Espectroscopia de Luminescência – TP1

1. Indique o que entende por:

a) Diagrama de Jablonski.
schematic diagram of the electronic states of a molecules showing the transitions between them
b) Quenching dinâmico de fluorescência.
dynamic (collisional) quenching – contact with quenching agent, diffusion-controlled collision during the
excited-state lifetime of the fluorophore. Represented by the Stern-Volmer eq.

2. Indique, justificando sucintamente, a validade das seguintes afirmações:

a) O desvio para o vermelho do espectro de emissão de fluorescência
(relativamente ao espectro de excitação/absorção) deve-se à rápida desactivação do 2º
estado singleto excitado para o 1º estado singleto excitado.
V desexcitação de S2 para S1 por conversão interna (geralmente por dissipação térmica – IC)
b) O aminoácido tirosina (max = 1.4 x 103 M-1.cm-1; F = 0.1) emite mais
fluorescência que o triptofano (max = 5.6 x 103 M-1.cm-1; F = 0.2).
F pois o Trp apresenta uma maior absorção (maior ) e um maior rendimento de fluorescência (F,
relação entre protões emitidos e protões absorvidos) – logo uma maior emissão.

IFrelativo =  x F , logo: Tyr – 1.4 x 103 x 0.10 = 0.14 x 103 = 140

Trp – 5.6 x 103 x 0.20 = 1.12 x 103 = 1120

3. A tabela seguinte representa valores típicos, para vários aminoácidos em solução

aquosa a pH 7, dos comprimentos de onda de absorção e emissão máximos, do
coeficiente de absorção molar para o máximo de absorção, e do rendimento quântico de
fluorescência.
_____________________________
Absorção Emissão
_____________________________
máx máxx10-3 máx F
Aminoácido (nm) (M-1.cm-1) (nm)
_________________________________________
Triptofano 280 5.6 348 0.20
Tirosina 274 1.4 303 0.10
Fenilalanina 257 0.2 282 0.04
_____________________________

a) Determine, justificando, a capacidade relativa de emissão de fluorescência dos

vários fluoróforos em solução aquosa.
IFrelativo =  x F , logo Trp > Tyr > Phen, pois: Trp – 5.6 x 103 x 0.20 = 1.12 x 103 = 1120
Tyr – 1.4 x 103 x 0.10 = 0.14 x 103 = 140
Phen – 0.2 x 103 x 0.04 = 0.08 x 103 = 80
b) Uma mistura 18:1 de tirosina e triptofano, em solução aquosa, apresenta duas
bandas de fluorescência bem definidas (a 303 e 348 nm). Já a albumina do soro
apresenta um só pico de fluorescência nas imediações de 340 nm, apesar de o conteúdo
molar nos dois aminoácidos ser idêntico (18:1). Justifique a diferença.
FRET – Devido à sobreposição parcial dos espectros de emissão de fluorescência da Tyr (a 303, ver Tab)
e de absorção do Trp (280 nm) ocorre transferência de energia (FRET) Tyr (303) → Trp (280). Esta
transferência leva à desactivação do estado excitado do dador (Tyr), sendo a transf. muito eficaz na
proteína (onde r é baixo – folding no sólido, contrariamente ao caso da solução para a qual r é elevado).
Assim, o sinal de emissão de fluorescência da Tyr (a 303 nm) praticamente desaparece na proteína, sendo
a fluorescência desta dominada pela emissão do Trp (a 348 nm).

4. Os coeficientes de absorção molar do triptofano (a max = 280 nm) e NADH (a max =

340 nm), em solução aquosa diluída, são 5.6x103 M-1.cm-1 e 6.2x103 M-1.cm-1,
respectivamente. O rendimento quântico de fluorescência do triptofano é 0.20.
Sabendo que para iguais concentrações e condições experimentais este aminoácido é
cerca de 9.5 vezes mais fluorescente do que o NADH (quando excitados a 280 e 340 nm
respectivamente), calcule o valor aproximado do rendimento quântico de fluorescência
do nucleótido. Justifique sucintamente a resposta.

Trp: max=280 nm, máx=5.6 x 103 M-1s-1, F =0.2

NADH: max=340 nm, máx=6.2 x 103 M-1s-1, F =?
iguais concentrações de Trp e NADH, logo ITrp=9.5 x INADH
IF =  x  F ( x F)Trp=9.5 x ( x F)NADH
(F)NADH=( x F)Trp/9.5 x NADH
(F)NADH=5.6 x 103 x 0.2/9.5 x 6.2 x 103=0.019