Apostila Práticas

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS EM BIOQUÍMICA
RECOMENDAÇÕES E USO DO LABORATÓRIO

RECOMENDAÇÕES PARA AS AULAS EXPERIMENTAIS
1. É obrigatório o uso de avental (jaleco) no laboratório; o mesmo deve ser comprido, com mangas longas e ser
usado fechado (com os botões fechados);
2. Não será permitido participar da aula de laboratório usando sandálias, bermudas, shorts ou saia;
3. Não é permitida a execução da aula usando celular, boné, óculos escuros e
fones de ouvido;
4. É proibido comer, fumar ou beber no laboratório;
5. Cabelos compridos devem estar devidamente presos;
6. Evitar ao máximo faltar ou chegar atrasado às aulas práticas para não ser
prejudicado;
7. O aluno que faltou em aula prática terá prejuízo no componente da parte prática da nota e nos seus
conhecimentos daquele tópico, uma vez que não há possibilidade de reposição da aula perdida;
8. Os roteiros deverão ter sido lidos antecipadamente ao início da aula. Aula se iniciará impreterivelmente no
horário estipulado. Será dado tempo de 05 minutos para tirar as dúvidas pertinentes ao protocolo experimental
antes de sua execução.
9. Tomar o máximo de cuidado para não contaminar reagentes: não trocar as tampas. Usar uma pipeta e/ou
ponteira de micropipeta para cada reagente. Não utilizar frascos de outra bancada. Ler o rótulo do frasco antes de
utilizá-lo.
10. Ao aquecer o tubo de ensaio, deve-se proceder de maneira adequada, para que o conteúdo não seja lançado
fora, causando acidentes graves. Líquidos inflamáveis (éter, álcool, acetona, benzeno, etc.) devem permanecer
distantes de chama ou fonte intensa de calor.
11. Reações com liberação de gases tóxicos deverão ser realizadas na capela.
12. Deve-se tomar o máximo de cuidado com ácidos e bases concentradas, pois estes atacam a pele. No caso de
acidentes com substâncias cáusticas, o fato deve ser comunicado ao professor(a) para providências.
13. Antes de iniciar e ao terminar as experiências a bancada deve permanecer organizada.
14. Trazer caneta marcadora permanente para marcar vidraria.
15. Entregar os relatórios solicitados nas datas estipuladas pelo(a) professor(a).
CONHECENDO OS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS A SEREM UTILIZADOS NAS AULAS PRÁTICAS.
A) UTENSÍLIOS PARA CONTER VOLUMES:

São enquadrados neste item, aqueles utensílios usados no preparo de soluções; evaporações; armazenamento de
líquidos; conter reagentes durante uma reação; receber produtos de uma reação; etc. Todos
estes utensílios são caracterizados por apresentarem diâmetros variados e consequentemente
volumes variáveis.
Copo de Becker (Griffin)

Serve para dissolver substâncias, efetuar reações químicas ou conter volumes de reagentes
Tubo de Ensaio
Empregado para fazer reações em pequena escala, tanto a frio como a quente.
B) UTENSÍLIOS PARA MEDIR VOLUMES

São destinados a fornecer volumes variados ou definidos durante o preparo de soluções e reagentes, durante uma
reação e outras operações de laboratórios. Nunca devem ser levados a estufa de secagem a temperaturas elevadas.
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Todo utensílio para medir volume traz a marca do fabricante relacionada com a temperatura que foi calibrado e a esta
temperatura de graduação é que fornece o volume exato.
Pipeta graduada
Consiste de um tubo de vidro estreito geralmente graduado em 0,1 mL. É usada para medir pequenos volumes líquidos.
Proveta
Consiste de um tubo de vidro largo graduado. É usada para medir pequenos a grandes volumes
líquidos.
C) UTENSÍLIOS DE USO LIMITADO (AUXILIARES)

As operações em química necessitam além dos utensílios de conter e medir volumes, outros mais específicos, de
funções definidas que auxiliam as manipulações, montagens de aparelhos, processos químicos em geral, desde uma
simples filtração até processos muito complicados. Os mais importantes e de uso corriqueiro são os seguintes.
Funil comum
Usado para transferência de líquidos.
Bico de Bunsen
É a fonte de aquecimento mais usada no laboratório.
Pisseta (Frasco Lavador)

Usada para lavagem de materiais ou recipientes através de jatos de água destilada, álcool ou outros
solventes.
Pinça
É um utensílio de ferro ou madeira, destinado a segurar, prender e retirar tubos de ensaio e
cápsulas, quando submetidos ao aquecimento.
Tripé
Sustenta a tela de amianto, podendo ser utilizado para outros fins.
Tela de amianto
Usada para aquecimento indireto de utensílios de vidro, porcelana e demais utensílios que sejam
submetidos a aquecimento sobre o bico de gás.
Estante de tubos de ensaio

Usada para sustentação de tubos de ensaio em posição vertical por ocasião de reações em
tubos.
3
Pipeta Pasteur
Usada para transferir pequenos volumes.
Uso em conjunto com uma tetina de
borracha ou silicone para pipetas Pasteur de vidro.
Pró-pipeta (Pêra)
Usada em conjunto com pipetas graduadas ou volumétricas para transferência segura de
soluções.
Bastão de vidro
Usados para agitação de soluções.
Espátulas de aço
Usados para transferir substâncias como reagentes secos e sais.
D) EQUIPAMENTOS
Balança semi-analítica e analítica.

Utilizados pesar substâncias derivadas de sais e/ ou compostos secos.
Diferença está na faixa de precisão e carga limite de cada uma delas.
Banhos-maria.
Utilizados para manter a temperatura em determinado valor, especialmente em reações
enzimáticas. O calor é transferido da resistência para a água contida na câmara e este para o
recipiente (tubo de ensaio ou béquer).
Banho de areia.
Utilizados para transferir altas temperaturas para o recipiente contendo a substância a ser
aquecida. O calor é transferido da resistência para a areia contida na câmara e este para o
recipiente (béquer, erlenmeyer e/ou outro recipiente).
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pHmetro
Equipamento que permite medir a concentração de íons H+ de uma solução na forma de
uma escala logarítmica (escala de pH) que varia de zero a quatorze (0,00-14,00)..
NOÇÕES DE PIPETAGEM USANDO PRÓ-PIPETAS COM PIPETAS DE VIDRO.

A transferência de volume exato de líquidos é fundamental para vasta maioria dos experimentos na área da bioquímica.
De uma maneira geral, o conhecimento sobre o pipetamento de líquidos, a compreensão de seus limites de precisão,
bem como o estudo de sua importância na execução reprodutível de experimentos justifica a relevância e abordagem
deste tema nesta aula.
TÉCNICAS DE PIPETAGEM – PIPETAS DE VIDRO

Os frascos volumétricos comumente utilizados em laboratório são classificados em dois grupos: os calibrados para
conter um certo volume (TC, to contain, gravado no vidro), sendo utilizados para preparar volumes fixos de solução e
aqueles utilizados para transferir um determinado volume (TD, to deliver). Na calibração, os frascos volumétricos TD
têm seus volumes corrigidos com relação ao filme líquido que fica retido na parede interna, escoando apenas o volume
aferido. As pipetas volumétricas são utilizadas para transferir volumes fixos (alíquotas) de solução, enquanto que as
graduadas, volumes variáveis. As pipetas volumétricas mais utilizadas possuem capacidades de 0,5 a 100 mL e as
pipetas graduadas de 1 a 25 mL. As buretas são frascos volumétricos TD, empregados para escoar volumes variáveis
de líquido e são manuseadas em titulações. As de uso rotineiro possuem capacidades de 5, 10, 25, 50 e 100 mL.
Balões volumétricos são construídos para conter um certo volume de líquido (TC) e são usados na preparação de
soluções de concentração conhecida. Os balões volumétricos mais empregados são de 1 mL a 2 L.
1) Use sempre uma pró-pipeta.
2) Leitura correta de volume: ao ler volumes em vidraria volumétrica deve-se evitar erros decorrentes de mau
posicionamento de seu olho em relação à altura do menisco do líquido. Procure sempre se posicionar de modo que sua
linha de visão fique na mesma direção da superfície do líquido.
3) Modo correto de se ler o volume de um líquido em um aparelho volumétrico: linha de visão horizontal à superfície do
líquido.
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TRAZER JALECO!
VESTIMENTA: SAPATO FECHADO,

CALÇA E CABELOS PRESOS!
TRAZER CANETA MARCADOR

PERMANENTE (CD/DVD)!
PAPEL ALMAÇO PAUTADO PARA

RELATÓRIOS
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AULA PRATICA 01 – PIPETAGEM USANDO PIPETAS DE VIDRO E PRÓ-
PIPETA
OBJETIVOS
-Identificar e familiarizar-se com a vidraria e equipamentos de laboratório utilziados no laboratório de bioquímica.
-Aprender realizar pipetagem correta usando pipetas graduadas emicorpipetas.
-Aprender noções de diluição de soluções.
-Aprender uso de balanças analítica e semi-analítica.
NÚMERO TOTAL DE EXPERIMENTOS: 02.
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10mL Pró-pipeta Tubos de ensaio grandes (20mL)
Micropipeta volume variável 100-100 μL Estantes de tubos Água destilada
Corante azul de bromofenol 0,0025 % em água (m/v)
Ponteiras (tips) azuis para micropipeta de 100-100 μL
EXPERIMENTO 1-2 – DILUIÇÃO USANDO PIPETAS DE VIDRO COM PRÓ-PIPETAS

PRODECIMENTO EXPERIMENTAL
a) Identifique a pipeta em relação ao seu volume a ser pipetado e o tipo de pipeta (TC ou TD).
b) Acoplar (encaixar) a pipeta à pró-pipeta. (Pipeta de 10 mL pode não encaixar na pró-pipeta. Neste
caso, não forçar, pois corre o risco dela quebrar e introduzir fragmentos de vidro na mão).
c) Preencher a pipeta acima da graduação máxima.
d) Acertar o menisco da pipeta na marcação máxima.
e) Proceder pipetagem dos volumes a serem pipetados nos cinco tubos de ensaio enumerados com as
soluções abaixo, agitando para homogeneizar a mistura de soluções.
f) Anotar e responder as questões abaixo.
Passos
1º 2º 3º 4º
Tubo Água destil. Corante estoque
Agitar Resultados
(mL) (2,5x10-3 %)
1 10 -
2 - 10 mL Observar mudança gradual na
3 9 mL 1 mL 3 seg coloração em correspondência
4 5 mL 5 mL com a diluição
5 1 mL 9 mL
QUESTÕES:
É POSSIVEL CALCULAR A CONCENTRAÇÃO FINAL DE CADA UM DOS TUBOS ONDE FORAM
REALIZADAS ESSAS DILUIÇÕES? POR QUE? COMO VOCÊ FARIA?
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AULA PRATICA 02 - DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE pH
OBJETIVOS
-Construir uma escala com diferentes valores de pH.
-Determinar o pH das soluções utilizando os métodos colorimétricos (indicadores de pH).
-Compreender melhor a dinâmica de funcionamento de uma solução tampão.
-Verificar o efeito de ácidos e bases sobre soluções tamponadas e não tamponadas.
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10 mL Pró-pipeta Tubos de ensaio grandes (20mL)
Estantes de tubos Pipeta Pasteur Água destilada
Soluções e Reagentes*
*SOLUÇÕES E REAGENTES
-Solução tampão variando de pH 3,0 a 8,0 (Tampão McIlvaine – Mistura em diferentes volumes de soluções de fosfato
de sódio dissódico 0,2M e de ácido cítrico 0,1M). Solução pH 14: solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2M acertado
com solução de ácido cclorídrico (HCl) 0,1 M.
-Indicador de pH universal: reagente de Bogen (fenolftaleína 20mg; vermelho de metila 40mg; azul de bromotimol
80mg; azul de timol 100mg; etanol absoluto q.s.p. 100mL; dissolver e juntar solução de NaOH até desaparecimento da
cor vermelha e substituição desta pela cor amarela) ou reagente de Shinobu Yama (azul de timol 0,018g; vermelho de
metila 0,025g; azul de bromotimol 0,1g; fenolftaleína 0,2g; etanol 95% 200mL; NaOH-10% 10mL; água destilada q.s.p.
400mL (q.s.p. quantidade suficiente para).
-Hidróxido de sódio 0,1M;
-Ácido clorídrico 0,1M;
EXPERIMENTO 1-2 – PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO DE pH

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Prepare uma série de sete tubos de ensaio, identificando-os de acordo com o seu pH, conforme tabela a seguir
(SEGUIR PASSOS INDICADOS NA TABELA).
2) Adicionar, solução tampão McIlvaine pH 3,0 a pH 8,0 e solução de pH 14,0 conforme tabela abaixo.
3) Adicionar em cada tubo 05 gotas de indicador universal e 9,0 mL de água destilada.
4) Agite a solução e anote resultados (colorações) na tabela abaixo.
5) Não descartar as soluções dos tubos, pois a coloração será a referência para os demais experimentos.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º
Tubo
Tampão Indicador Água Resultados
Agitar
pH Volume universal destilada (Coloração)
1 3,0 1 mL 5 gotas 9 mL 3 seg
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AULA PRATICA 02 - DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE pH
EXPERIMENTO 2-2 – TESTE DA CAPACIDADE TAMPONANTE DE DIFERENTES SOLUÇÕES
1) Prepare uma bateria com quatro tubos de ensaio e numere-os de 1 a 4, conforme tabela a seguir.
2) Acrescente nos respectivos tubos de ensaio as soluções descritas na Tabela 1 abaixo:
TABELA 1
PASSOS
Tubo 1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º
Indicador Água Tampão RESULTADOS Experimentos seguintes

Agitar
universal destilada pH 7,0 (Cor/pH) Parte A-B Parte B-B
1 5 gotas 10 mL - 3 seg
2 5 gotas 9 mL 1 mL 3 seg Seguir Seguir
3 5 gotas 10 mL - 3 seg TABELA 2 TABELA 3
4 5 gotas 9 mL 1 mL 3 seg
PARTE A-B (TABELA 2)

1) Adicione 1 gota de NaOH aos tubos 1 e 2. Agite. ** Observe e explique.
2) Com uma pipeta de vidro ou canudo assopre a solução do tubo 1 cuidadosamente por 15 segundos.
** Observe as mudanças de coloração. Determine o pH. Explique.
3) Assopre a solução do tubo 2 por um minuto.**OBSERVE E EXPLIQUE EM TERMOS DA ACIDEZ, BASICIDADE E
TAMPONAMENTO.
TABELA 2
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º
Tubo
Resultados
NaOH Agitar Assoprar Resultados (Cor)
(Cor)
1 1 gota 3 seg 15 seg
2 1 gota 3 seg 1 min
PARTE B-B (TABELA 3)

4) Adicione aos tubos 3 e 4 duas gotas de HCl 0,1M. Agite. ** Observe a mudança de coloração, anote o pH de cada
tubo e explique em termos da acidez, basicidade e tamponamento.
5) Continue a adição de HCl 0,1M no tubo 4, gota a gota, agitando-o. Determine quantas gotas ou mL de HCl devem
ser adicionadas até que se obtenha a mesma coloração do tubo 3. **EXPLIQUE O RESULTADO OBTIDO EM
TERMOS DA ACIDEZ, BASICIDADE E TAMPONAMENTO.
TABELA 3
PASSOS
Tubo 1º 2º 3º 4º 5º
HCl Agitar Resultados (Cor) HCl Resultados (Cor)
3 2 gotas 3 seg -
4 2 gotas 3 seg N gotas=
o Mesma coloração tubo 3
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AULA PRÁTICA 02 - REAÇÕES QUALITATIVAS PARA AMINOÁCIDOS E
PROTEÍNAS
OBJETIVOS
Identificar e caracterizar diferentes aminoácidos e proteínas através de reações específicas.
Número total de experimentos: 04.
PROTEÍNAS UTILIZADAS
LEITE - O leite é uma combinação de diversos elementos sólidos em água. Os elementos sólidos representam
aproximadamente 12 a 13% do leite e a água, aproximadamente 87%. Os principais elementos sólidos do leite são
lipídios (gordura), carboidratos, proteínas, sais minerais e vitaminas. Esses elementos, suas distribuições e interações
são determinantes para a estrutura, propriedades funcionais e aptidão do leite para processamento. As micelas de
caseína e os glóbulos de gordura são responsáveis pela maior parte das características físicas (estrutura e cor)
encontradas nos produtos lácteos.
(http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/Agencia8/AG01/arvore/AG01_128_21720039243.html - Acesso 27/ABR/2018)
(http://ansci.illinois.edu/static/ansc438/Milkcompsynth/milkcomp_physicochem.html - Acesso 09/MAI/;2018)
OVO - A clara do ovo apresenta um teor de água na faixa de 87-89%, podendo variar
em função fundamentalmente da estirpe e da idade das galinhas. A clara é constituída
basicamente por água, cujo conteúdo decresce ligeiramente das camadas externas
para as internas. A clara é considerada como um sistema protéico constituído por fibras
de ovomucina inclusas numa solução aquosa contendo grande quantidade de proteínas
globulares. As proteínas da clara são ricas em albumina que é representada pela
ovoalbumina e conalbumina,as quais respondem por 70% da proteína total.
https://edisciplinas.usp.br/mod/resource/view.php?id=1842310 (ACESSO 27/abr/2018)
Para estas práticas tomar cuidado ao pipetar acetato de chumbo (metal tóxico); Hidróxido
de Sódio (NaOH) concentrado e Ácido nítrico (HNO3) (corrosivos e irritantes). Eles
devem ser pipetados com pró-pipeta em capela de exaustão pelo técnico responsável.
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PROTEÍNAS
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10mL Pró-pipeta Tubos de ensaio médios (15mL)
Soluções e Reagentes* Pipeta Pasteur Água destilada
Banho-maria fervente Ovo fresco Leite
EXPERIMENTO 1-4 - REAÇÃO COM BIURETO
FUNDAMENTO TEÓRICO
O sulfato de cobre (CuSO4) em meio alcalino reage com as substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas
dando um complexo de coloração característica (púrpura). A intensidade da cor obtida é proporcional ao número de
ligações peptídicas.
*SOLUÇÕES E REAGENTES
-Reagente biureto (mistura de 1 volume de hidróxido de sódio (NaOH) 2,5 M (10%, m/v) + 1 volume de Sulfato de cobre
1% (m/v)).
-Água destilada.
-Leite in natura.
-Clara de ovo diluída 10% (v/v).
-Glicina 1% (m/v).
-Glutamato monossódico (Ajinomoto).
1) Adicionar em cada tubo as soluções, seguindo os passos da tabela abaixo, começando pelas soluções.
2) Adicione o reagente de biureto, agitando continuamente.
3) Observar, anotar e interpretar os resultados obtidos em termos das propriedades bioquímicas das proteínas e
aminoácidos e da reação observada.
PASSOS
Tubos 1º 2º 3º 4º
Solução Reagente de Biureto Agitar Resultados (Cor)
1 Água destilada 1mL 1 mL 3 seg Controle
2 Glicina 1mL 1 mL 3 seg
3 Glutamato monossódico (Ajinomoto) 1mL 1 mL 3 seg
4 Leite 1mL 1 mL 3 seg
5 Clara de ovo 1mL 1 mL 3 seg
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PROTEÍNAS
EXPERIMENTO 2-4 - REAÇÃO COM NINHIDRINA

FUNDAMENTO TEÓRICO
A ninhidrina é um agente oxidante que reage com grupos amino livres de aminoácidos, peptídeos e proteínas desde que
o pH da solução esteja entre 4 e 8, dando origem a púrpura de Ruhemann, de cor arroxeada. A reação também ocorre
com aminas primárias e amônia, porém sem liberação de CO2.
Os aminoácidos (prolina e hidroxiprolina) também reagem com a ninhidrina, porém neste caso, obtém-se um produto de
cor amarela.
SOLUÇÕES E REAGENTES
-Ninhidrina.
-Leite in natura.
-Clara de ovo in natura.
-Solução de prolina 0,1M.
2) Adicione reagente de ninhidrina.
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PROTEÍNAS
3) Ferver alguns minutos até o aparecimento de cor.

4) Comparar os tubos.
Observar, anotar e interpretar os resultados obtidos em termos das propriedades bioquímicas das proteínas e
O O
H
OH OH O
OH
+ R-C-COOH
H + NH3 + CO2 + R-C
+NH3 H
O O
NINHIDRINA OXIDADA
NINHIDRINA REDUZIDA
O O
NINHIDRINA OXIDADA
+ + NH3 C N-C-
NINHIDRINA REDUZIDA
+ 3H2O
O O-
PÚRPURA DE RÜHEMANN
(Complexo colorido)
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º
Tubo
Reagente de Banho Resultados
Solução Agitar
Ninhidrina fervente (Coloração)
1 Água destilada 1 mL 1 mL 3 seg 5 min Controle
2 Leite 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
3 Clara de ovo 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
4 Glicina 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
Glutamato monossódico
5 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
(Ajinomoto)
6 Prolina 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
EXPERIMENTO 3-4 - REAÇÃO XANTOPROTEICA

FUNDAMENTO TEÓRICO
As proteínas possuem grupamento fenil ( ) reagem com o ácido nítrico (HNO3) formando compostos fortemente
coloridos em meio alcalino.
Os aminoácidos como a tirosina e o triptofano darão teste positivo com o aparecimento de cor amarelo-alaranjado.
-HNO3 concentrado.
-NaOH 5M (20%).
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PROTEÍNAS
-Leite in natura.
-Clara de ovo in natura.
-Aminoácidos Tirosina, Triptofano e Glicina 1% (m/v).
2) Adicione HNO3 (Peça auxílio ao docente, técnico ou monitor).
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º
Tubo
Banho NaOH 5M
Solução HNO3 Agitar Agitar Resultados
fervente (20%)
1 Água destilada 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg Controle
2 Leite 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg
3 Clara de ovo 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg
4 Tirosina 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg
5 Triptofano 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg
Glutamato monossódico
6 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg
(Ajinomoto)
7 Glicina 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 2 mL 3 seg
EXPERIMENTO 4-4 - REAÇÃO PARA AMINOÁCIDOS SULFURADOS

FUNDAMENTO TEÓRICO
O enxofre que nas proteínas se apresenta na forma de grupos sulfidrilos (-SH) ou dissulfeto (cisteína e cistina) pode ser
identificado pela formação de sulfeto de chumbo (PbS), após as proteínas serem aquecidas com acetato de chumbo
(Pb(C2H3O2)2) em solução alcalina. O enxofre da metionina não é lábil em meio alcalino. Um precipitado fino castanho ou
preto, sulfeto de chumbo, indicará a presença de cisteína e cistina.
NaOH 2,5M (10%, m/v), Pb(C2H3O2)2 1,54 mM (5%, m/v) (acetato de chumbo), clara de ovo in natura, leite in natura, fios
de cabelo, glicina 1% (m/v).
2) Adicione NaOH e incube tubos em banho fervente.
3) Adicione o acetato de chumbo e incube os tubos em banho fervente novamente.
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PROTEÍNAS
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º
Tubo
NaOH
Banho Banho
Solução 2,5 M Agitar Agitar Pb(C2H3O2)2 Agitar Resultados
fervente fervente
(10%)
1 Água destilada 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 3 seg 5 gotas 3 seg 5 min Controle
Água destilada
2 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 3 seg 5 gotas 3 seg 5 min
+fios de cabelo
3 Leite 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 3 seg 5 gotas 3 seg 5 min
4 Clara de ovo 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 3 seg 5 gotas 3 seg 5 min
5 Glicina 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 3 seg 5 gotas 3 seg 5 min
Glutamato
6 monossódico 1 mL 1 mL 3 seg 5 min 3 seg 5 gotas 3 seg 5 min
(Ajinomoto)
QUESTÕES:
1) EM QUE SE FUNDAMENTA A REAÇÃO DO BIURETO E QUE GRUPOS NAS

PROTEÍNAS SÃO RESPONSÁVEIS POR ESTA REAÇÃO?
2) EM QUE SE FUNDAMENTA A REAÇÃO DA NINHIDRINA E QUE CLASSES DE

SUBSTANCIAS REAGEM POSITIVAMENTE?
3) O QUE PROVAVELMENTE OCORRE COM AS ESTRUTURAS DAS PROTEÍNAS

QUANDO REAGEM COM O ÁCIDO NÍTRICO PARA FORMAREM SOLUÇÕES
COLORIDAS?
4) QUE TIPO DE INTERAÇÃO COVALENTE PODE OCORRER ENTRE OS GRUPOS

SULFIDRILAS (-SH) DO AMINOÁCIDO CISTEÍNA E QUAL A IMPORTÂNCIA DESSA
INTERAÇÃO PARA UMA PROTEÍNA?
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AULA PRÁTICA 03 – MÉTODOS DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
FUNDAMENTO TEÓRICO
A solubilidade de uma proteína é muito variável e depende da distribuição e da proporção dos grupos polares
(hidrofílicos) e de apolares (hidrofóbicos) na molécula.
Muitas proteínas são solúveis em água ou soluções salinas. Como uma proteína possui muitos grupos carregados
positiva ou negativamente, provenientes das
cadeias laterais dos aminoácidos, essas moléculas
irão interagir uma com as outras, com pequenos
íons de cargas opostas e com a água. Assim,
ocorrem interações proteína-proteína, proteína-
pequenos íons e proteína-água. Se a interação
proteína-água é pequena, a proteína tenderá a ser
insolúvel. Por outro lado, se a interação proteína-
água é alta, a proteína tenderá a ser solúvel.
Qualquer condição que aumente a interação
proteína-água, aumentará a solubilidade e vice-
versa.
A desnaturação, geralmente, diminui a
solubilidade das proteínas. As proteínas possuem
uma estrutura tridimensional específica que está
relacionada com suas propriedades físicas e
biológicas. A modificação na estrutura
tridimensional nativa de uma proteína é conhecida
como desnaturação. A desnaturação envolve
alterações nas estruturas secundária, terciária e
quaternária, mas não da primária.
Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, alcális, solventes orgânicos, uréia, detergentes,
sais de metais pesados, etc.
A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos que prejudicam a interação
proteína-água e favorece a interação proteína-proteína. A floculação e a coagulação são manifestações visíveis das
alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.
As reações de precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas
em solução, também são úteis para promover a desproteinização de líquidos biológicos para análise de componentes
não protéicos.
Durante a precipitação por calor, se ocorrer por tempo prolongado, pode ocorrer a reação de
Maillard, uma reação química entre um aminoácido ou proteína a um carboidrato redutor: o grupo
carbonila (C=O) do carboidrato interage com o grupo amino (-NH2) do aminoácido ou proteína, e após
várias etapas produz as melanoidinas. Essa reação é caracterizada por dar aos alimentos o sabor, o
odor e a cor dourada.
PROTEÍNAS ANALISADAS
Leite
O leite é uma mistura homogênea contendo várias substâncias nutrientes, sendo alguns mantidas em emulsão
(lipídeos e substâncias associadas), outros em suspensão (caseínas ligadas a sais), e ainda outros em dissolução
verdadeira (lactose, vitaminas hidrossolúveis, proteínas do soro, sais, etc). As moléculas de água constituem grande
parte do leite (88%). Nesse ambiente aquoso estão os demais componentes.
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A lactose, um dissacarídeo insolúvel, é o principal carboidrato (4,7~5,2 %). Possui também outros sacarídeos como
a sacarose (1/6), seguidos de pequenas quantidades de glicose e galactose. A lactose, sob alta temperatura e na
presença de proteína, sofre reação de Maillard, resultando em coloração parda. A lactose e sua degradação ajuda no
desenvolvimento de microrganismos da flora intestinal e diminuição do pH nessa região, contribuindo para a absorção
de cálcio no organismo, devido a essa redução do pH intestinal, levando à solubilidade e disponibilidade dos compostos
do cálcio.
Os lipídeos majoritários do leite são os triglicerídeos (95%), sendo que os outros 5% restantes são ácidos graxos
como o butírico, capróico, caprílico, láurico, mirístico, esteárico e oléico. Esses lipídeos formam micelas de diversos
tamanhos, suspensos na fase aquosa. Já as principais proteínas encontradas no leite são as caseínas (80%) seguidas
das proteínas do soro (20%).
A caseína está associada ao cálcio e ao fósforo. Ela pode ser coagulada por ação de ácidos, coalhos (enzimas) ou
álcool, e são um grupo de fosfoproteínas com baixa solubilidade em pH 4,6. É formada por submicelas (α1 α2, β, γ e κ)
mantidas unidas por interações hidrofóbicas e pontes salinas.
As outras proteínas do soro são formadas pela albumina do soro, α-lactoalbumina, β-lactoglobulina, imunoglobulinas
e proteose-peptonas, sendo desnaturada em temperaturas superiores a 80ºC. Essa desnaturação contribui para seu
uso como agentes emulsificantes devido à facilidade de interagir com as partículas hidrofóbicas e com as moléculas de
água. Além disso, possui enzimas (cerca de 60 diferentes enzimas) em baixa concentração, mas que provocam a
hidrólise de componentes como proteases e lipases.
Ovo
A clara do ovo é constituída de 88,5% por água, 13,5% de proteínas, vitaminas Riboflavina (B2), traços de gorduras,
pequenas quantidades de glicoproteínas, glicose e sais minerais. A ovalbumina e a conalbumina (~70%) são as
principais proteínas e são responsáveis pelos efeitos de gelatinização. Outras proteínas também estão presentes como
ovomucóides, ovomucinas e lisozimas.
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10mL Pró-pipeta Tubos de ensaio grande (20mL)
Leite in natura Clara de ovo Ácido sulfosalicílico 10% (m/v)
Acetato de chumbo (Pb(C2H3O2)2) 5% (m/v) Cloreto de sódio 1M Sulfato de amônio ((NH4)2SO4) saturado
Banho-Maria fervente Pipeta Pasteur Água destilada
Número total de experimentos: 04.
EXPERIMENTO 1-4 – PRECIPITAÇÃO PELO CALOR (TÉRMICA)

O calor pode desnaturar a maioria das proteínas, pois a agitação térmica afeta as interações que estabilizam a estrutura
tridimensional das proteínas, como, por exemplo, as pontes de hidrogênio.
1) Separar dois tubos de ensaio, conforme tabela a seguir (SEGUIR PASSOS INDICADOS NA TABELA):
2) Pipetar solução de proteínas (2 mL) e aquecer em banho fervente ou bico de Bunsen.
3) Observar resultados e explicar o que ocorre com a estrutura tridimensional das proteínas nesse experimento.
Tubo PASSOS
1º 2º 3º 4º
Solução proteínas Aquecer (min) Esfriar Resultados
1 Clara de ovo 2 mL 10 min Agua corrente
2 Leite 2mL 10 min Agua corrente
17
EXPERIMENTO 2-4 – PRECIPITAÇÃO ÁCIDA (REAGENTES PARA ALCALÓIDES)

Os reagentes para alcalóides são ácidos que além de precipitarem alcalóides também podem combinar-se com as
proteínas que possuem cargas positivas e quando pH da solução estiver igual ao ponto isoelétrico da proteína, forma-se
complexos insolúveis. Exemplos destes compostos são: ácido pícrico, ácido sulfossalicílico, ácido tricloroacético, etc.
Por exemplo, a reação de proteínas com tricloroacético leva à formação de um tricloroacetato de proteína, que é
insolúvel.
Solução de proteína e Ácido tricloroacético (TCA) ou ácido sulfossalicílico 10% (m/v).
2) Pipetar solução de proteínas (1 mL).
3) Pipetar 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) ou ácido ácido sulfossalicílico 10% (m/v).
4) Observar formação de precipitado branco e explicar, com seus conhecimentos sobre estrutura de proteínas, os
resultados observados.
PASSOS
1º 2º 3º 4º
Tubo
Ácido Agitar
Solução proteínas Resultados
sulfossalicílico
1 Clara de ovo 1 mL 1 mL 3 seg
2 Leite 1 mL 1 mL 3 seg
EXPERIMENTO 3-4 – PRECIPITAÇÃO POR SAIS DE METAIS PESADOS.

Em pH situado no lado alcalino do seu pI (ponto isoelétrico), algumas proteínas combinam-se com cátions de metais
pesados, formando proteinatos insolúveis.
Solução de proteína e Acetato de chumbo (Pb(C2H3O2)2) 5% (m/v).
2) Pipetar solução de proteínas (1 mL).
3) Pipetar 1 mL de acetato de chumbo Pb(C2H3O2)2 5% (m/v).
4) Observar formação de precipitado branco e explicar, com seus conhecimentos sobre estrutura de proteínas, os
resultados observados.
Passos
Tubo 1º 2º 3º 4º
Solução proteínas Acetato de chumbo Agitar Resultados
1 Clara de ovo 1 mL 1 mL 3 seg
2 Leite 1 mL 1 mL 3 seg
18
EXPERIMENTO 4-4 – PRECIPITAÇÃO SEM DESNATURAÇÃO.

FUNDAMENTO TEÓRICO
As proteínas podem ser precipitadas sem desnaturação por ação de solventes orgânicos, variações do pH e por
alterações da força iônica do meio.
Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas

A capacidade de sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função da força iônica que tanto
depende de sua concentração como da valência de cátions e ânions que formam o sal. Em concentração reduzida, os
sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado “Salting-in”. Provavelmente isto ocorre
devido à interação da proteína com os sais, causando diminuição da interação proteína-proteína e, portanto,
aumentando a solubilidade. Em altas forças iônicas, conseguidas pela adição de grandes quantidades de um sal muito
solúvel, como por exemplo, o sulfato de amônio a uma solução de proteínas, pode ocorrer a remoção da água de
hidratação das moléculas, o que leva a predominância da interação proteína-proteína, resultando em precipitação. Esse
efeito é denominado “Salting-out”. Misturas complexas de proteínas podem ser separadas por este processo uma vez
que a concentração de sal necessária para precipitar diferentes proteínas é variável.
Exemplo: Efeito da força iônica sobre a solubilidade da albumina.
1) Clara de ovo “in natura”.
2) Cloreto de sódio 1M.
3) Solução saturada de sulfato de amônio ((NH4)2SO4).
19
a) SOLUBILIZAÇÃO - “SALTING-IN”
PASSOS Procedimento. “Salting-in”
1º Adicionar 2 mL clara de ovo em tubo de ensaio grande.
2º Adicionar água destilada em alíquotas de 1 mL em 1 mL, agitando cuidadosamente o tubo a cada adição
até aparecimento precipitado (Globulinas). Importante: anote a quantidade de água adicionada.
3º Adicionar cloreto de sódio (NaCl) em alíquotas de 2 mL em 2 mL até sua redissolução. *Restauração da
força iônica original: “Salting-in”.
4º Guardar solução para próximo experimento (“Salting-out”).
5º Anotar resultados e explicar.
b) PRECIPITAÇÃO – “SALTING-OUT”
PASSOS Procedimento
1º Adicionar 2 mL da solução experimento anterior em tubo de ensaio.
2º Adicionar 5 mL de solução saturada de sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e observar formação de precipitado
de proteínas (globulinas). * Efeito “Salting-out”
3º Adicionar 5 a 10 mL de água destilada para redissolução do precipitado, reestabelecendo, dessa forma, a
força iônica inicial.
4º Anotar resultados e explicar.
QUESTÃO:
1) VISTO OS RESULTADOS NOS EXPERIMENTOS, EXPLICAR A DIFERENÇA ENTRE OS TERMOS
DESNATURAÇÃO, INATIVAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS.
20
AULA PRÁTICA 04 – CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
DA AMILASE SALIVAR
OBJETIVOS
Estudar os parâmetros cinéticos na amilase salivar: a especificidade, a termolabilidade (termoestabilidade), a
influência do pH e da concentração de enzima sobre a velocidade de hidrólise do substrato.
FUNDAMENTO TEÓRICO
As enzimas são proteínas que se encontram na natureza misturadas entre si e com outras substâncias.
Entretanto, é possível detectar e determinar sua atividade através das reações que catalisam, bastando para isso
conhecerem-se as características da reação catalisada bem como dispor-se de métodos analíticos apropriados de
dosagem.
De acordo com a União Internacional de Bioquímica (IUBMB), uma Unidade Internacional (U.I.) de enzima é
definida como sendo a quantidade de enzima que catalisa a transformação de um micromol de substrato em produto
por minuto, em condições experimentais definidas.
A proporcionalidade existente entre a velocidade de uma reação enzimática e a quantidade de enzima ativa
presente, em condições de concentração saturante de substrato, permite conhecer a atividade enzimática (unidades de
enzima) de um extrato proteico qualquer. Para que a dosagem seja válida, é necessário que a concentração de
substrato permaneça praticamente constante durante o tempo de medida da atividade e que durante esse intervalo a
enzima seja estável.
De maneira geral, as velocidades usadas nos cálculos cinéticos são velocidades iniciais. Para uma reação
qualquer, a velocidade da reação será considerada inicial se, durante o tempo de medida da atividade, a variação da
concentração do substrato for igual ou inferior a 5% da concentração inicial.
A velocidade de uma reação, enzimática ou não, pode ser determinada de modo contínuo ou descontínuo.
No primeiro caso, é necessário dispor-se de aparelhos que possam registrar continuamente o aparecimento de um
produto da reação ou desaparecimento de um reagente. O mesmo não ocorre no segundo caso, em que a reação é
bloqueado decorrido um determinado intervalo de tempo específico. A utilização de um ou outro método dependerá
exclusivamente da reação em questão e da disponibilidade do equipamento a ser usado.
Em uma cinética enzimática, dois importantes aspectos devem ser considerados: a cinética propriamente dita
e a determinação quantitativa dos produtos formados ou reagentes consumidos. Em relação à cinética propriamente
dita, vários são os fatores a serem considerados: concentração da enzima, concentração do substrato, tempo de
incubação, pH, temperatura da solução, bloqueio da reação, presença de inibidores ou ativadores, etc. Em relação à
dosagem, é fundamental que o método escolhido seja simples, sensível, reprodutível e não sofra interferências de
outros componentes da mistura reacional. É importante, também, realizar controles que permitam descartar quaisquer
artefatos que possam simular uma atividade enzimática. Dentre eles, os fundamentais são o "branco" da enzima e o
"branco" do substrato. O primeiro possibilita corrigir a qualquer momento a hidrólise espontânea do substrato, enquanto
o segundo é um controle que evita erros devidos às interferências dos componentes do sistema reacional no método de
dosagem empregado.
Nos estudos cinéticos nos quais se utiliza o método descontínuo, o bloqueio da reação deve ser rigorosamente
controlado. Geralmente esse bloqueio é efetuado através da inativação irreversível da enzima, que pode ser provocada
por NaOH 1,0 M, ácido tricloro acético (TCA) 20-30%, solução saturada de tetraborato de sódio, calor, reagentes
específicos, etc.
O efeito da temperatura sobre a estabilidade de uma enzima depende de vários fatores: pH, força iônica do
meio, presença de ligantes, etc. Os substratos, por exemplo, frequentemente protegem a enzima da desnaturação pelo
calor. De modo geral, enzimas de baixo peso molecular compostas de uma única cadeia polipeptídica e possuindo
pontes dissulfetos são mais estáveis ao calor do que enzimas oligoméricas, de alto peso molecular. É comum também,
uma enzima ser mais estável ao calor quando em preparações brutas, livres de células, que contenham uma
concentração alta de outras proteínas.
21
DA AMILASE SALIVAR
AMILASE SALIVAR.
A alfa-amilase (EC 3.2.1.1) é a mais abundante enzima na saliva humana. A amilase salivar é formada
principalmente na glândula parótida. Esta enzima cliva as ligações glicosídicas  (14) dos polissacarídeos, liberando
glicose (monossacarídeos), maltose e dextrinas (carboidratos de baixa massa molecular – oligossacarídeos).
AMIDO E SACAROSE.
O amido é um polissacarídeo de extrema importância em alimentos, é produzido em grande quantidade pelos
vegetais como forma de armazenamento dos produtos da fotossíntese, e é constituído por dois polissacarídeos
estruturalmente diferentes: amilose e amilopectina. Eles possuem uma extremidade redutora e não redutora. Elas são
formadas pela união de moléculas de -D-glicose (monossacarídeo) por ligação glicosídica do tipo  (14) na cadeia
principal e do tipo  (16) nos pontos de ramificação. Os oligossacarídeos provenientes da quebra deste
polissacarídeo através de enzimas como a amilase expõem suas extremidades redutoras que reagem com metais como
os íons cobre, reduzindo-os.
22
DA AMILASE SALIVAR
Granulo de amido
A sacarose é um dissacarídeo formado pela união de dois monossacarídeos por ligação glicosídica de uma -D-
glicose e uma β-D-frutose. Como a extremidade redutora dos monossacarídeos estão envolvidas na ligação glicosídica
para formar o dissacarídeo, este não pode reagir e reduzir o cobre.
Reação para detecção de açucares redutores – Reagente de Benedict.

Utilizada para identificação de carboidratos redutores. Os íons de metais como, cobre, prata, ferro, mercúrio, etc,
são reduzidos por grupos aldeídos ou cetônicos livres de vários carboidratos. Todos os monossacarídeos são açucares
redutores, já os dissacarídeos e outros oligossacarídeos podem não ser reduzidos por metais se a extremidade
redutora do açúcar estiver livre. Colocando-se hidróxido de cobre II, Cu (OH)2, de cor azul, em meio alcalino, forma-se
uma suspensão que, sob aquecimento, se precipita como óxido de cobre II, CuO de cor preta. Mas se compostos
redutores forem acrescentados à suspensão, o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2O, que se precipita e cuja cor se situa entre o
amarelo e o vermelho. As reações abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na presença e na ausência de agentes
redutores, em meio alcalino e a quente.
Presença de composto redutor:
Meio alcalino
Cu(OH)2 Cu2O + H2O
(azul) Aquecimento (amarelo/vermelho)
23
DA AMILASE SALIVAR
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10mL Pró-pipeta Tubos de ensaio grande (20mL)
Substratos [Amido]=1% (m/v) Substratos [Sacarose]=1% (m/v) HCl 2M
Saliva humana (2 a 5 mL). pH 6,8~7,2 Salina fisiológica: NaCl 0,9% Água destilada
Banho-Maria a 37ºC Banho-Maria fervente Reagente de Benedict
REAGENTES E SOLUÇÕES
-Amilase salivar: Lavar a boca duas vezes com água corrente, colocar sob a língua um algodão umedecido ou
pedaço de plástico filme PVC para estimular produção de saliva. Coletar aproximadamente 4-5 mL de saliva.
Diluir inicialmente a saliva com solução salina (soro fisiológico - cloreto de sódio 0,9%) na proporção de 1:10
(Dil. 5x)= 2 mL saliva + 18mL solução salina.
-Substratos: Amido e sacarose.
-Solução salina: NaCl a 0,9% (m/v).
-Reagente de Benedict (para açúcares redutores): Solução de CuSO4 2% (m/v), solubilizado com citrato de sódio 20%
(m/v), dissolvidos em carbonato de sódio 2M (Na2CO3).
SEGURANÇA
Para esta aula prática tomar cuidado ao manusear o material biológico.
EXPERIMENTO 1-3 - ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA (QUALITATIVO).

a. Colocar respectivamente em 3 tubos de ensaio e numere-os de acordo com a tabela a seguir:
*substratos em água destilada (Agitar amido estoque antes de pipetar).
b. Incubar reação a 37ºC por aproximadamente 5 minutos.
c. Ao final do intervalo de tempo, adicionar à cada um dos tubos de ensaio 1 mL de reagente de Benedict. Aquecê-los
em banho fervente por 5 min.
Observar os resultados, interpretando-os em termos de qual substrato a amilase salivar consegue hidrolisar para obter
os açucares redutores que o reagente de Benedict irá detectar.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º
Tubo Substrato Incubação Banho

Água Enzima Agitar Benedict Agitar Resultados
37º C fervente
Estoque
(Cor)
(1%) (mL) (mL) (mL) (segundos) (min) (mL) (segundo) (min)
1 Amido* 1,0 1,0 - 3 seg 5 1,0 3 seg 5 min Controle
2 Amido* 1,0 - 1,0 3 seg 5 1,0 3 seg 5 min
3 Sacarose 1,0 - 1,0 3 seg 5 1,0 3 seg 5 min
*Agitar amido (Substrato) antes de pipetar

24
DA AMILASE SALIVAR
EXPERIMENTO 2-3 – TERMOLABILIDADE ENZIMÁTICA (QUALITATIVO).

1) Colocar respectivamente, em dois tubos de ensaio enumerados de acordo com a tabela a seguir (SEGUIR PASSOS
INDICADOS NA TABELA):
2) Note que um dos tubos será inicialmente aquecido em banho fervente (tubo 1) e o outro não (tubo 2).
3) Iniciar reação adicionando a cada um dos tubos 1 mL de amido.
4) Incubar os dois tubos, em banho-maria, a 37ºC, por 10 minutos.
5) Ao final da reação, adicionar aos dois tubos, 1 mL de reagente de Benedict. Aquecê-los por 3 min em banho
fervente até mudança de cor.
6) Observar os resultados, notando em que tubo houve maior atividade enzimática (redução do cobre).
7) Anotar e explicar os resultados obtidos.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º
Incubar
Tubo Amilase Incubar
banho Amido Incubar Reagente
salivar Agitar Agitar banho Resultados
fervente por 1%* 37º C Benedict
diluída fervente
5 min
1 1 mL Sim 1 mL 3 seg 5 min 1 mL 3 seg 5 min
2 1 mL Não 1 mL 3 seg 5 min 1 mL 3 seg 5 min
*Amido (Substrato) em água destilada (Agitar solução antes de pipetar).
EXPERIMENTO 3-3 – INFLUÊNCIA DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

(QUALITATIVO).
1) Adicionar aos tubos água destilada, saliva diluída, solução de HCl e amido, conforme tabela a seguir. Homogeneizar
solução.
2) Colocar em banho-maria 37o C, por 10 minutos.
3) Adicionar 1,0 mL do reagente de Benedict e aquecer tubos em banho de água fervente por 3 min.
4) Anote e interprete os resultados.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º
Tubo Incubar
Amido Incubar Reagente
Soluções HCl 2M Agitar Agitar banho Resultados
1% 37º C Benedict
fervente
1 Água dest.ilada 1 mL 5 gotas 2 mL 3 seg 5 min 1 mL 3 seg 5 min Controle
2 Saliva diluída 1 mL - 2 mL 3 seg 5 min 1 mL 3 seg 5 min
3 Saliva diluída 1 mL 5 gotas 2 mL 3 seg 5 min 1 mL 3 seg 5 min
*Amido (Substrato) em água destilada (Agitar solução antes de pipetar).
25
DA INVERTASE DE SACCHAROMYCES CEREVISAE
A invertase (EC 3.2.1.26; -fructofuranosidase) catalisa a hidrólise do dissacarídeo não

redutor sacarose em glicose e frutose (monossacarídeos redutores) e é a principal enzima
presente nas plantas e nos microrganismos. Porém, a maior fonte para extração é o levedo
(Saccharomyces cerevisiae).
A medida da velocidade de reação catalisada pelas enzimas pode ser realizada pela medida de formação de
produtos redutores. Para maior exatidão dos resultados, é importante que o tempo de reação enzimática seja o
mesmo em todos os experimentos. Assim, a reação deve ser rigorosamente cronometrada e interrompida com
a adição do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Este tem duas funções no experimento: interromper a reação,
desnaturando a enzima pela redução do pH e a de atuar como agente oxidante na reação com os açúcares
redutores formados durante a reação (produtos da reação).
Fonte: Sainz-Polo MA, Ramírez-Escudero M, Lafraya A, González B, Marín-Navarro J, Polaina J, Sanz-Aparicio
J (2013) Three-dimensional structure of saccharomyces invertase: role of a non-catalytic domain in
oligomerization and substrateSpecificity. J. Biol. Chem. vol. 288, no. 14, pp. 9755–9766.
a quantidade de sacarose hidrolisada, que é igual à quantidade de glicose+frutose liberadas pela hidrólise da
sacarose pela invertase. Esta hidrólise pode ser medida pela quantidade de 3,5-dinitrosalicilato (DNS) reduzido
durante a reação de oxido-redução. Este o DNS reduzido pode ser quantificado em comprimento de onda de
540nm, sendo que a cor amarela representa a ausência ou a presença de uma atividade muito baixa. Já a cor
alaranjado-vermelho mostra a presença de açucares redutores liberados pela hidrólise da sacarose pela
invertase.
MATERIAL
Banho Pró-
Banho- Estantes Tubos de Pipetas
Espectrofotômetro fervente pipeta ou
maria para tubos ensaio graduadas
pera
Enzima - Substrato Padrão
Água Reagente
Cubeta vidro Cronometro invertase sacarose 12,5 Glicose
destilada de DNS
mM 10mg/mL
Sacarose 12,5 mM= 0,4279g para qsp 100mL tampão acetato de sódio 100 mM pH 5,0..
METODOLOGIA
A) OBTENÇÃO DA INVERTASE DE SACCHAROMYCES CEREVISAE.
1) Pesar 1 g de levedo biológico desidratado em béqUer e adicionar 50 mL de água.
2) Agitar mistura por 30 min no agitador magnético.
3) Transferir mistura para tubos de ensaio e centrifugar 15 min/ 10,000xg/4º C.
4) Coletar extrato bruto (sobrenadante) rico em invertase.
26
AULA PRÁTICA 05 – CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA INVERTASE DE SACCHAROMYCES
CEREVISAE
B) EFEITO DA COCNETRAÇÃO DE SUBSTRATO SOBRE ATIVIDADE INVERTASE.
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE SOBRE A ATIVIDADE SACARASE DE S. CEREVISAE - 37º C
Tampão Aliquotar 200 μL Aquecer Esfriar tubos,
Sacarose acetato 100 Água Enzima Tempo reação em tubos em banho adicionar água Abs
TUBO
mM pH 5,0 contendo 200 μL DNS fervente destilada e agitar
(mM) (μL/mM) (μL) (μL) (μL) iniciar parar min (μL) min (μL) 540 nm
1 0,01 10/1 100 290 100 00’ 30” 10’ 30” 10 200 reação +200 DNS 5 min 2000
2 0,1 100/1  180  01’ 00” 11’ 00”  200 reação +200 DNS 5 min 2000
3 0,5 50/10  250  01’ 30” 11’ 30”  200 reação +200 DNS 5 min 2000
4 1,0 100/10  200  02’ 00” 12’ 00”  200 reação +200 DNS 5 min 2000
5 2,0 20/100  280  02’ 30” 12’ 30”  200 reação +200 DNS 5 min 2000
6 3,0 30/100  270  03’ 00” 13’ 00”  200 reação +200 DNS 5 min 2000
7 5,0 50/100  250  03’ 30” 13’ 30”  200 reação +200 DNS 5 min 2000
8 10,0 100/100 100 200 100 04’ 00” 14’ 00” 10 200 reação +200 DNS 5 min 2000
9 0,01 10/1 100 390 - 04’ 30” 14’ 30” Branco 200 reação +200 DNS 5 min 2000 Branco
10 0,1 100/1  280 - 05’ 00” 15’ 00”  200 reação +200 DNS 5 min 2000 
11 0,5 50/10  350 - 05’ 30” 15’ 30”  200 reação +200 DNS 5 min 2000 
12 1,0 100/10  300 - 06’ 00” 16’ 00”  200 reação +200 DNS 5 min 2000 
13 2,0 20/100  380 - 06’ 30” 16’ 30”  200 reação +200 DNS 5 min 2000 
14 3,0 30/100  370 - 07’ 00” 17’ 00”  200 reação +200 DNS 5 min 2000 
15 5,0 50/100  350 - 07’ 30” 17’ 30”  200 reação +200 DNS 5 min 2000 
16 10,0 100/100 100 300 - 08’ 00” 18’ 00” Branco 200 reação +200 DNS 5 min 2000 Branco
[Sacarose] Abs
TUBO Abs/min Atividade (Abs/min/mL enzima)
(mM) 540 nm
1 0,01
2 0,1
3 0,5
4 1,0
5 2,0
6 3,0
7 5,0
8 10,0
Construir um gráfico concentração de sacarose versus Atividade enzimática - [sacarose] x Abs/min/mL.
27
AULA PRÁTICA 06 – EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE
UREASE DE SOJA
OBJETIVOS
 Extrair a enzima urease de grãos ou farinha de soja.
 Caracterizar a enzima urease através de suas propriedades proteicas.
 Promover reações de atividade enzimática.
REAGENTES
Grãos ou farinha de soja Solução de Ureia (1%) Cloreto de mercúrio (5%)
Solução de tioureia (1%) Vermelho de fenol Reativo de Biureto
1) EXTRAÇÃO DA UREASE DE SOJA

Pesar 5,0 g de farinha de soja e adicionar 100 mL de água destilada. Agitar por 30 minutos (agitador magnético) e filtrar
em gaze ou algodão. Desprezar o resíduo sólido e utilizar o filtrado que contém a urease. Conservar em baixa
temperatura.
2) CARACTERIZAÇÃO DA UREASE
EXPERIMENTO 1-5 – REAÇÃO CARACTERÍSTICA DE PROTEÍNA: REAÇÃO DE

BIURETO
Soluções Tubo 1 Tubo 2 (Branco)
Urease (extrato) 10 gotas -
Água destilada 2 mL 2 mL
Biureto 2 mL 2 mL
AGITAR OS TUBOS E COMPARAR OS RESULTADOS.
1) REAÇÕES DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Observação: o indicador vermelho de fenol fica amarelo em meio ácido ou neutro e vermelho róseo em meio
alcalino.
28
UREASE DE SOJA
EXPERIMENTO 2-5 – AÇÃO DA ENZIMA SOBRE SUBSTRATO
Passos Soluções Tubo 3 (Padrão) Tubo 4 (Branco)
1º Ureia 1% 3 mL -
2º Água destilada - 3 mL
3º Urease (extrato) 5 gotas 5 gotas
4º Vermelho de fenol 2 gotas 2 gotas
5º Resultados Marcar no quadro Marcar no quadro
AGITAR OS TUBOS E OBSERVAR SE HÁ MUDANÇA DE COR NOS PRÓXIMOS 5 MINUTOS.
EXPERIMENTO 3-5 – DESNATURAÇÃO DA ENZIMA PELO CALOR

Passos Soluções Tubo 5
1º Água destilada 2 mL
2º Urease (extrato) 5 gotas
3º Agitar e ferver por 2 minutos
4º Ureia 1% 3 mL
5º Vermelho de fenol 2 gotas
6º Resultados Marcar no quadro
COMPARAR O RESULTADO COM O TUBO 3 (PADRÃO)
EXPERIMENTO 4-5 –AÇÃO DE INIBIDORES

1º Água destilada 2 mL
3º Agitar
4º HgCl2 5% 5 gotas
5º Agitar
6º Ureia 1% 3 mL
EXPERIMENTO 5-5 – REAÇÃO DE ESPECIFICIDADE DE ENZIMÁTICA

1º Tioureia 3 mL
UREIA TIOUREIA
29
UREASE DE SOJA
QUADRO 1 – CARACTERÍSTICAS DAS REAÇÕES

Tubo de ensaio Alterações de cor Formação de precipitado
1
2
3
4
5
6
7
30
AULA PRÁTICA 07 – IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS – PARTE I
Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na Terra. Alguns carboidratos (açúcar e amido) são os
principais elementos da dieta em muitas partes do mundo, e sua oxidação é a principal via de produção de energia na
maioria das células não fotossintéticas. Polímeros de carboidratos (também
chamados de glicanos) agem como elementos estruturais e protetores nas
paredes celulares bacterianas e vegetais e também nos tecidos conectivos
animais lubrificam as articulações e auxiliam o reconhecimento e a adesão
intercelular. Polímeros de carboidratos complexos covalentemente ligados
a proteínas ou lipídeos atuam como sinais que determinam a localização
intracelular ou o destino metabólico dessas moléculas híbridas, chamadas
de glicoconjugados. Carboidratos são poli-hidroxialdeídos ou poli-
hidroxicetonas, ou substâncias que geram esses compostos quando
hidrolisadas. Muitos carboidratos têm a fórmula empírica (CH2O)n; alguns
também contêm nitrogênio, fósforo ou enxofre.
Existem três classes principais de carboidratos: Monossacarídeos, Oligossacarídeos (representativos são

dissacarídeos) e Polissacarídeos. Os monossacarídeos, ou açúcares simples, são constituídos por uma única unidade
poli-hidroxicetona ou poli-hidroxialdeído, sendo os açucares de 6 carbonos como a glicose (dextrose) o mais abundante.
Monossacarídeos de quatro ou mais carbonos tendem a formar estruturas cíclicas. Os oligossacarídeos consistem em
cadeias curtas de unidades de monossacarídeos ou resíduos, unidas por ligações características chamadas de ligações
glicosídicas. Os mais abundantes são os dissacarídeos, com duas unidades de monossacarídeos. Um dissacarídeo
típico é a sacarose (açúcar de cana), constituído pelos açúcares de seis carbonos D-glicose e D-frutose.
Todos os monossacarídeos e dissacarídeos comuns têm nomes terminados com o sufixo “-ose”. Em células, a
maioria dos oligossacarídeos constituídos por três ou mais unidades não ocorre como moléculas livres, mas sim ligada
a moléculas que não são açúcares (lipídeos ou proteínas), formando glicoconjugados. Os polissacarídeos são
polímeros de açúcar que contêm mais de 20 unidades de monossacarídeo; alguns têm centenas ou milhares de
unidades.
Alguns polissacarídeos, como a celulose, têm cadeias lineares; outros, como o glicogênio, são ramificados. Ambos
são formados por unidades repetidas de D-glicose, mas diferem no tipo de ligação glicosídica e, em consequência, têm
propriedades e funções biológicas notavelmente diferentes.
31
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10mL Pró-pipeta Pipetas Pasteur
Banho fervente ou bico de Reagentes de Molisch,
Tubos de ensaio grande (20mL)
Bunsen Seliwanoff, Bial e Lugol
Ácido sulfúrico concentrado Ácido clorídrico concentrado Água destilada
Soluções de carboidratos a 0,1 M (mono- e dissacarídeos) e amido a 1%
SEGURANÇA
Para esta aula prática tomar cuidado ao pipetar soluções de ácidos
concentrados ou diluídos (ácido sulfúrico e ácido nítrico concentrados, HCl
concentrado e 4M (constituinte de alguns reagentes), etc - corrosivos e
irritantes). Ele deve ser pipetado com pró-pipeta em capela de exaustão pelo
técnico responsável.
EXPERIMENTO 1-3 – REAÇÃO DE MOLISCH.

FUNDAMENTO TEÓRICO
Esta reação é realizada para pesquisa de carboidratos. Os carboidratos, em presença de ácido sulfúrico, sofrem
desidratação com formação de furfural (para pentoses) ou 5-hidroximetilfurfural (para hexoses). Estes produtos reagem
com o alfa-naftol existente no reagente de Molisch produzino um composto de condensação colorido (anel).
Soluções glicose e sacarose 0,1M e amido 1 % (m/v). Ácido sulfúrico concentrado
Reagente de Molisch: 5g de alfa-naftol em 100mL de etanol
1) Separar cinco tubos de ensaio.
2) Pipetar soluções de carboidratos e o reagente de Molisch e agitar.
32
3) Com o tubo de ensaio inclinado, adicionar 2 mL de ácido sulfúrico lentamente, escorrendo pela parede e aguardar
formação de anel.
4) Caso a reação seja positiva, na interfase da solução haverá a formação de um anel púrpura, resultante da
condensação do furfural ou do hidroximetilfurfural com o alfa-naftol.
5) Comparar resultados e explicá-los em relação as propriedades dos carboidratos (aldoses e cetoses e pentoses e
hexoses).
PASSOS
Tubo 1º 2º 3º 4º 5º
Soluções Molisch Agitar Ácido Sulfúrico Resultados (Cor)
1 Água 2 mL 2 gotas 3 seg 2 mL Adicionar lentamente Controle
2 Glicose 2 mL 2 gotas 3 seg 2 mL Adicionar lentamente
3 Sacarose 2 mL 2 gotas 3 seg 2 mL Adicionar lentamente
4 Amido* 2 mL 2 gotas 3 seg 2 mL Adicionar lentamente
*Agitar amido antes de pipetar. NÃO AGITAR OS TUBOS APÓS ADIÇÃO DO ÁCIDO SULFÚRICO!!!!!
EXPERIMENTO 2-3 – REAÇÃO DE SELIWANOFF.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Frutose (cetose) em solução, quando aquecida na presença de HCl, perde 3 moléculas de água formando
furfural. O furfural produzido forma, com resorcinol, complexo de cor vermelha. A desidratação das cetoses é
mais rápida que as aldoses (glicose), e uma coloração vermelha será observada ao final. Para as aldoses a
coloração é mais fraca.
Solução de frutose, sacarose e glicose 0,1M Reagente de Seliwanoff: 0,05g de resorcinol em 100mL de HCl 2M.
Ácido clorídrico 10M (HCl)
1) Preparar quatro tubos contendo as soluções de carboidratos descritas na tabela.
2) Misturar cuidadosamente soluções de carboidratos com reagente de Seliwanoff cuidadosamente (Reagente contém
HCl).
3) Aquecer em banho fervente ou bico de Bunsen, acompanhando o aparecimento de coloração.
4) O aparecimento de cor vermelha indica reação positiva.
5) Comparar resultados e explicá-los em relação as propriedades dos carboidratos (aldoses e cetoses e pentoses e
hexoses).
33
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º
Tubo
Banho
Soluções HCl Seliwanoff* Agitar Resultados
fervente
1 Água 2 mL 2 mL 1 mL 3 seg 5 min Controle
2 Frutose 2 mL 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
3 Sacarose 2 mL 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
4 Glicose 2 mL 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
*REAGENTE DEVE SER PIPETADO PELO TÉCNICO NA CAPELA.
Observar as velocidades de formação da coloração vermelha para cada uma das soluções testadas.
EXPERIMENTO 3-3 – REAÇÃO COM IODO (LUGOL).
FUNDAMENTO TEÓRICO
Polissacarídeos são moléculas de elevada massa molecular, cuja unidade fundamental são os monossacarídeos,
principalmente a glicose. Como exemplos de polissacarídeos importantes na natureza podemos destacar o glicogênio,
a celulose e o amido. O amido, polissacarídeo de extrema importância em alimentos, é produzido em grande
quantidade pelos vegetais como forma de armazenamento dos produtos da fotossíntese, e é constituído por dois
polissacarídeos estruturalmente diferentes: a amilose e a amilopectina (ver figuras).
Como podemos observar, a molécula da amilose não apresenta ramificações e, no espaço, assume
conformação helicoidal (forma de hélice). A ligação entre os átomos de carbono das unidades de glicose são do tipo
alfa 1-4.
A amilopectina apresenta estrutura

ramificada, sendo que os "ramos" aparecem a
cada 24-30 moléculas de glicose. A ligação entre
as unidades de glicose também é do tipo alfa 1-4
na mesma cadeia. Porém, unindo duas cadeias
aparecem ligações do tipo a 1-6. Observe a figura
ao lado:
34
Moléculas de alto peso molecular (como a amilose e a amilopectina) podem sofrer reações de complexação, com
formação de compostos coloridos. Um exemplo importante é a complexação da amilose e da amilopectina com o iodo,
resultando em complexo azul e vermelho-violáceo, respectivamente.
A figura abaixo esquematiza a interação do iodo com a estrutura do amido:
O complexo esquematizado abaixo apresenta coloração azul intensa, desenvolvida pela oclusão (aprisionamento)
do iodo nas cadeias lineares da amilose.
Como vimos, o aprisionamento do iodo dá-se no interior da hélice formada pela amilose. A amilopectina, devido à
presença das ramificações, terá interação com o iodo menor, e a coloração menos intensa.
IMPORTANTE - nem todos os polissacarídeos, apesar de serem moléculas grandes, dão complexo colorido com o
iodo. Isso porque é necessário que a molécula apresente uma conformação que propicie o "encaixe" do iodo. A celulose
é um exemplo de polissacarídeo que não dá reação colorida com o iodo.
Este teste é utilizado para a detecção de amido, que em solução forma um complexo azul com o iodo. Este
complexo sofre dissociação com aquecimento torna-se a formar quando a solução é resfriada.
-Solução de amido 1% (m/v);
-Solução de lugol: dissolver 10 g de iodeto de potássio (KI) e 5 g de iodo (I2) inicialmente em 50 mL de água destilada.
Ao final, completar solução com 100 mL de água destilada.
1) Preparar dois tubos de acordo com a tabela abaixo e adicionar algumas gotas de lugol agitando a cada adição.
35
2) Observar o aparecimento de cor azul no tubo com amido. Aquecer em bico de Bunsen. Observar.
3) Resfriar o tubo em água corrente. Observar e comparar que modificações na molécula de amido propiciam as
mudanças na coloração observadas. Para ajudar em sua resposta, utilize as perguntas a seguir.
a) Quais os polímeros que constituem o amido?
b) O que acontece quando adicionamos lugol a solução de amido?
c) O complexo iodo-amilose é estável ao calor? Por quê?
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º
Tubo Reagente
Amido Resultados Incubar a Resultados Esfriar em Resultados
Lugol Agitar
1% (Cor) 100oC (Cor) água corrente (Cor)
no gotas
Agitando até Até
1 2 mL 2 gotas 3 seg desaparecimento reaparecimento
da cor cor (Parcial)
QUESTÕES:
1) EXPLIQUE PORQUE A REAÇÃO DE MOLISCH DEU RESULTADO POSITIVO PARA O AMIDO?
2) POR QUE A REAÇÃO DE SELIWANOFF É MAIS LENTA PARA ALGUNS CARBOIDRATOS EM RELAÇÃO
A OUTROS TUBOS OBSERVADOS?
3) QUAIS SÃO AS DIFERENÇAS ENTRE AS REAÇÕES DE MOLISH EM COMPARAÇÃO AO DE

SELIWANOFF PARA DETECÇÃO DE CARBOIDRATOS?
4) A REAÇÃO DE BIAL DETECTA A PRESENÇA DE PENTOSES. CITE OUTROS EXEMPLOS DE

PENTOSES?
5) EXPLIQUE O MOTIVO PELO QUAL A REAÇÃO AMIDO-LUGOL DESAPARECEU QUANDO AQUECIDOS?
6) POR QUE APÓS O RESFRIAMENTO DO TUBO PRÉ-AQUECIDO A SOLUÇÃO RETORNOU A

PERMANECER COLORIDA, MAS SEM A MESMA INTENSIDADE?
36
AULA PRÁTICA 08 – IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS – PARTE II
(REAÇÕES DE REDUÇÃO)
FUNDAMENTO TEÓRICO
Diversos reagentes são utilizados para demonstrar a presença de grupo redutor em açucares. Justamente por
possuírem grupo aldeídico livre ou grupo cetônico, os açucares capazes de se oxidarem em soluções alcalinas de íons
de determinados metais (Cu, Bi, Hg, Fe, Ag). Todos os monossacarídeos se comportam como açucares redutores.
MATERIAL
Pipetas graduadas de vidro 2, 5 e 10mL Pró-pipeta Pipetas Pasteur
Tubos de ensaio grande (20mL) Banho fervente ou bico de Bunsen Água destilada
Reagentes de Fehling (A e B) Soluções de carboidratos a 0,1 M (mono- e dissacarídeos) e amido a 1%
EXPERIMENTO 1-3 – REAÇÃO DE FEHLING.

A reação de Fehling, baseia-se no uso de soluções cuproalcalinas capazes de oxidarem o grupo aldeído dos açucares
e ácido. O reativo de Fehling é fortemente alcalino e contém íons cúpricos formando um complexo íon cúprico tartarato
de sódio e potássio. Nestas condições o cobre é reduzido por ação de açucares redutores formando-se óxido cuproso.
Sob a ação do calor, os monossacarídeos e dissacarídeos redutores o Cu(OH)2 que é azul a CuOH de cor amarela.
Continuando o aquecimento, o CuOH transforma-se em Cu2O que é vermelho.
Meio alcalino
Cu(OH)2 Cu2O + H2O
Aquecimento
(azul) (amarelo/vermelho)

1) Solução de carboidratos: Glicose, lactose, sacarose e amido 1% (m/v).
2) Reagente de Fehling:
-solução A (CuSO4 34,65 g em água destilada – q.s.p. 1000mL);
-solução B (tartarato de Na+ e K+- 173g dissolvidos em 300 mL NaOH 10,4M. Ao final, completar com água
destilada q.s.p. 1000mL).
1) Separar cinco tubos de ensaio e pipetar as soluções de carboidratos descritos na tabela.
2) Adicionar o reagente de Fehling, pipetando o reagente A e o reagente B.
3) Homogeneizar a solução, agitando-a.
4) Aquecer em bico de Bunsen. A reação é positiva quando há formação de um precipitado avermelhado de óxido
cuproso.
5) Explicar os resultados utilizando seu conhecimento sobre açucares redutores e não redutores.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º
Tubo
Reagente de Reagente de Banho Resultados
Soluções Agitar
Fehling A Fehling B fervente (Cor)
1 Água 2 mL 1 mL 1 mL 3 seg 5 min Controle
2 Glicose 2 mL 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
3 Lactose 2 mL 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
4 Sacarose 2 mL 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
5 Amido 1% 2 mL 1 mL 1 mL 3 seg 5 min
37
EXPERIMENTO 2-3 – REAÇÃO DE BARFOED.

FUNDAMENTO TEÓRICO
Distingue monossacarídeos de dissacarídeos redutores, pela velocidade com que se forma óxido
cuproso a partir da reação entre o acetato cúprico e o carboidrato. Os dissacarídeos com um
grupo aldeídico livre, darão redução após prolongado aquecimento com o reagente.
1) Solução de carboidratos: Glicose, lactose, sacarose e amido 1% (m/v).
2) Reagente de Barfoed: acetato de cobre 13,3g; água destilada 200mL; ácido acético glacial 1,8mL.
1) Separar cinco tubos de ensaio pipetando 2 mL de soluções, como descrito na tabela a seguir.
2) Adicionar a cada tubo o reagente de Barfoed e agitar.
3) Aquecer tubos em bioco de Bunsen por 1 minuto.
6) Anotar resultados e explicar o motivo pelo qual somente alguns carboidratos reagiram produzindo o óxido cuproso e
outros não. Quem são eles? Explicar os resultados utilizando seu conhecimento sobre açucares redutores e não
redutores.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º
Tubo
Reagente de Resultados
Soluções Agitar Banho fervente
Barfoed (Cor)
1 Água 2 mL 1 mL 3 seg 5 min Controle
2 Glicose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
3 Frutose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
4 Lactose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
5 Sacarose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
EXPERIMENTO 3-3 – REAÇÃO DE BENEDICT.

FUNDAMENTO TEÓRICO
Utilizada para identificação de carboidratos redutores. Íons de metais como, cobre, prata, ferro, mercúrio, etc, são
reduzidos por grupos aldeídos ou cetônicos livres de vários carboidratos. Colocando-se hidróxido de cobre II, Cu (OH)2,
de cor azul, em meio alcalino, forma-se uma suspensão que, sob aquecimento, se precipita como óxido de cobre II,
CuO de cor preta. Mas se compostos redutores forem acrescentados à suspensão, o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2O, que
se precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. As reações abaixo mostram o que ocorre o Cu (OH)2 na
presença e na ausência de agentes redutores, em meio alcalino e a quente.
Meio alcalino
Cu(OH)2 Cu2O + H2O
(azul) Aquecimento (amarelo/vermelho)
38
-Reagente de Benedict para açúcares redutores (Solução de CuSO4 2% (m/v), solubilizado com citrato de sódio 20%
(m/v), dissolvidos em carbonato de sódio 2M (Na2CO3).
1) Separar cinco tubos de ensaio e pipetar 2 mL das soluções descritas na tabela a seguir.
2) Adicionar o reagente de Benedict.
3) Homogeneizar mistura, agitando-a.
4) Aquecer solução em bico de Bunsen ou banho fervente.
5) Observar e anotar resultados associando-os com as propriedades dos carboidratos quanto ao seu poder redutor.
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º
Tubo
Banho
Soluções Reagente Benedict Agitar Resultados (Cor)
fervente
1 Água (Controle) 2 mL 1 mL 3 seg 5 min Controle
2 Glicose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
3 Lactose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
4 Sacarose 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
5 Amido 1% 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
6 Aspartame 5 gotas+2 mL água 1 mL 3 seg 5 min
7 Ciclamato/Sacarina 5 gotas+2 mL água 1 mL 3 seg 5 min
8 Stevia 5 gotas+2 mL água 1 mL 3 seg 5 min
9 Xilitol 0,1M 2 mL 1 mL 3 seg 5 min
Como não é prático utilizar uma suspensão de Cu2+, e também para evitar que o CuO (preto) mascare o resultado
da reação, acrescenta-se ao meio da reação um composto orgânico solubilizador que, em meio alcalino adequado,
reage com os íons metálicos, formando um complexo iônico solúvel. Este complexo se dissocia em grau suficiente para
que haja, nomeio da reação, íons metálicos disponíveis para se reduzirem. No caso do reagente de Fehling, emprega-
se CuSO4 à 2% (m/v), solubilizado por tartarato de sódio e potássio 10% (m/v), dissolvido em
NaOH 2 M; no caso de reagente de Benedict (qualitativo), emprega-se CuSO4 2% (m/v)
solubilizado por citrato de sódio 20% (m/v), dissolvidos em carbonato de sódio 2 M (Na2CO3).
Os testes de carboidratos redutores são positivos para compostos com grupamento – OH
glicosídico livre, mas negativos para polímeros de cadeias longas. Assim, amido não dá reação
positiva, a não ser após a sua hidrólise, e a reação é tanto mais positiva quanto maior a
extensão da hidrólise.
Até alguns anos atrás, o teste de substâncias redutoras, sobretudo na urina, era
empregado no diagnóstico de pacientes diabéticos, ou suspeito de sê-lo, de modo rotineiro.
Atualmente, há testes mais sensíveis para dosagem rápida de glicose, baseadas em ensaio
enzimático (glicofita/glicose-oxidase) e que são muitos mais práticos, por não exigirem a disponibilidade dos reagentes
mencionados.
QUESTÕES:
1) EXPLIQUE PORQUE AS REAÇÕES DERAM RESULTADO POSITIVO PARA A GLICOSE E A FRUTOSE.
2) EXPLIQUE O MOTIVO PELO QUAL ESTES MÉTODOS DETECTARAM A LACTOSE E NÃO A SACAROSE.
3) O REAGENTE DE BENEDICT DEU REAÇÃO POSITIVA COM OS ADOÇANTES ARTIFICIAIS? POR QUE?
39
AULA PRÁTICA 09 – EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS
DA SOJA
Objetivos: Extrair lipídeos presentes em alimentos com uso de solventes e verificar propriedades físico-
químicas dos lipídeos quanto à solubilidade em solventes polares e apolares, verificar as propriedades
químicas de óleos e gorduras rancificados e preparação e estudo das propriedades de emulsões lipídicas.
TOTAL DE EXPERIMENTOS: 04
Materiais
Soja moída e seca ou Etanol absoluto ou Pipetas Pipeta
Papel filtro Funil
extrato de soja moído 92,8º GL. graduadas Pasteur
Banho de
Pró-pipetas Béqueres Erlenmeyers Proveta Bastão de vidro
areia
Óleo de soja Banho de
Tubos de ensaio Óleo de soja fresco Clorofórmio Éter etílico
rançoso areia
HCl 0,5M NaOH 0,5M NaOH 0,1M Na2CO3 0,5% (carbonato de sódio)
PARTE 1 – EXTRAÇÃO DE LIPÍDEOS DE SEMENTE OU EXTRATO DE SOJA

EXPERIMENTO 1-4
Procedimento experimental
1) Pesar 10 g de soja moída e seca ou usar extrato de soja moído e transferir para erlenmeyer.
2) Adicionar 25 mL de etanol e agitar por 5 minutos.
3) Filtrar mistura em papel filtro, coletando filtrado no béquer.
4) Lavar resíduo retido no filtro com 10 mL de etanol duas vezes.
5) Colocar béquer contendo filtrado em banho de areia e aguardar evaporação total do etanol. Recomenda-se
agitar periodicamente o béquer para que a evaporação do solvente seja eficiente.
6) Observar formação de resíduo amarelo, viscoso e oleoso.
PARTE 2 – CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS

ESTABILIZAÇÃO DE UMA EMULSÃO
Emulsões são sistemas dispersos constituídos de duas fases líquidas imiscíveis (oleosa e aquosa), onde a fase
dispersa ou interna é finamente dividida e distribuída em outra fase contínua ou externa. Temos emulsões do tipo óleo
em água (O/A: fase externa aquosa) e água em óleo (A/O: fase externa oleosa). A estabilidade da emulsão é garantida
com o uso de agentes emulsificantes, geralmente substâncias tensoativas.
Em presença de água, agitando, o óleo se torna finamente dividido, formando uma emulsão instável, não permanente.
Logo, se separa e flutua, ao ser deixado em repouso. As proteínas possuem zonas hidrofóbicas em sua estrutura, as
quais podem fixar os lipídeos, e consequentemente estabilizam as emulsões. Em presença de soluções alcalinas, os
ácidos graxos livres são neutralizados e os sais resultantes são agentes estabilizadores das emulsões dos óleos e
gorduras em água. Este fenômeno é mais intenso em óleo rançoso.
EXPERIMENTO 2-4
Preparar 4 tubos de ensaio de acordo com o esquema abaixo:
1) Agitar vigorosamente todos os tubos com o auxílio de um vortex por 30 segundos.
2) Observar e anotar o resultado após a agitação.
3) Deixar alguns minutos em repouso (20 a 30 min) e verificar se a emulsão formada é estável ou instável em
relação a mistura água + óleo fresco (tubo 3).
4) Explique os resultados.
40
DA SOJA
Passos Tubos
Soluções
1 2 3 4
1º Água destilada 5mL 5mL 5mL -
2º Albumina (Clara de ovo) - - - 5 mL
3º Óleo rançoso 5 gotas - - -
4º Óleo fresco - 5 gotas 5 gotas 1 gota
5º Na2CO3 0,5% 10 gotas 10 gotas - -
6º Agitar 30 segundos em agitador vortex
7º Resultados 1
8º Repouso 20 a 30 min
9º Resultados 2
RESULTADO: EMULSÃO ESTÁVEL OU INSTÁVEL
SOLUBILIDADE
As propriedades físicas dos ácidos graxos e compostos em que eles estão presentes são determinadas em grande
parte pelo comprimento da cadeia carbônica e seu grau de insaturação. Quanto mais longa a cadeia e menor o número
de duplas ligações, menor a solubilidade do composto em água e maior o seu ponto de fusão. Lipídeos são moléculas
apolares e, portanto, solventes apolares interagem bem com essas biomoléculas.
Clorofórmio
41
DA SOJA
EXPERIMENTO 3-4
Preparar uma série de 7 tubos de ensaio. Colocar duas gotas de óleo de soja em todos eles. A seguir, acrescentar
os solventes de acordo com a tabela abaixo:
Passos
1º 2º 3º 4º
Tubos
Óleo de soja fresco Solventes Agitar Resultados (solúvel ou insolúvel)
1 2 gotas Água destilada 2mL 10 seg Controle
2 2 gotas HCl 0,5M 2mL 10 seg
3 2 gotas NaOH 0,5M 2mL 10 seg
4 2 gotas Etanol (temp ambiente) 2mL 10 seg
5 2 gotas Etanol (a quente) 2mL 10 seg
6 2 gotas Éter etílico 2mL 10 seg
7 2 gotas Clorofórmio 2mL 10 seg
Após adicionar os solventes, agitar, observar e anotar o resultado. Etanol a quente deve ser colocado em banho
fervente e agitado por alguns segundos. Cuidado: etanol possui ponto de ebulição baixo (78,4º C).
Resultado: solúvel ou insolúvel.
VERIFICAÇÃO DA ACIDEZ EM ÓLEO OU GORDURA RANÇOSA

Os óleos e gorduras não muito purificados contêm pequenas quantidades de ácidos graxos livres (palmítico,
esteárico, oléico, etc). Quanto maior for o grau de impureza destes lipídeos ou quanto mais tempo forem deixados em
contato com o ar, a temperatura ambiente, maior será a quantidade de ácidos graxos livres. Daí, a reação ácida do óleo
ou gordura rançosa.
A rancificação é um processo de decomposição de gorduras, óleos e outros lípidos que ocorre por hidrólise ou
oxidação essas moléculas, ou ambos. A hidrólise dos triacilgliceróis separa as cadeias de ácidos graxos do núcleo de
glicerol.
A oxidação converte as ligações carbono-carbono duplas da cadeia hidrocarbônica de um lipídeo insaturado em

radicais superóxidos. Estes favorecem a quebra da cadeia hidrocarbônica em unidades menores de álcoois, aldeído,
cetonas, etc., aterando as propriedades organolépticas desses lipídeos, conferindo o gosto ruim e cheiro desagradáveis
aos óleos e gorduras rancificados. Na manteiga por exemplo, a presença de ácido butanóico (ou butírico), dá o gosto
ruim de manteiga rancificada.
42
DA SOJA
EXPERIMENTO 4-4
Tubo 1- Após adição do NaOH e etanol e do indicador de pH fenolftaleína (ver tabela), adicionar o óleo rançoso gota a
gota, agitando a cada adição até descorar. Anotar o número de gotas adicionadas.
ÓLEO RANÇOSO
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º
Tubo
Etanol NaOH 0,1M Fenolftaleína Agitar Número de gotas de óleo rançoso adicionadas
1 2 mL 2 gotas 1 gota Agitar Óleo rançoso No=

Importante: a cada adição de óleo, agitar o tubo.
Tubo 2- Após adição do NaOH e etanol e do indicador de pH fenolftaleína (ver tabela), adicionar o óleo fresco gota a
gota, agitando a cada adição até descorar. Anotar o número de gotas adicionadas.
Continuar adicionando mais óleo fresco (continuar anotar o número de gotas), agitando tubo a cada adição de óleo
fresco até descorar. Anotar o número de gotas adicionadas.
Comparar e interpretar os resultados.
ÓLEO FRESCO
PASSOS
1º 2º 3º 4º 5º 6º
Aumentar quantidade de gotas
Tubo Número de gotas de óleo
Etanol NaOH 0,1M Fenolftaleína Agitar de óleo fresco até atingir mesma
fresco adicionadas
coloração tubo 1 (óleo rançoso)
Mesmo número de gotas
2 2 mL 2 gotas 1 gota Agitar No=
de óleo rançoso (tubo 1)
Importante: a cada adição de óleo, agitar o tubo.
QUESTÕES:
1) CARACTERIZE A COMPOSIÇÃO LIPÍDICA DO ÓLEO VEGETAL.
2) POR QUE CONSEGUIMOS EXTRAIR O ÓLEO DA FARINHA DE SOJA?
3) QUAL É A AÇÃO DO CARBONATO DE SÓDIO E DA ALBUMINA NO EXPERIMENTO 2?
4) O ETANOL FOI EFICAZ EM RETIRAR OS LIPÍDEOS CONTIDOS NA SOJA?
5) QUE TIPO DE SOLVENTE PODERIA UTILIZAR PARA AUMENTAR A EXTRAÇÃO DOS LIPÍDEOS DA
SOJA?
6) EXPLIQUE AS DIFERENÇAS ENCONTRADAS PARA SOLUBILIDADE DO ÓLEO EM COMPARAÇÃO AOS
SOLVENTES UTILIZADOS.
7) EXPLIQUE AS DIFERENÇAS ENTRE A SOLUBILIDADE DO ÓLEO FRESCO QUANDO USADO O ETANOL
A FRIO E A QUENTE.
8) EXPLICAR OS RESULTADOS DE ACORDO COM AS DIFERENÇAS EXISTENTES ENTRE OS ÓLEOS
RANÇOSO E FRESCO.
43
AULA PRÁTICA 10 – EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE AMIDO DA
BATATA E OUTROS ALIMENTOS
FUNDAMENTO TEÓRICO
A batata é um alimento rico em carboidratos e possui cerca de 80% de água e 20% de
matéria seca, sendo a maior parte composta pelo amido. A batata possui considerável
quantidade de proteínas (forma desidratada) comparável àquela encontrada em
cereais. Possui pouca gordura e é rica em vários micronutrientes, especialmente
vitamina C, fonte moderada de ferro, vitaminas B1, B3 e B6 e minerais como potássio,
fósforo e magnésio, além de conter fibras dietéticas e antioxidantes, que previne as
doenças relacionadas ao envelhecimento.
PARTE 1 – EXTRAÇÃO DO AMIDO E OBTENÇÃO DE SOLUÇÃO DE AMIDO.

1) Homogeneizar 50g de batata (ou outro alimento) no liquidificador com 200mL de água destilada por 1,5 minutos.
2) Filtrar homogeneizado em gaze dobrada e funil e recolhendo o filtrado em proveta 250 mL ou béquer de 1 L.
3) Deixar a suspensão decantar por 5 min até formação de precipitado.
4) Ao primeiro sobrenadante formado, aliquotar 2 mL em dois tubos de ensaio (TUBOS 2 E 6) e desprezar o
restante do sobrenadante. Ao precipitado, adicionar 100 mL de água destilada e aguardar novamente a
decantação por mais 5 min.
5) Repetir operação anterior mais cinco vezes.
6) Adicionar 300 mL de água destilada ao precipitado e aquecer até obter solução opalescente.
PARTE 2 – IDENTIFICAÇÃO DO AMIDO POR REAGENTE DE LUGOL.

1) Separar tubos de ensaio e pipetar soluções conforme tabela abaixo.
2) Adicionar as soluções a serem testadas.
3) Adicionar 2 gotas do reagente de Lugol.
4) Agitar tubos e anotar resultados.
5) Interpretar resultados de acordo com a estrutura das moléculas de carboidratos testados.
PASSOS
1º 2º 3º 4º
Tubo
Proteína Reagente biureto Resultados
Agitar Banho fervente
Soluções (mL) mL (Cor)
1 Água 2 mL 2 mL 3 seg 5 min Controle
2 Solução da primeira lavagem 2mL 2 mL 3 seg 5 min
3 Solução final da batata 2 mL 2 mL 3 seg 5 min
4 Amido comercial 2 mL 2 mL 3 seg 5 min
PASSOS
1º 2º 3º 4º
Tubo
Carboidratos Reagente de Lugol Resultados
Agitar
Soluções (mL) (gotas) (Cor)
5 Água 2 mL 2 3 seg Controle
6 Solução da primeira lavagem 2 mL 2 3 seg
7 Solução final da batata 2 mL 2 3 seg
8 Amido comercial 2 mL 2 3 seg
44

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ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS EM BIOQUÍMICA

RECOMENDAÇÕES E USO DO LABORATÓRIO

CONHECENDO OS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS A SEREM UTILIZADOS NAS AULAS PRÁTICAS.

A) UTENSÍLIOS PARA CONTER VOLUMES:

Copo de Becker (Griffin)

B) UTENSÍLIOS PARA MEDIR VOLUMES

C) UTENSÍLIOS DE USO LIMITADO (AUXILIARES)

Pisseta (Frasco Lavador)

Estante de tubos de ensaio

Balança semi-analítica e analítica.

NOÇÕES DE PIPETAGEM USANDO PRÓ-PIPETAS COM PIPETAS DE VIDRO.

TÉCNICAS DE PIPETAGEM – PIPETAS DE VIDRO

VESTIMENTA: SAPATO FECHADO,

TRAZER CANETA MARCADOR

PAPEL ALMAÇO PAUTADO PARA

EXPERIMENTO 1-2 – DILUIÇÃO USANDO PIPETAS DE VIDRO COM PRÓ-PIPETAS

EXPERIMENTO 1-2 – PREPARAÇÃO DA CURVA PADRÃO DE pH

EXPERIMENTO 2-2 – TESTE DA CAPACIDADE TAMPONANTE DE DIFERENTES SOLUÇÕES

Indicador Água Tampão RESULTADOS Experimentos seguintes

PARTE A-B (TABELA 2)

PARTE B-B (TABELA 3)

(http://ansci.illinois.edu/static/ansc438/Milkcompsynth/milkcomp_physicochem.html - Acesso 09/MAI/;2018)

EXPERIMENTO 1-4 - REAÇÃO COM BIURETO

EXPERIMENTO 2-4 - REAÇÃO COM NINHIDRINA

3) Ferver alguns minutos até o aparecimento de cor.

EXPERIMENTO 3-4 - REAÇÃO XANTOPROTEICA

EXPERIMENTO 4-4 - REAÇÃO PARA AMINOÁCIDOS SULFURADOS

1) EM QUE SE FUNDAMENTA A REAÇÃO DO BIURETO E QUE GRUPOS NAS

2) EM QUE SE FUNDAMENTA A REAÇÃO DA NINHIDRINA E QUE CLASSES DE

3) O QUE PROVAVELMENTE OCORRE COM AS ESTRUTURAS DAS PROTEÍNAS

4) QUE TIPO DE INTERAÇÃO COVALENTE PODE OCORRER ENTRE OS GRUPOS

EXPERIMENTO 1-4 – PRECIPITAÇÃO PELO CALOR (TÉRMICA)

EXPERIMENTO 2-4 – PRECIPITAÇÃO ÁCIDA (REAGENTES PARA ALCALÓIDES)

EXPERIMENTO 3-4 – PRECIPITAÇÃO POR SAIS DE METAIS PESADOS.

EXPERIMENTO 4-4 – PRECIPITAÇÃO SEM DESNATURAÇÃO.

Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas

Reação para detecção de açucares redutores – Reagente de Benedict.

Para esta aula prática tomar cuidado ao manusear o material biológico.

EXPERIMENTO 1-3 - ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA (QUALITATIVO).

Tubo Substrato Incubação Banho

1 Amido* 1,0 1,0 - 3 seg 5 1,0 3 seg 5 min Controle

2 Amido* 1,0 - 1,0 3 seg 5 1,0 3 seg 5 min

3 Sacarose 1,0 - 1,0 3 seg 5 1,0 3 seg 5 min

*Agitar amido (Substrato) antes de pipetar

EXPERIMENTO 2-3 – TERMOLABILIDADE ENZIMÁTICA (QUALITATIVO).

EXPERIMENTO 3-3 – INFLUÊNCIA DO pH SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

A invertase (EC 3.2.1.26; -fructofuranosidase) catalisa a hidrólise do dissacarídeo não

1) EXTRAÇÃO DA UREASE DE SOJA

EXPERIMENTO 1-5 – REAÇÃO CARACTERÍSTICA DE PROTEÍNA: REAÇÃO DE

1) REAÇÕES DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

EXPERIMENTO 3-5 – DESNATURAÇÃO DA ENZIMA PELO CALOR

EXPERIMENTO 4-5 –AÇÃO DE INIBIDORES

EXPERIMENTO 5-5 – REAÇÃO DE ESPECIFICIDADE DE ENZIMÁTICA

QUADRO 1 – CARACTERÍSTICAS DAS REAÇÕES

Existem três classes principais de carboidratos: Monossacarídeos, Oligossacarídeos (representativos são

EXPERIMENTO 1-3 – REAÇÃO DE MOLISCH.

EXPERIMENTO 2-3 – REAÇÃO DE SELIWANOFF.

EXPERIMENTO 3-3 – REAÇÃO COM IODO (LUGOL).

A amilopectina apresenta estrutura

A figura abaixo esquematiza a interação do iodo com a estrutura do amido:

1) EXPLIQUE PORQUE A REAÇÃO DE MOLISCH DEU RESULTADO POSITIVO PARA O AMIDO?

3) QUAIS SÃO AS DIFERENÇAS ENTRE AS REAÇÕES DE MOLISH EM COMPARAÇÃO AO DE

4) A REAÇÃO DE BIAL DETECTA A PRESENÇA DE PENTOSES. CITE OUTROS EXEMPLOS DE