Universidade Católica Dom Bosco

Instituição Salesiana de Educação Superior

PRÁTICAS

MICROBIOLOGIA

CDV

Acadêmico(a):________________________________________________________
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO

Aula Prática 1. Procedimentos e conduta no laboratório de microbiologia / Vidrarias

Aula Prática 2. Noções de Biossegurança
Aula Prática 3. Técnicas de Descontaminação e Esterilização / Autoclave
Aula Prática 4. Preparação de Meios de Cultivo
Aula Prática 5. Isolamento de microrganismos das mãos / Técnica lavagem de mãos
Aula Prática 6. Características macroscópicas das colônias
Aula Prática 7. Coloração e análise microscópica da estrutura de microrganismos
Aula Prática 8. Técnicas de inoculação de amostras em meio (Semeadura de bactérias)
Aula Prática 9. Isolamento de microrganismos do ambiente
Aula Prática 10. Metabolismo microbiano
Aula Prática 11 e 12. Atividades bioquímicas das bactérias – provas bioquímicas / Leitura das provas
bioquímicas
Aula Prática 13. Antibiograma / TSA
Aula Prática 14. Isolamento de microrganismos (fungos/ bactérias) em meios seletivos

AULA PRÁTICA 1

INSTRUÇÕES BÁSICAS PARA O TRABALHO NO LABORATÓRIO

Antes de iniciar qualquer aula prática, leia atentamente as instruções do roteiro.

Organize todo o material necessário para a realização do experimento, se for trabalhar em grupo
dividir as tarefas entre seus colegas.

Leia atentamente os rótulos dos frascos antes de utilizar qualquer substância. Se algum reagente
químico forte entrar em contato com sua pele, lave-a imediatamente com água corrente.

Siga corretamente as instruções contidas no item procedimento, anote tudo que observar,
assim terá o máximo de informações para a elaboração do relatório.

O modelo é baseado no de um pequeno trabalho científico e, portanto, constitui-se em boa

oportunidade para iniciar seu treinamento neste aspecto, que é de fundamental importância
para um pesquisador.

Recomenda-se frequentar a biblioteca. Você sabe como fazer um levantamento bibliográfico.

Isto é também fundamental para um profissional competente. A bibliotecária poderá ajudá-lo.

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Não descarte sobras de material usados em experimentos na pia, principalmente se for sólidos
podem entupir encanamentos.

Depois de usados, os materiais devem ser lavados e deixados nos seus devidos lugares.

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 VIDRARIAS E OUTROS EQUIPAMENTOS DE LABORATÓRIO:

ALMOFARIZ COM PISTILO

Usado na trituração e pulverização de sólidos em pequena escala.

BALÃO DE FUNDO CHATO

Utilizado como recipiente para conter líquidos ou soluções, ou mesmo, fazer

reações com desprendimento de gases. Pode ser aquecido sobre o tripé com
tela de amianto.

BALÃO DE FUNDO REDONDO

Utilizado principalmente em sistemas de refluxo e evaporação a vácuo,

acoplado a um rotaevaporador.

BALÃO VOLUMÉTRICO

Possui volume definido e é utilizado para o preparo de soluções com

precisão em laboratório

BECKER

É de uso geral em laboratório. Serve para fazer reações entre soluções,

dissolver substâncias sólidas, efetuar reações de precipitação e aquecer
líquidos. Pode ser aquecido sobre a tela de amianto.

BURETA COM TORNEIRA DE VIDRO OU TEFLON

Aparelho utilizado em análises volumétricas não tão precisas. Apresenta tubo

de parede uniforme para assegurar a tolerância estipulada com exatidão e
gravação permanente em linhas bem delineadas afim de facilitar a leitura de
volume escoado.

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 CONDENSADOR

Utilizado na destilação, tem como finalidade condensar vapores gerados pelo

aquecimento de líquidos. Os mais comuns são os de Liebig, como o da figura
ao lado, mas há também o de bolas e serpentina.

ERLENMEYER

Utilizado em titulações, aquecimento de líquidos e para dissolver

substâncias e proceder reações entre soluções. Seu diferencial em
relação ao béquer é que este permite agitação manual, devido ao seu
afunilamento, sem que haja risco de perda do material agitado.

FUNIL DE SEPARAÇÃO

Utilizado na separação de líquidos não miscíveis e na extração

líquido/líquido.

FUNIL DE HASTE LONGA

Usado na filtração e para retenção de partículas sólidas. Não deve ser

aquecido.

KITASSATO

Utilizado em conjunto com o funil de Büchner em filtrações a vácuo.

PIPETA GRADUADA

Utilizada para medir pequenos volumes. Mede volumes variáveis. Não

pode ser aquecida e não apresenta precisão na medida.

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PROVETA OU CILINDRO GRADUADO

Serve para medir e transferir volumes variáveis de líquidos em grandes

quantidades se necessário. Pode ser encontrada em volumes de 25 até
1000mL. Não pode ser aquecida.

TUBO DE ENSAIO

Empregado para fazer reações em pequena escala, principalmente em testes

de reação em geral. Pode ser aquecido com movimentos circulares e com
cuidado diretamente sob a chama do bico de bunsen.

VIDRO DE RELÓGIO

Peça de Vidro de forma côncava, é usada em análises e evaporações em

pequena escala, além de auxiliar na pesagem de substâncias não voláteis e não
higroscópicas. Não pode ser aquecida diretamente.

ANEL OU ARGOLA

Usado como suporte do funil na filtração.

BICO DE BUNSEN

É a fonte de aquecimento mais utilizada em laboratório. Mas

contemporaneamente tem sido substituído pelas mantas e chapas de
aquecimento. Deve-se evitar seu uso quando utilizamos substâncias
inflamáveis dentro do recipiente que se quer aquecer.

GARRA DE CONDENSADOR

Usada para prender o condensador à haste do suporte ou outras peças

como balões, erlenmeyers etc.

PISSETA OU FRASCO LAVADOR

Usada para lavagens de materiais ou recipientes através de jatos de água,

álcool ou outros solventes.

TRIPÉ
Sustentáculo para efetuar aquecimentos de soluções em vidrarias diversas
de laboratório. É utilizado em conjunto com a tela de amianto.
 ESPÁTULAS E COLHERES

Utilizadas para transferência de sólidos, são encontradas em aço

inox, porcelana, níquel, osso e pp.

AGITADORES

Em geral são feitos de vidro, mas há também

os de monel, inox e teflon(este tem vantagem
de se adaptar ao fundo do recipiente por ser
flexível)

ESTANTES

Utilizados para tubos, geralmente, como suporte de

apoio.

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 AULA PRÁTICA 2

NÍVEIS DE BIOSSEGURANÇA

Introdução
“Biossegurança é o conjunto de ações voltadas para a prevenção, minimização ou eliminação de
riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e
prestação de serviços, riscos que podem comprometer a saúde do homem, dos animais, do meio
ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.”

Objetivos
• Compreender a importância de se trabalhar com segurança e responsabilidade em
laboratórios de pesquisa ou em atividades de Saúde.
• Definir o conceito de biossegurança.
• Prever sobre as fontes de risco em um laboratório de pesquisa e no trabalho na área de
Saúde.
• Aplicar os conceitos de contaminação biológica, desinfecção e esterilização em prol da boa
prática de atividade de pesquisa e clínica.

Procedimentos
Aula dialogada sobre o tema.
Discussão em sala e resenha sobre a Apostila–Biossegurança em Laboratórios Biomédicos e de
Microbiologia. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância emSaúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Brasília-DF. 2004.

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 AULA PRÁTICA 3

UICA 3
 TÉCNICAS DE DESCONTAMINAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO / AUTOCLAVE

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 AULA PRÁTICA 4

PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTIVO

Meios de Cultura

Sistema utilizado para isolar microrganismos em laboratórios, que permite o crescimento e

a multiplicação dos agentes. Um bom meio de cultura deve preencher todas as necessidades
nutricionais dos agentes, ser estéril e possuir pH adequado. Os meios de cultura podem ser
líquidos ou sólidos. Podem ser ainda:
- Não seletivos: permitem crescimento de um grande número de espécies
- Seletivos: meio geral no qual são adicionadas substâncias que inibem ou reduzem certos
grupos, salientando outros.
Os meios de culturas possuem como principais componentes: H2O destilada, fonte de
carbono (energia - CO2, lipídeos, açúcar, álcool e outras substâncias), fonte de nitrogênio,
fatores de crescimento (vitaminas que variam de espécie para espécie), extratos (de carne,
levedura, caseína de leite, hidrolisado de proteína de soja), minerais (P, Fe, Zn, Mn, Ca, Cu, Na –
em baixas concentrações).
Eles se apresentam na forma desidratada, devendo ser diluídos em H2O deionizada (sem
íons) e esterilizados. A esterilização é um processo que elimina todos os contaminantes
provenientes da água ou do próprio meio de cultura. Esse processo é feito em autoclave à 121ºC
por 15 minutos e o pH do meio deve ser ajustado conforme indicado pelo fabricante, ou de
acordo com o microrganismo pesquisado.
Os meios de cultura dividem-se primeiramente em meios sólidos, aqueles que contêm ágar,
e meios líquido, sem ágar. Ambos os meios são preparados com água destilada.
Nos meios sólidos o crescimento por exaustão de nutrientes, devendo realizar-se a
transferência de colônias para novo meio. No entanto estes meios permitem a individualização
das colônias.
Os meios líquidos permitem melhor difusão de metabólitos, mas não o isolamento de
colônias.

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 AULA PRÁTICA 5

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DAS MÃOS /

TÉCNICA LAVAGEM DE MÃOS

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 AULA PRÁTICA 6

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DAS COLÔNIAS

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 Exemplos de vários tipos de morfologia das colônias

FUNGOs ASPECTO FILAMENTOSO

Colônia de vários tipos

Colônia de bactérias com crescimento do centro para a periferia

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 Colônia de bactérias puntiforme

AULA PRÁTICA 7

COLORAÇÃO E ANÁLISE MICROSCÓPICA DA ESTRUTURA DE MICRORGANISMOS

Fixação e coloração de microrganismos

A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares
para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de
um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que,
além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém,
antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples
exposição ao ar ou secagem na chama.
Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Um desse íons, o que
dá a cor, é chamado de radical cromóforo. Então, os corantes conhecidos como básicos tem a
cor do seu íon positivo, enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. A célula
bacteriana é negativamente carregada, portanto atrai corantes básicos. Os corantes básicos
mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno e safranina .
Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos
microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões
principais:

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 Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são
reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos;
Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares;

Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e

Podem, eventualmente, identificar alguns grupos.

Quanto aos tipos de coloração temos:

1) Coloração simples- cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células
mais visíveis. Identificação pelo tamanho, forma e arranjo.

2) Coloração diferencial- nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes

tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações
diferenciais.

3) Coloração especial- são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos
microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.

No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por
aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são
chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente
é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.

COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

É o método de coloração mais empregado em bacteriologia.

Importância do método:

. separa as bactérias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS (G+/GP) e GRAM NEGATIVAS (G- /GN);
. taxonomia ( identificação, classificação e nomenclatura, sendo o primeiro passo no processo de
identificação);
. possibilita o diagnóstico presuntivo (preliminar), principalmente em casos de infecções graves e de
evolução fatal quando o médico necessita introduzir uma terapêutica, antes mesmo da identificação
do microrganismo causador da infecção;
. permite evidenciarmos a contaminação a partir de diferentes materiais.

SOLUÇÕES EMPREGADAS:

1- CRISTAL VIOLETA - função: corante principal ( cora igualmente todas as bactérias )

2- LUGOL ( solução de iodo-iodeto de potássio) - função: mordente. O mordente tem a finalidade de
aumentar a afinidade do corante pela célula, permitindo que ela se core mais intensamente.
3- ÁLCOOL ETÍLICO - função: agente descorante e diferenciador. Sua utilização permite que algumas
células se descorem mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de descoloração é que
diferencia as bactérias.
4- FUCSINA DILUÍDA - função: corante de contraste, corante secundário ou contra corante. É o corante
que dá às células descoradas uma cor diferente daquelas que mantêm a cor do corante principal.

Os microrganismos que não se descoram facilmente retêm a cor do corante principal (cristal violeta)
enquanto que aqueles que se descoram facilmente poderão ser visualizados, pois corar-se-ão com o
corante de contraste ( fucsina. ).
TÉCNICA:

1º- Cobrir o esfregaço já fixado com solução de Cristal Violeta por um (1) minuto.
2º-Escorrer o cristal violeta, lavar em fio d’água e cobrir o esfregaço com Lugol por um (1) minuto.
3º-Escorrer o lugol, lavar em fio d’água .
4º- Descorar rapidamente com Álcool Etílico ( +/- 20 segundos)
5º-Interromper o processo de descoramento lavando o esfregaço com fio d’ água.
6º-Cobrir o esfregaço com Fucsina diluída por 30 segundos.
7º-Lavar e secar com papel filtro, pressionando o esfregaço cuidadosamente.
8º-Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observar ao microscópio, utilizando a
objetiva de imersão.

RESULTADO:

Bactérias coradas em roxo (cor do cristal violeta) - GRAM POSITIVAS

Bactérias coradas em vermelho (cor da fucsina) - GRAM NEGATIVAS

FUNDAMENTO DA TÉCNICA DE GRAM:

Muitas explicações já foram sugeridas na tentativa de elucidar o mecanismo da reação de Gram. As

mais plausíveis dizem respeito à diferença na estrutura química da parede celular.
Num primeiro momento, todas as bactérias ( G+ e G- ) absorvem igualmente o cristal violeta ( corante
básico que possui afinidade pelos seus citoplasmas, devido a carga elétrica negativa oriunda
principalmente dos radicais fosfatos dos ácidos nucléicos ). A seguir, o lugol reage com o cristal violeta
formando o complexo iodo-pararosanilina, que se fixa e cora a célula mais intensamente.
Posteriormente, quando tratamos o esfregaço com álcool, as bactérias se comportam de maneira
diferente:

1) Gram-positivas não se descoram facilmente pelo tratamento com o álcool. Isto se explica pelo fato
de comporem sua parede celular uma espessa camada de peptideoglicano, além de outros possíveis
componentes, como: ác. teicoicos, proteínas. polissacarides e etc., substâncias estas, não solúveis em
álcool.
O álcool atua desidratando as várias camadas desta parede, o que traz como consequência uma
diminuição na sua porosidade e esta diminuição reduziria a permeabilidade da parede, dificultando a
extração (saída) do complexo CV-I (que se encontra no citoplasma ) de dentro da célula. Além disto,
parece haver uma retenção do CV-I na parede após a ação do álcool, o que também contribuiria para
a diminuição de sua porosidade. A bactéria Gram-positiva permanece então com a mesma coloração
até o final.

Figura: Parede celular de bactéria Gram-positiva

Fonte: CTISM

-2) as bactérias Gram-negativas são descoradas pelo tratamento com o álcool. Tal fato se explica por
comporem a parede destas bactérias: delgada camada de peptideoglicano (menor entrecruzamento,
o que não é suficiente para impedir a passagem do solvente) além de substâncias
ricas em lípides (lipoproteina de apoio, fosfolípides da membrana externa e lipídio “A” que participa
do LPS).
O álcool solubiliza (dissolve) estes lipídios (muitas vezes extraindo a camada da membrana externa),
aumentando a porosidade da parede, o que contribuiria para um aumento da permeabilidade. Assim
sendo, o álcool penetra dentro da célula (atravessando a membrana citoplasmática), removendo o
complexo CV-I, descorando a célula.
Finalmente as bactérias descoradas pelo álcool, por não apresentarem contraste que permita sua
visualização, seriam coradas pelo corante secundário que é a fucsina. As células que não foram
descoradas pelo álcool (e tiveram sua permeabilidade diminuída) permaneceriam coradas com a cor
do corante principal
até o final da coloração, pois não absorveriam a fucsina.

Figura: Parede celular de bactéria Gram-negativa

Fonte: CTISM

COLORAÇÃO DE GRAM

Fixação e coloração de microrganismos

A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares

para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um
microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de
facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser
corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou
secagem na chama.
Objetivo

• O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os
alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente, devem ser
capazes de distinguir formas e arranjos.
• Coloração de microrganismos provenientes de meios, sólido e líquido, pelo método de Gram.
Material

➢ alça de platina;
➢ lâmina de vidro;
➢ placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido;
 ➢ tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído;
➢ cristal violeta a 1%;

➢ lugol;
➢ solução diferenciadora;
➢ fucsina básica;

Procedimento:

A. PREPARO DO ESFREGAÇO

Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido

1) Flambar a alça corretamente

2) Esfriá-la nas paredes do tubo
3) Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça.
4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca.
5) Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino.
6) Secar à temperatura ambiente.
7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina algumas vêzes pela chama.
OBS. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo.
8) Realizar a coloração.

Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido

1) Colocar com a própria alça, já flambada, uma gota de água de torneira no centro da lâmina de vidro.
2) Flambar novamente a alça
3) Esfriá-la na tampa da placa de Petri, ou no meio sólido numa região sem colônia.
4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano.
5) Homogeneizar este material com a gota de água, cuidando para obter uma suspensão pouco densa
e sem grumos.
6) Secar a lâmina por exposição ao ar.
7) Fixar o esfregaço.

B. COLORAÇÃO

1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto.

ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!!
2) Lavar rapidamente em água corrente;
3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto;
4) Lavar rapidamente em água corrente;
5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool ou acetona;
6) Lavar rapidamente em água corrente;
7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos;
8) Lavar novamente em água corrente;
9) Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço;

10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de Gram.

➢ A solução de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada, devendo ser filtrada para a
remoção de precipitados.

➢ A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser efetuada rapidamente.
Porém, não tão rapidamente que a descoloração não possa ser completada.
➢ Os esfregaços não devem ser muito espessos, pois são mais difíceis de descorar e de permitir
observações.

➢ Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração, com bactérias
G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se fracamente. Evitar estas culturas!
Resultados:

___________________ ____________________

__________________ ___________________

Questionário

1. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram positivas e Gram
negativas?
2. Cite alguns fatores que podem influenciar na coloração de Gram, podendo inclusive levar a
erros?
 AULA PRÁTICA 8

TÉCNICAS DE SEMEADURA

Semeadura é o processo de isolamento de uma substância que esteja sob suspeita de

contaminação por algum microrganismo. Esse isolamento deve proporcionar as condições ideais
de crescimento e desenvolvimento do microrganismo, caso este esteja presente.
Portanto, semear um material (substância suspeita) significa espalhá-lo sobre o meio de
cultura em Placa de Petri, e incubá-la em temperatura ideal (geralmente em estufa a 37°C por
cerca de 24 - 48 h). Após o período de incubação, realiza-se a leitura da placa.
O não crescimento de colônias significa a ausência de microrganismos na substância
pesquisada, enquanto que o crescimento significará a presença de um ou mais tipos de
microrganismos.
Os meios de cultura utilizados na grande maioria dos experimentos são Ágar nutriente e
Caldo Nutriente, designados de meios de cultura gerais, visto serem adequados ao crescimento
e manutenção de vários microrganismos. A composição destes meios inclui extrato de levedura,
peptona, cloreto de sódio como componentes
nutritivos, e no caso do meio sólido, o ágar que permite ao meio obter uma consistência sólida, de
forma a proporcionar um suporte ao desenvolvimento das colônias de microrganismos.

Procedimentos Padrão:
1. Para o manuseio de amostras, placas, alças de platina e meios de cultura deve-se estar com
o cabelo preso, jaleco de manga longa e em silêncio (concentração absoluta).
2. Trabalhe sempre junto da chama da lamparina ou Bunsen.
3. Na preparação dos meios e na manutenção das culturas de microrganismos é importante
observar as condições de assepsia necessárias, de modo a evitar contaminações com outros
microrganismos.
4. Para inoculação e isolamento de microrganismos nas placas de Petri ou tubos de ensaio,
utiliza-se uma alça circular (alça de platina) ou um fio reto (fio de platina).
5. Após a utilização das alças ou fio de platina esterilizar passando pela chama do bico de Bunsen
até se tornar vermelho rubro, espere esfriar e coloque novamente no recipiente adequado.
Jamais deixe o cabo de Kole sob a bancada.
6. Se o objetivo do experimento é somente semear bactérias pode-se fazer técnicas de
semeadura simples, porém, se o objetivo é isolamento de colônias deve-se proceder a técnica
de semeadura composta.

Técnica I: Meio Sólido (ágar em Placa de Petri):

Semeadura por esgotamento – simples e composta

1. Esterilize a alça de platina passando-a pelo bico de Bunsen

2. Ao redor da chama do bico de Bunsen, mergulhe a alça de platina esterilizada na amostra
que lhe é fornecida.
3. Encoste a alça carregada de bactérias na superfície do ágar e inicie movimentos de zigue-
zague retilíneos, uniformes e bem próximos (semeadura simples).
4. Desencoste levemente a alça de platina da superfície, gire a placa (± 90°), encoste novamente
a alça de platina no final da primeira semeadura e inicie nova semeadura com movimentos em
zigue-zague, retilíneos, unifomes e um pouco mais espaçados (semeadura composta).
5. Desencoste levemente a alça de platina da superfície, gire a placa (± 90°), encoste
novamente a alça de platina no final da segunda semeadura e inicie nova semeadura com

6. os mesmos movimentos, mas desta vez, bem espaçados (semeadura composta).

7. Incube em estufa para crescimento sob tempo e temperatura sugeridos.

Técnica II: Meio Líquido (caldo nutritivo)

1. Ao redor da chama do bico de Bunsen, mergulhe a alça de platina esterilizada na cultura de

isolamento bacteriano que lhe é fornecida.
2. Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo líquido (caldo) e
agite a alça.
3. Incube em estufa para crescimento. Geralmente o tempo de crescimento varia de 4 a
6 h. Dependendo da bactéria, pode levar de 18 a 24 h. Visualize o caldo após incubação. Um
caldo turvo demonstra crescimento bacteriano.

Técnica III: Meio semi-sólido

1. Ao redor da chama do bico de Bunsen, mergulhe a alça de platina esterilizada na cultura

bacteriana que lhe é fornecida.
2. Mergulhe o fio de platina esterilizado na cultura bacteriana que lhe é fornecida.
3. Inocule o fio de platina carregado com bactérias no centro do meio de cultivo semi-sólido.
4. Incube em estufa para crescimento sob temperatura e tempo sugeridos.
Técnica IV: Meio sólido (ágar inclinado) para bactérias.

1. Ao redor da chama do bico de Bunsen, mergulhe o fio de platina esterilizado na cultura

bacteriana que lhe é fornecida.
2. Inocule o fio de platina carregado com bactérias na parte mais baixa do ágar inclinado até
quase encostar o fundo do tubo.
3. Durante a retirada do fio de platina, quando este atingir a superfície, suba fazendo estrias na
superfície do ágar.
4. Incube em estufa para crescimento sob temperatura e tempo sugeridos.

AULA PRÁTICA 9
 AULA PRÁTICA 9

ISOLAMENTO DE MICROORGANISMOS DO AMBIENTE

Obtenção de Culturas mistas

Em primeiro lugar inspecionar cuidadosamente as placas de Petri com ágar nutriente, e tubos de
ensaio com caldo nutriente, certificando-se sobre a esterilidade dos meios. Aqueles meios que se
apresentem contaminados devem ser descartados.

1. Coletar material de vários lugares com a utilização de um Swab estéril. Cada grupo vai ficar
responsável por um local diferente:

Grupo 1 e 7 = Boca

Grupo 2 e 8 = Nariz

Grupo 3 e 9 = Ouvido

Grupo 4 e 10 = Vaso sanitário

Grupo 5 e 11 = Bebedouro

Grupo 6 e 12 = Maçaneta da porta

Obs.: para a coleta do material recolhido do seu próprio corpo deve-se somente passar o cotonete sob
o local; e para a coleta em superfícies secas deve-se umedecer antes o cotonete em meio líquido
(caldo) estéril e depois proceder a coleta.

2. Inocular uma placa com o material coletado. Não se esqueça de anotar na tampa da placa o
que foi inoculado e a data.
3. Semear utilizando técnicas de semeadura simples ou composta, a gosto do grupo.
4. Incubar os meios semeados, na incubadora a 37oC.
5. Não se esqueça de esterilizar a alça antes e depois da utilização, nunca deixá-la sob a bancada e
efetuar as semeaduras próximas a chama do bico de Bunsen.

Técnicas de Isolamento de Bactérias em Culturas Puras

Após a semeadura e inoculação de meio ágar nutriente, com microrganismos do corpo humano e
do meio ambiente, os objetivos desta prática consistem em isolamento em cultura pura a partir das
culturas mistas que foram obtidas nessa aula, em meio sólido através da técnica de semeadura por
esgotamento.

1. Observe o desenvolvimento de colônias de microrganismos no meio ágar nutriente. Registre a

forma, tamanho, cor, elevação, bordos, das colônias desenvolvidas. Quantos tipos distintos de
colônias se desenvolveram? Qual a proveniência dessas colônias?
2. Selecione 1 tipo distinto de colônia desenvolvida no ágar nutriente. Anote as características
morfológicas da colônia selecionada.
3. Com uma alça de platina previamente esterilizada na chama do bico de Bunsen, toque numa das
colônias escolhidas e semeie (transfira) em placa de ágar nutriente nova, seguindo os
 movimentos relativos à semeadura composta. Esterilize a alça antes de cada arrastamento. Anote
na placa de Petri de onde é o material e a data.
4. Após as semeaduras inverta as placas de Petri (de modo que a região semeada fica de cabeça
para baixo) e incube a 37oC, 48h.

AULA PRÁTICA 10
METABOLISMO MICROBIANO

Introdução

A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas
Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou
leveduras através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato,
pela ação das enzimas de um dado microrganismo.
Bactérias realizam diversas atividades bioquímicas (crescimento e multiplicação) utilizando
matérias-primas (nutrientes) obtidas a partir do meio ambiente. As transformações bioquímicas que
ocorrem tanto dentro como fora das bactérias são regidas por catalisadores biológicos, as enzimas.
Esta parte do manual de laboratório apresenta testes para algumas das atividades bioquímicas de
bactérias, que vai ser realizado através da observação da capacidade das bactérias para utilização de
enzimas e capacidade de degradar carboidratos, lipídeos, proteínas e aminoácidos. Moléculas orgânicas
O metabolismo
Dessas frequentemente produz subprodutos que podem ser usados na identificação e
caracterização de bactérias
Cada microrganismo possui um sistema enzimático específico (perfil bioquímico), por isso as
provas bioquímicas são um recurso auxiliar valioso na identificação dos gêneros e espécies microbianas.
As provas bioquímicas baseiam-se em fenômenos como:

Utilização de fonte de carbono

carboidratos: polissacarídeos, dissacarídeos e monossacarídeos

alcoóis poli-hídricos: manitol, glicerol, sorbitol
glicosídeos: esculina

Utilização de fonte de nitrogênio

proteína: peptídeo, aminoácido

Outras
motilidade
Método: Para a correta caracterização e/ou identificação de um dado
microrganismo é necessário que o mesmo esteja ISOLADO ou em CULTURA PURA.

UTILIZAÇÃO DE FONTES DE CARBONO

 Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.) Um
determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o
que depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gás (que pode ser detectado
pela presença de bolhas no tubo de Durham) e ácidos orgânicos (que pode ser detectado
pela mudança de cor do indicador).

Mesmo com uma reação negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de
cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no máximo 24 h, pois podem ocorrer
reações alcalinas sobre outros substratos.

Utilizam-se meios básicos (pH 7,2) e o indicador de pH.

Principais Provas:

1 – Meio Mac Conkey: É um meio de cultura seletivo-indicador, utilizado para isolamento

de enterobactérias (bacilos Gram-negativos) a partir de fezes, urina, líquor, alimentos,
água residual, etc.

FUNDAMENTOS:

Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da microbiota Gram-positiva por ventura
existente no material (seletividade para Gram-negativo).
A lactose junto com o indicador de pH (vermelho neutro) serve para comprovar a degradação
(fermentação) deste carboidrato (o que é feito por apenas parte dos membros desta família).
Quando ocorre a fermentação, a bactéria é classificada como Lac +.
LEITURA:

• Colônias lactose-positiva (Lac +): degradação (fermentação) da lactose com acidificação

do meio que produzirá colônias de cor rosa com halo central mais claro.

• Colônias lactose-negativa (Lac.-): não utilização da lactose, formação de colônias

incolores e transparentes. As colônias assumem a coloração do meio,
que se apresentará um pouco alterado, devido à utilização dos outros componentes (só
não utilizará a lactose).

2 – Meio TSI (Tríplice Açúcar Ferro): Revela a fermentação da glicose, sacarose e lactose
e a produção de H2S pelos bastonetes Gram-negativos. Esses açúcares estão na proporção
de 1:10:10, respectivamente.

FUNDAMENTOS:

- A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para

amarelo (ácido), no fundo se fermentar apenas a glicose e no fundo e na superfície se
fermentar os outros açúcares também.
- As bactérias ao metabolizar aminoácidos sulforados ou degradar o tiossulfato de
sódio do meio, produz H2S que ao reagir com sulfato de ferro (presente no meio), forma
sulfeto ferroso, composto insolúvel de cor preta.
 - O ágar inclinado possibilita a verificação do metabolismo aeróbio na superfície do ágar
e de metabolismo anaeróbio no fundo do tubo, gerando uma série de combinações
possíveis.

3 – Meio SIM (Sulfeto Indol Motilidade): É um meio semi-sólido que permite a verificação
da motilidade do micro-organismo, a produção de H2S e produção de indol.

FUNDAMENTOS:

1. Motilidade: A bactéria móvel cresce e turva o meio além da picada, a imóvel cresce
somente na picada.

2. O meio contém sulfato férrico que ao reagir com o H2S, forma sulfato ferroso, de cor
negra.

3. O meio contém peptona e a triptona que são fontes de triptofano, que ao ser
metabolizado produz indol, que é indicado ao utilizar o reagente de Kovacs (para-
dimetilaminobenzaldeído), formando um produto de coloração vermelha.

triptofanase
Triptofano Indol + piruvato e amônia

LEITURA:

1)

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 2) Após o reativo de Kovacs

- Reação negativa: halo de cor amarela

- Reação positiva: halo de cor rósea a vermelha

4- Meio Citrato de Simmons: É um meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo

azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. Este teste
determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono
para o metabolismo e crescimento.

FUNDAMENTOS:

1. Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela

citratoliase ou citrilase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo
com que a reação se torne azul.

O piruvato é utilizado pela célula (para seu metabolismo) e o CO2 é liberado no

meio de cultura. O CO2 liberado reage então com o sódio (proveniente do sal citrato de
sódio incorporado na composição do meio de cultura), formando carbonato de sódio
(composto alcalino), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinização.

LEITURA:
Reação negativa: meio de cor verde
Reação positiva: meio de cor azul

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1 – Fermentação do manitol: O meio de Chapman, ou Ágar Manitol Salgado caracteriza-
se por apresentar uma alta concentração de NaCl – 7,5% - e contém o indicador de pH
vermelho de fenol.

FUNDAMENTOS:

Quando o micro-organismo utiliza o manitol como fonte de carbono, fermentando-o,

produz ácido no meio, reduzindo o pH e alterando a cor do indicador de vermelho (laranja)
para amarelo.

LEITURA:

1) As bactérias fermentadoras de manitol apresentam-se amarelas.

2 – Hemólise: Verifica a capacidade do micro-organismo em produzir hemólise.

FUNDAMENTOS:

O ágar sangue é um meio altamente nutritivo e que permite a visualização de propriedades

hemolíticas de diversos micro-organismos. Conforme o tipo de hemólise, o micro-
organismo pode ser classificado quanto ao potencial hemolítico em beta, se a hemólise for
total; alfa, se for parcial ou em gama, se não houver hemólise.

LEITURA:

Observar os halos de hemólise e os diferentes graus de hemólise: α–hemólise: presença

de um halo esverdeado ao redor das colônias de bactérias – lise parcial dos eritrócitos.
β–hemólise: presença de um halo transparente ao redor das colônias de bactérias – lise
total dos eritrócitos.
γ–hemólise: ausência de halo ao redor das colônias – os eritrócitos permanecem
íntegros, não ocorrendo hemólise.

Beta-hemólise
3- Prova da produção da catalase: - Esta enzima atua sobre a água oxigenada (peróxido
de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a em oxigênio e água.

FUNDAMENTOS:

O peróxido de hidrogênio é formado como produto final do metabolismo oxidativo

aeróbio dos carboidratos. A enzima catalase é participante do sistema enzimático de
alguns gêneros bacterianos e é encontrada somente em células viáveis.

LEITURA:

Observar a formação de bolhas sobre a cultura

 AULAS PRÁTICAS 11 e 12

Atividades bioquímicas das bactérias – provas bioquímicas

Prática Provas Bioquímicas – Parte I

Material por grupo:

- Cada grupo receberá uma cultura bacteriana, denominada de A, B, C D ou E.

Procedimentos:

1 – Realizar um esfregaço e efetuar a técnica de coloração de Gram;

2 – Analisar no microscópio e classificar o tipo de bactéria;

3 – As bactérias Gram-negativas deverão ser semeadas nos seguintes meios de

culturas: Mac Conkey, TSI, SIM e Citrato;

4 – Identifique cada tubo com a respectiva bactéria a ser inoculada, seu nome e data;

5 – Utilizando técnica asséptica, semeie a bactéria da seguinte forma:

A1- Meio Mac Conkey: Com auxílio da alça de platina devidamente flambada até o
rubro e FRIA, faça uma semeadura composta;

A2- Meio TSI: com fio de platina, efetue uma picada central com movimento firme e
retilíneo até o fundo do tubo e ao retirar a agulha faça estrias na superfície (bizel);

A3- Meio SIM: semeie com fio de platina uma picada central em movimento firme e
retilíneo até o meio do tubo;

A4- Meio Citrato: semeie com fio de platina, fazendo estria sinuosa ou reta na
superfície.

Obs.: O fio de platina não deve ser flambado entre um meio e outro. Somente deve
ser flambado após o término da operação.

– Incube por 18-24h a 35°C.

Prática Provas Bioquímicas – Parte II

1 – Faça a leitura e interpretação dos resultados de todas as provas.

2 – Após a leitura dos testes de motilidade e H 2S, no meio SIM, adicione 3 a 4 gotas
do reativo de Kovacs e analise os resultados.
 Prática Provas Bioquímicas – Parte III

Material por grupo:

- Cada grupo receberá uma cultura bacteriana, denominada de F, G, H, I ou J.

Procedimentos:

1 – Realizar um esfregaço e efetuar a técnica de coloração de Gram;

2 – Analisar no microscópio e classificar o tipo de bactéria;
3 – As bactérias Gram-positivas deverão ser submetidas à prova da catalase:

a) Separar uma lâmina limpa e seca;

4_Com o auxílio de uma alça de platina, flambada e resfriada, aplicar parte de uma
colônia isolada do microrganismo já classificado como coco Gram-positivo sobre o
centro da lâmina;

5- Pingar uma gota de H2O2 a 3% sobre o material contido na lâmina;

6 - Analisar e interpretar os resultados.

7 – As culturas catalases positivas deverão ser semeadas em placas de ágar manitol;

8 – As culturas catalases negativas deverão ser semeadas em ágar sangue

9 – Incube por 18-24h a 35°C.

Prática Provas Bioquímicas – Parte IV

1 – Faça a leitura e interpretação dos resultados de todas as provas.

2 – Efetuar o teste de sensibilidade a antimicrobianos – TSA

TICA 11

AULA PRÁTICA 13

ANTIBIOGRAMA

Um antibiograma é um ensaio que mede a susceptibilidade/resistência de uma bactéria

a um ou mais agentes antimicrobianos. Seu objetivo é tanto a análise do espectro de
sensibilidade/resistência a drogas de uma bactéria quanto à determinação da concentração
mínima inibitória.
Ágar Müeller Hinton é um meio de cultura em placas recomendado para a realização de
antibiograma (teste de sensibilidade) pela técnica de difusão de discos. O meio Müeller Hinton
é rico proteínas e carboidratos que fornece o substrato ideal para o desenvolvimento e
crescimento de cepas bacterianas de interesse clínico.
O teste, denominado antibiograma, é feito utilizando-se discos de difusão antibióticos
depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou, por espalhamento, uma amostra de
uma cultura bacteriana previamente crescida em meio líquido.
PROTOCOLO:

Semear, por espalhamento completo com alça de platina esterilizada ou swab estéril,
uma alíquota da cultura bacteriana em uma placa de Petri contendo meio Ágar de Mueller
Hinton.
Em seguida, depositar os discos de papel filtro impregnados, separadamente, com
quantidades determinadas de um antibiótico específico sobre a superfície do meio em
disposição ordenada. Podem ser utilizados os seguintes antibióticos:

Penicilina
Amipicilina
Gentaminicina
Eritromicina
**Cada antibiótico apresentava uma sigla especifica para sua identificação.

As placas são incubadas, na posição invertida, a 37ºC por cerca de 2 dias.

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 ÁTICA 10

AULA PRÁTICA 14

ISOLAMENTO DE MICROORGANISMOS (FUNGOS/

BACTÉRIAS) EM MEIOS SELETIVOS

2
Meio Sólido (ágar Manitol em Placa de Petri): Bactérias

Semeadura por esgotamento – simples e composta

1. Esterilize a alça de platina passando-a pelo bico de Bunsen

2. Ao redor da chama do bico de Bunsen, mergulhe a alça de platina esterilizada na amostra
que lhe é fornecida.
3. Encoste a alça carregada de bactérias na superfície do ágar e inicie movimentos de zigue-
zague retilíneos, uniformes e bem próximos (semeadura simples).
4. Desencoste levemente a alça de platina da superfície, gire a placa (± 90°), encoste novamente
a alça de platina no final da primeira semeadura e inicie nova semeadura com movimentos em
zigue-zague, retilíneos, uniformes e um pouco mais espaçados (semeadura composta).
5. Desencoste levemente a alça de platina da superfície, gire a placa (± 90°), encoste novamente
a alça de platina no final da segunda semeadura e inicie nova semeadura com os mesmos
movimentos, mas desta vez, bem espaçados (semeadura composta).
6. Incube em estufa para crescimento 37oC, 24h.

Meio Sólido (BDA em Placa de Petri): Fungos

Semeadura por esgotamento – simples e composta

1. Esterilize a alça de platina passando-a pelo bico de Bunsen

2. Ao redor da chama do bico de Bunsen, mergulhe a alça de platina esterilizada na amostra
que lhe é fornecida.
3. Encoste a alça carregada de fungos na superfície do ágar e inicie movimentos de zigue-
zague retilíneos, uniformes e bem próximos (semeadura simples).
4. Desencoste levemente a alça de platina da superfície, gire a placa (± 90°), encoste novamente
a alça de platina no final da primeira semeadura e inicie nova semeadura com movimentos em
zigue-zague, retilíneos, unifomes e um pouco mais espaçados (semeadura composta).
5. Desencoste levemente a alça de platina da superfície, gire a placa (± 90°), encoste novamente
a alça de platina no final da segunda semeadura e inicie nova semeadura com os mesmos
movimentos, mas desta vez, bem espaçados (semeadura composta).
6. Incube em estufa para crescimento 28oC, 24h.
 IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

Observar as lâminas confeccionadas por coloração simples e diferencial (Gram)

em microscópio óptico, na objetiva de 100X (com o auxílio do óleo de imersão)

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 IDENTIFICAÇÃO FÚNGICA

Observar as lâminas preparadas com lactofenol azul em microscópio ótico, na objetiva

de 40X

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