 e K263),
formando bases de Schiff. Abaixo, nota-se o zinco (Zn2+ ) coordenado
por três tiolatos (S-) dos resíduos de cisteínas (C133, C135 e C143)
correspondentes às cisteínas (C122, C124 e C134) de mamíferos. Mo-
dificado de ROCHA et al., 2012. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

5 Competição entre o P b2+ e o Zn2+ no sítio ativo da ALAD humana.

Modificado de ROCHA et al., 2012. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

6 Descrição esquemática do método MFCC com a representação dos

quatro momentos da técnica. Modificado de LIMA NETO, 2015. . . . . . 28
7 Alinhamento múltiplo da enzima ALAD (GenBank: P13716) pelo T-cofee
Espresso com organismos de diferentes táxons. Em vermelho, as mu-
tações E89K, C132R e G133R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

8 Caracterização de estruturas cristalográficas. (A) Superposição da en-

zima ALAD humana selvagem (vermelho) e a estrutura mutante E89K
(verde). (B) Superposição da enzima ALAD humana selvagem (verme-
lho) e a estrutura mutante C132R (verde). (C) Superposição da enzima
ALAD humana selvagem (vermelho) e a estrutura mutante G133R (verde) 33

9 Resíduos Pro125, Phe79, Leu150, Met170, Met171, Phe208 e Ala166

que compõem o core hidrofóbico da ALAD humana. . . . . . . . . . . . 35

10 Resíduos Thr127, Ser214 e Tir224 localizados na superfície proteica

em torno do bolsão hidrofóbico de ligação ao íon Zn2+ e resíduo Tir196
localizado no domínio β-barril da ALAD humana. . . . . . . . . . . . . . 36

11 Representação esquemática dos resíduos Arg209, Lis199, Lis252 e Arg174

os quais apresentaram maior energia de repulsão com o Zn2+ . . . . . . 36

12 Energia de interação do painel de BIRD (Bind interaction Residues Dis-

tance) para as constantes dielétricas 4, 10, 20 e 40 com os resíduos
mais relevantes divididos de acordo com a proximidade da região de
interação com o íon Zn2+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

13 Representação esquemática dos resíduos Asp169, Ser168 e Asp120

que apresentaram grande energia de atração com o Zn2+ . . . . . . . . 38

14 Alinhamento da sequência enzima ALAD (GenBank: P13716) pelo T-

cofee Espresso com sequências de organismos de diferentes táxons.
Em amarelo, os resíduos Cis122, Cis124 e Cis132. Em azul, os resíduos
Gli130 e Gli133. Em verde, os resíduos Asp 120, Ser168 e Asp169 que
apresentaram maior energia de interação (atração) com o íon Zn2+ . . . 39
 Lista de tabelas

1 Parâmetros de validação dos modelos baseados na análise estrutural

realizada pelo MolProbity 4.3 e pelo e ModFold 4.0. Em laranja, distan-
tes aos ca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2 Resultados dos preditores de mutação Polyphen 2, Panther, HOPE, e

I-Mutant 3.0 sobre o efeitos das mutações E89K, C132R e G133R na
ALAD humana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3 Influência das substituições na acessibilidade ao solvente e no ponto

isoelétrico das proteínas mutantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

4 Distâncias e energias de interação GGA calculadas com as constantes

=4, =10, =20 e =40 entre os 30 resíduos da região de ligação e o
Zinco. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
 Lista de abreviaturas e siglas

ADP - Porfiria por Deficiência de ALAD

ALA - Ácido aminolevulínico desidratase

ALAD - Ácido aminolevulínico desidratase

ALAS - Ácido aminolevulínico sintase

ASH - Albumina sérica Humana

BIRD - Bind site, interaction energy residue domain

CHARMM - Chemistry at HARrvard Molecular Mechanics

DFT - Density Funcional Theory

ERO - Espécies reativas de oxigênio

FECH - Ferroquelatase

FMT - formetanatehydrochloride

GGA - Generalized Gradient Approximation

IBU - Ibuprofeno

LDA - Local Density Approximation

MFCC - Molecular Fractionation with Conjugate Caps

PBGS - Porfibilinogênio sintase

PBG - Porfibilinogênio

PDB - Protein data bank

PPO - Protoporfirinogênio oxidase

UROD - Uroporfirinogênio descarboxilase

URO3S - Uroporfirinogênio III sintase

Å - Angstrons
 Sumário

1 Introdução 10

1.1 A Enzima Delta Aminolevulinico Desidatrase . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.1.1 Via de biossíntese do heme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.1.2 Características estruturais da forma monomérica e da estrutura

quaternária . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.1.3 Ligação da enzima a íons metálicos . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.1.4 Catálise enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.1.5 Aspectos toxicológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.2 Modelagem computacional como ferramenta de avaliação de processos

biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.2.1 Modelagem por homologia preditores de mutação online . . . . 18

1.2.2 Bioquímica quântica computacional . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.2.3 Teoria do Funcional da Densidade . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2 Objetivos 24

2.1 Objetivo geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.2 Objetivos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3 Metodologia 25

3.1 Modelagem Comparativa e preditores de mutação online . . . . . . . . 25

3.2 Análise quântica computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.1 Otimização de hidrogênios e resíduos incompletos . . . . . . . . 26

 3.2.2 Fracionamento molecular com capas conjugadas (MFCC) - Cál-
culos energéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4 Resultados 30

4.1 Modelagem comparativa e preditores de mutação online . . . . . . . . . 30

4.2 Análise quântica computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5 Discussão 40

5.1 Análise das mutações missense relacionadas ao sítio de ligação ao Zinco 40

5.1.1 Mutação E89K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

5.1.2 Mutação C132R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.1.3 Mutação G133R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

5.2 Análise Quântica Computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

6 Conclusão 47

7 Perspectivas 48

Referências 49
 10

1 Introdução

1.1 A Enzima Delta Aminolevulinico Desidatrase

A Delta aminolevulínico desidratase (ALAD), também conhecida como porfibilino-

gênio sintase (PBGS) é uma metaloproteína bastante conservada possuindo uma am-
pla distribuição na natureza (JAFFE; LAWRENCE, 2012b). Atua no segundo passo da via
de biossíntese do heme, catalisando a condensação assimétrica de duas moléculas
de ácido aminolevulínico (ALA) resultando na formação de uma molécula monopir-
rólica, o porfibilinogênio (PBG). Nas células, os anéis monopirrólicos são estruturas
precursoras importantes para a síntese dos tetrapirrólicos ou porfirina.

A molécula do heme é uma das principais porfirinas, sendo um grupo prostético

de importância funcional para proteínas com papéis celulares centrais, como a he-
moglobina, mioglobina, citocromos, catalase e peroxidase (NORDMANN; PUY, 2002). A
diversidade funcional do heme pode ser explicada pela sua estrutura molecular, a qual
possui múltiplos anéis e ligações duplas intererspaçadas por heteroátomos, os quais
conseguem suprir uma grande gama de níveis redox, necessários para as reações de
transferência de elétrons; além de fornecer um poderoso sítio para quelação de íons
de transição, fazendo com que o poder catalítico dos mesmos seja intensificado ao
ligar-se à porfirina (THUNELL, 2000).

Na espécie humana, a enzima ALAD é codificada por um gene localizado no cro-

mossomo 9q34, que apresenta dois alelos codominantes ALAD1 e ALAD2. A natureza
desse polimorfismo ocorre devido a uma transversão de uma guanina (G) por citosina
(C) no nucleotídeo de posição 177, levando a uma substituição do resíduo Lis59 (na
ALAD1) para Asn59 (na ALAD2). A expressão desses alelos resulta em três formas
diferentes de isoenzimas, designadas ALAD1-1, ALAD1-2 e ALAD2-2. Sendo assim,
os indivíduos ALAD-1/ALAD-2 e ALAD-2/ALAD-2 expressam uma enzima mais eletro-
negativa quando comparada com indivíduos homozigotos ALAD-1/ALAD-1 (ROCHA et
 11

al., 2012; TASMIN et al., 2015). Contudo, diferenças de carga entre as isoenzimas não
influenciam a atividade na síntese de PBG, uma vez que o sítio ativo não é afetado
(JAFFE et al., 2001).

Esta enzima é classicamente conhecida como alvo molecular primário na intoxica-

ção por chumbo, pode-se supor que as variantes naturais ALAD1 e ALAD2 podem ser
influenciadas diferentemente pela ligação a este metal. Alguns estudos relatam os efei-
tos da intoxicação pelo chumbo nos diferentes polimorfismos da enzima e concluem
que indivíduos com a variante ALAD2 apresentam maiores concentrações de chumbo
no sangue em relação aos indivíduos que possuem a variante ALAD1 (MONTENEGRO
et al., 2006; CHIA et al., 2007; ROCHA et al., 2012; TASMIN et al., 2015).

1.1.1 Via de biossíntese do heme

A via de síntese do heme é composta por oito enzimas, altamente conservadas

entre os organismos, sendo realizada nos compartimentos mitocondrial e citosólico,
com uma sequência de reações semelhantes ocorrendo desde bactérias até humanos
(Figura 1) (BESUR et al., 2014; JAFFE, 2000).

Figura 1: Esquema da via de biossíntese do heme. Abreviaturas: ALAS, Ácido aminolevulínico sin-
tase; PBGD, Porfibilinogênio desaminase; URO3S, Uroporfirinogênio III sintase; UROD, Uroporfirino-
gênio descarboxilase; CPO, Coproporfibirinogênio oxidase; PPO, Proporfibirinogênio oxidase; FECH,
Ferroquelatase.
 12

A biossíntese do heme pode ser dividida nos seguintes processos: a formação do

anel pirrólico, a montagem do anel tetrapirrólico, a modificação das cadeias laterais do
anel tetrapirrólico, a oxidação do protoporfirinogênio IX à protoporfirina IX e a inserção
do átomo de F e2+ (AJIOKA; PHILLIPS; KUSHNER, 2006).

O primeiro passo da via constitui a formação da molécula de ácido aminolevulínico

a partir da condensação de glicina e succinil coenzima-A, no interior da mitocôndria.
Os próximos passos utilizam os compartimentos separadamente para catalisar a te-
tramerização do porfobilinogênio até a molécula cíclica de protoporfirina IX, à qual é
adicionado o átomo de ferro em seu estado ferroso, na etapa final de síntese, for-
mando assim, o heme (KAUPPINEN, 2005). Apesar de os mamíferos utilizarem succinil
CoA e glicina no primeiro passo da via, a maior parte dos organismos, como as plan-
tas, utiliza como substrato o glutamato para a síntese inicial do ácido aminolevulínico
(THUNELL, 2000).

Esta via possui algumas ramificações que em certos organismos podem dar ori-
gem a moléculas diferentes do produto final, o heme. Na quinta etapa da via, pode
haver a formação de corrinas em organismos que realizam a síntese de cobalaminas
pela metilação e rearranjo de oito grupos carboxílicos de porfirinogênios. Outra ramifi-
cação importante ocorre no último passo da via, no qual a recém-formada molécula de
porfirina pode atrair diferentes íons de transição divalentes: a incorporação do mag-
nésio gera a molécula de clorofila e a incorporação do ferro gera o heme (THUNELL,
2000).

1.1.2 Características estruturais da forma monomérica e da estru-

tura quaternária

A enzima ALAD, em sua completa atividade, aparece sob a forma de um homo-

octâmero composto de quatro dímeros constituídos de monômeros da mesma pro-
teína (JAFFE; LAWRENCE, 2012a). Apesar de possuir uma ampla distribuição na natu-
reza estando presente em espécies evolutivamente distantes, a enzima ALAD é alta-
mente conservada tanto em sequência aminoacídica quanto em estrutura tridimensio-
nal. (JAFFE, 2004).

A sequência de cada multímero da enzima humana é composta por 330 aminoáci-

dos, que fazem parte de dois domínios principais: o domínio αβ-barril , com aproxima-
damente 300 aminoácidos onde está localizado o sítio ativo da enzima, e o domínio do
 13

braço N-terminal, com cerca de 25 aminoácidos, o qual está envolvido com interações
multiméricas (BREINIG et al., 2003; JAFFE et al., 2001). O sítio ativo da ALAD humana
compreende os 52 aminoácidos que se localizam a 8 angstrons (Å) da molécula de
porfobilinogênio, sendo estes invariantes ou altamente conservados entre os organis-
mos (JAFFE, 2003b).

A regulação alostérica da enzima está relacionada a transição entre as formas

ativa e inativa que, por sua vez, envolve a mudança conformacional entre os domínios
de cada monômero de modo que a mesma pode afetar o tráfego de ligantes para den-
tro ou para fora do sítio ativo. Sendo assim, quanto a sua estrutura quaternária, pode
comportar-se como um octâmero, apresentando maior atividade, ou um hexâmero,
apresentando menor atividade (Figura 2) (JAFFE; LAWRENCE, 2012a).

gi

Figura 2: Estruturas tridimensionais das conformações octamérica (de alta atividade) e hexamérica
(de baixa atividade) da ALAD humana. a- Dímero octamérico (à esquerda) e estrutura quaternária (à
direita) (código PDB 1E51); b- Dímero hexamérico (à esquerda) e estrutura quaternária hexamérica
(código PDB 1PV8). N e C representam as extremidades amino e carboxil terminais, respectivamente.
Modificado de BREINIG et al., 2003.

O fenômeno é representado pelo equilíbrio 8mer ⇐⇒ 2mer ⇐⇒ 2mer* ⇐⇒

6mer*, o qual mostra a interconversão entre as duas unidades multiméricas: o oc-
 14

tâmero é formado por quatro dímeros que podem sofrer uma dissociação; eventual-
mente, as unidades dos dímeros podem sofrer uma mudança conformacional, a partir
da reorientação do domínio αβ-barril em relação ao braço N-terminal, originando um
dímero com uma conformação diferente, podendo este se associar para formar o he-
xâmero, que possui menor atividade. Em pH fisiológico, a forma octamérica da enzima
selvagem é predominante no equilíbrio (SELWOOD et al., 2008).

A reorientação dos domínios não pode ocorrer enquanto a enzima está em forma
de octâmero ou hexâmero devido a impedimentos estéricos e, por isso, a interconver-
são entre estas duas formas deve requerer a dissociação prévia dos dímeros (JAFFE,
2005; JAFFE; LAWRENCE, 2012a). Os estudos realizados sobre esta enzima resulta-
ram em uma nova abordagem sobre a alosteria enzimática e introduziram o termo
”morpheein” para referir-se às proteínas homo-oligoméricas que existem em um equilí-
brio de isoformas cujas funcionalidades e estruturas quaternárias são distintas (SELWOOD
et al., 2008). Através desse mecanismo, um confôrmero da proteína - que no caso da
ALAD, é representado pelo dímero - permite sua montagem em um tipo particular de
multímero, enquanto que um confôrmero alternativo da proteína permite sua monta-
gem em outro multímero com diferentes propriedades (JAFFE; LAWRENCE, 2012a). O
termo ”morpheein” é uma contração de duas palavras do inglês: ”protein” e o verbo
”to morph”, referindo-se, portanto, às proteínas que apresentam mudanças na sua
estrutura quaternária (JAFFE, 2005).

1.1.3 Ligação da enzima a íons metálicos

Por se tratar de uma metaloproteína, enzima ALAD possui sítios de ligações a íons
metálicos os quais residem no sítio ativo ou no seu sítio alostérico. Os íons utilizados
em ambos os sítios sofrem variações entre enzimas de diferentes organismos, de
modo que a região do sítio ativo pode ligar-se a átomos de zinco ou magnésio e/ou
potássio (ROCHA et al., 2012). Quanto a sua função, a enzima pode ser classificada
em dois grupos: aquelas que necessitam de zinco e aquelas que não requerem este
íon para a catálise, propriedades estas determinadas pela composição da sequência
na região de ligação ao metal do sítio ativo (JAFFE, 2003a). De forma geral, enzimas
ricas em resíduos de histidina e cisteína nesta região ligam-se ao zinco, enquanto
que aquelas que possuem resíduos de ácido aspártico ligam-se ao magnésio (JAFFE,
2000).

A enzima humana não possui um sítio de regulação alostérico mediado por íons,
 15

apresentando apenas átomos de zinco no sítio ativo, os quais participam como me-
tais de coordenação na catálise (JAFFE, 2003a). A enzima de mamíferos pode ser
purificada contendo oito átomos de zinco ao total, sendo que apenas quatro deles pa-
recem ser necessários para a reação catalítica e aparentam estar fortemente ligados
à proteína (JAFFE, 2000). Sua estrutura octamérica abriga quatro regiões de sítio ativo
funcionais, cada uma das quais contendo duas regiões de ligação ao zinco, chamadas
de ZnA e ZnB (ROCHA et al., 2012).

O sítio ZnA, na enzima humana, consiste nos aminoácidos His131 e Cis223, en-
quanto que o sítio ZnB compreende o grupo de cisteínas Cis-122, Cis-124 e Cis-132,
este último localizado próximo ao aminoácido lisina do sítio ativo (JAFFE et al., 2001). A
natureza ubíqua do zinco e suas propriedades de coordenação contribuem para seu
uso em sítios ativos de várias enzimas, já que possui uma boa flexibilidade geométrica
para as reações catalisadas por elas (TIAN; ERDTMAN; ERIKSSON, 2012).

Figura 3: Sítios de ligação ao zinco na enzima ALAD. O ZnA, coordenado pela Histidina 131 e pela
cisteína 223 e o ZnB, localizado no sítio ativo coordenado pelas cisteínas 122, 124 e 132 e o. Modificado
de (JAFFE et al., 2001)
 16

1.1.4 Catálise enzimática

Os processos físico-químicos envolvendo a síntese de PBG pela ALAD tem sido

bastante estudados por variadas metodologias computacionais e em diferentes cris-
talografias (JAFFE et al., 2001; BREINIG et al., 2003; JAFFE, 2004) e, mais recentemente
elucidados por uma abordagem quântica in sílico (ERDTMAN et al., 2010; TIAN; ERDTMAN;
ERIKSSON, 2012).

Figura 4: Mecanismo catalítico da enzima ALAD. A ilustração é baseada na estrutura dos cristais de
leveduras de código PDB 1H7O e 1OHL com condensação assimétrica de dois ALA (cadeia A em
vermelho e cadeia P em azul) ligados covalentemente a resíduos de lisina (K210 e K263), formando
bases de Schiff. Abaixo, nota-se o zinco (Zn2+ ) coordenado por três tiolatos (S-) dos resíduos de
cisteínas (C133, C135 e C143) correspondentes às cisteínas (C122, C124 e C134) de mamíferos.
Modificado de ROCHA et al., 2012.

Em todas as abordagens feitas pelos pesquisadores houve um consenso de que

os grupamentos amino das lisinas do sítio ativo (Lis252 e Lis199 na ALAD humana)
formam uma base de Schiff (-CH=N-) com o carbono 4 (C4) das moléculas de ALA,
originando respectivamente a cadeia lateral P (propiônica) e cadeia lateral A do PBG.
Concomitantemente, o grupamento amino da cadeia A é coordenado pelo Zn2+ e
promove a condensação assimétrica entre as duas moléculas, seguida de liberação
de duas moléculas de água. O zinco exerce um papel de coordenação importante no
reconhecimento do grupo amino da cadeia lateral A para posterior formação do PBG
(Figura 3) (ERDTMAN et al., 2010).
 17

1.1.5 Aspectos toxicológicos

A inibição da ALAD pode prejudicar a rota biossintética do heme, resultando em

consequências patológicas inespecíficas, uma vez que a produção exagerada de es-
pécies reativas de oxigênio pode atuar nos mais diferentes órgãos e compartimentos
celulares dos organismos nos quais são gerados. Além da insuficiente produção de
heme (que pode levar a uma doença conhecida por porfiria), a inibição da ALAD pode
resultar no acúmulo de ALA no sangue, levando à superprodução de espécies reativas
de oxigênio (ERO) (LAYER et al., 2010; PATRICK, 2006; SARAIVA et al., 2012).

As propriedades de ligação a metais da ALAD são importantes de ser analisadas

devido a sua suscetibilidade à ligação ao chumbo (P b2+ ), tornando a ALAD um biomar-
cador de intoxicação ambiental e ocupacional por este elemento químico (JAFFE et al.,
2001; SARAIVA et al., 2012). O chumbo consegue inibir a atividade enzimática da ALAD
por deslocar a ligação dos íons de zinco da enzima. Segundo ROCHA et al., (2012),
este deslocamento é provocado pela maior afinidade do chumbo no sítio de ligação
que compreende a três tiolatos (S-) dos resíduos de cisteínas (122,124 e 132) natural-
mente ocupado pelo Zinco, este posicionado em uma formação geométrica tetraédrica
propícia ao seu papel de coordenação na atividade catalítica da enzima (Figura 4).

A dosagem da atividade da enzima ALAD tem sido utilizada há muito tempo como
um marcador de exposição ao chumbo (PATRICK, 2006; ZHAO et al., 2014). Além disso,
indivíduos portadores de alelo ALAD-2 parecem apresentar um maior conteúdo de
Pb no organismo e maior risco de intoxicação pelo mesmo, possivelmente devido a
uma maior afinidade da enzima determinada por este alelo. Além do chumbo, outros
metais (mercúrio, cádmio, berílio) e espécies reativas são capazes de inibir a atividade
da enzima ALAD (Al Bakheet et al., 2013; ZHAO et al., 2014). A atividade da ALAD de
mamíferos é inibida por moléculas quelantes como EDTA e a 1,10 -fenantrolina, e esta
inibição pode ser revertida pela adição de zinco demonstrando que a ALAD precisa do
Zn como metal de coordenação para realizar sua catálise (PATRICK, 2006).
 18

Figura 5: Competição entre o P b2+ e o Zn2+ no sítio ativo da ALAD humana. Modificado de ROCHA et
al., 2012.

1.2 Modelagem computacional como ferramenta de ava-

liação de processos biológicos

1.2.1 Modelagem por homologia preditores de mutação online

A determinação experimental da estrutura de proteínas ainda é um procedimento

muito dispendioso e com bastante limitações técnicas, seja através de cristalografia
por raios X ou por espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RAMACHAN-
DRAN; DOKHOLYAN, 2012). A construção de modelos computacionais pode ser útil para
o estudo de proteínas ou outras moléculas as quais não possuem estrutura resolvida,
permitindo assim inferências sobre as influências das mutações na sua estrutura e/ou
função. Uma das ferramentas usadas com tal finalidade é a modelagem comparativa
ou modelagem por homologia. Nela, a estrutura proteica é construída combinando
a sequência da proteína de interesse, chamada de query, com uma proteína evo-
lutivamente relacionada que possua uma estrutura já resolvida experimentalmente,
chamada de template (ROY; ZHANG, 2012). Assim, esta técnica explora o fato de que
proteínas com sequências evolutivamente similares apresentam características estru-
 19

turais semelhantes, permitindo a predição da estrutura de uma proteína de interesse

(RAMACHANDRAN; DOKHOLYAN, 2012). Além disso, há algumas ferramentas disponíveis
online com metodologias próprias que possuem a finalidade de ajudar na predição da
influência de mutações na estrutura, função, característica s físico-químicas, intera-
ções com outras moléculas e outras particularidades, permitindo uma melhor análise
do impacto das mesmas sobre os sistemas biológicos.

1.2.2 Bioquímica quântica computacional

Descrita como um conjunto de técnicas utilizadas na investigação de problemas bi-

oquímicos in silico utilizando uma abordagem refinada, a bioquímica quântica compu-
tacional é um importante método para o estudo de materiais, nanomateriais, biofísica e
outros campos da ciência relacionados à investigação das estruturas eletrônicas con-
formacionais dos compostos (ORTOLAN, 2014). Tem-se encontrado vários trabalhos na
literatura envolvendo cálculos computacionais na investigação de problemas biológi-
cos, desde o estudo de geometrias moleculares a propriedades físicas de substâncias
(ORTOLAN, 2014; JING; HAN, 2010; DIVNE et al., 1994; MACKERELL; FEIG; BROOKS, 2004).

Com o desenvolvimento científico observado ao longo do século XX, a evolução

de áreas como a medicina, a bioquímica, a farmacologia e a física quântica puderam
propiciar uma visão mais íntima da natureza se estendendo a minuciosos processos
moleculares. Isto só foi possível devido ao acelerado desenvolvimento computacional
e à construção de hardwares e softwares eficientemente avançados, permitindo que
outros campos da ciência também pudessem ser agraciados com estas ferramentas
no desenvolvimento dos seus estudos (ATKINS; PAULA; FRIEDMAN, 2009).

Neste sentido, observa-se que a modelagem computacional também pode avaliar

potenciais toxinas em sistemas biológicos auxiliando na dedução de vias metabólicas
de toxicidade (SUN; YOST, 2008). Em estudos de toxicologia in silico, a abordagem é
essencial para compreender os mecanismos de interação entre agentes tóxicos e os
alvos importantes (MA et al., 2011).

O método a ser escolhido na utilização de ferramentas da biologia computacional

dependerá da complexidade do sistema, do tipo de informação que se deseja obter e
da robustez computacional disponível. Por incluírem a informação eletrônica em seus
cálculos, os métodos quânticos possuem capacidade de apresentar grande precisão
em seus resultados e tem sido de grande importância para o desenvolvimento in silico
 20

de fármacos (CHO et al., 2009). Este método utiliza física quântica para calcular as
propriedades de uma molécula considerando as interações entre elétrons e o núcleo
de cada átomo com a aplicação da equação de Schrödinger, Ĥψ = Eψ , em que E
é a energia eletrônica e ψ é a função de onda multi-eletrônica, que é a função das
coordenadas de todos os elétrons e do núcleo (ATKINS; JONES, 2012).

Por se tratar de uma análise computacional, os cálculos envolvendo métodos quân-

ticos possuem maior acurácia e são mais lentos computacionalmente, o que os tornam
mais adequados para sistemas moleculares menores como o estudo de interações en-
tre ligantes e macromoléculas (receptores proteicos, enzimas, DNA, canais iônicos).
Sendo recomendado métodos clássicos para sistemas mais robustos (na ordem de
500 a 1.000 átomos). (KITCHEN et al., 2004; MORGON; COUTINHO, 2007).

Existem centenas de estudos desenvolvidos totalmente por métodos quânticos,

por exemplo, os extensos trabalhos teórico sobre as enzimas do citocromo P450 por
Shaik e colaboradores em (2005) e Friesner e colaboradores em (2002), tornando
notável que essas abordagens em pequenos sistemas é bastante útil no estudo de
mescanismos de metaloproteinas. Dentre os métodos mais utilizados e recomendados
para estudar as interações entre ligantes e proteínas dentro da bioquímica quântica
computacional, estão os métodos baseados na teoria do funcional da densidade (DFT
- do inglês, Density Functinal Theory ) que é capaz de realizar cálculos precisos em
grandes moléculas com maior facilidade (ORTOLAN, 2014).

1.2.3 Teoria do Funcional da Densidade

A teoria do funcional da densidade é uma das mais conceituadas em cálculos de

primeiros princípios para a descrição e entendimento das propriedades dos materiais
em seu estado fundamental, sendo ao longo dos últimos 20 anos uma das ferramen-
tas mais utilizadas na investigação e solução de problemas nas áreas de atuação da
química (BURKE, 2012).

O embasamento inicial dessa teoria foi proposto em 1928 por Llewellyn Thomas e
Enrico Fermi. Os dois pesquisadores, trabalhando de forma independente, estudaram
em seus trabalhos um gás de elétrons interagentes e empregaram um modelo esta-
tístico para aproximar a distribuição dos elétrons nos átomos, o qual ficou conhecido
como modelo de Thomas-Fermi, que posteriormente foi acrescido do termo da energia
de troca por Dirac (DIRAC, 1928).
 21

Embora a origem da DFT remonta-se aos trabalhos de Thomas, Fermi e Dirac,

essa teoria só ganhou grande impulso após a publicação de dois teoremas, os quais
afirmavam que, através do cálculo do funcional da densidade para um sistema de
elétrons no estado fundamental interagindo com um potencial externo seria possí-
vel encontrar a energia deste estado. Tais teoremas foram pubicados em 1964 pelo
norte-americano Walter Kohn juntamente ao seu aluno Pierre Hohenberg, feito que
rendeu-lhes o prêmio Nobel de Química de 1998 (KOHN, 1999). Neste trabalho é de-
monstrado que a partir da densidade eletrônica do sistema no estado fundamental é
possível obter a energia de maneira exata. Contudo, ainda não era possível determi-
nar a densidade eletrônica na prática, o que foi conseguido no ano posterior com o
auxílio de Lu Sham (KOHN; SHAM, 1965).

Em 1965, W. Kohn e seu aluno doutorando, Lu J. Sham, desenvolveram as equa-

ções para obter a densidade eletrônica do estado fundamental de um sistema, que
ficaram conhecidas como as equações de Kohn-Sham, na qual o problema dos mui-
tos corpos interagentes foi substituído por um problema auxiliar de partículas inde-
pendentes (KOHN; SHAM, 1965). Na prática, estas equações são fundamentais e têm
permitido gerar formulações aproximadas com notável sucesso (GRIMME, 2006; ZHAO;
TRUHLAR, 2006). A DFT é, em princípio, coerente, mas quando aplicada para sistemas
reais, certas aproximações devem ser usadas para o potencial de troca-correlação,
uma vez que esse não é conhecido, apesar de sabermos que se trata simplesmente
de um funcional da densidade eletrônica.

As duas principais aproximações utilizadas na construção dos funcionais de troca-

correlação são as aproximações de densidade local (LDA - do inglês, Local Density
Approximation) e a de gradiente generalizado (GGA - do inglês, Generalized Gradient
Approximation).

Na aproximação LDA, o funcional da energia de troca e correlação depende pu-

ramente densidade da eletrônica local. Assim, ela é exata quando sistemas possuem
densidade eletrônica uniforme. Portanto, espera-se que ela descreva bem os sistemas
em que a densidade eletrônica varie lentamente com a posição. Contudo, métodos ba-
seados em LDA não oferecem a precisão desejada em sistemas que apresentam ino-
mogeneidade significativa na densidade eletrônica, levando a erros não sistemáticos.
Um avanço no sentido de resolver essas pendências consiste em introduzir a depen-
dência com o gradiente da densidade na expressão do funcional de troca-correlação
(GGA).
 22

A aproximação GGA é um aperfeiçoamento da LDA. Nessa aproximação o funcio-

nal da energia de troca e correlação de cada célula não depende só da densidade ele-
trônica local, mas também do gradiente da densidade eletrônica das células vizinhas.
Além disso, essa aproximação pode ser de dois tipos: semi-empírica e não-empírica
(ou ab initio) (PERDEW; BURKE; ERNZERHOF, 1996).

Por meio de muitos resultados obtidos com a LDA e a GGA podem-se tirar algumas
comparações (PERDEW; BURKE; ERNZERHOF, 1996):

• LDA

1. A energia total de superfícies metálicas é menor que a experimental;

2. A energia de troca é subestimada entre 15% a 20% e a de correlação pode

ser superestimada em até 100%;

3. Quase todos íons negativos leves mostram-se instáveis;

4. Nos óxidos de metais de transição, os gaps de energia são da ordem de

100% menores em relação aos resultados experimentais.

• GGA

1. Melhoram os resultados para átomos leves, bem como seus compostos;

2. As propriedades dos metais de transição com elétrons 3d são aprimora-

das;

3. Nos óxidos de metais de transição, a LDA prediz comportamento metálico,

enquanto o GGA, em alguns casos prediz um estado fundamental isolante. Mas,
em geral, as energias dos gaps são subestimadas em relação aos resultados
experimentais.

No entanto, entre as aproximações LDA e GGA, não tem como dizer qual é a me-
lhor, pois cada uma tem suas particularidades dependentes do problema que será
estudado. Mais características dessas aproximações podem ser consultadas nas re-
ferências (GIESE; YORK, 2010)e (LEE; MARTIN, 1997).

Vários ensaios utilizando diferentes abordagens envolvendo a enzima ALAD hu-

mana demonstraram a importância funcional do zinco como metal de coordenação
durante a atividade catalítica, assim como seu posicionamento coordenado pelos gru-
pos tiolátos (S-) da cisteínas (122,124 e 132). Todavia, segundo revisão feita para este
 23

trabalho, essas interações do zinco com os resíduos do bolsão da ALAD ainda não fo-
ram analisadas com maior precisão energética por meio de uma descrição molecular
quântica. Uma investigação utilizando esta metodologia seria essencial para caracte-
rizar outros resíduos, além das clássicas cisteínas já identificadas, que formam esse
bolsão de ligação ao sítio, como resíduos carregados, os quais podem representar um
ponto-chave na descrição energética do sistema zinco-ALAD.
 24

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Analisar as mutações missense relacionadas ao sítio de ligação ao zinco e des-

crever energeticamente as interações energéticas entre o zinco e os resíduos que
compõem o bolsão do sítio de ligação a metais da ALAD humana.

2.2 Objetivos específicos

• Realizar uma análise bioquímica estrutural e funcional das mutações missense

que acometem o sítio de ligação ao zinco até então relatadas nesta enzima.

• Analisar filogeneticamente a conservação desses sítios acometidos pelas muta-

ções missense.

• Quantificar, por meio de cálculos computacionais, as energias individuais de

cada aminoácido em interação com o Zinco.

• Comparar os valores energéticos encontrados neste estudo com os dados expe-

rimentais de relevância para cada aminoácido e para a resposta biológica.

• Analisar filogeneticamente os resíduos que demonstraram maior representativi-

dade energética no sítio de ligação ao Zinco.
 25

3 Metodologia

3.1 Modelagem Comparativa e preditores de mutação

online

Para a avaliação da influência das mutações relacionadas ao sítio de ligação ao

zinco, realizamos a construção de modelos das diferentes proteínas mutantes da
ALAD baseados nas estruturas resolvidas da enzima humana ALAD humana (PDB
1E51) e da levedura Saccharomyces cerevisiae (PDB 1H7N). E para ajudar na com-
preensão de como as mutações da enzima ALAD podem alterar sua estrutura e fun-
ção, submetemos a sequência das proteínas mutantes em programas de predição
online.

As mutações missense estudadas nesse trabalho (E89K, C132R e G133R), fo-

ram selecionadas após uma revisão da literatura e por meio de bancos de dados, tais
como o OMIM (MCKUSICK, 2007) e o Uniprot (CONSORTIUM et al., 2014). A sequência
da proteína selvagem, com 330 aminoácidos, foi obtida através do banco de dados
Uniprot, cuja entrada neste é P13716 (HEM2_HUMAN). Para a obtenção das estrutu-
ras resolvidas da enzima, foi realizado um pBLAST contra o banco de dados Protein
Data Bank (BERMAN et al., 2007), obtendo-se as estruturas 1E51, a qual corresponde à
enzima humana, e a estrutura 1H7N, referente à enzima de levedura (Saccharomyces
cerevisiae), cuja identidade de sequência corresponde a 53% em relação à enzima hu-
mana, sendo ainda válida para a construção de modelos por homologia (ROY; ZHANG,
2012). As sequências (.fasta) das proteínas mutantes foram editadas manualmente e,
com base nelas, foram construidos 50 modelos de cada sequência, incluindo a pro-
teína selvagem, por meio de modelagem comparativa utilizando o programa Modeller
9.10 (ŠALI; BLUNDELL, 1993).

A validação dos modelos foi realizada baseada nos resultados do avaliador Mol-
Probity 4.3 (CHEN et al., 2010) e ModFold 4.0 (MCGUFFIN; BUENAVISTA; ROCHE, 2013).
 26

A avaliação da patogenicidade causada pelas mutações e alterações bioquímicas na

estrutura de cada enzima mutante foi feita pelos seguintes preditores online: HOPE
(VENSELAAR et al., 2010), PolyPhen-2 (ADZHUBEI et al., 2010), SDM/Mordred (WORTH;
PREISSNER; BLUNDELL, ), I-Mutant 2.0 (CAPRIOTTI; FARISELLI; CASADIO, 2005) e Panther
10.0 (THOMAS et al., 2003). A predição da acessibilidade ao solvente dos aminoáci-
dos nas posições acometidas pelas mutações foi realizada pelo SDM/Mordred e ASA-
view (AHMAD et al., 2004) e a avaliação do ponto isoelétrico das proteínas mutantes
foi realizada pelo ProtParam (GASTEIGER et al., 2005). As imagens dos modelos mole-
culares e as análises das estruturas tridimensionais realizadas neste trabalho foram
obtidas por meio do programa USCF Chimera 1.10.2 (PETTERSEN et al., 2004). A ca-
racterização da estrutura secundária da enzima humana foi analisada pelo servidor
PDBsum. Para avaliar a conservação e importância das regiões mutantes, foi feito um
alinhamento múltiplo utilizando o programa T-Coffee Espresso(NOTREDAME; HIGGINS;
HERINGA, 2000), na modalidade (PSI-42 Coffee). Foram escolhidos nove organismos
de diferentes táxons para este alinhamento com a sequência da enzima ALAD humana
(GenBank: P13716):, os quais foram Macaca fascicularis (GenBank:Q60HH9), Pongo
abelii (GenBank: Q5R971), Mus musculus (GenBank: P10818), Bos taurus (Gen-
Bank: Q58DK5), Gallus gallus (Genbank: NM001291406.1), Xenopus laevis (Gen-
bank: Q6GN55), Salmo salar (GenBank: B5XEM0) e Danio rerio (GenBank: Q568L9).

3.2 Análise quântica computacional

Os dados cristalográficos da Enzima Delta aminolevulínico desidratase humana

e o íon zinco (Zn2+ ) utilizados como input neste trabalho foram obtidos por meio do
site do RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/), código 1E51, Cadeia A.
Segundo Jaffe e colaboradores (2001), o pH ótimo para a atividade desta enzima é
entre 6,8 e 7,3. Como os valores de pKa podem ser modificados por efeitos locais
do entorno protéico, uma atribuição rigorosa dos estados de protonação de todos os
resíduos a um pH=7 foi realizada recalculando os valores padrões de pKa tituláveis
dos aminoácidos, utilizando o programa propKa (OLSSON et al., 2011).

3.2.1 Otimização de hidrogênios e resíduos incompletos

Estruturas obtidas por análises cristalográficas constantemente são observadas

com a ausência dos átomos de hidrogênio, acarretada por sua grande mobilidade e
 27

pequeno raio atômico. Por este motivo, eles foram adicionados em suas devidas po-
sições, completando a valência de outros átomos quando se fez necessário. Foram
observados também, a ausência de dois resíduos de aminoácidos na estrutura crista-
lográfica como também erros estruturais, na qual átomos de alguns aminoácidos não
estavam presentes. Foram adicionados os resíduos Glu137 e Asn138 na estrutura, as-
sim como os átomos ausentes foram adicionados e mantidos livres. Todos os átomos
pesados (não-hidrogênio) foram fixados, exceto os adicionados posteriormente.

Em seguida, sistema foi submetido a uma otimização clássica para o ajuste dos
átomos livres, permitindo uma melhor descrição de ligações não covalentes, como as
ligações de hidrogênio. Esta otimização foi realizada sob os parâmetros de cálculo do
campo de força CHARMm (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics), sendo este
parametrizado para todos os átomos, porém com maior especialização para moléculas
orgânicas em geral (MOMANY; RONE, 1992).

3.2.2 Fracionamento molecular com capas conjugadas (MFCC) -

Cálculos energéticos

O Fracionamento Molecular com Capas Conjugadas (MFCC - do inglês, Molecular

Fractionation with Conjugate Caps) originalmente proposto por Zhang e Zhang (2003)
foi adotado para realizar a descrição do sistema zinco-ALAD (Zn-ALAD) a nível quân-
tico. Esta técnica de fracionamento molecular visa a diminuição do tempo computacio-
nal sem perda na acurácia durante a aplicação de métodos precisos que possibilitou a
realização de vários estudos, como por exemplo, quando Lima Neto e colaboradores
em (2015) diferenciaram energeticamente os níveis de ativação nos receptores AMPA
acarretado por agonistas parciais wilardina, como também, quando Ourique e cola-
boradores em (2016) estudaram a energia de interação entre um serina-proteinase
(NS2B-N53) do vírus da dengue (DENV) e o inibidor (BZ-nKRR-H), representando
um passo fundamental na concepção e desenvolvimento de medicamentos antivirais
da dengue, e quando Mota e colaboradores em (2016) descreveram detalhadamente
as interações dos moduladores (4-hidroxitamoxifeno (OHT) e raloxifeno (RAL)) com
o receptor de estrógeno α (ERα) . (BARROSO-NETO et al., 2012; Lima Neto et al., 2015;
OURIQUES et al., 2016; MOTA et al., 2016).

Para a realização dos cálculos energéticos, foi utilizado o esquema do MFCC. O

MFCC se baseia no fracionamento do sistema estudado em pequenos fragmentos
(Ri ) que, posteriormente, passam por um cálculo quântico para a obtenção de suas
 28

propriedades. Com a quebra da ligação covalente que une os fragmentos, as regiões

C- e N- terminal de cada fragmento tornam-se carregadas. Para uma melhor descrição
do sistema, capas são adicionadas anterior e posteriormente ao resíduo (C −i e C i ) que
completa a valência do fragmento. A energia de interação entre o zinco e os resíduos
da ALAD EI(Zn-Ri ) foram obtidos executando o seguinte esquema:

Figura 6: Descrição esquemática do método MFCC com a representação dos quatro momentos da
técnica. Modificado de LIMA NETO, 2015.

No primeiro momento, o sistema (C 1−i Ri C 1+i ) é separado da proteína, e o íon

Zn2+ é adicionado, finalizando o primeiro momento com o cálculo da energia do sis-
tema (Zn + C 1−i Ri C 1+i ). No segundo momento, o ligante é retirado do cálculo, es-
tando somente as capas e o resíduo principal (C 1−i Ri C 1+i ). Posteriormente, o íon é
reintegrado ao sistema e o resíduo em estudo é retirado, resultando na interação do
ligante com as capas (Zn + C 1−i C 1+i ). Ao final, somente a energia das capas é obtida
(C 1−i C 1+i ) (Figura 6).

A partir dessas estruturas fragmentadas, a energia de interação entre o ligante e

os fragmentos individuais, EI(Zn − Ri ), foi calculada de acordo com a equação:
 29

EI(Zn−Ri ) = E(Zn+C 1−i Ri C 1+i )−E(C 1−i Ri C 1+i )−E(Zn+C 1−i C 1+i )+E(C 1−i C 1+i )
(3.1)

Os resíduos de aminoácidos funcionais classicamente conhecidos na literatura, e

os resíduos que obtiveram altos valores energéticos (atração ou repulsão) com o íon
Zn2+ , apresentam-se inclusos até o raio de 8,5 Å.

Por se tratar de uma análise computacional de um sistema molecular pequeno, os

cálculos envolvendo métodos quânticos possuem maior acurácia e são mais lentos
computacionalmente comparado a análises por métodos clássicos, sendo este reco-
mendado para sistemas maiores comgrande número de átomos (KITCHEN et al., 2004;
MORGON; COUTINHO, 2007). Sendo assim, os cálculos energéticos de cada resíduo fo-
ram realizados dentro do formalismo da Teoria do Funcional da Densidade (DFT ), uti-
lizando a Aproximação de Gradiente Generalizado (GGA)(PERDEW; WANG, 1992). Os
cálculos para obtenção das superfícies de potencial eletrostático do ligante (zinco),
assim como do ligante com os resíduos, foram obtidos utilizando o funcional M062X,
que oferece grande velocidade sem perder precisão nos cálculos. (ZHAO; TRUHLAR,
2008). Para a expansão dos orbitais eletrônicos de Kohn-Sham foi utilizado o con-
junto de base LanL2DZ, que possui um amplo alcance e consegue calcular sistemas
que contenham tanto átomos de baixo peso molecular quanto átomos que possuem
núcleos maiores (HAY; WADT, 1985), considerando que posteriormente será realizada
uma diferenciação energética entre os sistemas Zinco-ALAD e Chumbo-ALAD neste
mesmo sítio.

As constantes dielétricas são importantes no estudo da interação entre proteínas e

ligantes especialmente para a descrição das forças eletrostáticas (DANTAS et al., 2015).
Todos os cálculos de interação energética para o sistema Zinco-ALAD foram realiza-
dos utilizando constantes dielétricas nos valores de 4, 10, 20 e 40 ( = 4,  = 10,  = 20
e  = 40, respectivamente), valores utilizados em outras simulações que objetivaram
avaliar a permissibilidade energética individual de cada resíduo de aminoácido, por
exemplo, quando Martins e colaboradores em (2016) avaliaram a inibição da atividade
catalítica da enzima Lacase por formetanatohidroclorídrico (FMT) e quando Dantas e
colaboradores em (2015) investigaram as interações energéticas do ibuprofeno (IBU)
à albummina sérica humana (ASH). Para este trabalho foi aplicado o modelo de solva-
tação C-PCM (Polarizable continuum model)(COSSI et al., 2003).
 30

4 Resultados

4.1 Modelagem comparativa e preditores de mutação

online

As mutações missense que acometem o sítio de ligação ao zinco até então repor-
tadas na literatura foram: No sítio 132, uma substituição da Cisteína por uma Arginina
(C132R); No sítio 133, uma substituição da Glicina por uma Arginina (G133R) e no
sítio 89, uma substituição do resíduo Aspartato por uma Lisina (E89K).

Figura 7: Alinhamento múltiplo da enzima ALAD (GenBank: P13716) pelo T-cofee Espresso com orga-
nismos de diferentes táxons. Em vermelho, as mutações E89K, C132R e G133R.

O Alinhamento de sequências múltiplas da proteína ALAD humana com sequên-

cias de diferentes organismos monstra o grau de conservação dos sítios acometidos
pelas mutações localizadas no sítio ativo (figura 07).

A validação dos modelos das enzimas mutantes foi realizada objetivando seleci-
 31

onar as melhores estruturas dentre as cinquenta modeladas para cada mutação. O

perfil validação estrutural dos melhores modelos estão descritos na tabela abaixo:

Tabela 1: Parâmetros de validação dos modelos baseados na análise estrutural realizada pelo MolPro-
bity 4.3 e pelo e ModFold 4.0. Em laranja, distantes aos ca

Os resultados de simulação dos preditores Deleterius Effect (HOPE) e I-Mutante

2.0 para estas mutações descreveram todas as possíveis modificações exercidas pelo
resíduo mutante na enzima ALAD. Os Scores dados pelo Polyphen e pelo Panther
indicam opotencial de dano da mutação sobre a Enzima (Tabela 2).
 32

Tabela 2: Resultados dos preditores de mutação Polyphen 2, Panther, HOPE, e I-Mutant 3.0 sobre o
efeitos das mutações E89K, C132R e G133R na ALAD humana.

As análises de acessibilidade ao solvente das enzimas mutantes realizadas pelo

ASAview e pelo SDM/mordred mostram as mudanças na acessebilidade ao solvente
provocadas pelos resíduos mutantes na enzima ALAD. os resultados do PROTPA-
RAM, mostra as mudanças no ponto isoelétrico (pI) das enzimas mutadas (Tabela 3).

Tabela 3: Influência das substituições na acessibilidade ao solvente e no ponto isoelétrico das proteínas
mutantes.

A partir da superposição das estruturas cristalográficas dos complexos enzimáti-

cos contendo o íon de Zinco pode-se observar diversas alterações bioquímicas funci-
onais e estruturais presente na estrutura da enzimas mutantes. A figura abaixo mostra
a superposição da estrutura da ALAD humana selvagem e mutantes (E89K, C132R e
G133R).
 33

Figura 8: Caracterização de estruturas cristalográficas. (A) Superposição da enzima ALAD humana

selvagem (vermelho) e a estrutura mutante E89K (verde). (B) Superposição da enzima ALAD humana
selvagem (vermelho) e a estrutura mutante C132R (verde). (C) Superposição da enzima ALAD humana
selvagem (vermelho) e a estrutura mutante G133R (verde)
 34

4.2 Análise quântica computacional

Os cálculos quânticos foram realizados para compreender o perfil energético do

sítio de ligação ao Zinco que propicia a assimetria deste metal durante a reação ca-
talítica da enzima ALAD humana. Foram identificados 30 resíduos dentro de um raio
crescente de 2 a 8.5 Å que apresentaram energias de interação variadas (atração ou
repulsão) calculadas a partir de diferentes constantes dielétricas ( = 4,  = 10,  = 20
e  = 40) representadas na Tabela 1.

Tabela 4: Distâncias e energias de interação GGA calculadas com as constantes =4, =10, =20 e
=40 entre os 30 resíduos da região de ligação e o Zinco.

Os resíduos de aminoácidos que apresentaram menor energia de interação calcu-

lada nas constantes dielétricas utilizadas nesse estudo foram: Pro125, Tyr224, Leu150,
 35

Met170, Phe79, Met171, Phe208, Ala166, Tyr196, Thr127 e Ser214. Dentre os resí-
duos, Pro125, Phe79, Leu150, Met170, Met171, Phe208 e Ala166, apresentam menor
afinidade ao solvente (água) e estão localizados no core da proteína se demonstrando
essenciais para a construção do bolsão hidrofóbico de ligação ao sítio (Figura 6).

Figura 9: Resíduos Pro125, Phe79, Leu150, Met170, Met171, Phe208 e Ala166 que compõem o core
hidrofóbico da ALAD humana.

Os resíduos Thr127 e Ser214 a 8 Å, Tir224 a 5,5Å e Tir196 a 7,5 Å estão localiza-

dos em volta do bolsão hidrófobico do sítio de ligação ao Zinco e possuem caráter hi-
drofílico compondo regiões de importante acessibilidade ao solvente. Thr127, Ser214
e Tyr224 estão localizadas na superfície proteica enquanto a Tir196 está localizada
no domínio β-barril no interior da proteína (Figura 7). Todos os resíduos hidrofílicos
tiveram baixa interação com o íon Zn2+ e apresentaram próximos valores de energia
entre todas as constantes dielétricas (Tabela 1).

No painel BIRD (Figura 9) é possível observar uma forte energia de repulsão do

resíduo Lis199 a 4,5 Å nas constantes =4 (28,76 Kcal/mol), =10 (5,81 Kcal/mol) e
=20 (2,90 Kcal/mol), o resíduo Lis252 a 8,5 Å nas constantes =4 (14,45 Kcal/mol),
=10 (2,89 Kcal/mol), o resíduo Arg174 nas constantes =4 (19,59 Kcal/mol) e =10
(3,96 Kcal/mol) e o resíduo Arg209 nas constantes =4 (16,50 Kcal/ mol) e =10 (3,32
Kcal/mol), ambas situadas a 7,5 Å do íon Zn2+ . Abaixo, na figura 8, segue a represen-
tação esquemática dos resíduos Lis199, Lis120, Arg174 e Arg209 que apresentaram
maior energia de repulsão.
 36

Figura 10: Resíduos Thr127, Ser214 e Tir224 localizados na superfície proteica em torno do bolsão
hidrofóbico de ligação ao íon Zn2+ e resíduo Tir196 localizado no domínio β-barril da ALAD humana.

Figura 11: Representação esquemática dos resíduos Arg209, Lis199, Lis252 e Arg174 os quais apre-
sentaram maior energia de repulsão com o Zn2+ .

Observa-se no painel de BIRD que os resíduos que apresentaram maior atra-

ção foram Cis122, Ser168, Asp169 e Asp120. Cis122 localizada perto do íon Zn2+
a 2,5 Å de raio, apresentou alta energia de atração em todas as constantes, =4 (-
22,90Kcal/mol), =10 (-6,67 Kcal/mol), =20 (-4,81 Kcal/mol) e =40 (-3,19 Kcal/mol).
O resíduo de Ser168, localizada a 3,5 Å, apresentou uma boa atração energética em
 37

todas constantes dielétricas =4 (-7,26 Kcal/mol), =10 (-2,18 Kcal/mol), =20 (-1,51
Kcal/mol) e =40 (-1,18 Kcal/mol). A Cis124 localizada a 3,5 Å apresentou atração
razoável na constante =4 (-2,01 Kcal/mol) e uma baixa atração nas constantes =10
(-0,88 Kcal/mol), =20 (-0,84 Kcal/mol) e =40 (-0,83 Kcal/mol) (Tabela 1). O resíduo
Cis132 apresentou energia de atração na constante =4 (-3,29 Kcal/mol).

Figura 12: Energia de interação do painel de BIRD (Bind interaction Residues Distance) para as cons-
tantes dielétricas 4, 10, 20 e 40 com os resíduos mais relevantes divididos de acordo com a proximidade
da região de interação com o íon Zn2+ .

Na Tabela 4, observa-se que os resíduos Gli130 e Gli133, localizados a 7 Å, obtive-

ram atração energética pouco representativa. O resíduo Gli130 apresentou boa atra-
ção na constante dielétrica =4 (-2,10 Kcal/mol) e baixa atração nas contantes =10
 38

(-0,43 Kcal/mol), =20 (-0,22 Kcal/mol) e =40 (-0,11 Kcal/mol). O resíduo de Gli133
apresentou boa atração na constante dielétrica =4 (-2,82 Kcal/mol) e baixa atração
nas contantes =10 (-0,69 Kcal/mol), =20 (-0,45 Kcal/mol) e =40 (-0,33Kcal/mol).
Fora os resíduos de cisteína já descritos na literatura, os resíduos Asp169, Ser168 e
Asp120 também se mostraram relevantes para a permanência do íon Zn2+ no sítio
(Figura 11).

Figura 13: Representação esquemática dos resíduos Asp169, Ser168 e Asp120 que apresentaram
grande energia de atração com o Zn2+ .

A partir dos resultados obtidos dos cálculos energéticos do sistema Zinco-ALAD

obteva-se alinhamento de sequências múltiplas para verificar a importância e a con-
servação dos resíduos que apresentaram maior energia de atração nesse bolsão,
considerando que estes possam ser os resíduos que possuam maior representati-
vidade energética e que podem ter grande responsabilidade pela permanência do
íon Zn2+ no bolsão (Figura 12). A sequência da enzima ALAD humana (GenBank:
P13716) foi alinhadada com as sequências da ALAD das espécies: Macaca fascicula-
ris (GenBank:Q60HH9), Pongo abelii (GenBank: Q5R971), Mus musculus (GenBank:
P10818), Bos taurus (GenBank: Q58DK5), Gallus gallus (Genbank: NM001291406.1),
Xenopus laevis (Genbank: Q6GN55), Salmo salar (GenBank: B5XEM0) e Danio rerio
(GenBank: Q568L9).
 39

Figura 14: Alinhamento da sequência enzima ALAD (GenBank: P13716) pelo T-cofee Espresso com
sequências de organismos de diferentes táxons. Em amarelo, os resíduos Cis122, Cis124 e Cis132. Em
azul, os resíduos Gli130 e Gli133. Em verde, os resíduos Asp 120, Ser168 e Asp169 que apresentaram
maior energia de interação (atração) com o íon Zn2+ .
 40

5 Discussão

5.1 Análise das mutações missense relacionadas ao

sítio de ligação ao Zinco

As mutações E89k, C132R e G133R até então relatadas relacionadas ao sítio de

ligação ao Zn2+ , acometem regiões conservadas as quais são fundamentais para a
estrutura da enzima; por isso, podem afetar de forma crucial a atividade enzimática. O
alinhamento de sequências múltiplas (Figura 07), mostra que existe uma alta conser-
vação desses resíduos nas espécies, o que pode-se inferir, que estes sítios também
obtiveram sucesso evolutivo.

A Tabela 2, apresenta de forma esquemática os resultados da patogenicidade cau-

sada pelas mutações e alterações bioquímicas na estrutura de cada enzima mutante
feitas pelos preditores online. A Tabela 3, mostra os resultados de predição de aces-
sibilidade ao solvente dos aminoácidos nas posições acometidas pelas mutações e a
avaliação do ponto isoelétrico das proteínas mutantes.

5.1.1 Mutação E89K

O ácido glutâmico está localizado na região de coil entre uma folha β4 e a α-hélice
H5. É um aminoácido carregado negativamente em pH fisiológico, apresentando carga
total negativa e caráter ácido. Devido a essas propriedades, é capaz de formar liga-
ções de hidrogênio com outras moléculas, inclusive com a água presente na camada
de solvatação do meio; está localizado na superfície, sendo bastante acessível ao sol-
vente (Tabela 3). O resíduo mutante, a lisina, está carregado positivamente quando
em condições fisiológicas e caracteriza-se por ser um aminoácido básico, com uma
cadeia lateral maior que aquela do aminoácido selvagem, de modo que a substituição
para um aminoácido com carga oposta pode interferir no contato com outras molé-
culas, inclusive com o afastamento eletrostático do zinco (Figura 8A). Além disso, a
 41

substituição de um aminoácido com características ácidas para outro com caracterís-

ticas básicas resulta em mudança no ponto isoelétrico da proteína, passando a ser
6,76, um pouco maior que aquele da enzima selvagem, que possui um pI de 6,32
(Tabela 3).

Baseando-se nos resultados do alinhamento de sequências múltiplas na Figura

7, o sítio em questão é bastante conservado entre as espécies e, embora alguns
outros resíduos terem sido observados nesta posição, a lisina ou outros aminoácidos
com propriedades semelhantes não foram encontrados em sequências homólogas. A
mutação E89K foi reportada em um paciente com uma atividade enzimática menor
que 8% em relação à enzima selvagem (AKAGI et al., 2006). Segundo dados obtidos
por JAFFE; STITH em 2007, a atividade da enzima mutante quando expressa em células
CHO foi de aproximadamente 10%, enquanto que a sua atividade quando expressa
em E. coli foi de 64%.

Pode-se observar na Figura 8A que o ácido glutâmico nesta posição faz parte de
uma volta a qual se localiza tridimensionalmente próximo à histidina 129 e histidina
131, podendo realizar interações eletrostáticas estáveis com esses resíduos nesta
regiao. A substituição para uma lisina pode afetar a região de ligação ao zinco devido
à repulsão eletrostática deste com a histidina 129 ou com a histidina 131, à grande
probabilidade de repulsão eletrostática deste com o íon Zn2+ e a competição destes
resíduos carregados positivamente pelos tiolatos (s-) da Cisteina 132, resultando em
diminuição da afinidade da proteína com o zinco, diminuindo assim sua atividade.

5.1.2 Mutação C132R

Na proteína selvagem, o resíduo na posição 132 é representado pela cisteína,

aminoácido de carga neutra com hidrofobicidade intermediária, estando localizado no
core proteico, apresentando baixa acessibilidade ao solvente. Juntamente com a gli-
cina na posição 133, integra uma região de coil entre as α-hélices H7 e H8 . Faz parte
de um sítio bastante conservado entre as espécies, pois é uma região de ligação ao
zinco, importante na catálise enzimática (JAFFE, 2003b). O aminoácido que compôe a
enzima mutante, a arginina, possui uma cadeia lateral maior, uma carga total positiva
e caráter básico (Tabela 3). Devido a estas propriedades, pode haver uma repulsão
eletrostática entre o resíduo de arginina e o Zinco, dificultando a interação do íon com
o sítio e, possivelmente, interferindo na atividade enzimática (Figura 8B). De fato, cor-
robora com o que foi constatado que a atividade enzimática apresentou-se parcial em
 42

um indivíduo que possuía um alelo normal e o C132R (AKAGI et al., 2006). A repulsão
catiônica poderia ser estendida ao chumbo, havendo menor ligação deste metal ao
sítio, resultando em uma possível resistência à inibição enzimática por este íon (AKAGI
et al., 2006).

O resíduo selvagem também é capaz de realizar uma ligação de hidrogênio com

Tir224. A introdução de uma carga positiva ao core proteico pode resultar em deses-
tabilização da estrutura nesta região (Tabela 2). Esta desestabilização provavelmente
pode ocorrer devido à perda nas interações hidrofóbicas e a perda da ligação com a
Tir224. Possivelmente, em decorrência da polaridade da arginina, pode haver forma-
ção de novas interações com outros aminoácidos ou com as moléculas do solvente. A
substituição observada ainda interfere no ponto isoelétrico da enzima, correspondendo
a 6,51 (Tabela 3). Considerando-se os estudos realizados in vitro sobre a atividade es-
pecífica da enzima mutante, encontramos que a mesma quando expressa em células
CHO e em E. coli, possuía uma atividade de 4% e 0,3%, respectivamente, em relação
à enzima selvagem (JAFFE; STITH, 2007).

5.1.3 Mutação G133R

A glicina está localizada próxima a uma região bastante conservada, posicionando-

se na região mais interna e hidrofóbica da proteína, estando localizado em um coil
entre as α-hélice H7 e H8. A glicina possui uma cadeia lateral pequena e uma carga
total neutra, sendo também bastante flexível, propriedade necessária para a confor-
mação espacial daquela região (Tabela 3). A glicina não está em contato direto com
os átomos de Zinco, mas sua presença nesta posição pode ser importante para a es-
tabilidade da ligação deste íon com os aminoácidos circunvizinhos, contribuindo para
a estabilidade da região. Com isso, pode-se inferir que a mutação neste sítio introdu-
zindo o aminoácido arginina pode levar a problemas no dobramento da proteína, já
que há a introdução de uma carga positiva no local, e o fato da cadeia lateral do resí-
duo arginina ser maior que aquela do resíduo selvagem. Além disso, a arginina pode
criar ângulos de torção não usuais para a região proteica, podendo levar a uma con-
formação incorreta que irá distorcer a estrutura daquela região além de competir com
os grupos Tiolatos (S-) das Cis122 , Cis124, e Cis132 impedindo a ligação do átomo
de Zinco (Figura 8C). Além disso, a substituição para uma arginina causa mudança
no ponto isoelétrico da proteína de forma semelhante àquela observada na mutação
C132R, passando este a ser de 6,51 (Tabela 3).
 43

Estes resultados estão de acordo com aqueles achados por MARUNO et al., 2001, o
qual também afirmou que a referente substituição pode alterar a ligação com o átomo
de zinco e afetar a atividade catalítica da enzima. Dados obtidos in vitro por este autor
mostram que a atividade catalítica da enzima G133R foi 8,1% daquela observada na
forma selvagem da enzima.

A avaliação dos modelos construídos e a análise dos dados obtidos a partir dos
preditores mostra que os danos bioquímicos causados pelas mutações possuem uma
natureza heterogênea e, por isso, a atividade enzimática pode ser diminuída propor-
cionalmente quanto maior for a importância de determinado resíduo para a estrutura
monomérica da proteína. Desta maneira, estes estudos, desenvolvidos in silico ou in
vitro, são importantes para a caracterização estrutural desta enzima, que realiza um
papel primordial em todos os seres vivos.

5.2 Análise Quântica Computacional

As propriedades de ligação a metais na ALAD humana são importantes de ser

analisadas devido a sua suscetibilidade à ligação ao chumbo, o que torna a ALAD
um biomarcador de intoxicação ambiental e ocupacional por este elemento químico
(JAFFE et al., 2001; SARAIVA et al., 2012). Além do chumbo, outros metais (mercúrio,
cádmio, berílio) são capazes de inibir a atividade da enzima (SARAIVA et al., 2012).
O chumbo consegue inibir a atividade enzimática da ALAD por deslocar o Zinco da
enzima. Segundo Jaffe e colaboradores (2009), este deslocamento é provocado pela
maior afinidade do chumbo no sítio de ligação que compreende aos três tiolatos (S-
) dos resíduos de Cisteínas (122,124 e 132) naturalmente ocupado pelo zinco, este
posicionado em uma formação geométrica tetraédrica propícia ao seu papel de coor-
denação na atividade catalítica.

Nesse sentido, os resultados bioquímicos quânticos obtidos nesse estudo são de

suma relevância uma vez que descrevem com acurácia as interações energéticas exis-
tentes no bolsão catalítico da enzima ALAD, permitindo descrever a energia individual
dos resíduos de aminoácidos que interagem com o zinco.

A Tabela 4, mostra os diferentes valores energéticos dos 30 resíduos de aminoá-

cidos da enzima dentro de um raio crescente de 2 a 8.5 Å calculados em diferen-
tes constantes dielétricas ( =4, =10, =20, =40), os resíduos de aminoácidos que
apresentaram baixa interação energética (Pro125, Tir224, Leu150, Met170, Phe79,
 44

Met171, Phe208, Ala166, Tir196, Thr127 e Ser214) estão representados nas Figu-
ras 6 e 7. Apesar de apresentarem pouca representatividade energética no sistema
Zinco-ALAD, Jaffe e colaborares em (2009) descreveram que estes resíduos são bas-
tante conservados entre as espécies, portanto, evolutivamente mostram-se essenciais
na construção do bolsão catalítico da enzima. Na Figura 9, Pro125, Phe79, Leu150,
Met170, Met171, Phe208 e Ala166, são resíduos que apresentam pouca afinidade
ao solvente (água) estando localizados no core proteico. A característica hidrofóbica
desses resíduos permite a construção de regiões específicas do bolsão com pouca
afinidade à água. Na Figura 10, Thr127, Ser214, Tir224 e Tir196 são resíduos de ca-
ráter hidrofílico e estão localizados em torno do bolsão catalítico, em regiões de grande
acessibilidade ao solvente. A Thr127, Ser214 e Tir224 estão localizadas na superfí-
cie proteica enquanto que a Tir196 está localizada no domínio β-barril no interior da
proteína.

No painel BIRD (Figura 12), observa-se uma forte energia de repulsão do resí-
duo Lis199 a 4,5 Å nas constantes =4 (28,76 Kcal/mol), =10 (5,81 Kcal/mol) e =20
(2,90 Kcal/mol), e da Lis252 a 8,5 Å nas constantes =4 (14,45 Kcal/mol), =10 (2,89
Kcal/mol), resíduos já reportados por Erdtman e colaboradores em (2010) e Tian e
colaboradores em (2012), como muito importantes para o sítio catalítico, sendo cruci-
ais para a assimetria dos substratos durante a reação enzimática da ALAD por serem
indispensáveis na formação da base de Schiff com o Carbono 4 do ALA (ácido amino-
levulínico) através dos seus grupamentos amino (FIGURA 11).

Além de Lis199 e Lis252, também pode ser observado no painel de BIRD (Figura
9), outros resíduos que apresentaram forte repulsão, como: Arg174 nas constantes
=4 (19,59 Kcal/mol) e =10 (3,96 Kcal/mol) e Arg209 nas constantes =4 (16,50 Kcal/
mol) e =10 (3,32 Kcal/mol). Ambas situadas a 7.5 Å do íon Zn2+ , também são im-
portantes para na assimetria das moléculas ALA, umavez que os grupamentos amino
dessas argininas são capazes de formar interações eletrostáticas com o grupamento
carboxila (COOH) do carbono 1 da molécula de ALA (ERDTMAN et al., 2010; TIAN; ERDT-
MAN; ERIKSSON, 2012).

Dentre os resíduos observados no painel BIRD (Figura 9), o quais apresentaram

maior energia de atração em todas as constantes dielétricas estão: Cis122, Ser168,
Asp169 e Asp120. A energia de atração das cisteínas são extremamente importantes
no sítio do bolsão, uma vez que promovem a coordenação do Zn2+ durante a atividade
catalítica (JAFFE et al., 2001; ERDTMAN et al., 2010; TIAN; ERDTMAN; ERIKSSON, 2012). A
 45

substituição destes resíduos por meio de mutações podem causar a perda total da fun-
ção da ALAD, conforme visto por Akagi e colaboradores (AKAGI et al., 2006) em (2006)
ao estudar o sexto caso até então reportado no mundo de porfiria por deficiência de
ácido aminolevulínico. Eles verificaram que a substituição na posição 132 do resíduo
cisteína por um resíduo Arginina provocou perda total da função proteica.

Os resíduos Gli130 e Gli133, localizados a 7 Å, obtiveram atração energética

pouco representativa. O resíduo Gli130 apresentou uma boa atração na constante
dielétrica =4 (-2,10 Kcal/mol) e nas contantes =10 (-0,43 Kcal/mol), =20 (-0,22
Kcal/mol) e =40 (-0,11 Kcal/mol). O resíduo de Gli133 apresentou boa atração na
constante dielétrica =4 (-2,82 Kcal/mol) e baixa atração nas contantes =10 (-0,69
Kcal/mol), =20 (-0,45 Kcal/mol) e =40 (-0,33Kcal/mol). Mutações relacionadas a esse
sítio foram descritos por Akagi em colaboradores em 2000 ao estudar o quarto caso de
Porfiria no mundo. A substituição na posição 133 do resíduo de Glicina por um resíduo
de Arginina produzem proteínas com apenas 8% de atividade catalítica (MARUNO et
al., 2001). Embora o resíduo Gli133 não apresentar forte energia de atração, a substi-
tuição nesse sítio pelo resíduo mutante arginina, pode provocar problemas no dobra-
mento da proteína, uma vez que há a introdução de uma carga positiva no local, e o
fato da cadeia lateral do resíduo mutante ser maior que aquela do resíduo selvagem.
Além disso, a arginina cria ângulos de torção não usuais para a região proteica, po-
dendo levar a uma conformação incorreta que irá distorcer a estrutura daquela região
além de competir pelos grupos Tiolatos (S-) das Cis122, Cis124 e Cis132, impedindo
a ligação do ion de Zinco (MARUNO et al., 2001). A substituição observada ainda in-
terfere no ponto isoelétrico da enzima, correspondendo a 6,51, um pouco maior que
aquele da enzima selvagem, que possui um pI de 6,32.

O resíduo de Ser168 a 3,5 Å também obteve valores energéticos de atração im-

portantes =4 (-7,26 kcal/mol) =10 (-2,18 kcal/mol) =20 (-1,51 kcal/mol) e =40 (-1,18
kcal/mol). Ambos os os resíduos Ser168, Asp169 e Asp120, mostraram-se bastante
relevantes no aumento da energia de atração nesse sítio embora ainda não tenham
sido reportados na literatura como resíduos importantes na interação e permanência
do íon Zn2+ no bolsão catalítico (Figura 13). Nesse contexto, é possível observar um
aumento nos valores energéticos de atração em todas as constantes dielétricas no
intervalo entre 0 e 3,5 Å, justamente onde foram identificados os resíduos Cis122,
Asp169 e Ser168.

Dentre os resíduos observados na constante =4 que apresentaram maior atração,

 46

se destacam o resíduo Asp169 a 3,5 Å, que apresentou uma alta energia de atração
nas constantes =4 (-28,38 Kcal/mol) e =10 (-5,81 Kcal/mol) e o resíduo Asp120 a 5,5
Å nas constantes =4 (-28,38 Kcal/mol) e =10 (-5,90 kcal/mol) (Tabela 4). Ambos os
resíduos (Asp169 e Asp120) se mostraram os mais relevantes no aumento da energia
de atração nesse sítio embora ainda não tenham sido reportados na literatura como
resíduos importantes na interação e permanência do íon Zn2+ no bolsão devido esse
aminoácido possuir um grupamento caboxílico (COOH) em sua cadeia lateral (Figura
13).

O alinhamento de sequências múltiplas demonstrado na Figura 14, mostra que

o cerne proteico é altamente conservado entre as espécies, principalmente nas re-
giões de ligação ao íon metálico, próximo ao sítio ativo da enzima. Os resíduos de
aminoácidos Aps120, Cis122, Cis124, Gli130, Cis132, Gli133, Ser168 e Asp169 se
apresentaram bastante conservados, indicando a importância e o sucesso evolutivo
destes resíduos ao longo do tempo, ratificando a relevância funcional dos resultados
obtidos na descrição quântica destes no sistema zinco-ALAD.

Em resumo, além dos resíduos Cis122, Cis124 e Cis132 funcionalmente já des-

critos na literatura (Tian et al 2012), os resíduos Asp120, Gli130, Gli133, Ser168 e
Ser169 se apresentaram bastante conservados na proteína e demonstraram grande
relevância na composição do bolsão de ligação ao íon Zn2+ , portanto, podem ser re-
levantemente significativos para esclarecer com acurácia a inibição da enzima ALAD
por metais pesados como o chumbo (P b2+ ).
 47

6 Conclusão

A avaliação dos modelos construídos e a análise dos dados obtidos a partir dos
preditores online, mostra que os danos bioquímicos causados pelas mutações próxi-
mas ao bolsão catalítico possuem uma natureza heterogênea e, por isso, a atividade
enzimática pode ser diminuída proporcionalmente quanto maior for a importância de
determinado resíduo para a estrutura monomérica da proteína, suportando os dados
obtidos in vitro sobre a atividade da enzima por outros autores. Desta maneira, es-
tes estudos, desenvolvidos in silico ou in vitro, são importantes para a caracterização
estrutural desta enzima, que realiza um papel primordial em todos os seres vivos.

As abordagens eletroquímicas sugerem que apesar das interações entre a enzima

ALAD e o zinco como metal de coordenação na reação catalítica já terem sido des-
critas, os cálculos bioquímicos quânticos baseados em DFT com a abordagem de
fragmentação proteica obteveram sucesso em elucidar o comportamento energético
dos resíduos de aminoácidos que interagem com o zinco no bolsão catalítico, e quais
resíduos de aminoácidos interagem favoravelmente para a permanência do metal na
enzima. O Asp169 e o Asp120 foram os resíduos que mostraram maior relevância,
uma vez que ambos mostraram altos valores energéticos de atração e nunca foram
reportados anteriormente.

A análise filogenética dos sítios acometidos pelas mutações missense assim como
dos resíduos funcionais do sítio catalítico que obtiveram altos valores energéticos,
mostrou a importância funcional e estrutural destes resíduos na composição e funci-
onamento catalítico da ALAD humana, uma vez que ainda permanecem conservados
em organismos evolutivamente distantes.
 48

7 Perspectivas

• Após finalizar a otimização do sistema chumbo- ALAD, realizar os cálculos ener-

géticos entre os resíduos da ALAD humana que interagem com o chumbo.

• Diferenciar os resultados energéticos dos resíduos que apresentaram interação

(atração ou repulsão) do sistema chumbo-ALAD com os resíduos do Sitema
zinco-ALAD.

• Comparar os valores energéticos encontrados neste estudo com os dados ex-

perimentais de relevância para cada aminoácido e para a resposta biológica de
cada sistema

• Redigir o segundo artigo da Dissertação.

 49

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