UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

EFEITOS DE UMA FORMULAÇÃO FUNGICIDA

NO DESENVOLVIMENTO EMBRIO-LARVAL,
METAMORFOSE E GONADOGÊNESE DO SAPO
SUL-AMERICANO RHINELLA ARENARUM

DOCENTE: PROFº DRº PAULO SERGIO MARTINS DE CARVALHO

DISCENTES: LUCAS FELIX CABRAL DA SILVA E MARIA
FERNANDA TAVARES DE ARAÚJO
 É composto por uma mistura de dois ingredientes
ativos: Fludioxonil (2,5%) e Metalaxil-M (1%).

O Fludioxonil pertence à classe química dos

fenilpirróis e atua inibindo o desenvolvimento do
micélio fúngico. Já o Metalaxil-M é um ingrediente

Fungicida
ativo do grupo dos fenilamidas e age como um
fungicida sistêmico.

Maxim® XL Utilizado para proteger a germinação e o

desenvolvimento inicial das culturas (Syngenta,
2016)

Esses componentes ativos são responsáveis

pela eficácia do Maxim® XL no controle de
doenças fúngicas em diversas culturas.
 É um dos fungicidas formulados mais utilizados
na Argentina, com aplicação anual de 290.400 L

Fungicida Apesar de seu uso intensivo, existem poucos

Maxim® XL estudos relatando os níveis ambientais desses

dois princípios ativos em águas superficiais

Maxim®XL é considerado altamente tóxico para

os organismos aquáticos (Syngenta, 2016)
 É um composto químico natural produzida por uma
bactéria do solo: Pseudomona spp.

Atua por contato e penetração parcial,

interrompendo a troca intercelular do fungo ao nível

Ações: da membrana e reduzindo a absorção de

aminoácidos e açúcares, inibindo assim o

Fludioxonil desenvolvimento do micélio fúngico;

Classificado pela OMS como moderadamente

perigoso (Classe III), mas a classificação europeia o
considera muito tóxico para os organismos
aquáticos, com potencial de causar efeitos adversos
a longo prazo nesses ecossistemas.
 Atua inibindo o crescimento micelial e a formação
de esporos que penetram no revestimento da
semente e se translocam sistemicamente ao
longo da muda em crescimento

Relatos evidenciaram que o metalaxil induziu

nefrotoxicidade em camundongos e indução de

Ações: troca de cromátides-irmãs em linfócitos humanos

Metalaxil
Baixa absorção no solo, alta solubilidade em
água e alta persistência em água, tornam o
metalaxil um potencial contaminante de corpos
d'água.

Em anfíbios, o metalaxil causou efeitos letais e

subletais somente em larvas de Rana pipiens. Um
estudo mostrou uma taxa de mortalidade de 35%
em larvas expostas a uma concentração de 0,1
µg/L durante a fase inicial de metamorfose.
 Avaliar a toxicidade do fungicida em espécies
nativas essenciais, como os anfíbios, durante a
fase mais sensível de seu ciclo de vida, como o
desenvolvimento embrionário e larval.

OBJETIVOS
O objetivo do presente estudo foi avaliar os
efeitos subletais do Maxim®XL sobre as fases
embrionária, larval e juvenil do sapo sul
americano Rhinella arenarum
 3 pares de acasalamento de adultos pesando 200–
250g por animal foram adquiridos em Lobos,
Argentina.

A ovulação das fêmeas foi induzida por meio de uma

injeção intraperitoneal de uma suspensão de uma
glândula pituitária de sapo homogeneizada em 1 mL

METODOLOGIA de solução AMPHITOX (AS) por fêmea preservada

A composição do AS era NaCl 36 mg/ L, KCl 0,5

mg/L, CaCl2 1mg/L e NaHCO3 2 mg/L preparado em
água destilada.

Oócitos foram fertilizados em vitro usando um

homogenato de macerado testicular suspenso em
AS, resultando em uma suspensão de
espermatozoides a 10%.
 A viabilidade espermática foi confirmada pela
observação da morfologia e movimentos dos
espermatozóides ao microscópio óptico

Ovos eram considerados aceitáveis se a taxa de

fertilidade fosse superior a 75% e a sobrevivência do

METODOLOGIA
embrião no estágio de neurula fosse superior a 70%

Lavagem completa dos embriões

Os embriões foram mantidos em AS a 20 ±2 C. O ◦

AS foi totalmente substituído a cada três dias e
monitorado semanalmente para garantir que o pH
estivesse em níveis aceitáveis (7± 0,5)
 Os testes de toxicidade foram realizados
usando a formulação comercial Maxim®XL

Esta formulação contém uma mistura de dois

METODOLOGIA ingredientes ativos: 2,5 g/100 mL de Fludioxonil

e 1 g/100 mL de Metalaxil-M

Preparação de soluções teste

As concentrações testadas foram: 0,25, 0,5, 1,
2, 3, 5 e 10 mg/L Maxim®XL. As soluções teste
foram preparadas em AS e utilizadas
imediatamente após seu preparo.
 Dez embriões no estágio inicial de blástula foram
colocados aleatoriamente em placas de Petri de
vidro triplicadas de 10 cm de diâmetro contendo
40 mL da solução teste.

Os bioensaios de toxicidade foram realizados por

exposição contínua dos embriões ao Maxim®XL,
◦
METODOLOGIA mantido em 20±2 C e fotoperíodo de 12:12 h,
até a metamorfose (75 dias)

Bioensaio de toxicidade Quando os espécimes atingiram o estágio de

opérculo completo, eles foram alimentados
diariamente com 3 grânulos de ração balanceada
TetraColor® por placa de Petri.

As soluções de teste foram totalmente

substituídas a cada 48 h. Os grupos controle
foram mantidos simultaneamente em AS sem
acréscimos
 A análise dos desfechos em indivíduos pós-
metamórficos foi realizada com larvas
sobreviventes a 0,25, 0,5, 1, 2 e 3 mg/L
Máxim®XL e seus respectivos controles, que
foram mantidos sem exposição até 60 dias pós-
metamorfose, tempo estimado para atingir a
diferenciação sexual

METODOLOGIA
Bioensaio de toxicidade Juvenis metamorfoseados foram transferidos
para frascos de vidro com 100 g de areia
embebidos em AS e mantidos úmidos por
pulverização com AS diariamente. Os juvenis
foram alimentados com micro-grilos.
 Os efeitos teratogênicos e neurotóxicos de
Maxim®XL foram avaliados diariamente,
comparando-se as alterações observadas nos
indivíduos expostos com o desenvolvimento e
comportamento normal dos controles

METODOLOGIA
Aos 60 dias pós-metamorfose, os juvenis foram
eutanasiados por submersão em uma solução de
concentração letal de benzocaína e seus
Avaliação de efeitos comprimentos
medidos.
focinho-cloacal (SVL) foram

Os indivíduos foram dissecados sob um

microscópio estéreo Zeiss Stemi DV4 e suas
gônadas foram medidas e examinadas quanto à
classificação sexual e anomalias grosseiras
gonadais.
 As concentrações efetivas e letais (EC10 e CL10) foram
estatisticamente estimadas para cada estágio larval
usando o programa USEPA Probit

O Índice Teratogênico (IT) foi calculado como o LC10

dividido pelo EC10, estabelecendo um IT > 1,5 como alto
risco para embriões serem malformados na ausência de
letalidade embrionária significativa

METODOLOGIA
O tempo médio para completar a metamorfose em cada
tratamento foi analisado pelo teste de Kruskal-Wallis. Os
valores médios do comprimento corporal (SVL) foram
Análise de Dados comparados estatisticamente por ANOVA de uma via.

As razões sexuais foram analisadas estatisticamente pelo

teste exato de Fisher, e o qui quadrado de Pearson foi
usado para testar diferenças significativas na incidência de
anomalias gonadais.
As análises foram realizadas com o software GraphPad
Prism versão 6.03 e as diferenças foram consideradas
significativas quando p < 0,05.
 Alterações morfológicas:

Atraso no desenvolvimento
Curvatura axial
Microcefalia
Guelras subdesenvolvidas
Edema

RESULTADOS Cauda ondulada

Dissociação da superfície celular

Efeitos no desenvolvimento Desorganização geral do epitélio

embrio-larval Alterações comportamentais:

Contrações espasmódicas
Movimentos fracos
Natação errática
Comportamento não alimentar
Fotografias estereomicroscópicas de R. arenarum exposto a Maxim®XL em diferentes concentrações a partir do
estágio de blástula (S.4):

(A) embrião controle (S.23), 96 h;

(B) amostra exposta a 5 mg/L Máxim®XL, 96 h,
(C) amostra exposta a 10 mg/L Máxim®XL, 96h;
(D) larva controle (S.25), 216 h;
(E, F) amostras expostas a 5 mg/L Máxim®XL, 216h.

Todos os espécimes expostos exibiram subdesenvolvimento geral, microcefalia, edema acentuado e curvatura
axial.
Fotografias SEM de R. arenarum expostas continuamente ao Maxim® XL começando no estágio de blástula
(S.4) e fixadas às 240 h:

(A) larva controle (S.25);

(B, C) espécimes expostos a 5 mg/L Maxim® XL apresentaram subdesenvolvimento geral, microcefalia,
cauda ondulada e edema;
(D) detalhe do epitélio da larva controle;
(E, F) detalhe do epitélio de amostras expostas a 5 mg/L de Maxim® XL mostrando diferentes graus de
dissociação da superfície celular e desorganização geral do epitélio
 Comprometimento gonadal:

10-18% dos indivíduos expostos a 0,25 e 2 mg/L Maxim®

XL apresentaram desenvolvimento prejudicado de uma

RESULTADOS
ou ambas as gônadas.

Efeitos nas gônadas de

Razão sexual, tamanho (SVL) e comprimento das gônadas:
juvenis pós-metamórficos
Não há diferenças significativas entre indivíduos expostos
a Maxim® XL e indivíduos de controle.
 O estudo revela que o fungicida Maxim®XL tem graves
efeitos subletais no desenvolvimento de embriões e
juvenis de R. arenarum. Ele demonstra ser altamente
teratogênico, com um índice de 8,19, indicando um alto
risco de má formações em embriões na ausência de

DISCUSSÃO mortalidade significativa.

Os efeitos subletais observados, como a redução da

ingestão alimentar e o crescimento reduzido, são
semelhantes aos causados por outros pesticidas, como
inseticidas e outros fungicidas. Portanto, esses efeitos
podem ser considerados não específicos.
 As diferenças nas concentrações de Maxim®XL que
causam efeitos letais e subletais sugerem que as
malformações são um ponto crítico a ser considerado
para avaliar a viabilidade da população afetada pela
redução da aptidão dos indivíduos.

DISCUSSÃO Os resultados indicam que sua formulação pode afetar

negativamente o desenvolvimento desses animais,
tornando-os mais vulneráveis a predadores, doenças,
invasões de espécies e mudanças ambientais. Isso pode
prejudicar a saúde dos anfíbios e sua capacidade de
reprodução, representando um risco indireto para a
sobrevivência da população.