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Toxicologia e Farmacologia Aplicada 260 (2012) 155–161

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Toxicologia e Farmacologia Aplicada

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/ytaap

O fungicida mancozebe induz efeitos tóxicos em células da granulosa de mamíferos

Rita Paro a,1 , Gian Mario Tiboni b,1 , Roberto Buccione c
, Gianna Rossi uma

, Valério Cellini uma

,
Rita Canipari , Sandra Cecconi a, ÿ
d

uma

Departamento de Ciências da Saúde, Universidade de L'Aquila, Via Vetoio, L'Aquila, Itália Departamento
b
de Medicina e Envelhecimento, Seção de Ciências da Reprodução, Universidade “G. D'Annunzio”, Chieti-Pescara, Itália Laboratório de Invasão de Células
c
Tumorais, Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro, Chieti, Itália Departamento de Anatomia, Histologia, Medicina Legal e Ortopedia, Seção de
d
Histologia e Embriologia, Escola de Farmácia e Medicina, Universidade “Sapienza” de Roma, Roma, Itália

informações do artigo resumo

Historia do artigo: O etileno-bis-ditiocarbamato mancozeb é um fungicida amplamente utilizado com baixa toxicidade relatada em mamíferos.
Recebido em 5 de dezembro de 2011 Em camundongos, o mancozebe induz a apoptose do embrião, afeta a morfologia do fuso meiótico do oócito e prejudica
Revisado em 8 de fevereiro de 2012 a taxa de fertilização mesmo quando usado em concentrações muito baixas. Avaliamos os efeitos tóxicos do mancozebe
Aceito em 10 de fevereiro de 2012
nas células somáticas da granulosa ovariana de camundongos e humanos. Examinamos parâmetros como morfologia
Disponível online em 17 de fevereiro de 2012
celular, indução de apoptose e níveis de expressão de p53. Células da granulosa de camundongos expostas ao mancozeb
sofreram uma modificação de sua morfologia dependente do tempo e da dose e adquiriram a capacidade de migrar, mas
Palavras-chave:
Mancozebe não de proliferar. O nível de expressão de p53, em termos de mRNA e teor de proteína, diminuiu significativamente em
células da granulosa comparação com células não expostas, mas nenhuma alteração na apoptose foi registrada. Os efeitos tóxicos podem ser
Mouse atribuídos, pelo menos em parte, à presença de etilenotioureia (ETU), principal catabólito do mancozeb, encontrado no
Humano meio de cultura. As células da granulosa humana também apresentaram alterações morfológicas dependentes da dose e
p53 níveis de expressão de p53 reduzidos após a exposição ao mancozeb. No total, esses resultados indicam que o mancozeb
afeta as células somáticas dos folículos ovarianos de mamíferos, induzindo um estado semelhante ao pré-maligno, e que
tal dano ocorre na mesma extensão em GC de camundongos e humanos. Esses resultados substanciam ainda mais o
conceito de que o mancozebe deve ser considerado um tóxico reprodutivo. © 2012 Elsevier Inc. Todos os direitos
reservados.

Introdução começando desde a infância. Apesar de sua capacidade de induzir câncer de

O mancozeb é um fungicida metálico etileno-bis-ditiocarbamato usado para
proteger muitas frutas (por exemplo, maçãs, frutas cítricas), vegetais (incluindo
tomates, feijões, aipo, cenouras, cebolas, ginseng) e culturas de campo contra um
amplo espectro de doenças fúngicas ( EPA 2/92). A exposição ocupacional ao
mancozeb ocorre em instalações de fabricação ou formulação, durante a aplicação
no campo ou por contato com folhagens ou culturas tratadas. A ingestão de
alimentos representa a principal fonte de contaminação para a população em geral.
O mancozeb tem baixa toxicidade aguda em mamíferos e é rapidamente excretado
do corpo (48-96 h) pela urina. Seu principal catabólito é a etilenotioureia (ETU). Em
1988, a Organização Mundial da Saúde (OMS, 1988) estimou que a exposição ao
mancozeb e ETU era de 0,01–1 ÿg/kg pc/dia para a população em geral. Pequenas
quantidades de ETU foram detectadas em tomates, batatas, vinho e tabaco,
sugerindo que a população pode estar cronicamente exposta ao mancozebe
tireoide e hepático em roedores (Chhabra et al., 1992), o ETU foi degradado de um
grupo 2B para um produto químico do grupo 3 pela IARC (2001).
O mancozeb é considerado um carcinógeno multipotente em animais de
laboratório (Belpoggi et al., 2002; Cecconi et al., 2007) com evidências de alguns
efeitos genotóxicos (Cecconi et al., 2007). Além disso, a exposição ao manco zeb
determina uma redução nos níveis de T(4) em ratas, podendo, portanto, afetar
adversamente o cérebro em desenvolvimento (Axelstad et al., 2011). Em humanos,
foi relatada uma associação moderada entre exposição ao mancozebe e defeitos
do tubo neural, mas não câncer de tireoide (Nordby et al., 2005). Um estudo recente
relatou o potencial neoplásico induzido pelo mancozebe na pele humana in vitro e
na pele de camundongos in vivo (Tyagi et al., 2011). Experimentos in vitro mostram
que o fungicida atinge principalmente as enzimas mitocondriais (Domico et al., 2006;
Leiphon e Picklo, 2007) e que em fibroblastos de ratos estimula a formação de
espécies reativas de oxigênio (Calviello et al., 2006).

Quanto à toxicidade reprodutiva em geral, é difícil afirmar se os efeitos adversos

observados em animais de laboratório expostos a agrotóxicos são devidos a
ÿ Autor correspondente em: Departamento de Ciências da Saúde, Universidade de L'Aquila, 67100, L'Aquila, Itália.
alterações do eixo gônada-hipotálamo, a danos ocorridos em células específicas do
Fax: +39 0862 433785.
Endereço de e-mail: sandra.cecconi@cc.univaq.it (S. Cecconi). órgão reprodutor ou a ambos. A este respeito, o uso de oócitos isolados de
1
Contribuição igual. camundongos fornece

0041-008X/$ – ver matéria inicial © 2012 Elsevier Inc. Todos os direitos reservados. doi:10.1016/
j.taap.2012.02.005
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156 R. Paro et ai. / Toxicologia e Farmacologia Aplicada 260 (2012) 155–161
informações sobre os efeitos sutis de muitos pesticidas na aquisição da capacidade
de desenvolvimento das células germinativas (Can e Albertini, 1997; Pocar et al.,
2003). Além disso, o mancozeb prejudica o desempenho reprodutivo feminino,
com efeitos tóxicos já se tornando evidentes em concentrações muito baixas (ÿ1
ÿg/ml) (Cecconi et al., 2007).
De fato, oócitos de camundongos expostos a tais concentrações (0,01–1 ÿg/ml)
durante a maturação in vitro mostraram alterações dependentes da dose da
estrutura do fuso meiótico e redução da taxa de fertilização in vivo e in vitro (Rossi
et al., 2006a, 2006b) . Esses resultados estão de acordo com um relatório anterior
de Greenlee et al. (2004) demonstrando a apoptose de blastômeros de
camundongos em embriões expostos a 0,003 ÿg/ml de mancozebe. No entanto,
poucos dados estão disponíveis sobre a toxicidade de fungicidas em células
ovarianas somáticas e, em particular, em células da granulosa (GC) (Cecconi et
al., 2007). São células somáticas do ovário dos mamíferos que interagem com as
células germinativas desde o desenvolvimento até a vida adulta formando,
juntamente com o oócito, um sistema funcional e metabólico que garante o correto
desenvolvimento de todo o folículo (Zuccotti et al., 2011). . O GC pode sofrer
transformação neoplásica, dando origem a cerca de 5% de todos os cânceres de
ovário (Schumer e Cannistra, 2003). O GC pode, portanto, ser usado como um
sistema modelo para testar efeitos tóxicos, especialmente em termos de potencial
de transformação por substâncias exógenas.
Aqui mostramos os efeitos da exposição ao mancozeb em GC obtidos de
camundongos de laboratório e de mulheres submetidas a procedimentos de
reprodução assistida, avaliando a morfologia, aquisição de características
migratórias e proliferativas, indução de apoptose, bem como níveis de expressão
de p53.
materiais e métodos
Produtos químicos. Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma Chemical
Company (St. Louis, MO, EUA), salvo indicação em contrário. A gonadotrofina
sérica de égua prenhe (PMSG; Folligon) foi adquirida da Intervet Italia (Milão,
Itália). Mancozeb (>99% puro) foi adquirido da AccuStandard, Inc. (New Haven,
CT, EUA). Reagentes para RT e PCR em tempo real, Actinomicina D foram
adquiridos da Life Technologies (Carlsbad, CA, EUA); Alexa fluor 488- e 594-
phalloidin da Invi trogen, Brilliant SYBR Green QPCR master mix da Stratagene
(La Jolla, CA, EUA), anticorpo monoclonal p53 da Santa Cruz Biotech nology
(Santa Cruz, CA, EUA) e Magic Red Caspase Kit de detecção da ImmunoChemistry
Technologies, LLC (Bloomington, MN, EUA).
Animais. Camundongos Swiss CD1 (Harlan Itália, Udine, Itália) foram alojados
em um biotério sob condições controladas de temperatura (21 ± 1 °C) e luz (12 h
de luz/dia), com livre acesso a comida e água. Camundongos fêmeas de 21 a 23
dias de idade foram injetados ip com 5 UI de PMSG e sacrificados 48 horas depois.
Os animais foram mantidos de acordo com o Guia do Departamento de Saúde
Italiano para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório e todos os protocolos
experimentais foram aprovados pelos comitês locais para cuidados e uso de
animais de acordo com a prática médica veterinária aceita.
Cultura de células da granulosa. Os GC de camundongos foram isolados de
explantes de ovário conforme relatado anteriormente (Vaccari et al., 2006).
Resumidamente, GC foram liberados por punção de folículos pré-ovulatórios e
cultivados em DMEM 5% FBS suplementado com 2 mM L-glutamina e antibióticos
(100 mM penicilina, 100 ÿg/ml estreptomicina) a 37 °C, 5% CO2 no ar, por 12 h
para permitir a adesão. Meio fresco contendo ou não (controle, CTR) concentrações
crescentes de mancozeb (0,001, 0,01, 0,1 e 1 ÿg/ml) foi adicionado e as células
cultivadas por vários tempos (1–24–36 h) em DMEM-5% FBS dependendo no
protocolo experimental. Os GC humanos foram obtidos de aspirados foliculares de
mulheres submetidas a procedimentos de reprodução assistida (Morelli et al., 2008)
e cultivados conforme descrito acima para GC de camundongo. O consentimento
informado foi obtido de todos os pacientes. Em alguns experimentos, GC foram
semeados em lamelas e cultivados conforme descrito
acima de. As concentrações de mancozebe foram selecionadas de acordo com
Rossi et al. (2006a,b), e foram baseados no valor de 1 × dose de referência (RfD) (US
EPA, 2007) e convertido de unidades RfD para microgramas por mililitro de acordo
com Greenlee et al. (2004).
Análise do citoesqueleto cortical. GC de camundongos e humanos foram cultivados
em lamínulas por vários tempos (1–24–36 h) como controle ou expostos a
concentrações crescentes de mancozeb. Ao final do cultivo, as células foram
fixadas com paraformaldeído 3,7% por 10 min e permeabilizadas com Triton X-100
0,01% por 10 min. Para marcar o citoesqueleto cortical, as células foram incubadas
com Alexa fluor 488 faloidina (1:100) a 37 °C por 1 h. As células foram então
lavadas com lamínulas de PBS montadas com glicerol a 50% e fotografadas com
varredura a laser confocal (Zeiss 510, Esslingen, Alemanha) ou microscópio de
epifluorescência (Axioplan2, Zeiss, Alemanha).
Ensaios de migração celular, proliferação e degradação da matriz extracelular.
Esses experimentos foram realizados usando camundongo GC. Para avaliar a
migração, os GC foram cultivados em placas de 24 poços por 12 h, e as feridas
foram produzidas com uma ponta de pipeta. O controle ou GC exposto foram
cuidadosamente verificados ao microscópio para confirmar a remoção completa
das células da ferida raspada. As células foram então cultivadas na ausência (CTR)
ou na presença de concentrações crescentes de mancozeb (0,001–1 ÿg/ml) e
deixadas migrar durante 36 h de incubação. O número de células que se moveram
para dentro da ferida foi registrado pela análise de três campos selecionados
aleatoriamente. Para avaliar a proliferação, os GC foram primeiro cultivados com
5% de FBS por 12 h, deixados de lado com 1% de FBS por 12 h (Shizukuda et al.,
1999) e depois incubados por 24 h em 5% de FBS como CTR ou na presença de
concentrações crescentes de mancozebe. As células foram coradas com cristal
violeta a 0,2% em metanol (Kaur et al., 2004) e, após a eluição, a absorbância foi
medida a 540 nm. As diferenças no crescimento celular foram expressas como
porcentagem da taxa de crescimento das células tratadas em relação às células de
controle (Yamakawa et al., 2004). A análise de imunofluorescência da degradação
da matriz extracelular (ECM) foi realizada de acordo com os procedimentos
publicados (Baldassarre et al., 2003; Bowden et al., 2001). Resumidamente, os GC
de camundongos foram semeados em lamínulas, pré-revestidos com gelatina
fluorescente reticulada em DMEM com 5% de FBS sozinho (CTR) ou na presença
de mancozeb (0,001–1 ÿg/ml) e incubados por 36 h. As células foram então fixadas
(3,7% paraformaldeído, 10 min), permeabilizadas (0,01% Triton X-100) e incubadas
com Alexa fluor 594 faloidina (1:100) por 30 min. Por fim, as lamínulas foram
lavadas com PBS e montadas em glicerol a 50%. Os eventos de degradação de
ECM, se houver, são identificados por áreas escuras e não fluorescentes no
substrato (Baldassarre et al., 2003; Bowden et al., 2001). Os experimentos foram
analisados com microscópios focais de varredura a laser Zeiss 510 (Esslingen,
Alemanha).
Western blotting. Os experimentos foram realizados usando GC de camundongo e
humano. Os GC tratados com mancozeb e de controle foram ressuspensos em
tampão de lise (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 1% Igepal)
contendo inibidores de protease (1 mM fenilmetilsulfonil fluoreto, 1 ÿg/ml leupeptina
e 1 ÿg/ml aprotinina) e inibidores de fosfatase (fluoreto de sódio 1 mM, pirofosfato
de sódio 10 mM e ortovanadato de sódio 1 mM) por 20 min. Os lisados foram
centrifugados a 15.000 rpm por 20 min a 4 °C. Quantidades iguais de proteínas (70
ÿg) foram separadas e transferidas para membranas de nitrocelulose. Após o
bloqueio com 5% de leite desnatado em tampão TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,6,
137 mM NaCl, 0,1% Tween 20), os filtros foram incubados a 4 ° C com um anticorpo
primário p53 (1: 200), e então por 1 h com um anticorpo secundário anti-
camundongo conjugado com peroxidase (1:5000). Para detectar pAKT, os filtros
foram incubados com anticorpo primário AKT1 (fosfo S473) (1:1000) e com
anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase (1:1000).
Após a detecção usando um reagente de quimioluminescência (ECL, Pierce,
Rockfort, EUA), a quantificação densitométrica foi realizada com o software de
domínio público NIH image v.1.62 e padronizada usando GAPDH como controle
de carga.
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R. Paro et ai. / Toxicologia e Farmacologia Aplicada 260 (2012) 155–161 157

Quantificação do p53 mRNA por PCR em tempo real. O RNA total foi extraído
de camundongos tratados e não tratados e GC humano com Trizol de acordo
com as instruções do fabricante. A pureza e integridade do RNA foram verificadas
por eletroforese em gel de agarose a 1%. Os cDNAs de fita simples foram
obtidos com transcrição reversa (RT) de 5 ÿg de RNA total, em um volume final
de 20 ÿl, utilizando a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de
Moloney. As amostras foram analisadas por PCR em tempo real (qRT-PCR;
termociclador Mx3000P, Stratagene, CA, EUA).
Os DNAs complementares foram amplificados usando um conjunto de primers
apropriado e o Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix. A mistura para reação
em tempo real foi composta por 6 ÿl de cDNA do gene p53 ou 2 ÿl de cDNA do
gene doméstico GAPDH, 12,5 ÿl Master Mix 2X, 0,25 ÿl de primer de camundongo
para ward (mp53: fw 5ÿ-ACTCTTGGCCCACCTGTATG-3ÿ; mGAPDH: fw 5'-
CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3') e 0,25 ÿl de primer reverso (mp53: rw 5'-
GGCCCAAAAAGGTTGTTGTCAGA-3'; mGAPDH: rw 5'-
GACGGACACATTGGGGTAG-3'). As mesmas quantidades foram usadas para
o primer humano direto (hp53: fw 5'-AGCCTTGGCTTACAAAGACTCT 3';
hGAPDH fw 5'-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3') e o primer humano reverso
(hp53: rw 5'-GCTAGGTGCCCCCTAACTGT-3'; hGAPDH: rw 5 ÿ-
AGGTCCACCACTGACACGT-3ÿ) e H2O (volume final 0,25 ÿl). As condições de
amplificação foram realizadas da seguinte forma: 1 ciclo a 72 °C por 10 min, 40
ciclos em três etapas (desnaturação a 94 °C por 45 s, anelamento a 60 °C por
45 s e alongamento a 72 °C por 45s).

Determinação quantitativa de ETU. A ETU foi determinada de acordo com Sottani

et al. (2003). Para este fim, GC de camundongo foram cultivados por 36 h na
presença de concentrações crescentes de mancozeb, e o meio de cultura foi
então testado. Este é um método rápido e seletivo baseado no uso de uma fase
Fluorosil de uma coluna BondElut1 seguida de um procedimento de extração
líquido-líquido. O ensaio é linear na faixa de 0–50 mg/l, com um limite inferior de
quantificação de 1,5 mg/le um coeficiente de variação de 8,9%. O limite inferior
de detecção é avaliado em 0,5 ÿg/l.

Detecção de apoptose. A apoptose foi avaliada em GC de camundongo pelo

Magic Red Caspase Detection Kit [MR-(DEVD)2]. Para este fim, os GC foram
semeados em lâminas de câmara (Falcon Becton-Dickinson, Cowley, Oxford,
Reino Unido) e depois cultivados sem (CTR) ou com 1 ÿg/ml man cozeb por 36
h. A apoptose foi avaliada de acordo com as instruções do fabricante. Como
controle positivo para MR-(DEVD)2, GC foram tratados com actinomicina D (2
ÿg/ml) por 3 h e depois processados conforme descrito acima. As células foram
observadas ao microscópio de epifluorescência.

Análise estatística. Os dados são expressos como média ± SEM de pelo menos
3 experimentos independentes. A análise estatística foi realizada pelo teste
ANOVA seguido do teste comparativo múltiplo de Bonferroni.
Pb0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Efeitos do mancozebe no citoesqueleto cortical de camundongos GC

Para avaliar o efeito do mancozeb na morfologia celular, GC de camundongos

foram cultivados por 1, 24 e 36 h na presença de concentrações crescentes do
fungicida (0,001–1 ÿg/ml) e observados após coloração por imunofluorescência
de actina cortical. Em todas as concentrações testadas, o GC incubado por 1 h
com mancozeb não apresentou alterações morfológicas em comparação com as
células controle não tratadas (não

Fig. 1. Efeitos dependentes da dose de mancozebe no citoesqueleto GC de camundongo.

Imagens representativas de GC cultivadas por 36 h na ausência (CTR) ou na presença de
concentrações crescentes (0,001–1 ÿg/ml) de fungicida. A actina cortical foi marcada com
Alexa Fluor 488 faloidina. Observe a mudança da morfologia celular que ocorre em
concentrações mais altas de fungicida. Três experimentos diferentes foram realizados. Barra = 20 ÿm.
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158 R. Paro et ai. / Toxicologia e Farmacologia Aplicada 260 (2012) 155–161

mostrando). Por outro lado, um tratamento de 24 h com 0,1 e 1 ÿg/ml induziu

remodelagem celular e alterações no citoesqueleto cortical de actina, o que não
ocorreu em GC cultivado na ausência (CTR) ou na menor concentração de
mancozeb (0,001 ÿg/ ml) (não mostrado). Conforme relatado na Fig. 1, essas
mudanças se tornaram mais evidentes após 36 h de exposição, quando um rearranjo
marcadamente diferente das fibras corticais de estresse foi observado também na
concentração de 0,01 ÿg/ml.
Com base nesses resultados, o tempo de incubação de 36 h foi escolhido para os
experimentos seguintes.

Efeitos do mancozeb no citoesqueleto cortical do GC humano

Para avaliar o efeito do mancozeb na morfologia do GC humano, os GC foram

cultivados por 36 h na presença de concentrações crescentes do fungicida (0,001–1
ÿg/ml) e observados após coloração por imunofluorescência de actina cortical. Em
concentrações ÿ0,01 ÿg/ml, uma organização marcadamente diferente das fibras
corticais de estresse foi observada (Fig. 2).

Efeitos do mancozebe na migração e proliferação de GC de camundongos

e na digestão da matriz extracelular

A segunda questão abordada foi avaliar se o mancozeb poderia induzir

características pré-malignas em GC, como migração, proliferação e capacidade de
degradar a matriz extracelular. Experimentos realizados com a técnica de ferida por
raspagem mostraram que GC de camundongo cultivadas como controle (CTR) ou
expostas a 0,001 ÿg/ml de mancozebe por 36 h não migraram para a ferida. Em
contraste, em concentrações ÿ0,01 ÿg/ml, o número de células que migraram foi
significativamente maior do que CTR (Fig. 3A). Essa diferença não se deveu à
proliferação celular, pois a razão entre a absorção dependente do cristal violeta das
células expostas e não expostas foi ~1 (Fig. 3B). A invasão da matriz extracelular é
um processo complexo que requer várias atividades celulares, incluindo migração
ativa e degradação controlada dos componentes da matriz. Assim, investigamos se
o GC apresentava a capacidade de degradar proteoliticamente uma matriz
extracelular subjacente e se o tratamento com mancozebe a afetava. Verificou-se
que o GC não tratado parecia incapaz de degradar a matriz subjacente e que esse
comportamento não foi afetado pelo tratamento com mancozebe (dados não
mostrados).

Efeito do mancozebe nos níveis de expressão de p53 em GC de camundongo

Partindo da observação de que as modificações do citoesqueleto poderiam ser

devidas à expressão alterada de p53 (Alexandrova et al., 2000), verificamos se o
mancozeb afetava o conteúdo da proteína p53 em GC de camundongo incubadas
por 36 h na ausência (CTR) ou na presença de aumento concentrações (0,001–1
ÿg/ml) do fungicida. Ficou evidente que quando GC de camundongos foram
incubados na presença de 0,001 ÿg/ml de mancozeb, o conteúdo de proteína foi
comparável ao controle (P> 0,01). Em concentrações ÿ0,01 ÿg/ml, os níveis de
proteína p53 em GC expostos diminuíram drasticamente até o desaparecimento
completo (Pb0,001 vs CTR) (Fig. 4A, B). Para determinar se a diminuição induzida
pelo mancozeb no nível da proteína p53 foi devido ao comprometimento da
transcrição do gene p53, p53 mRNA foi quantificado em camundongo GC exposto
por 36 h em concentrações crescentes de mancozeb. Como mostrado na Fig.

4C, o conteúdo de mRNA foi comparável entre controle e 0,001 ÿg/ml de células
expostas (P> 0,05). Por outro lado, significativamente menor p53

Fig. 2. Efeitos dependentes da dose de mancozeb no citoesqueleto GC humano. Imagens

representativas de GC cultivadas por 36 h na ausência (CTR) ou na presença de
concentrações crescentes (0,001–1 ÿg/ml) de fungicida. A actina cortical foi marcada com
Alexa Fluor 488 faloidina. Observe a mudança da morfologia celular que ocorre em
concentrações mais altas de fungicida. Três experimentos diferentes foram realizados. Barra = 20 ÿm.
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R. Paro et ai. / Toxicologia e Farmacologia Aplicada 260 (2012) 155–161
Fig. 3. Efeitos de concentrações crescentes de mancozeb na migração e proliferação de GC de
camundongo. (A) A migração foi testada com o ensaio de ferida por raspagem. (B) A proliferação
foi testada pelo ensaio do cristal violeta. As células foram incubadas sem (CTR) ou com
concentrações crescentes de mancozebe por 36 h. Em (A) os dados são expressos como o número
de células tratadas que entraram na ferida em comparação com as células de controle (CTR). Em
(B) os dados são expressos como razão entre a absorbância dependente do cristal violeta das
células expostas e de controle. Os dados representam a média ± SEM de três experimentos diferentes (*Pb0,05).
Níveis de mRNA foram observados em GC incubados com concentrações de
fungicida ÿ0,01 ÿg/ml (Pb0,05 vs CTR).
Efeitos do mancozeb nos níveis de expressão de p53 em GC humano
Para avaliar se os níveis de expressão de p53 em CG humano também poderiam
ser afetados pelo mancozebe, o conteúdo de mRNA e proteína foi determinado por
PCR em tempo real e análise de western blot, respectivamente.
Células cultivadas por 36 h na presença de concentrações crescentes do fungicida
sofreram uma diminuição significativa dependente da dose de ambos os conteúdos
de proteína (Figs. 5A, B) e mRNA (Fig. 5C).
De fato, em concentrações ÿ0,01 ÿg/ml, os níveis de mRNA e proteína foram
significativamente menores em comparação com o controle (CTR)
(Pb0.05).
Quantificação de ETU
Para determinar a presença de ETU no meio de cultura, GC de camundongo
foram cultivados por 36 h na presença de concentrações crescentes de mancozeb.
Os resultados obtidos mostraram que a ETU foi detectada apenas na presença de
0,1 e 1 ÿg/ml de mancozebe, sendo as concentrações de 0,012 ÿg/ml e 0,28 ÿg/ml,
respectivamente (Tabela 1).
Apoptose GC de camundongo
A apoptose foi avaliada em GC de camundongos cultivados por 36 h expostos a
1 ÿg/ml de fungicida ou não (controle). Como controle positivo, as células foram
tratadas por 3 h com actinomicina D. Descobrimos que mancozeb não desencadeou
apoptose em GC de camundongo (dados não mostrados).
Discussão
Aqui mostramos que o fungicida mancozeb induz uma reorganização do
citoesqueleto de actina, a aquisição de capacidade migratória e uma diminuição
significativa dos níveis de expressão de p53 em camundongos
159
Fig. 4. Efeitos de concentrações crescentes de mancozeb na expressão de p53 em GC de
camundongo incubadas por 36 h na ausência (CTR) ou na presença de fungicida. (A) Imagem
representativa de p53 western blotting. (B) A proporção de p53 para actina total foi determinada
para cada condição. Os resultados são expressos como a média ± SEM de três experimentos
separados. Diferenças significativas (Pb0,05) são representadas com letras diferentes. (C) mRNA
de p53 foi determinado por PCR em tempo real. Os dados são obtidos de quatro experimentos
separados. A razão relativa entre p53 e G3PDH é expressa como média ± SEM. Letras diferentes
indicam diferenças significativas (Pb0,05).
GC. Esses efeitos são produzidos pela exposição das células a baixas doses de
fungicida (0,01–1 ÿg/ml), selecionadas na faixa de concentrações que demonstraram
induzir anomalias do fuso meiótico do oócito e comprometimento da taxa de
fertilização (Rossi et al., 2006a , b). Nas mesmas concentrações, o GC humano
também sofreu modificações morfológicas e uma redução drástica do mRNA de p53
e conteúdo de proteína. Sabe-se que as concentrações de mancozebe aqui utilizadas
causam danos ao DNA em fibroblastos de ratos (Calviello et al., 2006), efeitos
neurotóxicos agudos em culturas neuronais mesencefálicas (Domico et al., 2006) e
inibição da produção do fator de necrose tumoral alfa em leucócitos (Corsini e outros,
2006). Em nossas condições experimentais, o mancozeb induziu uma modificação
dependente da dose e do tempo da morfologia do GC, de uma forma epitelial para
uma forma fusiforme/alongada. Além disso, a aquisição dependente de mancozebe
de um fenótipo migratório é um achado bastante incomum para GC. O fato de que
nem a proliferação celular nem a capacidade de degradar a matriz extracelular
(ambas características tumorais avançadas) parecem ser induzidas/aumentadas pelo
mancozeb sugere que ele tem o potencial de induzir um tumor pré-tumoral em vez de
um tumor totalmente transformado.
status.
A literatura está repleta de evidências de que as funções da proteína supressora
de tumor p53 vão muito além das canônicas na transativação e repressão
transcricional de genes-alvo específicos, como os que interrompem o ciclo celular nas
fases G1/S e G2/M, controlam o reparo do DNA ou desencadeando a apoptose
quando o dano ao DNA não pode ser reparado (Lim et al., 2007). Por exemplo, a
remodelação celular também pode ser modulada por p53 (Gadéa et al., 2002; Muller
et al., 2011). De fato, em muitos sistemas celulares, as modificações morfológicas
têm sido associadas à expressão defeituosa de p53 (Alexandrova et
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160 R. Paro et ai. / Toxicologia e Farmacologia Aplicada 260 (2012) 155–161
Fig. 5. Efeito de concentrações crescentes de mancozeb na expressão de p53 em GC humano incubado
por 36 h na ausência (CTR) ou na presença de fungicida. (A) Imagem representativa da análise de western
blot da proteína p53. (B) A proporção de p53 para actina total foi determinada para cada condição. Os
resultados são expressos como a média ± SEM de três experimentos separados. Diferenças significativas
(Pb0,05) são representadas com letras diferentes. (C) p53 mRNA foi determinado por PCR quantitativo.
Os dados são obtidos a partir de três experimentos separados. A razão relativa entre p53 e G3PDH é
expressa como média ± SEM. Letras diferentes indicam diferenças significativas (Pb0,05).
al., 2000). Por exemplo, em fibroblastos de embriões de camundongos, a deleção
de p53 induz a remodelação do citoesqueleto com formação de fibras de estresse e
estimula a motilidade celular e a invasão (Guo et al., 2003; Guo e Zheng, 2004). Em
nossas condições experimentais, o tratamento com mancozebe de GC de
camundongo e humano levou a uma diminuição dramática de
ambos os níveis de p53 mRNA e proteína sem afetar a apoptose.
Tal diminuição é geralmente consequência de mutações no gene p53, mas a
ocorrência de modificações epigenéticas em sítios reguladores da transcrição não
pode ser excluída. Isso está atualmente sob investigação.
Greenlee et ai. (2004) descobriram que a exposição de embriões de camundongos
a 0,003 ÿg/ml de mancozebe por 96 h induziu apoptose de blastômeros.
Essa discrepância com nossa falta de evidência para indução de apoptose em GC
pode ser devido ao tempo de incubação mais longo utilizado para embriões e/ou a
diferenças na sensibilidade a lesões tóxicas entre esses dois tipos de células
extremamente diferentes. Por exemplo, os fibroblastos de ratos são mais sensíveis
do que os leucócitos à ação pró-apoptótica do manco zeb (Colosio et al., 1996).
Considerando o exposto, e tendo em vista a escassez de informações definitivas e
dados epidemiológicos, seria sensato testar a toxicidade do mancozeb, bem como
de outros pesticidas, em vários tipos de células antes de extrapolar as conclusões
para humanos e estabelecer sua posição no lista de agentes cancerígenos.
Encontramos ETU no meio quando as células foram tratadas com 0,1 e 1 ÿg/ml
de mancozeb, enquanto em concentrações mais baixas e/ou diferentes tempos de
cultivo, o ETU foi indetectável. Portanto, não podemos excluir que o ETU, em vez
do mancozebe, foi o principal culpado pelos efeitos tóxicos observados nesta
investigação. No entanto, um papel importante para o mancozeb é apoiado por
Corsini et al. (2006), que relataram que o próprio fungicida, e não o ETU, afetou a
secreção de TNF alfa pelos leucócitos. É digno de nota que o ETU foi classificado
pela EPA como um composto do Grupo B2 (provável carcinógeno humano;
Tabela 1
Valores de concentração de ETU encontrados em meio condicionado por GC após 36 h de cultivo.
Mancozebe (ÿg/ml) ETU (ÿg/ml)
CTRL ND
0,001 ND
0,01 ND
0,1 1 0,012± 0,001
0,28± 0,03
Os valores são média ± SEM.
US EPA, 1992 revisado em janeiro de 2000), pois é capaz de induzir tumores de
tireoide em ratos e tumores de tireoide, fígado e glândula pituitária em camundongos.
Novamente, parece razoável sugerir que investigações adicionais são necessárias
para definir se a ETU desempenha um papel direto na toxicidade de GC induzida
por mancozebe.
Sumário e conclusões
Nossos achados demonstram pela primeira vez que o fungicida mancozeb
amplamente utilizado pode afetar negativamente a função e a morfologia de GC em
mamíferos, mesmo em concentrações muito baixas. O fato de que tanto o GC de
camundongo quanto o humano foram responsivos, embora apoie nossas
observações, também sugere que, pelo menos no que diz respeito ao sistema
reprodutivo, o camundongo é um modelo confiável para investigar o efeito tóxico do
mancozebe. A ideia de que o mancozebe pode afetar a reprodução humana também
é apoiada pela recente detecção de defeitos congênitos em três bebês expostos ao
mancozebe durante a gravidez (Calvert et al., 2007). Conclui-se que a caracterização
precisa do potencial de risco reprodutivo humano do mancozeb pode representar
uma prioridade toxicológica, e que estratégias destinadas a prevenir o uso
indiscriminado desse fungicida devem ser pelo menos consideradas.
Declaração de conflito de interesse
Os autores não têm nenhum conflito de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Minoia pela quantificação do ETU. O projeto foi
apoiado por uma bolsa do Istituto Superiore di Sanità (CROV/4) e por uma generosa
doação da Cartiera Lucchese (Grupo Lucart) para SC
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