Santos LuizFernandoArruda D

Universidade Estadual de Campinas
Instituto de Química
Departamento de Química Orgânica

Luiz Fernando Arruda Santos

Uso de Espectrometria de Massas e

Mobilidade Iônica na Caracterização de
Peptídeos Provenientes de Experimentos de
Ligação Cruzada
Orientador: Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo
Campinas SP
2011
i

ii

iv

“When I wake up, well I know I'm gonna be,
I'm gonna be the man who wakes up next to you
When I go out, yeah I know I'm gonna be
I'm gonna be the man who goes along with you
If I get drunk, well I know I'm gonna be
I'm gonna be the man who gets drunk next to you
And if I haver, hey I know I'm gonna be
I'm gonna be the man who's havering to you
But I would walk 500 miles

And I would walk 500 more
Just to be the man who walks a thousand miles
To fall down at your door
When I'm working, yes I know I'm gonna be

I'm gonna be the man who's working hard for you
And when the money, comes in for the work I do
I'll pass almost every penny on to you
When I come home, well I know I'm gonna be
I'm gonna be the man who comes back home to you
And if I grow, well I know I'm gonna be
I'm gonna be the man who's growing old with you”
(The Proclaimers I'm Gonna Be (500 Miles))

v

vi

Dedico este trabalho aos meus pais, Marilda e José Carlos.
Não sei o que faria sem o apoio deles…
Obrigado por tudo.
vii

viii

AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e amigo, Prof. Fábio Cesar Gozzo, pela orientação e

paciência durante esses quatro anos.
Ao meu pai, José Carlos, minha mãe, Marilda e minha irmã, Carol, por todo
o carinho, incentivo e dedicação. É muito mais fácil conquistar qualquer coisa
quando temos pessoas assim nos apoiando.
A toda minha família, em especial ao meu avô, Álvaro, meus tios e primos.
À minha namorada, Tallita, por estar ao meu lado por todo esse tempo. Por
me apoiar nas decisões difíceis e tornar tudo muito mais alegre e prazeroso. Te
amo minha fofinha!
Aos amigos do grupo, Pilau, Alex, Alana e Mariana, pelo companheirismo e

paciência durante esse período e ajudarem a realizar esse trabalho. Tenho
certeza que nossa amizade não acaba agora. Em especial, agradeço ao Amadeu,
por toda a força e ensinamento. É muito bom saber que posso contar sua
amizade.
Aos Profs. Juri Rappsilber e Perdita Barran, da Universidade de Edimburgo,

pelo aceite e orientação durante os seis meses que passei na cidade mais bela do
mundo. Aos amigos “internacionais” que fiz por lá, Martin, Salman, Lutz, Flávia,
Angel, Fernando, Gardênia, Noah e todos os outros que não coloquei o nome
aqui.
Aos amigos de república, Pablo e Indaia; e do futebol, Almir.
ix

Aos meus amigos de Itu, em especial ao Galo, Gus, Mané, Brubru, Peteco,
Ikaros e muitos outros, que mesmo não tendo a mínima idéia do que se tratou
meu projeto de doutorado sempre perguntavam “como as coisas estão indo?”.
Ao Prof. Marcos Eberlin, por ceder tempo e espaço de laboratório para os

experimentos realizados no FT ICR.
A todos aqueles que de uma forma ou outra contribuíram para a realização

deste trabalho.
Ao Instituto de Química da UNICAMP e o LNLS, pela infra estrutura

disponibilizada para realização desse projeto.
À CAPES, CNPq e FAPESP pelo auxílio financeiro.
x

SÚMULA CURRICULAR
Dados Pessoais
Nome Luiz Fernando Arruda Santos
Filiação José Carlos dos Santos e Marilda Laghi Arruda Santos
Nascimento 15/03/83 – Itu, SP, Brasil
Tel. Celular: (11) 7417 7782
Endereço eletrônico lfitu@yahoo.com.br
______________________________________________________________________
Formação Acadêmica
03/2007 – 03/2011, Doutorado em Química Orgânica
Instituto de Química ‐ Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, Brasil
Título da Tese: Estudos de Fragmentação e Mobilidade Iônica de Peptídeos Contendo Agentes
de Ligação Cruzada e Aplicação em Sistemas Protéicos
Previsão defesa: Março 2011
Orientador: Fabio César Gozzo
03/2005 – 12/2006, Mestrado em Química Orgânica

Departamento de Química Universidade Federal de São Carlos, UFSCar, São Carlos, Brasil
Título da Dissertação: Estudo do Metabolismo Secundário de Xylaria sp, um Fungo Endofítico
Isolado de Sapindus saponaria
Orientador: Edson Rodrigues Filho
03/2005 – 12/2006, Licenciatura em Química

Departamento de Química Universidade Federal de São Carlos, UFSCar, São Carlos, Brasil
03/2001 – 12/2004, Bacharelado em Química

Universidade Federal de São Carlos, UFSCar, São Carlos, Brasil
______________________________________________________________________
Formação Complementar
03/2010 – 08/2010 Doutorado Sandwich (SWE)
Escola de Química, Universidade de Edimburgo, Edimburgo, Escócia, UK
Título do Projeto: Estudos de Mobilidade Iônica acoplada a Espectrometria de Massas de
peptídeos contendo agentes de ligação cruzada.
Co orientação: Dr. Juri Rappsilber e Dra. Perdita Barran
______________________________________________________________________
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Artigos Publicados
1. SANTOS, L. F. A.; Iglesias, A. H.; Gozzo, F. C. Fragmentation features of intermolecular cross
linked peptides using N Hydroxy succinimide esters by MALDI and ESI MS/MS for use in structural
proteomics. Journal of Mass Spectrometry, aceito para publicação, 2011.
2. SANTOS, L. F. A.; Eberlin, M. N.; Gozzo, F. C. IRMPD and ECD fragmentation of intermolecular
cross linked peptides. Journal of Mass Spectrometry, aceito para publicação, 2011.
3. SANTOS, L. F. A.; Iglesias, A. H.; Pilau, E. J.; Gomes, A. F.; Gozzo, F. C. Traveling wave ion
mobility mass spectrometry analysis of isomeric modified peptides arising from chemical cross
linking. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, v. 21, p. 2062 2069, 2010.
4. Iglesias, A. H.; SANTOS, L. F. A.; Gozzo, F. C. Identification of cross linked peptides by high
resolution precursor ion scan. Analytical Chemistry (Washington), v. 82, p. 909 916, 2010.
5. Ferreira, C.R.; Saraiva, S.A.; Catharino, R.R.; Garcia, J.S.; Gozzo, F.C.; Sanvido, G.B.;
SANTOS, L.F.A.; Lo Turco, E.G.; Pontes, J.H.F.; Basso, A. C. ; Bertolla, R.P.; Sartori, R.;
Guardieiro, M.M.; Perecin, F.; Meirelles, F.V.; Sangalli, J.R.; Eberlin, M.N. Single embryo and
oocyte lipid fingerprinting by mass spectrometry. Journal of Lipid Research, v. 51, p. 1218 1227,
2010.
6. Medinas, Danilo B.; Gozzo, Fabio C.; SANTOS, Luiz F.A.; Iglesias, Amadeu H.; Augusto, Ohara.
A ditryptophan cross link is responsible for the covalent dimerization of human superoxide
dismutase1 during its bicarbonate dependent peroxidase activity. Free Radical Biology & Medicine,
p. 1, 2010.
7. Iglesias, A. H.; SANTOS, L. F. A.; Gozzo, F. C. Collision Induced Dissociation of Lys Lys
Intramolecular Crosslinked Peptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry,
v. 20, p. 557 566, 2009.
8. Tsuzuki, Joyce K.; Svidzinski, T.I.E.; Shinobu, C.S.; SANTOS, L.F.A. Rodrigues Fo. E.; Cortez,
D.A.G.; Ferreira, I.C.P. Antifungal Activity of the Extracts and Saponins from Sapindus saponaria
L. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 79, p. 538 577, 2007.
9. Murgu, M.; SANTOS, L.F.A.; Souza, G.D.; Daolio C.; Schneide, D.; Ferreira, A.G.; Rodrigues
Fo. E. Hydroxylation of a hederagenin derived saponin by a Xylareaceous fungus found in fruits
of Sapindus saponaria. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 19, p. 831 835, 2007.
xii

RESUMO
Uso de Espectrometria de Massas e Mobilidade Iônica na Caracterização de
Peptídeos Provenientes de Experimentos de Ligação Cruzada
Palavras Chave: Espectrometria de Massas, Ligação cruzada, Fragmentação,

Mobilidade Iônica.
A função de uma proteína está diretamente relacionada com sua estrutura e

conhecendo a estrutura de uma proteína é possível verificar onde estão localizados e
como agem seus sítios ativos e de interação. Dentre os métodos empregados para
análise estrutural de proteínas por espectrometria de massas (MS), experimentos de
ligação cruzada vêm recebendo grande destaque. Nestes experimentos, após
digestão enzimática três tipos de peptídeos contendo agentes de ligação cruzada
(ALCs) podem ser formados: espécies intramoleculares, quando o ALC está ligado
entre dois resíduos do mesmo peptídeo; espécies intermoleculares, quando o ALC
une dois peptídeos distintos e dead end, quando o ALC liga se apenas a um resíduo,
sendo que o outro lado de sua cadeia normalmente sofre hidrólise. A etapa crucial em
experimento de ligação cruzada consiste na correta atribuição e identificação dos
peptídeos modificados por ALC, etapa que pode ser facilitada conhecendo a
fragmentação destes peptídeos. Desse modo, o foco principal deste trabalho foi
realizar experimentos de fragmentação das diferentes espécies de peptídeos
modificados por ALCs utilizando metodologias baseadas na técnica de espectrometria
de massas, como dissociação induzida por colisão (CID), dissociação multifotônica
por infravermelho (IRMPD) e dissociação por captura de elétrons (ECD). Os estudos
realizados proporcionaram a visualização de um padrão de fragmentação de espécies
inter e intramoleculares, bem como a presença de íons diagnósticos, capazes de
auxiliar na identificação de peptídeos modificados por ACLs. Além disso, a técnica de
mobilidade iônica, que consiste na separação de íons baseado em suas seções de
choque, acoplada à espectrometria de massas (IMMS), foi emprega para realizar
estudos para caracterização de peptídeos modificados por ALCs. Utilizando IMMS foi
possível realizar a separação de espécies isoméricas do tipo dead end, bem como
verificar que peptídeos lineares e modificados por ALC, com m/z próximos possuem
seções de choque semelhantes.
xiii

xiv

ABSTRACT
Use of Mass Spectrometry and Ion Mobility for the Characterization of Cross
linked Peptides from Protein Cross linking Experiments
Keywords: Mass Spectrometry, Protein Cross linking, Peptide Fragmentation, Ion

Mobility.
There are several advantages associated with the use of mass spectrometry
(MS) applied to structural studies of proteins, such as unlimited mass of target
protein or protein complex, very low time and sample consumption, ease of
manipulation and interpretation of the data obtained. In chemical cross linking
coupled to MS, bifunctional reagents (cross linkers, XL) are used to generate
covalent bonds between the side chains of specific residues (usually lysine) and
the distance constraints obtained are then used to model the structure of the
protein and reveal interacting regions in the case of protein complexes. After
enzymatic digestion, three types of peptides modified by the XL can be generated:
intramolecular cross linked, in which the cross linker is linked to two residues of the
same peptide; intermolecular cross linked, when the reagent connects two
peptides; and “dead end”, that occurs when the cross linker is bound to only one
residue and the other side is usually hydrolyzed. The critical step in a cross linking
experiment is the correct attribution and identification of the modified peptides,
which is in turn based on the fragmentation of such species. So, the main focus of
this work is to perform fragmentation studies of cross linked peptides and
rationalize fragmentation models to aid in the correct identification and attribution of
modified peptides. In our studies we verified a fragmentation pattern of modified
peptides, as well as diagnostic fragment ions, able to help in the identification of
cross linked peptides. Studies of ion mobility (IMS) coupled to mass spectrometry
(IMMS) to analyze cross linked peptides were also performed. It was possible to
separate dead end isomers and it was verified that linear and modified peptides, of
similar m/z have similar collision cross section.
xv

xvi

SUMÁRIO
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS............................................................. xix

LISTA DE TABELAS ............................................................................................. xxi
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xxii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1
1.1. Proteínas................................................................................................... 1
1.2. Caracterização Estrutural de Proteínas por Técnicas Baseadas em
Espectrometria de Massas .................................................................................. 3
1.3. Ligação Cruzada e Espectrometria de Massas......................................... 6
1.4. Análise de Peptídeos por Dissociação Induzida por Colisão CID......... 13
1.5. Dissociação Multifotônica por Infravermelho IRMPD ............................ 17
1.6. Dissociação por Captura de Elétrons ECD ........................................... 18
1.7. Espectrometria de Mobilidade Iônica – IMS............................................ 22
2. OBJETIVOS ................................................................................................... 28
3. PARTE EXPERIMENTAL............................................................................... 29
3.1. Material ................................................................................................... 29
3.2. Estudo de fragmentação de peptídeos contendo ALC por CID .............. 29
3.2.1. Espécies Intramoleculares ............................................................... 29
3.2.2. Espécies Intermoleculares ............................................................... 29
3.2.3. Reação de Ligação Cruzada............................................................ 30
3.2.4. Análise de Espécies Intra e Intermoleculares por MS...................... 30
3.3. Estudo de Varredura de Íon Precursor (PIS) para Auxiliar na Detecção de
Peptídeos Modificados por ALCs....................................................................... 31
3.3.1. Preparação de Amostras ................................................................. 31
3.3.2. Análise por LC MS/MS .................................................................... 32
3.4. Estudo de Fragmentação de Espécies Intermoleculares por ECD e
IRMPD ............................................................................................................... 33
3.4.1. Peptídeos e ALCs utilizados ............................................................ 33
3.4.2. Formação de Espécies Intermoleculares......................................... 33
3.4.3. Preparação das Amostras e Análise por MS ................................... 33
3.5. Separação de Peptídeos Isoméricos Contendo ALC por IMMS ............. 34
3.5.1. Peptídeos, ALCs e Reação de Ligação Cruzada............................. 34
3.5.2. Análise por IMMS............................................................................. 34
3.6. Mobilidade Iônica de Peptídeos Modificados por ALC e Peptídeos
Lineares ............................................................................................................. 35
3.6.1. Preparação de Amostras – Universidade de Edimburgo, Escócia... 35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 39
4.1. Estudo de Fragmentação de Peptídeos Modificados por CID ................ 39
4.1.1. Desenho de Peptídeos Modelo........................................................ 39
4.1.2. Fragmentação de Espécies Intramoleculares por CID..................... 47
4.1.3. Estudo de Espécies Intermoleculares.............................................. 54
4.1.4. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por ESI MS/MS
utilizando CID................................................................................................. 58
xvii

4.1.5. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por MALDI MS/MS
utilizando CID................................................................................................. 66
4.1.6. Uso de Diferentes ALCs para Formação de Espécies
Intermoleculares............................................................................................. 70
4.2. Varredura de Íon Precursor (PIS) para Identificação de Espécies
Modificadas por ALCs........................................................................................ 73
4.3. Estudo de Fragmentação de Espécies Intermoleculares por IRMPD e
ECD 84
4.3.1. Formação de Espécies Intermoleculares para os Estudos de IRMPD
e ECD 84
4.3.2. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por IRMPD ............... 85
4.3.3. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por ECD ................... 93
4.4. Estudo de Mobilidade Iônica de Peptídeos Modificados por ALC......... 101
4.4.1. Separação de Espécies Isoméricas do Tipo Dead end ................. 101
4.4.2. Uso de Mobilidade Iônica para Separação Entre Peptídeos
Modificados por ALCs e Peptídeos Lineares ............................................... 108
5. CONCLUSÕES ............................................................................................ 118
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 119
xviii

ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACN .................................................................................................... Acetonitrila

ALC...........................................................................Agente de Ligação Cruzada
CHCA ............................................................... Ácido α ciano 4 hidróxi cinâmico
CID ...................................................................Dissociação Induzida por Colisão
CRP ........................................................................... Cristalografia de Proteínas
Da .............................................................................................................. Dalton
DDA ..................................................................... Análise Dependente de Dados
DMF ......................................................................................... Dimetilformamida
DSS .............................................................................. Dissuccinimidil Suberato
DTSSP...................................................3,3 ditiobis [sulfosuccinimidilpropionato]
DTT ...................................................................................................... Ditiotreitol
ECD ........................................................... Dissociação por Captura de Elétrons
ESI ..............................................................................Ionização por Electrospray
FT ICR ............Ressonância Ciclotrônica de Íons com Transformada de Fourier
HDX ............................................................................Troca Hidrogênio Deutério
IMS ............................................................ Espectrometria de Mobilidade Iônica
IPTG ......................................................... Isopropil β D 1 tiogalactopiranosídeo
IRMPD ........................................... Dissociação Multifotônica por Infravermelho
LC (HPLC/UPLC) ..................... Cromatografia Líquida (Alta/Ultra Performance)
MALDI .............................Ionização por Dessorção a Laser Auxiliada por Matriz
MS ............................................................................. Espectrometria de Massas
MS3D .................. Espectrometria de Massas Aplicada a Estrutura de Proteínas
NHS .................................................................................... N hidróxisuccinimida
PTM ................................................................... Modificações Pós Traducionais
PDB..........................................................................................Protein Data Bank
Q Tof ........................................................................ Quadrupolo Tempo de Vôo
RMN ................................................................. Ressonância Magnética Nuclear
SAXS ..............................................Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos
SDS PAGE ........Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Dodecilsulfato de Sódio
xix

TFA ...................................................................................... Ácido Trifluoracético
TW................................................................................................Travelling Wave
UV......................................................................................................Ultra Violeta
xx

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características de fragmentação observadas para as espécies

intermoleculares utilizando MALDI e ESI como fontes de ionização..................... 73
Tabela 2. Seção de choque para as espécies modificadas por BS3 do peptídeo

TR20. .................................................................................................................. 111
Tabela 3. Seção de choque para as espécies modificadas por BS3 do peptídeo

LR16.................................................................................................................... 111
xxi

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura de proteínas: (A) estrutura primária, (B) secundária, (C)

terciária e (D) quaternária. ...................................................................................... 2
Figura 2. Estrutura de ALCs derivados de ésteres de N hidróxisuccinimida (NHS)
com diferentes tamanhos da cadeia espaçadora. Os mais comuns são os com n =
3, 6 ou 8, que recebem as seguintes abreviaturas: DSG, DSS e DSSeb. .............. 8
Figura 3. Representação esquemática de um experimento típico de ligação
cruzada com análise por distância. 1) Reação da(s) proteína(s) alvo com o ALC
desejado; 2) Formação de peptídeos modificados e convencionais por digestão
enzimática; 3) Análise da mistura de peptídeos por LC MS/MS. 4) Agrupamento
das restrições de distância obtidas pelo experimento e desenho de um mapa de
ligações cruzadas. 5) Uso do conjunto de restrições de distância na determinação
de modelos estruturais compatíveis para a proteína alvo. ...................................... 9
Figura 4. Formação de peptídeos modificados após a reação com ALC. No caso,
um ALC derivado de éster de NHS foi utilizado, levando a formação das espécies
dead end, intramolecular ou intermolecular. ......................................................... 10
Figura 5. Ilustração do processo de dissociação induzida por colisão (CID). A
energia cinética do íon precursor, após colisão com gás inerte, é convertida em
energia interna e ocorre a fragmentação. ............................................................. 14
Figura 6. (A) Série de íons fragmentos baseada na cadeia peptídica: a/x, b/y e c/z;
(B) Mecanismo de fragmentação de um peptídeo duplamente protonado por CID,
seguindo o modelo do próton móvel. Na primeira etapa ocorre a transferência do
próton, seguido pela formação de um anel oxazolona e posterior clivagem da
ligação peptídica (amida), levando a formação de íons b (carga no N terminal) e y
(carga no C terminal) (modificado da ref. 84)........................................................ 15
Figura 7. (A) Esquema de um espectrômetro de massas do tipo FT ICR capaz de
realizar experimentos de IRMPD. O precursor (peptídeo protonado) de interesse é
aprisionado na cela de ICR e um laser infravermelho é introduzido na cela. O
precursor adquire energia vibracional e há dissociação das ligações mais lábeis,
fornecendo íons fragmentos b e y (mostrados em vermelho, B). .......................... 17
Figura 8. Proposta do mecanismo de fragmentação de proteínas e peptídeos por
ECD101,102,104. Após a captura do elétron, uma clivagem homolítica deve ocorrer.
Embora não seja completamente compreendido, a dissociação em ECD,
diferentes de CID, não ocorre na ligação peptídica (amida). ................................ 19
Figura 9. Espectro de CID (A) e ECD (B) do fator de crescimento humano
(GHRF), a sequência do peptídeo, bem como a cobertura obtida por CID e ECD
são ilustrados. A perda neutra de 64 Da refere se ao hidrosulfinilmetano
(CH3SHO), proveniente de metionina oxidada e foi verificada apenas por CID. O
espectro de ECD fornece uma cobertura sequêncial do peptídeo muito superior ao
CID110. ................................................................................................................... 21
xxii

Figura 10. Esquema de uma cela de IMS convencional. Na entrada da cela de
difusão (drift tube), os íons são submetidos a um campo elétrico baixo, que
acelera os íons até o detector (ou um espectrômetro de massas). O gás presente
na região de difusão esta sob pressão constante, que varia de 1 torr a pressão
ambiente. Um íon que passa através do gás sofre considerável número de
colisões. Íons maiores possuem maior seção de choque que íons menores, de
modo que demoram mais para atravessar o drift tube, tornando possível a
separação de íons com diferentes formas, tamanhos e carga. ............................. 24
Figura 11. Esquema da cela de TWIMS no Synapt HDMS, (B) movimento dos
íons após o pulso elétrico120. Um campo elétrico elevado é aplicado em um
segmento e arrastado sequencialmente pela cela, o que permite que os íons
sejam empurrados e, devido ao choque com gás, temos a separação dos mesmos
de acordo com sua mobilidade. Desse modo os íons se movem em pulsos,
conforme a onda do campo elétrico elevado passa por estes............................... 26
Figura 12. Guia de íons (stacked ring ion guides – SRIG) responsável pelo
funcionamento da técnica de mobilidade iônica conhecida como traveling wave
(TWIMS). ............................................................................................................... 27
Figura 13. Esquema geral da reação dos peptídeos com ALC para a formação de
espécies intra e intermoleculares. Partindo de um peptídeo linear, com sequência
comum AC xxRxxxKxxxRxxxKxxxR (A), onde x representa um número variável de
qualquer aminoácido, exceto lisina (K) e arginina (R); após a reação com o ALC
temos a formação de espécie intramolecular com N terminal acetilado (B); seguida
por digestão parcial com tripsina temos a formação de espécie intramolecular com
N terminal livre (C) e, finalmente, após digestão total com tripsina a formação de
espécie intermolecular (D)..................................................................................... 40
Figura 14. Espectros de MALDI MS do peptídeo P3 intacto (A), após a reação
com DSS (B) e digestão com tripsina por 1 hora (C) e 3 horas (D). Os íons
assinalados com uma seta correspondem às espécies de interesse. Abaixo temos
o esquema de reação com DSS e digestão enzimática para o peptídeo P3, e suas
respectivas m/z. .................................................................................................... 42
respectivas m/z. .................................................................................................... 43
respectivas m/z. .................................................................................................... 44
Figura 17. Espectros de MALDI MS do peptídeo PX intacto (A), após a reação
xxiii

o esquema de reação com DSS e digestão enzimática para o peptídeo PX, e suas
respectivas m/z. .................................................................................................... 45
Figura 18. Exemplo de possível coincidência de massas para o peptídeo P3 entre
as espécies intermolecular e dead end................................................................. 46
Figura 19. Espectros de MALDI MS/MS das espécies P3 (A), P4 (B) e P5 (C). As
estruturas de cada uma dessas espécies e os íons atribuídos estão presentes em
seus respectivos espectros. A formação dos íons fragmentos de m/z 222, 239 e
305 (circulados) está descrita no texto. Íons marcados com * são fragmentos
internos. ................................................................................................................ 49
Figura 20. Caminho de fragmentação presente em espécies intramoleculares onde
a fragmentação ocorre entre a Lys e o ALC (no caso DSS). O peptídeo P3 foi
utilizado como exemplo. Primeiro a fragmentação deve ocorrer na porção linear do
peptídeo e, uma vez que atinge a porção cíclica, ocorre a clivagem entre a ligação
DSS/Lys e fragmentação segue pela sequência do peptídeo, onde o DSS
comporta se como uma extensão da cadeia lateral da Lys. ................................. 50
Figura 21. Caminho de fragmentação presente em espécies intramoleculares
onde a fragmentação ocorre entre a Lys e o resíduo adjacente (ao longo da cadeia
peptídica). Nesse caso ambas Lys permanecem conectadas pelo DSS. O peptídeo
P3 foi utilizado como exemplo. Temos a ciclização da Lys, levando ao anel
tetrahidropiridina (representado por {K}). Esse caminho de fragmentação levou a
identificação dos íons diagnósticos de espécies modificadas por DSS, de m/z
222,1; 239,2 e 305,2. ............................................................................................ 52
Figura 22. Espectro de MALDI MS/MS da espécie intramolecular envolvendo uma
Lys e o N terminal do peptídeo PX........................................................................ 53
Figura 23. Formação de espécies intermoleculares a partir dos peptídeos P1, P2,
P3, P4, PX1 e PX2. As m/z ilustradas aqui são referents ao uso do DSS como
ALC. ...................................................................................................................... 55
Figura 24. Espectro de MALDI MS dos peptídeos P1 (A), P2 (B), P3 (C), P4 (D) e
PX(D). As setas indicam as m/z referente às espécies intermoleculares formadas
a partir destes peptídeos. ...................................................................................... 56
Figura 25. Espectro de MALDI MS do peptídeo PX, onde temos as espécies de
dead end formada pela hidrólise (m/z 1638,9) e após o ataque por Tris (m/z
1742,1). ................................................................................................................. 57
Figura 26. Espectros anotados de ESI MS/MS das espécies intermoleculares dos
peptídeos P1 (m/z 539,9; [M+3H]3+), P2 (m/z 592,6; [M+3H]3+), P3 (m/z 787,9;
[M+2H]2+), P4 (m/z 928,9; [M+2H]2+), PX1 (m/z 546,9; [M+3H]3+) e PX2 (m/z 613,4;
[M+2H]2+)............................................................................................................... 61
Figura 27. Proposta de formação do anel tetrahidropiridina a partir do íon análogo
ao imônio de Lys. .................................................................................................. 64
Figura 28. Formação de um íon fragmento cuja estrutura seria composta por dois
anéis THPs separados pela cadeia espaçadora do ALC (as m/z referem se ao uso
xxiv

de DSS) de m/z 305,2; a perda neutra de um anel THP ( 83 Da) leva a formação
do íon de m/z 222,1............................................................................................... 65
Figura 29. Espectros anotados de MALDI MS/MS das espécies intermoleculares
dos peptídeos P1 (m/z 1617,8; [M+1H]1+), P2 (m/z 1775,9; [M+1H]1+), P3 (m/z
1574,8; [M+1H]1+), P4 (m/z 1857,0; [M+1H]1+), PX1 (m/z 1638,9; [M+1H]1+) e PX2
(m/z 1225,7; [M+1H]1+).......................................................................................... 69
Figura 30. Estrutura dos agentes de ligação cruzada (ALC): glutarato de
disuccinimidila (DSG), suberado de disuccinimidila (DSS) e sebacato de
disuccinimidila (DSSeb). ....................................................................................... 71
Figura 31. ESI MS/MS da espécie intermolecular de P4, duplamente carregado,
gerados a partir dos ALCs: DSSeb (m/z 942,9; A), DSS (m/z 928,9; B) e DSG (m/z
908,9; C). Íons marcados com “estrela” não contém o ALC em sua estrutura e
possuem o mesma m/z nos três espectros. Íons marcados por triângulo
apresentam m/z deslocado pois são oriundos dos diferentes ( +28 para o DSSeb e
42 para o DSG, em relação ao DSS). .................................................................. 71
Figura 32. Região expandida dos espectros ilustrados da Figura 31 (P4 ESI
MS/MS). (A) íons diagnósticos formados quando utilizando DSSeb: m/z 250 (M1),
267 (M2) e 333 (M3); (B) íons diagnósticos quando utilizando DSS: m/z 222 (M1),
239 (M2) e 305 (M3); (C) íons diagnósticos quando utilizando DSG: m/z 180 (M1),
197 (M2) e 263 (M3).............................................................................................. 72
Figura 33. Representação esquemática de experimentos de MS/MS.................. 74
Figura 34. Estrutura dos íons diagnósticos gerados a partir do DSS (222,1494;
239,1759 e 305,2229). Os análogos, gerados a partir do DSG apresentam três
grupos CH2 a menos (m/z 180,1025; 197,1290 e 263,1760). Os análogos,
gerados a partir do DSSeb apresentam dois grupos CH2 a mais (m/z 250,1807;
267,2072 e 333,2542 ). ......................................................................................... 76
Figura 35. Cromatograma da amostra proveniente da reação entre o peptídeo PX
e DSS (após digestão enzimática) com baixa energia de colisão (sem
fragmentação). As espécies mais intensas estão indicadas. ................................ 77
Figura 36. Cromatograma de íons selecionados da amostra PX com alta energia
de colisão, indicando a presença dos íons de m/z 222,1494 (A), 239,1759 (B) e
305,2229 (C) utilizando erro de 0,02 Da. .............................................................. 77
Figura 37. Cromatogramas adquiridos com baixa energia de colisão para a
hemoglobina digerida com (linha verde) e sem PX (linha vermelha). ................... 79
Figura 38. Cromatogramas de íons selecionados com alta energia de colisão para
as amostras contendo hemoglobina + PX (traço superior) e somente hemoglobina
(traço inferior), indicando a presença dos íons diagnósticos, de m/z 222,1 (A);
239,1 (B) e 305,2 (C)............................................................................................. 79
Figura 39. Cromatogramas com alta energia de colisão para a lisozima controle
(sem DSS, traço inferior) e experimento (com DSS, traço superior), dos íons
diagnósticos de m/z 222,1 (A); 239,1 (B) e 305,2 (C). .......................................... 80
xxv

Figura 40. (A) Cromatogramas de alta energia de colisão de íons selecionados
para as m/z 222,1494 e 239,1759 (± 0,02 Da), em vermelho e verde
respectivamente. O retângulo destaca o pico cromatográfico referente ao espectro
de MS (baixa energia de colisão) apresentado em (B). Em (C) temos o espectro de
fragmentação anotado do íon de m/z 381,7, referente ao peptídeo N terminal da
lisozima modificado com DSS (dead end). Em (D), ampliação do espectro (C),
destacando a presença dos íons marcadores....................................................... 81
Figura 41. Fluxograma de interpretação de dados obtidos de um experimento de
PIS para detecção de peptídeos contendo ALC derivados de diésteres de NHS (os
valores de m/z presentes referem se ao DSS, mas caso outro ALC seja utilizado, é
só usar o m/z do ALC empregado)........................................................................ 83
Figura 42. Formação de espécies intermoleculares a partir de dois peptídeos e
ALC para estudos de IRMPD e ECD..................................................................... 84
Figura 43. Espectro de IRMPD do estado de carga [M+5H]5+ das espécies
formadas entre os peptídeos P6 e P7 utilizando os três ALCs: DSG (A, m/z
657,75), DSS (B, m/z 666,16) e DSSeb (C, m/z 671,77), da região de m/z 680 até
1150. ..................................................................................................................... 87
Figura 44. Cobertura obtida por IRMPD para o estado de carga [M+5H]5+ da
espécie P6 ALC P7 utilizando DSG (linha tracejada), DSS (linha preta) e DSSeb
(linha cinza). .......................................................................................................... 87
Figura 45. Espectros de IRMPD da espécie P8 DSS P10 com três cargas (m/z
883,16) em (A) de m/z 175 a 975 e (B) de m/z 880 a 1190; e com quatro cargas
(m/z 662,63) em (C) de m/z 175 a 710 e (D) de m/z 720 a 1070. ......................... 90
Figura 46. Cobertura obtida para P8 DSS P10 com três (traços cinza) e quarto
cargas (traços pretos). .......................................................................................... 91
Figura 47. Espectro de IRMPD e coberturas obtidas para estado de carga
[M+4H]4+ das espécies com N terminal livre das espécies P6 DSS P7 (A), P6
DSS P8 (B) e P7 DSS P8 (C). .............................................................................. 93
Figura 48. Espectros de ECD dos precursores com cinco cargas das espécies
intermoleculares P6 DSG P7 (A), P6 DSS P7 (B) e P6 DSSeb P7 (C). Em todos
os casos, o íon mais intenso é o precursor, seguido pela espécie [M+nH](n 1)+.. ... 94
Figura 49. Espectro atribuído de ECD para a espécie P6 DSS P7: de m/z 150 a
660 (A), 670 a 790 (B) e 1000 a 1610 (C). ............................................................ 96
Figura 50. Cobertura obtida para o precursor com cinco cargas, da espécie
formada entre P6 e P7, com os três ALC: DSG (linha tracejada), DSS (linha preta)
e DSSeb (linha cinza)............................................................................................ 96
Figura 51. Espectros atribuídos e as respectivas coberturas para as espécies P6
DSS P7 (A), P6 DSS P8 (B) e P7 DSS P8 (C) com N terminal livre. ................... 98
Figura 52. Espectros anotados de ECD da espécie P8 DSSeb P10 com três (A,
m/z 892,5) e quatro (B, m/z 669,6) cargas. ........................................................... 99
xxvi

Figura 53. Cobertura obtida para P8 DSSeb P10 com três (traços cinza) e quarto
cargas (traços pretos). .......................................................................................... 99
Figura 54. Esquema do instrumento Synaot HDMS utilizado nos experimentos de
separação por mobilidade iônica de isômeros do tipo dead end. Na ampliação é
mostrada a cela de mobilidade (IMS), localizada entre o quadrupolo e o Tof. Logo
após o quadrupolo temos a cela responsável pelo aprisionamento, seguida pela
cela de IMS e posteriormente a cela de transferência. Tanto a cela de
aprisionamento quanto a cela de transferência possibilitam a fragmentação de
íons (ambas são preenchidas com Ar, enquanto que a cela de IMS é preenchida
com N2). .............................................................................................................. 101
Figura 55. Distribuição por tempo de chegada (ATD) e espectros de íons produtos
dos isômeros dead end do peptídeo P11. (A) ATD total, em cinza temos as
regiões acumuladas para fornecer os espectros de íons produtos presentes (C) e
(D). Em (B) temos os ATDs extraídos dos íons fragmentos y5 (não modificados,
reação com DSS ocorreu na primeira lisina) e y5* (modificado, indicando que a
reação ocorreu na segunda lisina). Em (C) temos o espectro de íons produtos
anotado do isômero onde a modificação ocorreu na segunda lisina; e em (D) o
espectro de íons produtos anotado do isômero onde a modificação ocorreu na
primeira lisina. ..................................................................................................... 104
dos isômeros dead end do peptídeo P1. (A) ATD total, em cinza temos as regiões
acumuladas para fornecer os espectros de íons produtos presentes (C) e (D). Em
(B) temos os ATDs extraídos dos íons fragmentos y6 (não modificados, reação
com DSS ocorreu na primeira lisina) e y6* (modificado, indicando que a reação
ocorreu na segunda lisina). Em (C) temos o espectro de íons produtos anotado do
isômero onde a modificação ocorreu na segunda lisina; e em (D) o espectro de
íons produtos anotado do isômero onde a modificação ocorreu na primeira lisina.
............................................................................................................................ 105
dos isômeros dead end do peptídeo PX. (A) ATD total, em cinza temos as regiões
acumuladas para fornecer os espectros de íons produtos presentes (C) e (D). Em
(B) temos os ATDs extraídos dos íons fragmentos y5 (não modificados, reação
com DSS ocorreu no N terminal ou na primeira lisina) e y5* (modificado, indicando
que a reação ocorreu na segunda lisina). Em (C) temos o espectro de íons
produtos anotado do isômero onde a modificação ocorreu na segunda lisina; e em
(D) o espectro de íons produtos anotado dos isômeros onde a modificação ocorreu
no N terminal ou na primeira lisina, de modo que não foi possível observar
separação entre esse dois isômeros................................................................... 107
Figura 58. ATDs referentes às correntes iônicas dos íons y6, proveniente do
isômero onde a modificação ocorreu na primeira lisina e y6*, onde a modificação
ocorreu na segunda lisina, nas três condições (três diferentes pHs). Com base nos
ATDs destes dois íons, quando mantemos fixa a intensidade do íon y6,
verificamos que há uma diminuição, em relação a ela, do íon y6* conforme há um
aumento do pH.................................................................................................... 108
xxvii

Figura 59. Obtenção de espécies modificadas e lineares para os peptídeos LR16
e TR20. O ALC BS3 possuí a mesma cadeia espaçadora do DSS. ................... 110
Figura 60. Gráficos de seções de choque obtidas para cada um dos estados de
carga das espécies provenientes dos peptídeos TR20 (A) e LR16 (B). As espécies
estão atribuídas por diferentes cores em cada gráfico........................................ 112
Figura 61. Gráficos de mobilidade iônica VS. m/z das amostras XL, rica em
espécies intermoleculares (A), Ecoli, digesto tríptico de um extrato de E. coli (B) e
a mistura Ecoli:XL (C). Para a amostra Ecoli foram adicionados manualmente
linhas para ilustrar a presença de nuvens referentes a espécies monocarregadas
(1+), dicarregadas (2+) e com três ou mais cargas (3+ ou mais)........................ 115
xxviii

1. INTRODUÇÃO
1.1. Proteínas

Proteínas constituem um dos tipos de macromoléculas biológicas mais
abundantes, versáteis e complexas. Sua complexidade se deve ao fato de
serem constituídas por diferentes aminoácidos, que podem ou não estar
modificados, além de apresentarem uma ampla faixa de tamanho, variando de
poucos kDa a alguns MDa, bem como adquirir diferentes estruturas. Em
decorrência dessa diversidade, são atribuídas a essas macromoléculas as mais
diversas funções, tais como catálise, transporte, estrutura, defesa, dentre outras.
De quase todas as proteínas a função está diretamente relacionada com sua
estrutura, de modo que se uma proteína perder sua estrutura, muito
provavelmente também perderá sua função.1
A cadeia polipeptídica de uma proteína enovela se de modo que,
normalmente, resíduos hidrofóbicos localizam se no interior, enquanto resíduos
hidrofílicos situam se na superfície da proteína. O modo com que as ligações de
hidrogênio da cadeia polipeptídica interagem ditam como será o enovelamento
de uma proteína, de modo que podem gerar hélices (α, π ou poliprolina), quando
interação ocorre entre resíduos vizinhos; ou folhas β, quando a interação entre
os resíduos da cadeia peptídica ocorrem à distância. Esses elementos
conformacionais foram propostos por Pauling e Corey2 e são tidos como os
blocos de construção de proteínas sendo, em média, responsável por dois
terços das estruturas de proteínas conhecidas. Nos anos 50, Linderstrøm Lang e
Schellman3 perceberam que estruturas de proteínas são compostas de forma
hierárquica e propuseram quatro níveis de organização (complexidade): (i)
estrutura primária, referente à sequência de aminoácidos; (ii) estrutura
secundária, baseada nas ligações de hidrogênio da cadeia peptídica, que dão
origem à hélices ou folhas, como já descrito; (iii) estrutura terciária, referente ao
enovelamento da proteína, devido às interações entre as cadeias laterais após a
formação da estrutura secundária; e (iv) em alguns casos temos ainda a
1
formação de estrutura quaternária, que corresponde a agregação de cadeias
polipeptídicas distintas, de modo a formar uma estrutura supramolecular. Na
Figura 1 temos uma ilustração representativa das estruturas primária (A),
secundária (B), terciária (C) e quaternária (D) da hemoglobina humana.
(A) (C) D)
(B)
Figura 1. Ilustração representativa das estruturas primária (A), secundária (B), terciária (C) e
quaternária (D) da hemoglobina humana (modificado de ref. 3).

As técnicas de caracterização estrutural de proteínas e complexos
protéicos disponíveis atualmente podem ser divididas nos seguintes grupos:
técnicas de estrutura primária e terciária, esta última classificada em alta
resolução, média resolução, baixa resolução/sonda e computacionais4. Técnicas
de caracterização de estrutura primária não fornecem nenhum tipo de
informação espacial, limitando se a identificação de proteínas. Nesta classe a
espectrometria de massas (MS) a principal ferramenta para identificação de
proteínas. As técnicas de baixa resolução/sonda englobam as espectroscopias,
onde a resposta é determinada pela presença de certa característica estrutural
da proteína. Essa classe engloba as técnicas de Dicroísmo Circular (CD),
Fluorescência de Emissão, Transferência de Energia Ressonante por
Fluorescência (FRET) dentre outras. Embora essas técnicas sejam em geral
sensíveis, rápidas, relativamente simples e de fácil acesso, a resposta obtida em
geral é insuficiente para caracterização mais profunda do sistema. Como
técnicas de média resolução, temos aquelas que fornecem informações gerais
da proteína ou complexo protéico, tais como posição e orientação dos
2
componentes, destacando se as microscopias e o espalhamento de raios X a
baixos ângulos (SAXS). Em geral tais técnicas são bem restritas a alguns
usuários tanto pela necessidade de instrumentação muito específica e
dispendiosa quanto pelo alto grau de dificuldade de interpretação de dados.5
Atualmente existem duas técnicas estabelecidas para determinação
estrutural de proteínas com alta resolução (resolução atômica): Ressonância
Magnética Nuclear (RMN) e Cristalografia de Proteínas (CRP). Apesar do
grande sucesso dessas técnicas, elas apresentam algumas limitações que
impedem seu uso irrestrito para qualquer tipo de proteína, dentre as quais se
destacam a necessidade de uma grande quantidade de amostra (vários
miligramas) com alto grau de pureza. No caso de RMN, há ainda a necessidade
de a amostra ser estável em algum dos tampões que não interfiram na análise
por um longo intervalo de tempo (dias a semanas) a temperatura ambiente.
Além disso, as técnicas disponíveis atualmente restringem o tamanho máximo
da amostra a aproximadamente 50 kDa. Devido à necessidade de meios de
cultura enriquecidos com diferentes isótopos, trata se de uma metodologia cara
e tanto o experimento quanto a análise dos dados são processos longos e pouco
automatizados. A CRP por sua vez requer que a amostra esteja na forma de
monocristal, o que constitui a principal limitação da técnica. Além disso, a
estrutura obtida por CRP é uma estrutura estática e não necessariamente
representativa do sistema em solução.6,7,8
1.2. Caracterização Estrutural de Proteínas por Técnicas

Baseadas em Espectrometria de Massas
No fim da década de 80, com o desenvolvimento das técnicas de

ionização de ESI (electrospray)9 e MALDI (matrix assisted laser
desorption/ionization)10, a análise de peptídeos e proteínas por MS deu um
grande salto. Tais técnicas permitem a ionização dessas macromoléculas com
alta eficiência e sem a necessidade de derivatização.11 Vale ressaltar que o
desenvolvimento dessas técnicas contribuiu significativamente para a melhoria
3
dos analisadores de m/z, como dos tipos ion trap, Q ToF (quadrupolo – tempo
de vôo), Tof Tof, FT ICR e Orbitrap.12 Desse modo, esse período presenciou
uma grande quantidade de artigos explorando os diferentes tipos de informação
que poderiam ser obtidos pela análise de proteínas e peptídeos por MS. O uso
de MS para análise estrutural de proteínas, principalmente devido às suas
vantagens intrínsecas, como alta sensibilidade, rapidez de análise e
especificidade.
Alguns anos após o desenvolvimento das técnicas de ionização de ESI e
MALDI foi possível observar que essas técnicas eram suficientemente brandas
para a manutenção, ao menos em parte, da estrutura de complexos protéicos
em fase gasosa.13,14,15 Inicialmente, os primeiros trabalhos mostravam que em
muitos casos, interações não covalentes proteína ligante podiam ser mantidas
em fase gasosa desde que o processo de ionização fosse realizado em
condições controladas.16 Apesar dos primeiros resultados animadores, esse
método sofria de grandes limitações instrumentais, uma vez que complexos
maiores tendem a se dissociar facilmente devido às grandes diferenças de
pressão às quais são submetidos na análise por MS; além disso, detectores
convencionais apresentavam limitações na faixa de m/z que impediam a
detecção dessas espécies. O desenvolvimento de instrumentação dedicada a
essa aplicação contribuiu significativamente para o estudo de proteínas grandes
e complexos mais lábeis.17 Macromolecular MS, denominação proposta para
esses experimentos, tem sido atualmente utilizada para determinação da
estequiometria de complexos18, determinação de força de ligação das espécies
constituintes de complexos19,20, análise de mudanças conformacionais
promovidas pela interação com ligantes21, cinética de enovelamento e
desenovelamento22,23 e determinação da topologia24,25. A principal limitação
desses experimentos é a necessidade de instrumentos adaptados, não
comerciais, cujas características dificultam sua utilização para outros fins.
Um método de caracterização estrutural de proteínas é a Troca
Hidrogênio/Deutério (HDX)26,27,28. HDX baseia se no fato de que quando
proteínas são solubilizadas em excesso de solvente deuterado, os hidrogênios
4
lábeis da proteína trocam com o deutério do solvente. Os hidrogênios das
cadeias laterais dos aminoácidos que possuam grupos SH, OH e NH trocam
muito rapidamente e, portanto, não permitem determinação de sua cinética de
troca por MS. Os H das ligações peptídicas (amidas) da cadeia principal da
proteína, por sua vez, apresentam uma faixa de 108 ordens de grandeza de
diferença de velocidade de troca, dependendo do perfil de ligações de
hidrogênio e, principalmente, do grau de exposição desses átomos ao
solvente27. Após o experimento de troca, que deve ser realizado por diferentes
intervalos de tempo para permitir o cálculo da cinética, o pH do meio reacional é
alterado para 2 3 e a temperatura para 0°C de modo a evitar a troca reversa.
Análises por MS podem ser realizadas tanto para a proteína ou complexo
protéico intacto, com intuído de determinar o nível de incorporação de deutério,
bem como na análise dos peptídeos, após digestão enzimática, com o objetivo
de determinar a cinética de troca em cada uma das regiões da proteína. HDX
requer assim experimentos muito cuidadosos para evitar artefatos. Como
descrito anteriormente, para diminuir a taxa de troca reversa, após a reação
deve se abaixar o pH e a temperatura. Essas condições são incompatíveis com
a grande maioria das enzimas, sendo que atualmente a única utilizada em
experimentos desse tipo é a pepsina. Essa enzima apresenta baixa
especificidade e eficiência no pH utilizado, o que dificulta a identificação dos
peptídeos obtidos por MS. Apesar das dificuldades apresentadas, HDX tem sido
aplicada com relativo sucesso para o estudo de enovelamento e estabilidade de
proteínas29,30, mudanças conformacionais mediante interação com ligantes31,32 e
no estudo de interações proteína proteína33 devido à atratividade de MS
caracterização de proteínas.
Na última década duas outras técnicas de caracterização estrutural de
proteínas e complexos protéicos baseadas em MS vêm recebendo grande
destaque. Tratam se das técnicas conhecidas como Footprinting e Cross linking
(ligação cruzada); essas técnicas baseiam se em modificações químicas nas
cadeias laterais dos resíduos de uma proteína, seja por radicais hidroxila, no
caso de footprinting ou por agentes de ligação cruzada no caso de cross lining.
5
O termo footprinting refere se a ensaios que analisam mudanças
estruturais em macromoléculas por meio da acessibilidade do solvente a cadeia
principal ou cadeias laterais, por meio de agentes químicos clivagem enzimática,
ou modificação de reações34,35. Dentro desse grupo, cabe destacar a
importância que radicais hidroxilas vêem recebendo nos últimos anos. Esses
radicais apresentam reatividade frente à cadeia lateral dos aminoácidos de uma
proteína, levando a modificação dessas cadeias por ligações covalentes36. De
modo simplificado, um experimento típico de footprinting consiste na exposição,
tanto de uma proteína isolada quanto do complexo proteína ligante, aos radicais
hidroxilas por diferentes intervalos de tempo. As amostras são submetidas a
digestão enzimática e analisadas por MS. Análises do tipo LC MS/MS permitem
identificar os sítios de oxidação, enquanto análises de LC MS são utilizadas para
quantificar a oxidação. Métodos computacionais podem ser subseqüentemente
utilizados para a construção de modelos tridimensionais do complexo37. O
método de footprinting com geração de radicais hidroxilas (•OH) por meio de
diferentes fontes de radiação tem permitido realizar estudos relacionados à
estrutura de proteínas em solução38 e o seu desenovelamento39,40.
1.3. Ligação Cruzada e Espectrometria de Massas
O fenômeno de ligação cruzada (cross linking) refere se à união de duas

espécies através da formação de uma ligação covalente, muitas vezes
realizadas por intermédio de um agente de ligação cruzada (ALC). As espécies
envolvidas em experimentos de ligação cruzada podem representar diferentes
classes químicas, variando de proteínas e ácidos nucléicos a partículas sólidas,
ou ainda diferentes regiões da mesma espécie como, por exemplo, ligação entre
dois resíduos de uma mesma proteína41. Talvez o tipo de ligação cruzada mais
comum presente em proteínas seja a formação de ligação de dissulfeto entre
resíduos de cisteína. Entretanto, quando temos uma proteína ou complexo
protéico como alvo, o mais interessante é a realização de experimentos de
ligação cruzada mediados por ALCs. Além disso, as interações de complexos
6
não covalentes são em geral muito fracas e, desse modo, são facilmente
dissociadas, o que torna sua análise muito difícil. Assim, do ponto de vista
analítico, é muito interessante a estabilização desses complexos mediante a
formação de ligações covalentes, uma vez que isso facilita a posterior
purificação e caracterização do mesmo em condições mais adequadas, mas que
ainda retém as informações espaciais desejadas. As informações obtidas podem
então ser utilizadas como base para interrogação de um grande número de
informações importantes desses complexos42.
ALCs são compostos orgânicos multifuncionais, contendo em geral dois
ou três grupos reativos, unidos por uma cadeia espaçadora de comprimento
variável. No caso de proteínas, os ALC são capazes de ligar covalentemente a
cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos, de acordo com suas respectivas
especificidades43. Os grupos reativos podem ser idênticos (homobifuncionais) ou
distintos (heterobifuncionais), permitindo maior versatilidade na especificidade
de cada reagente. Os ALCs reagem com as cadeias laterais de dois resíduos
distintos que estejam espacialmente separados, no máximo, pela distância da
cadeia espaçadora. Como exemplos de grupos reativos mais empregados em
ALC estão os reativos frente a aminas, álcoois e tióis, como ésteres de N
hidroxisuccinimida (NHS) e imidoésteres; frente a ácidos carboxílicos, como
carbodiimidas; frente a alcoóis, como isocianatos; e específicos para tióis, como
maleimidas41. Dentre os ALCs disponíveis atualmente, os de maior destaque
são aqueles reativos frente a aminas primárias. Isso se deve principalmente a
alta ocorrência de grupos aminos em proteínas, sejam em resíduos de lisina ou
no N terminal da proteína. Os derivados de NHS são os ALCs mais utilizados
atualmente devido aos rendimentos relativamente altos das reações e,
principalmente, à facilidade de sua obtenção, bastando para isso reagir um ácido
carboxílico com o NHS44. Comercialmente existe uma série de ALCs
homobifuncionais homólogos, diferenciando se pelo tamanho da cadeia
espaçadora, o que permite um estudo mais refinado da estrutura da proteína ou
complexo protéico, uma vez que se conhecendo o comprimento da cadeia
espaçadora pode se inferir com mais precisão a real distância entre os dois
7
grupos reativos. Na Figura 2 temos a estrutura de alguns dos ALCs derivados de
ésteres de NHS comumente utilizados em experimentos de ligação cruzada de
proteínas, com as respectivas distâncias máximas que estes ALC podem
proporcionar reações entre lisinas.
n Nome Distância (Å)

3 Glutarato de Dissuccinimidila (DSG) 7,7
5 Pimelato de Dissuccinimidila
6 Suberato de Dissuccinimidila (DSS) 11,4
8 Sebacato de Dissuccinimidila (DSSeb) 13,0
Figura 2. Estrutura de ALCs derivados de ésteres de N hidróxisuccinimida (NHS) com diferentes
tamanhos da cadeia alifática. Os mais comuns são os com n = 3, 6 ou 8, que recebem as
seguintes abreviaturas: DSG, DSS e DSSeb. As distâncias (Å) mencionadas são baseadas de
acordo com o fornecedor de cada ALC.
Em 2000, Young e colaboradores propuseram pela primeira vez a

utilização conjunta de ligação cruzada e MS para a obtenção de informações
estruturais de proteínas. Tais informações seriam provenientes do tamanho da
cadeia espaçadora do reagente utilizado, onde a distância máxima entre dois
resíduos ligados pelo ALC corresponderia ao comprimento do reagente. Caso o
número dessas restrições espaciais fosse igual a N/10 (onde N é o número de
resíduos da proteína), seria possível determinar o tipo de enovelamento por
meio de métodos computacionais. Desse modo, foi proposta pela primeira vez a
utilização de um método rápido e sensível baseado em ligação cruzada e MS
para a obtenção de informações estruturais de proteínas45.
Em experimentos de ligação cruzada e espectrometria de massas
envolvendo proteínas (Figura 3), estas são submetidas à reação com um
determinado agente de ligação cruzada (ALC, representado em vermelho na
etapa 1), seguida por digestão enzimática (2) e os peptídeos gerados são então
8
analisados pela técnica de espectrometria de massas (3)43. Os peptídeos
resultantes são então analisados por MS, sendo que a partir dessa etapa as
análises realizadas são dependentes do tipo de informação desejada: pode se
simplesmente identificar as proteínas presentes em um complexo ou até a
identificação exata de quais peptídeos estão ligados entre si em uma proteína ou
complexo protéico. Caso seja desejado, os peptídeos modificados pelo ALC são
então identificados e um mapa de ligações cruzadas é obtido (4); com base nas
restrições de distância (dado pelo ALC utilizado) é possível selecionar modelos
estruturais compatíveis para a proteína alvo (5).

Figura 3. Representação esquemática de um experimento típico de ligação cruzada com análise
por distância. 1) Reação da(s) proteína(s) alvo com o ALC desejado; 2) Formação de peptídeos
modificados e convencionais por digestão enzimática; 3) Análise da mistura de peptídeos por
LC MS/MS. 4) Agrupamento das restrições de distância obtidas pelo experimento e desenho de
um mapa de ligações cruzadas. 5) Uso do conjunto de restrições de distância na determinação
de modelos estruturais compatíveis para a proteína alvo.
A união das técnicas de ligação cruzada e MS têm sido extensivamente

utilizada nos últimos anos visando à obtenção de dados estruturais como
determinação do tipo de enovelamento de proteínas46,47,48,49, identificação de
parceiros de interação50,51,52, monitoramento de mudanças conformacionais
9
mediante interação com ligante53,54,55, determinação de superfície de interações
em complexos protéicos56,57,58,59,60,61,62 e finalmente na determinação de
acessibilidade ao solvente63,64,65,66. Em todos esses estudos a detecção e
identificação de peptídeos modificados pelo ALC é uma etapa crítica.
Após a reação com o ALC e digestão enzimática, diferentes tipos de
peptídeos modificados pelo ALC podem ser formados: i) espécies hidrolisadas
ou dead end, onde somente um dos grupos reativos reagiu com a proteína,
enquanto o outro sofreu hidrólise; ii) ligação cruzada intramolecular, onde os
dois resíduos de aminoácidos ligados encontram se na mesma peptídeo; e iii)
ligação cruzada intermolecular, onde os resíduos ligados encontram se em
cadeias peptídicas distintas. A Figura 4 ilustra a formação de dessas espécies
após a reação com ALC derivado de éster de NHS.
Figura 4. Formação de peptídeos modificados após a reação com ALC. No caso, um ALC
derivado de éster de NHS foi utilizado, levando a formação das espécies dead end,
intramolecular ou intermolecular.
Cada uma dessas espécies fornece informações úteis sobre a estrutura

da proteína (ou complexo), sendo que as espécies do tipo dead end trazem
informação de que o sítio reativo está exposto ao solvente, além de não deve
haver nenhum outro sítio reativo próximo do que já reagiu com o ALC; as
10
espécies intramoleculares trazem a informação de que dois resíduos próximos
na estrutura primária também se localizam dentro da distância do ALC utilizado
na estrutura terciária e, finalmente, as espécies intermoleculares que nos dizem
que dois resíduos estão próximos na estrutura terciária de uma proteína mesmo
sendo de regiões distantes em sua estrutura primária ou, ainda, no caso de um
complexo protéico, nos dizem que resíduos de duas proteínas distintas
encontram a certa distância quando estas formam o complexo de interesse. Esta
última espécie é, sem dúvida, a que fornece informações de maior relevância,
seja para uma única proteína ou, principalmente, para complexos protéicos
onde, com base nessas espécies, é possível verificar quais regiões de
determinada proteína estão próximas de regiões das outras proteínas desse
complexo.
Embora a metodologia de ligação cruzada com análise por MS tenha se
mostrado bastante promissora em fornecer informações estruturais de proteínas,
um dos grandes desafios da técnica é a detecção e correta identificação dos
peptídeos modificados pelo ALC, uma vez que os mesmos sempre estão
presentes em quantidades muito reduzidas na mistura de peptídeos43,67. Várias
estratégias têm sido desenvolvidas visando contornar esse problema, como o
uso de ALC marcados isotopicamente68,69,70, ALC modificados com grupos
específicos visando purificação por cromatografia de afinidade dos peptídeos
modificados71,72, ALC cliváveis visando facilitar a detecção dos peptídeos
modificados,73,74,75 expressão de proteínas alvo marcadas isotopicamente com
14
N76,77 e digestão enzimática em água marcada com 18
O78,79,80. Essas duas
últimas estratégias baseiam se no fato que após digestão tríptica, os pares de
peptídeos ligados pelo ALC terão dois resíduos N terminal e C terminal cada,
possibilitando a identificação dos peptídeos modificados pela diferença de
massa proporcionada pela marcação isotópica. Todos esses métodos, no
entanto, necessitam de etapas adicionais para facilitar a identificação dos
peptídeos modificados por ALC, o que deve acarretar em perda de amostra, o
que, como dito anteriormente, é um problema grave, uma vez que os peptídeos
11
modificados já se encontram em quantidades muito reduzidas em relação aos
peptídeos convencionais.
De modo geral, toda metodologia utilizada para identificação de peptídeos
modificados por ALC é baseada na fragmentação destes peptídeos. Desse
modo, uma compreensão correta sobre a fragmentação desses peptídeos é de
importância fundamental para que peptídeos modificados por ALC sejam
identificados corretamente, além de possibilitar o desenvolvimento de
metodologias baseadas na fragmentação desses peptídeos que facilitem a
identificação em larga escala. Em 2003, foi proposta pela primeira vez a
possibilidade de implementação de uma ferramenta de bioinformática capaz de
interpretar os dados de experimentos de MS3D automaticamente91. O
desenvolvimento dessas ferramentas seria extremamente interessante, uma vez
que aumentaria consideravelmente a velocidade de análise de dados e permitiria
desse modo a elucidação de inúmeras estruturas em curto intervalo de tempo.
Essa ferramenta foi dividida em duas partes, ASAP e MS2Assign. Enquanto o
ASAP seria responsável pela atribuição dos peptídeos modificados baseado em
dados de MS, o MS2Assign seria utilizado para validar essas identificações
pelos dados de fragmentação. Entretanto, nenhum espectro de fragmentação
apresentado continha as espécies propostas, sendo estes dominados pela
presença de íons do tipo y e b (a formação desses íons será discutida
posteriormente). Posteriormente, o mesmo grupo realizou um estudo sistemático
de fragmentação de peptídeos contendo diferentes ALCs derivados de ésteres
de NHS. Para realizar esses estudos, foram utilizados peptídeos contendo
múltiplas repetições de um aminoácido (A ou G), contendo uma ou duas lisinas
(para o estudo de espécies inter ou intramoleculares, respectivamente) e o N
terminal acetilado. A acetilação do N terminal foi realizada para bloquear esse
sítio de reação com o ALC, dirigindo a reação somente à lisina. Isso evitaria a
formação de espécies isóbaras que impediriam o estudo de fragmentação dos
peptídeos de interesse. Entretanto, a acetilação do N terminal de peptídeos deve
alterar significativamente o perfil de fragmentação dessas espécies, visto que
essa modificação exclui um sítio de protonação da molécula. Além disso, a
12
utilização de seqüências baseadas na repetição de aminoácidos em muitos
casos levou a formação de fragmentos isóbaros, de modo que suas estruturas
não puderam ser atribuídas. Em vista disso, os mecanismos de fragmentação
desses peptídeos não poderiam ser aplicados em experimentos de MS3D, onde
proteínas com seqüências aleatórias são modificadas e posteriormente digeridas
levando a formação de peptídeos trípticos.
1.4. Análise de Peptídeos por Dissociação Induzida por

Colisão CID

A fragmentação de peptídeos por espectrometria de massas é utilizada
rotineiramente para identificação de proteínas. Esse processo é comumente
realizado por meio de dissociação induzida por colisão (collision induced
dissociation – CID)81,82,83. Apesar de outras metodologias para a fragmentação
de peptídeos terem sido desenvolvidas, tais como dissociação por captura de
elétrons (electron capture dissociation ECD) e dissociação multifotônica por
infravermelho (infrared multiphoton dissociation – IRMPD), que serão discutidas
nas próximas seções, CID é sem dúvida o método mais amplamente
empregado, além de ser o de maior disponibilidade em espectrômetros de
massas disponíveis comercialmente. Neste processo de CID, os peptídeos são
inicialmente introduzidos em uma região de vácuo do espectrômetro de massas
por meio dos processos de electrospray ou MALDI. Usando uma descrição
cabível para a maior parte dos equipamentos comercialmente disponíveis, os
peptídeos protonados de interesse são selecionados em um primeiro analisador
de m/z e acelerados para uma região do espectrômetro preenchida com um gás
inerte (geralmente hélio, argônio ou nitrogênio) proporcionando, assim, a colisão
entre os íons e as moléculas do gás inerte. Como resultado, a energia cinética
transferida em cada colisão é convertida em energia interna; essa energia
interna é distribuída pelas ligações do íon e ocorre a fragmentação (processo é
ilustrado na Figura 5).
13
Íons Fragmentos

Figura 5. Ilustração do processo de dissociação induzida por colisão (CID). A energia cinética do
íon precursor, após colisão com gás inerte, é convertida em energia interna e ocorre a
fragmentação.
Para explicar a fragmentação de peptídeos, Wysocki e colaboradores

propuseram o modelo do próton móvel84, que descreve como a energia interna
adquirida induz a transferência dos prótons em cada peptídeo protonado,
culminando na desestabilização das ligações do esqueleto polipeptídico e, por
conseqüência, induzindo a formação de íons fragmentos85, que são classificados
como íons que retêm a carga (próton) no lado N terminal, gerando fragmentos a,
b e c, dependendo da ligação que é fragmentada; e íons que retém a carga
(próton) na região C terminal, gerando os fragmentos x, y e z, dependendo da
ligação que é fragmentada, segundo a nomenclatura proposta por Roepstorff–
Fohlmann–Biemann86. As séries de íons fragmentos descritos para peptídeos
lineares está ilustrada na Figura 6A. Considerando se que as ligações peptídicas
(amida) são as mais lábeis, espera se que a formação do par de fragmentos b/
y seja mais freqüente em experimentos de CID que os demais pares de
fragmentos, facilitando a interpretação dos espectros. A Figura 6B ilustra como o
modelo do próton deve ocorrer para um peptídeo duplamente protonado em
experimentos de CID, levando à formação de íons b ou y. As etapas envolvidas
no processo envolvem a transferência do próton, seguida pela formação de um
anel oxazolona e posterior clivagem da ligação peptídica (amida), levando a
formação de íons b (carga no N terminal) e y (carga no C terminal).
14
A
Dissociação
Induzida por
Colisão (CID)
Figura 6. (A) Série de íons fragmentos baseada na cadeia peptídica: a/x, b/y e c/z; (B)
Mecanismo de fragmentação de um peptídeo duplamente protonado por CID, seguindo o modelo
do próton móvel. Na primeira etapa ocorre a transferência do próton, seguido pela formação de
um anel oxazolona e posterior clivagem da ligação peptídica (amida), levando a formação de
íons b (carga no N terminal) e y (carga no C terminal) (modificado da ref. 84).
Embora experimentos de fragmentação de peptídeos lineares estejam

presentes de forma rotineira em laboratórios há alguns anos, estudos de
peptídeos modificados por ALC, provenientes de experimentos de ligação
15
cruzada de proteínas e complexos protéicos apresentam desafios,
especialmente para as espécies intra e intermoleculares, de modo que a análise
dessas espécies não é realizada em larga escala, quase sempre necessitando
de inspeção manual para validação dos dados. A espécie dead end não
apresenta um perfil de fragmentação muito diferente de peptídeos lineares, uma
vez que o ALC é apenas uma extensão da cadeia lateral da lisina, comportando
se como uma modificação pós traducional. Já no caso de espécies
intramoleculares, temos a presença de um macrocíclico, como ilustrado na
Figura 4, de modo que rotas de fragmentação diferentes de peptídeos lineares
devem ser observadas. Já as espécies intermoleculares apresentam o maior
desafio, uma vez que duas cadeias peptídicas estão presentes e a fragmentação
deve ocorrer em ambas as cadeias.
Enquanto existem alguns trabalhos na literatura que mostram espectros
de fragmentação de peptídeos modificados por ALCs48,52,54,55,61,80,87, poucos
discutem profundamente como o esses peptídeos fragmentam88,89,90. Schilling e
colaboradores91 propuseram uma nomenclatura para os fragmentos
provenientes da dissociação de peptídeos modificados por ALC baseado na
nomenclatura proposta por Roepstorff–Fohlmann–Biemann para peptídeos
lineares. No entanto, a grande maioria dos trabalhos por CID que apresentam
espectros de fragmentação de peptídeos provenientes de experimentos de
ligação cruzada anota apenas íons convencionais (b e y). Desse modo é de
grande interesse verificar a presença de caminhos de fragmentação particulares,
tanto por CID como para outros métodos de dissociação, de peptídeos
modificados por ALC que permitam identificá los dentre peptídeos não
modificados. Cabe salientar que em CID peptídeos muito grandes, com mais de
15 resíduos, costumam não fornecer espectros de dissociação informativos, uma
vez que, devido ao seu tamanho, temos uma maior distribuição de energia ao
longo da cadeia, acarretando em poucos fragmentos.
16
1.5. Dissociação Multifotônica por Infravermelho IRMPD
O método de dissociação multifotônica por infravermelho (infrared

multiphoton dissociation – IRMPD) surgiu no final da década de 70 para estudos
de fragmentação de moléculas pequenas92 e passou a ser utilizado para análise
de biomoléculas no final da década de 90, principalmente devido à ausência de
métodos eficientes de CID para análises de moléculas grandes em instrumentos
do tipo ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (FT ICR)93.
Em experimentos de IRMPD os íons precursores de interesse são isolados e
aprisionados na cela de ICR e um feixe de laser infravermelho é direcionado a
eles (como ilustrado na Figura 7A). O mecanismo de fragmentação envolve a
incidência de múltiplos fótons no precursor, que adquire energia vibracional até
ocorrer clivagem das ligações mais lábeis94. Em IRMPD, assim como em CID, os
precursores passam por um processo lento de ativação (slow heating method), e
esses eventos, muitas vezes, necessitam de eventos da ordem de ms para
ocorrem de forma eficiente; no caso de CID são necessárias múltiplas colisões
com o gás, enquanto que IRMPD múltiplos fótons são necessários para a
dissociação95,96. Desse modo, no caso da análise de peptídeos, esses dois
métodos de dissociação geram íons fragmentos similares, do tipo b e y (Figura
7B).
Precursor
Laser
Cela do
(A) FT ICR (B)

Figura 7. (A) Esquema de um espectrômetro de massas do tipo FT ICR capaz de realizar
experimentos de IRMPD. O precursor (peptídeo protonado) de interesse é aprisionado na cela
de ICR e um laser infravermelho é introduzido na cela. O precursor adquire energia vibracional e
há dissociação das ligações mais lábeis, fornecendo íons fragmentos b e y (mostrados em
vermelho, B).
17
A eficiência da dissociação em IRMPD, definida como a abundância
relativa do íon precursor em relação a seus fragmentos, depende de três
parâmetros: a quantidade de íons irradiados pelo laser, a intensidade do laser
(potência do laser, normalmente inferior a 100 W/cm²) e o tempo de irradiação
(de 10 a centenas de ms), sendo comum utilizar um feixe de laser não focado,
de modo a atingir a maior parte dos precursores presentes na câmara de ICR97.
Na maior parte dos instrumentos comerciais todos esses parâmetros podem ser
controlados manualmente, de forma a aperfeiçoar a dissociação de modo
desejado.
Aplicações de IRMPD para estudo estrutural de moléculas pequenas são
realizadas para diferenciação de isômeros98,99, pois isômeros normalmente
possuem estados diferentes de energia e, em IRMPD, o processo de
fragmentação ocorre pelo menor caminho energético. No caso de moléculas
maiores, IRMPD tem sido utilizado na caracterização e identificação de
peptídeos100, oligonucleotídeos101 e, principalmente, no estudo que envolve a
caracterização de proteínas intactas, conhecido como top down102,103. Até agora,
a literatura apresenta apenas um trabalho onde IRPMD foi utilizado em estudos
envolvendo ligação cruzada de proteínas e espectrometria de massas104 e
apenas dois espectros de IRMPD são mostrados, contendo apenas íons
fragmentos do tipo b e y atribuídos.
1.6. Dissociação por Captura de Elétrons ECD
Dissociação por captura de elétrons (electron capture dissocation – ECD)

representa um dos avanços mais recentes e significativos para a identificação e
caracterização de peptídeos e proteínas por espectrometria de massas. A
técnica foi desenvolvida por McLafferty e colaboradores em 1998105 e vêm
sendo amplamente aplicada em estudos de top down de proteínas
(seqüenciamento de proteínas intactas, sem digestão enzimática)106,107 e
localização e identificação de modificações pós traducinais.
18
Em comparação com CID, o método de dissociação mais difundido, ECD
é capaz de fornecer uma sequência de fragmentos mais extensa da cadeia
peptídica, de modo que permite que modificações lábeis das cadeias laterais
dos resíduos permaneçam intactas durante a dissociação da cadeia peptídica108.
Em relação à questão instrumental, a geometria utilizada para experimentos de
ECD é bastante similar ao IRMPD. Os íons precursores, multicarregados
positivamente, são aprisionados na cela de instrumentos do tipo FT ICR e, ao
invés de um laser, são irradiados por um feixe de elétrons de baixa energia (≤
0,2 eV), normalmente produzidos por um filamento convencional. Ocorre então a
captura de elétrons pelo precursor, de modo que uma neutralização parcial é
obtida (reação exotérmica). A dissociação então se dá por um processo descrito
como não ergódigo, ou seja, ela ocorre antes que haja tempo para redistribuição
de energia109, de modo que toda ligação peptídica deve se fragmentar sem que
haja preferência, mantendo intacta até mesmo modificações pós traducionais
lábeis. Uma vez que a clivagem ocorre apenas ao longo da cadeia peptídica é
possível manter até mesmo interações não covalentes, sendo que estruturas
secundária de proteínas e peptídeos podem ser estudadas por ECD110.
Após a neutralização parcial do precursor multiprotonado íons fragmentos
do tipo c e z• são observados em experimentos de ECD de peptídeos e
proteínas e, embora o mecanismo exato de fragmentação em ECD ainda não
seja completamente compreendia108,109,110, a idéia mais aceita é ilustrada na
Figura 8 (ver legenda).
c .z
102,103,105
Figura 8. Proposta do mecanismo de fragmentação de proteínas e peptídeos por ECD .
Após a captura do elétron, uma clivagem homolítica deve ocorrer. Embora não seja
completamente compreendido, a dissociação em ECD, diferentes de CID, não ocorre na ligação
peptídica (amida). Uma vez que ocorre a neutralização parcial do precursor, é importante notar
que o peptídeo em questão deve possuir mais de uma carga, de modo que é possível determinar
as m/z dos fragmentos gerados (uma carga na porção N terminal para verificar íons c e outra na
C terminal, para os íons z•).
19
Enquanto métodos lentos de dissociação (CID e IRMPD) fornecem
majoritariamente íons fragmentos b e y, provenientes da ligação peptídica
(amida) de peptídeos e proteínas, conforme ilustrado na Figura 8, após a
captura do elétron, ECD gera fragmentos do tipo c e z•, provenientes da
clivagem da ligação entre N Cα da cadeia peptídica.
Para ilustrar a fragmentação extensiva em peptídeos por ECD temos o
estudo realizado por Guan e colaboradores111. Na Figura 9 temos o espectro de
CID (A) e ECD (B) do mesmo peptídeo, o fator de crescimento humano (GHRF)
contendo metionina oxidada (Met(O)). Quando peptídeos contendo Met(O) são
submetidos a CID é esperado a perda neutra de 64 Da, referente à
hidrosulfinilmetano (CH3SHO) e, verificando o espectro da Figura 9A poucos
íons fragmentos b e y referentes a sequência do peptídeo são observados,
levando a uma baixa cobertura do mesmo, enquanto que a perda de 64 Da é
verificada com freqüência. Já no espectro de ECD (Figura 9B) a perda de 64 não
foi observada, mas uma cobertura praticamente completa, com base em íons c e
z•, foi obtida. Embora a cobertura do peptídeo seja muito superior em ECD do
que em CID, CID é capaz de fornecer informação sobre a modificação deste
peptídeo, no caso, metionina oxidada ( 64 Da), o que leva a conclusão que
ambos os métodos são complementares e podem ser utilizado em estudos
detalhados que envolvam sequênciamento e identificação de modificações de
peptídeos e proteínas. Além disso, com base no espectro da Figura 9B, onde
uma ampliação da intensidade dos fragmentos em relação ao precursor foi
utilizada, é possível verificar que, embora ECD forneça uma maior cobertura, a
eficiência de fragmentação é inferior do que em CID.
20
(A)
(B)
Figura 9. Espectro de CID (A) e ECD (B) do fator de crescimento humano (GHRF), a sequência
do peptídeo, bem como a cobertura obtida por CID e ECD são ilustrados. A perda neutra de 64
Da refere se ao hidrosulfinilmetano (CH3SHO), proveniente de metionina oxidada e foi verificada
apenas por CID. O espectro de ECD fornece uma cobertura sequêncial do peptídeo muito
111
superior ao CID .

Mesmo com todas as vantagens de ECD descritas aqui, para realização
desse tipo de dissociação é necessário instrumentos do tipo FT ICR MS, que é,
de modo geral, o tipo de MS mais caro no mercado. No entanto, Hunt e
colaborados desenvolveram recentemente um método similar ao ECD, a
dissociação por transferência de elétrons (ETD), que pode ser implementada em
instrumentos de baixo custo (em relação a instrumentos do tipo FT ICR), do tipo
ion traps112,113. Em ETD, ânions (por exemplo, antraceno) são utilizados como
21
veículos de transferência de elétrons para precursores multiplamente carregados
positivamente (normalmente peptídeos), como consequência temos um
processo de fragmentação similar a ECD.
Embora apenas um trabalho cite o uso de ECD para estudo de peptídeos
contendo ALC104, os espectros não são profundamente discutidos. Além disso,
ETD vêm sendo amplamente difundido, de modo que é de grande relevância
realizar experimentos fundamentais de fragmentação utilizando métodos
alternativos de dissociação para peptídeos modificados por ALCs. Como
conseqüência, estudos utilizando tais métodos (como IRMPD, ECD ou ETD)
podem mostrar alternativas vantajosas frente a CID para identificação de
peptídeos modificados provenientes de experimentos de ligação cruzada de
proteínas.
1.7. Espectrometria de Mobilidade Iônica – IMS
A espectrometria de mobilidade iônica (ion mobility spectrometry – IMS)

foi introduzida no início dos anos 60 por Cohen e Karasek, com nome de
cromatografia de plasma ou cromatografia iônica. Considerada uma técnica de
separação de íons, sendo os tempos de travessia (drift time) de cada íon
análogo aos tempos de retenção em cromatografia114. Trata se de uma técnica
eletroforética que permite que íons sejam separados com base em sua massa,
carga e seção de choque (que depende de sua geometria). A mobilidade de um
íon na fase gasosa é medida através da velocidade com a qual este íon se move
através de um gás inerte, sobre a influência de um campo elétrico.
Embora tenha ocorrido uma grande explosão sobre esta técnica no início
da década de 70 graças à versatilidade analítica, limites de detecção, análises
em tempo real e baixo custo115,116, a partir de 1976 houve um desinteresse sobre
IMS, principalmente devido à comparação com a espectrometria de massas
(MS), capaz de gerar maiores informações sobre massa e com maior poder de
resolução117.
22
Quando IMS é acoplada à espectrometria de massas passamos a ter uma
ferramenta analítica poderosa, capaz de fornecer dados estruturais além da
separação de amostras complexas. A união entre IMS e MS, é muitas vezes
denominada apenas de IMMS, devido à complementação entre as duas técnicas
e a facilidade instrumental com que podem ser unidas. Essa união entre é quase
tão antiga quanto à própria IMS, sendo relatada pela primeira vez em 1962, por
McDaniel e colaboradores118.
Um instrumento de IMMS deve obedecer cinco processos: introdução de
amostra, ionização, separação por mobilidade, separação por m/z e detecção
dos íons. Existem quatros tipos de espectrômetros de mobilidade iônica: drift
time, aspiration, field asymmetric waveform e traveling wave; e cada um destes
pode ser acoplado a uma variedade de espectrômetros de massas. Os
instrumentos do tipo drift time e traveling wave, utilizados neste estudo, serão
discutidos a seguir.
No primeiro e mais utilizado tipo de mobilidade iônica, conhecido
simplesmente como drift time, e comumente chamado de IMS, os íons migram
através de um gás inerte, sobre a influência de um campo elétrico baixo e
uniforme, de modo que a energia proveniente deste campo elétrico não deve ser
maior do que a energia proveniente das colisões entre as moléculas do gás116,
conforme ilustrado na Figura 10.
23
Região de Ionização Separação por MobilidadeIônica
Entrada de Íons Gás
Aquisição
Campo de
Elétrico Dados
Campo Elétrico
Região de Entrada Pulsada

Ionização de Íons
Figura 10. Esquema de uma cela de IMS convencional. Na entrada da cela de difusão (drift
tube), os íons são submetidos a um campo elétrico baixo, que acelera os íons até o detector (ou
um espectrômetro de massas). O gás presente na região de difusão esta sob pressão constante,
que varia de 1 torr a pressão ambiente. Um íon que passa através do gás sofre considerável
número de colisões. Íons maiores possuem maior seção de choque que íons menores, de modo
que demoram mais para atravessar a cela de mobilidade, tornando possível a separação de íons
com diferentes formas e carga.

Assim os íons possuem energia similar ao gás, e o processo de difusão é
dominante. A temperatura e a pressão do gás devem ser uniformes, e densidade
das espécies iônicas deve ser baixa o suficiente para que a repulsão culômbica
seja ignorada. Nestas condições a velocidade do íon é diretamente proporcional
ao campo elétrico aplicado. A velocidade de difusão dos íons (vd, cm s 1), na
presença do gás, é dependente do campo elétrico (E, V cm 1 ) e é dada por:
vd KE
Onde K é a constante de mobilidade iônica (K, cm2s 1V 1). Se o tempo que
um íon leva para atravessar uma cela de difusão de comprimento d (cm) é td (s),
então:
K = d_
td E
A mobilidade iônica é normalmente expressa como mobilidade reduzida
K0, corrigida para condições padrões de temperatura (T, em Kelvin) e pressão
(P, em Torr):
K0 = K P
T
24
A constante de mobilidade iônica está relacionada com condições
experimentais e características do analito, e pode ser encontrada por:
Kqπm M

NkbTmM
Onde q é a carga do íon, N é a densidade do gás, m a massa do gás, M a

massa do íon, kb é a constante de Bolztmann, T é a temperatura na cela de
difusão e é a seção de choque do íon. Em campos elétricos elevados a
mobilidade dos íons torna se dependente apenas do campo elétrico, em outras
palavras, a presença do gás passa a não influenciar a mobilidade dos íons. Este
princípio é utilizado na mobilidade iônica diferencial ou high field asymmetric
waveform ion mobility spectrometry – FAIMS.
Um novo método de mobilidade iônica foi recentemente desenvolvido,
chamado de traveling wave ion mobility spectrometry (TWIMS)119,120,121 e já
introduzido comercialmente no equipamento conhecido como Synapt HDMS
(Waters, Co). Neste formato, a construção da cela de mobilidade é similar a IMS
tradicional (inclusive em relação à presença do gás inerte); no entanto, diferente
de IMS, onde um campo elétrico baixo é aplicado continuamente, um campo
elétrico RF mais elevado é aplicado em um segmento e arrastado
sequencialmente pela cela, o que permite que os íons sejam empurrados e,
devido ao choque com gás, temos a separação dos mesmos de acordo com sua
mobilidade. Desse modo os íons se movem em pulsos, conforme a onda do
campo elétrico elevado passa por estes. Na
Figura 11A temos o esquema da cela de TWIMS e em
Figura 11B temos o movimento dos íons121 após o pulso elétrico. Na
ausência de gás
Figura 11B, todos os íons devem se movimentar de modo simultâneo, no
entanto, na presença de gás íons mais volumosos ou com menor número de
carga, devem se movimentar de modo mais lento que íons menos volumosos ou
em maior estado de carga.
25
(A) (B)

Figura 11. Esquema da cela de TWIMS no Synapt HDMS, (B) movimento dos íons após o pulso
121
elétrico , na ausência de gás (todos os íons se movem simultaneamente). Um campo elétrico
elevado é aplicado em um segmento e arrastado sequencialmente pela cela, o que permite que
os íons sejam empurrados e, devido ao choque com gás, temos a separação dos mesmos de
acordo com sua mobilidade. No caso ilustrado não temos a presença de gás, e todos os íons se
movem simultaneamente. Desse modo os íons se movem em pulsos, conforme a onda do
121
campo elétrico elevado passa por estes (adaptado de ).
O primeiro equipamento que fez uso desta tecnologia foi mostrado por
Bowers e colaboradores em 2004120. Neste caso a cela de TWIMS foi colocada
entre a fonte de ionização e o quadrupolo de um espectrômetro de massas do
tipo Q Tof Ultima (Waters, Co.). Quando o uso do TWIMS passou para o
equipamento comercial (Synapt) uma cela similar a esta foi posicionada no lugar
da câmara de colisão de um Q Tof, entre o quadrupolo e o ToF121. A
configuração do equipamento, com a cela de TWIMS entre o quadrupolo e o
ToF, permite que vários tipos de análises sejam realizados. Analisando a
Figura 11A verificamos que a cela de mobilidade possui, na verdade, três
setores de traveling waves: o primeiro deles (trap) é responsável por aprisionar
os íons, proporcionando a entrada pulsada desse para a próxima cela; na
segunda (IMS), situada em uma região com gás (normalmente N2), ocorre a
separação por mobilidade, e a terceira (transfer) fica responsável por transferir
os íon do quadrupolo para o ToF. As celas de TWIMS funcionam da seguinte
maneira: os guias de íons (stacked ring ion guides – SRIG, anéis por onde os
íons passam pelo centro, como mostrado na Figura 12) são formados por
eletrodos planares arranjados ortogonalmente ao eixo de transmissão dos
íons121. Uma vez que as câmaras de aprisionamento (trap) e transferência
26
(transfer) operam sob pressões similares à de câmaras de colisões
convencionais (10 2mbar) é possível que íons sejam fragmentados em ambas
essas regiões, permitindo que experimentos similares a MS3 sejam realizados.

Figura 12. Guia de íons (stacked ring ion guides – SRIG) responsável pelo funcionamento da
121
técnica de mobilidade iônica conhecida como traveling wave (TWIMS) (adaptado de ).
Tendo em vista o potencial de separação e de análise estrutural

proporcionado pela técnica de IMMS, é de grande interesse o uso da mesma
para estudos envolvendo ligação cruzada e espectrometria de massas. Até o
momento não há relatos na literatura do uso de IMMS para estudos de
peptídeos e/ou proteínas modificados por ALCs.
27
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho consistiu em explorar a fragmentação e

mobilidade iônica de peptídeos provenientes de experimentos de ligação
cruzada utilizando espectrometria de massas, para servir de base nas
aplicações de proteômica estrutural.
Os objetivos específicos deste projeto são:

i) Obtenção de peptídeos modelos para realização de experimentos de
fragmentação;
ii) Estudo de fragmentação de espécies Intra e Intermoleculares por CID;
iii) Emprego de métodos alternativos de dissociação: ECD e IRPMD;
iv) Uso de experimentos seletivos para identificação de peptídeos contendo
ALCs;
v) Utilização de IMMS para análise de peptídeos isoméricos (contendo
ALCs);
vi) Uso de IMMS para separação entre peptídeos lineares e peptídeos
modificados por ALC.
28
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Material
Todos os peptídeos utilizados neste estudo foram adquiridos da

Proteimax (SP, Brasil); os ALCs utilizados foram: glutarato de disuccinimidila
(DSG, Pierce, IL, EUA), suberato de disuccinimidila (DSS) e sebacato de
disuccinimidila (DSSeb) (Sigma Aldrich, MO, EUA). Os demais reagentes,
quando não especificado, foram adquiridos da Tedia Chemicals (OH, EUA). As
proteínas utilizadas nesse trabalho (Hemoglobina e Lisozima) foram adquiridas
da Sigma (EUA) e a tripsina da Promega (Gold, Sequence Grade, EUA). Todos
os reagentes foram utilizados sem prévia purificação.
3.2. Estudo de fragmentação de peptídeos contendo ALC por

CID
3.2.1. Espécies Intramoleculares
Para o estudo de fragmentação de peptídeos de espécies

intramoleculares foram utilizados peptídeos com as seguintes sequências:
AGAKGAERLVKAGVR (PX), Ac ARKGCREVTKNDLR (P3), Ac
ARYTKDLSQRAFKGMR (P4) e Ac ARGKWPREVKIHR (P5). O agente de
ligação cruzada utilizado foi o DSS.
3.2.2. Espécies Intermoleculares
Para o estudo de fragmentação de peptídeos de espécies

intermoleculares foram utilizados peptídeos com as seguintes: Ac
RKRVWSEKGNMAR (P1), Ac RLKRDTYQAGKFHR (P2), Ac
ARKGCREVTKNDLR (P3), Ac ARYTKDLSQRAFKGMR (P4) e
29
AGAKGAERLVKAGVR (PX). O termo “Ac ” refere se ao resíduo N terminal
acetilado. Os ALCs utilizados foram o DSS, DSSeb e DSG.
3.2.3. Reação de Ligação Cruzada
Os peptídeos foram dissolvidos em tampão fosfato de sódio 50 mM pH

7,0 a uma concentração final de 40 M; por sua vez os ALCs foram dissolvidos
em N,N dimetilformamida (DMF) em concentração final de 1 mg/mL e
adicionado em 50 vezes de excesso molar à solução anterior. A reação com os
ALCs foi mantida a temperatura ambiente por duas horas, seguido da adição de
tampão Tris•HCl (1 M, pH 7,6) até atingir uma concentração final de 50 mM.
Após 15 minutos, adicionou se tripsina (razão tripsina/peptídeo 1:50 em massa)
e a digestão enzimática foi conduzida a 37º C por 1 hora para obtenção de
espécies intramoleculares 3 horas para obtenção das espécies intermoleculares.
Após a digestão os produtos da reação foram purificados usando o cartucho
Oasis HLB (Waters Co.) e o solvente foi evaporado utilizando evaporador
rotativo (SpeedVac, ThermoFisher, EUA).
3.2.4. Análise de Espécies Intra e Intermoleculares por MS

Para as análises por MALDI MS, as amostras foram resuspensas em 1
mL de solução aquosa contendo 50% ACN e 0,1% TFA. A amostra foi preparada
pelo método dried droplet, utilizando se como matriz o ácido α ciano 4 hidroxi
trans cinâmico (CHCA, 10 mg/mL, na mesma solução do peptídeo). Os
espectros foram adquiridos no equipamento Q Tof Premier (Waters Co.), que
opera com um laser de estado sólido de 200 Hz. Os parâmetros de análise
foram 250 a.u. (energia do laser), 10 V (sample plate) e 2200 V (MCP). O gás de
colisão utilizado foi o Argônio e os espectros de fragmentação foram adquiridos
manualmente, aumentando se a energia de colisão até a completa dissociação
30
do precursor. Antes da análise foi efetuada a calibração externa usando uma
mistura de polipropileno glicol (600, 800 e 2000 Da) de m/z 300 até 3000.
As análises de ESI MS foram realizadas após resuspender as amostras
em 1 mL de solução aquosa contendo 50% ACN e 0,1% ácido fórmico,
utilizando se para isso o equipamento Q Tof Premier. Os experimentos foram
realizados por infusão direta da amostra com fluxo de 2 L/min, com voltagens
do cone e capilar de 40 V e 3,5 kV, respectivamente. Como no caso anterior, os
espectros de fragmentação foram adquiridos aumentando se a energia de
colisão até completa dissociação do precursor. Os espectros adquiridos foram
deconvoluídos utilizando se o algoritmo MaxEnt3 (Waters Co.). Em todos os
casos, os espectros foram calibrados internamente utilizando se como padrão a
massa do precursor. Antes da análise foi efetuada a calibração externa usando
oligômeros de ácido fosfórico de m/z 100 até 2000.
3.3. Estudo de Varredura de Íon Precursor (PIS) para Auxiliar

na Detecção de Peptídeos Modificados por ALCs
3.3.1. Preparação de Amostras

A amostra denominada PX+Hemoglobina foi preparada misturando se
quantidades equimolares da amostra contendo diversas espécies modificadas
pelo ALC DSS proveniente do peptídeo PX (cuja preparação foi descrita
anteriormente) com um padrão de digestão enzimática utilizando tripsina de
hemoglobina bovina. Para comparação foi utilizado um controle contendo
apenas o digesto tríptico de hemoglobina.
O experimento de ligação cruzada em lisozima com DSS, DSSeb e DSG
foi realizado adicionando se o ALC desejado dissolvido em DMF (1 mg/mL) à
solução de 10 M de proteína em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,5, na
proporção molar de 1:50 (proteína/DSS). Após 30 minutos de reação, adicionou
se Tris•HCl 1M pH 7,5 de modo que sua concentração final fosse 50 mM. Após
15 minutos, adicionou se ditiotreitol (DTT, razão tripsina/proteína 1:50 em
31
massa) e a reação foi conduzida por 1 hora a 60º C. Em sequida adicionou se
iodoacetamida (IAA, 1:10 m/m), sendo que a reação ocorreu por 30 minutos no
escuro; após esse período, tripsina foi adicionada (1:50 m/m) e a digestão
enzimática foi conduzida a 60º C por 1 hora.
3.3.2. Análise por LC MS/MS

A análise por Varredura de Íon Precursor (PIS – Precursor Ion Scan) foi
realizada no equipamento Q Tof Ultima (Waters Co.) acoplado a o sistema
cromatográfico UPLC nanoAcquity (Waters Co.). Em geral, 1 L de amostra foi
injetada e os peptídeos foram dessalinizados na coluna Symmetry C18 (Waters
Co.) por 5 minutos. Após esse período, os peptídeos foram direcionados para a
coluna BEH130 C18 (Waters Co.), onde foi feito um gradiente (45 minutos) de
água/0,1% ácido fórmico (Sol. A) e ACN/0,1% ácido fórmico (Sol.B), fluxo 1,1
L/min, na coluna com o seguinte perfil: 100% → 70% A de 0 a 30 minutos; 70%
→ 50% de 30 a 32 minutos; 50% até 38 minutos; 50% → 100% de 38 a 40
minutos. Os parâmetros utilizados no equipamento foram os seguintes: 2 s
(tempo de aquisição do espectro), 3,5 kV (voltagem do capilar), 100 V (voltagem
do cone), 10 eV (energia de colisão no modo de baixa energia), 70 85 eV
(energia de colisão no modo de alta energia) e 2200 V (MCP). A energia de
colisão utilizada no modo de alta energia foi obtida após a aquisição de
espectros de fragmentação adquiridos manualmente, por 10 segundos, em
diversas energias, para diversos peptídeos modificados por ALC até que
observar a formação dos íons diagnósticos de espécies modificadas. Os
espectros de fragmentação foram calibrados utilizando se a massa do trímero de
ácido fosfórico injetado ao longo da corrida (m/z 294,9385).
32
3.4. Estudo de Fragmentação de Espécies Intermoleculares
por ECD e IRMPD
3.4.1. Peptídeos e ALCs utilizados

Para os estudos de IRMPD e ECD os seguintes peptídeos foram
utilizados: Ac ARAKGAEFAVYAGVR (P6); Ac ARAKGAEFAVHAGVR (P7); Ac
ARAKGAEFAVSAGVR (P8); Ac ARAYVALKA (P9) e Ac ARAHVALKA (P10). Os
ALCs DSS, DSG e DSSeb foram utilizados.
3.4.2. Formação de Espécies Intermoleculares
As espécies intermoleculares foram formadas entre os seguintes

peptídeos P6 P7; P8 P9; P8 P10; P6 P8 e P7 P8. Para as reações, 200 nmol de
cada par de peptídeo (100 nmol de cada) foi reagido com 200 nmol do ALC
utilizado (DSS, DSG ou DSSeb), resultando em um total de 50 µL de reação
(tampão fosfato, pH 7,5). As reações procederam por 1 h e, após esse período,
a mesma concentração de ALC foi adicionada ao meio reacional e mantido por
mais 1 h. Após esse período tampão Tris•HCl 1M pH 7,5 foi adicionado até obter
uma concentração final de 50 mM. Os pares formados entre os peptídeos P6 e
P7, P6 e P8 e P7 e P8 foram ainda digeridos enzimaticamente pela adição de
tripsina em uma proporção em massa de 1:50 (enzima/substrato) e a reação
procedeu por 3 h à 37°C.
3.4.3. Preparação das Amostras e Análise por MS
Os experimentos de IRMPD e ECD foram realizados em colaboração com

o Prof. Marcos N. Eberlin, no Laboratório Thomson de Espectrometria de
Massas, Unicamp. Antes da análise por MS, todos os produtos de reação foram
dessalinizados como descrito anteriormente As análises de nano ESI MS/MS
foram realizadas em um instrumento LTQ FT Ultra de 7 Tesla (Thermo Scientific
33
Co., San Jose, EUA) acoplados a uma fonte de NanoMate TriVersa
(Biosciences, Ithaca, NY, EUA), com voltagem no capilar de 1,5 kV. O
instrumento foi previamente calibrado com uma mistura de cafeína, peptídeo
MRFA e Ultramark 1621 (Sigma Aldrich). Os espectros de IRMPD foram
adquiridos mantendo a energia do laser em 100 e variando o tempo de
exposição de 20 a 200 ms. Os espectros de ECD foram adquiridos mantendo a
energia do feixe de elétrons em 4 e variando o tempo de exposição de 3 a 20
ms. Todos os espectros foram manualmente interpretados.
3.5. Separação de Peptídeos Isoméricos Contendo ALC por

IMMS
3.5.1. Peptídeos, ALCs e Reação de Ligação Cruzada

Para o estudo de mobilidade de espécies do tipo dead end os seguintes
peptídeos com N terminal acetilado foram utilizados Ac RKRVWSEKGNMAR
(P1), Ac ARYTKDLSQRAFKGMR (P4), Ac ARAKGAEFAVKAGVR (P11) e o
peptídeo com N terminal livre AGAKGAERLVKAGVR (PX). Neste estudo o ALC
DSS foi empregado. Cada peptídeo foi solubilizado em tampão fosfato 50 mM
em três diferentes pHs (6, 7 e 8) a uma concentração de 40 M. O DSS foi
dissolvido em DMF (10 mg/ml) e adicionado em excesso molar de 50 vezes.
Para favorecer a formação de espécies do tipo dead end o DSS foi adicionado
ao meio reacional antes dos peptídeos (favorecer a hidrólise). As reações
ocorreram a temperatura ambiente por 45 min e tampão Tris (1M, pH 7,6) foi
adicionado até uma concentração final de 50 mM.
3.5.2. Análise por IMMS
As amostras foram dessalinizadas utilizando cartuchos de fase reversa

Oasis HLB, eluídas com 0,1% ácido fórmico em ACN e posteriormente diluídas
na proporção de 1:1 com 0,1% de H2O. Os experimentos de IMMS foram
34
conduzidos em um instrumento Synapt HDMS (Waters Co.). As análises foram
realizadas com fonte de ESI por infusão direta, com fluxo de 6 µL/min, com
voltagem no capilar de 3,0 kV e no cone de 40 V. Para os peptídeos em
questão, tanto para experimentos de MS quanto MS/MS, as espécies
triplamente carregadas foram selecionadas no quadrupolo, seguido de
separação por mobilidade iônica e posterior análise no TOF. A energia de
colisão (CE) foi mantido na câmara de aprisionamento (Trap) em 6 eV e variada,
conforme a m/z de cada peptídeo, na câmara de transferência (Transfer). As
condições de obtidas para separação por mobilidade iônica serão discutidas
detalhadamente. Argônio (Ar) foi utilizado como gás de colisão no Trap e
Transfer enquanto N2 foi utilizado como gás de separação para IMS. Todos os
espectros de ESI MS/MS obtidos (IMMS) foram processados utilizando o
algoritmo de deconvolução MaxEnt 3 (Waters Co.). O instrumento foi
previamente calibrado utilizando oligômeros de ácido fosfórico para uma m/z de
100 a 2000.
3.6. Mobilidade Iônica de Peptídeos Modificados por ALC e

Peptídeos Lineares
3.6.1. Preparação de Amostras – Universidade de Edimburgo,

Escócia
Essa etapa do trabalho foi realizada na Universidade de Edimburgo,

Escócia, sob supervisão dos Prof. Juri Rappsilber do Wellcome Trus Centre for
Cell Biology e da Profa. Perdita Barran, da School of Chemistry.
Os seguintes peptídeos foram utilizados nos estudos para obtenção de
seção de choque: Fmoc LLDKYLRVGFGKYGAR (LR16) e Fmoc
THAVKTEASVAALEKLAEQR (TR20) (Biomatik, Canadá). O ALC utilizado foi o
suberato de bissulfosuccinimidila (BS3, Pierce, EUA). Para obtenção da espécie
intermolecular do peptídeo LR16, a reação foi realizada com 125 µM de
peptídeo, excesso de BS3 de 25 vezes em volume final de 200 µl em tampão
35
TEAB 25 mM, pH 8,5 (bicarbonato de trietilamônia). A reação foi realizada em
temperatura ambiente, por 2 h e finalizada pela adição de tampão bicarbonato
de amônio 1 M (ABC) até concentração final de 50 mM por 15 min. Para
obtenção das espécies intramoleculares, dead end (uma e duas modificações) e
lineares (não modificados), para os peptídeos LR16 e TR20, a solução estoque
dos peptídeos (1 mg/ml) foi adicionada após 5 minutos da adição de BS3 ao
tampão e, ao invés de 2 h de reação, um período de 15 min. foi utilizado. Após a
reação com BS3, 200 µl de uma solução 20% de piperidina em dimetil
formamida (DMF) foi adicionada para remover o grupo Fmoc do N terminal dos
peptídeos. A reação de desproteção ocorreu à temperatura ambiente por 5 h.
Para os frascos referentes às espécies intermoleculares, tripsina foi adicionada
em uma proporção de 50 peptídeo:1tripsina por 16 h à 37°C. Para as outras
espécies a mesma proporção de tripsina, por um período de 2 h à 37°C Foi
utilizado. Após essas etapas, obtivemos as seguintes espécies foram obtidas:
peptídeos lineares (não modificados), intramoleculares, dead end (com uma e
duas modificações) e intermolecular (apenas para o peptídeo LR16). Antes das
análises por IMMS (seja por infusão direta ou cromatografia líquida), as
amostras foram desalinizadas utilizando ponteiras de pipeta contendo pequenos
discos de fase reversa C18 (octadecilsilano, 3M, EUA), como descrito na ref. 122.
Antes de carregar as amostras, as ponteiras foram ativadas com metanol,
seguido por condicionamento com 0,1% de TFA (ácido trifluoroacético). As
amostras foram então carregadas, lavadas com 0,1% TFA para remoção do sal
e, posteriormente, eluidas com 80% de acetonitrila, 0,1% TFA.
Para cálculo da seção de choque ( ), uma solução 200 µM de cada um
dos dois peptídeos (LR16 e TR20) em 1:1 H2O/acetonitrila 0,1% ácido fórmico
foram analisadas por infusão direta no instrumento MoQToF123, trata se de um
equipamento construído pelo grupo de pesquisa da Prof. Perdita Barran, que
possuí uma cela de mobilidade iônica convencional antes do quadrupolo de um
Q Tof, utilizando uma fonte de nano electrospray (nano ESI). Os dados foram
adquiridos com voltagem no capilar de, aproximadamente, 1,5 kV; a pressão na
cela de mobilidade foi de 3,5 Torr, usando He como gás de colisão; as voltagens
36
de mobilidade variaram de 60 a 10 V e a voltagem de injeção foi de 35 V. A
temperatura em que os experimentos foram realizados foi de 300 K e a
freqüência do pusher foi de 70 µs.
Para os estudos de mobilidade envolvendo uma mistura complexa de
peptídeos contendo ALC, 20 peptídeos, todos com N terminal bloqueado por
grupo Fmoc (fluorenilmetiloxacarbonil), arginina como C terminal e uma lisina
em sua sequência foram utilizados. Para que a reação de ligação cruzada
ocorresse entre as diferentes moléculas dos peptídeos o seguinte procedimento
foi utilizado: 5 µl do estoque de cada peptídeo (5 mg/ml) foram misturados,
seguido por 5 µl de uma solução 25% de trietilamina (TEA) e 5 µl de DMF
contendo 1,5 mg de BS3. A reação ocorreu por 16 hs, a 60°C sob agitação de
800 rpm. Depois desse período, 15 µl de ABC saturado foi adicionado e
incubado por 2h a 60°C. Para remoção dos grupos Fmoc, 200 µl de uma solução
20% de piperidina em DMF foi adicionado e incubado por 16 h a temperatura
ambiente. Para efeito de comparação, um extrato de Escheichia coli foi digerido
com tripsina seguindo o protocolo: 100 µg de E. coli (30 µl), 30 µl de Urea 8 M, 2
µl de DTT, por 30 min a 37°C, seguido pela adição de 2 µl de iodoacetamida
(IAA) 20 min no escuro; após esse período 60 µl de ABC 25 mM e 2 µl de
tripsina 2mg/ml foi adicionado; a digestão enzimática ocorreu por 16 h, a
temperatura ambiente. Levando em consideração que em alguns desses
peptídeos temos a presença de metionina e essa pode estar oxidada temos,
após a reação com o ALC, mais do que 200 peptídeos intermoleculares.
Para os experimentos de LC IMMS realizados pela empresa Waters, em
Manchester, Reino Unido, um cromatógrafo líquido do tipo Acquity nanoUPLC
acoplado em um instrumento Synapt G2, com fluxo de 300 nL/min, fase móvel
0,1% ácido fórmico em H2O (A) e 0,1% ácido fórmico em acetonitrila (B), em
uma corrida total de 90 min, com gradiente de 0 a 30% de B em 50 min, 30 a
70% de B de 50 a 75 min, 70% de 75 a 85 min e 0% B até 90 min. O IMMS foi
utilizado com voltagem no capilar de 3 kV, cone de 40 V, função de mobilidade
ativa. O instrumento foi calibrado com oligômeros de ácido fosfórico antes das
37
análises. Todos os dados obtidos foram processados utilizando os programas
MassLynx 4.1 e Driftscope 2.1 (Waters, Co.)
38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Estudo de Fragmentação de Peptídeos Modificados por

CID
4.1.1. Desenho de Peptídeos Modelo

Os peptídeos utilizados nesta primeira etapa do projeto foram adquiridos
com a seguinte sequência comum AC xxRxxxKxxxRxxxKxxxR, onde x
representa número variável de qualquer aminoácido, exceto lisina (K) e arginina
(R). O uso de peptídeos contendo composições e número variável de
aminoácidos permitiu atribuir, de forma inequívoca, os íons presentes nos
espectros de MS/MS. Uma vez que diversos resíduos diferentes estão presentes
nos quatro peptídeos temos ainda como vantagem a capacidade de verificar a
presença de fragmentações dependente da seqüência. No entanto, o grande
atributo destes peptídeos está na posição fixa dos resíduos K e R, o que torna
possível, após a reação com o ALC, e digestão parcial ou completa com tripsina,
a obtenção de espécies intra e intermoleculares, partindo de um mesmo
peptídeo (Figura 13). Desse modo, partindo do peptídeo linear (Figura 13A),
após a reação do peptídeo com o ALC uma espécie intramolecular, contendo o
N terminal acetilado é gerada (Figura 13B) e, seguida pela digestão com
tripsina, os dois produtos de interesse podem ser obtidos: i) peptídeo contendo
DSS, intramolecular, após digestão parcial com tripsina, onde apenas a primeira
R é clivada (Figura 13C); ii) peptídeo contendo DSS, gerando a espécie
intermolecular, após digestão completa com tripsina (clivagem nas duas R,
Figura 13D). A obtenção destas duas espécies pode ser realizada controlando o
tempo de digestão com tripsina: verificamos que, após uma hora, a espécie
intramolecular é favorecida; já a obtenção da intermolecular é verificada após
três horas de digestão. É importante relatar que ambas as espécies obtidas
representem peptídeos trípticos contendo ALC encontrados em experimentos de
ligação cruzada de proteínas.
39
(A)
(B)
(C)
(D)
Figura 13. Esquema geral da reação dos peptídeos com ALC para a formação de espécies intra
e intermoleculares. Partindo de um peptídeo linear, com sequência comum AC
xxRxxxKxxxRxxxKxxxR (A), onde x representa um número variável de qualquer aminoácido,
exceto lisina (K) e arginina (R); após a reação com o ALC temos a formação de espécie
intramolecular com N terminal acetilado (B); seguida por digestão parcial com tripsina temos a
formação de espécie intramolecular com N terminal livre (C) e, finalmente, após digestão total
com tripsina a formação de espécie intermolecular (D).
A utilização de diferentes peptídeos com seqüências aleatórias permitiu a

atribuição inequívoca de vários íons fragmentos que seriam isóbaros no caso da
utilização de seqüências com repetições de um mesmo aminoácido. Esses
peptídeos também permitiram o estudo de fragmentações dependente da
seqüência, ao mesmo tempo em que as posições fixas dos resíduos de lisina e
arginina possibilitaram a formação tanto de espécies intra e intermoleculares em
um único experimento e a partir de um único peptídeo precursor. Além disso,
como as espécies intermoleculares são geradas a partir dos peptídeos
intramoleculares, não é necessária a utilização de grandes concentrações de
peptídeos nos experimentos, o que reduz significativamente os custos; de fato, a
40
concentração de peptídeo utilizada nesse trabalho é cerca de 200 vezes menor
que o de experimentos descritos na literatura124. A estratégia experimental para
isso é extremamente simples: os peptídeos reagem com DSS (ou outro ALC) por
2 horas e após esse período é realizada a digestão enzimática com tripsina,
onde o tempo da proteólise favorece a formação das espécies intra (1 h de
digestão enzimática) ou intermoleculares (3 hs ou mais de digestão com
tripsina).
Para ilustrar este procedimento estão ilustrados nas Figura 14, Figura 15,
Figura 16 e Figura 17 os espectros de MALDI MS dos peptídeos P3, P4, P5 e
PX antes e depois da reação com o DSS, digestão com tripsina por 1 hora (P3,
P4 e P5) e 3 horas. As espécies de interesse estão indicadas por setas. Pelos
espectros é possível notar que o rendimento da reação com o DSS é
dependente da seqüência dos peptídeos, sendo que enquanto para P3 o
rendimento foi de aproximadamente 30%, a reação com PX converteu
praticamente todo o material de partida no produto desejado. A formação de
outras espécies, como peptídeos tipo dead end também é afetada pela
seqüência do peptídeo. Além disso, é possível observar que com diferentes
tempos de digestão pode se formar preferencialmente as espécies intra ou
intermolecular, conforme esperado. Nota se ainda que o controle do tempo de
digestão com tripsina determina a presença majoritária de espécies intra ou
intermoleculares, sendo que também esses rendimentos se mostraram
dependentes da seqüência dos peptídeos. Esse comportamento é esperado
visto que a cinética de digestão enzimática é mais rápida no resíduo de arginina
exposto, gerando preferencialmente a espécie intramolecular não bloqueada em
menores intervalos de digestão.
41

Figura 14. Espectros de MALDI MS do peptídeo P3 intacto (A), após a reação com DSS (B) e
digestão com tripsina por 1 hora (C) e 3 horas (D). Os íons assinalados com uma seta
correspondem às espécies de interesse. Abaixo temos o esquema de reação com DSS e
digestão enzimática para o peptídeo P3, e suas respectivas m/z.
42

43


44

Figura 17. Espectros de MALDI MS do peptídeo PX intacto (A), após a reação com DSS (B) e
digestão com tripsina por 3 horas (C). Os íons assinalados com uma seta correspondem às
espécies de interesse. Abaixo temos o esquema de reação com DSS e digestão enzimática para
o peptídeo PX, e suas respectivas m/z.
Nesse ponto, é importante notar que existe a possibilidade da formação

de espécies isóbaras que poderiam interferir no estudo de fragmentação das
moléculas de interesse. No caso da formação das espécies intermoleculares,
pode haver coincidência de massas para todos os peptídeos entre as espécies
45
intermoleculares, cuja digestão ocorreu em todos os sítios trípticos não
modificados e espécies dead end, onde a modificação se encontra em uma das
lisinas e na qual a digestão ocorreu somente no primeiro resíduo tríptico (R em
todos os casos). Essa coincidência está exemplificada na Figura 18 para o P3.
INTERMOLECULAR Dead End
Figura 18. Exemplo de possível coincidência de massas para o peptídeo P3 entre as espécies
intermolecular e dead end.
Essa possibilidade não pode ser descartada em princípio, uma vez que
em todos os espectros, após a reação com DSS (Figura 14B a Figura 17B) é
possível observar a formação de peptídeos do tipo dead end, com intensidades
relativas que variam de 10% (P3) a 100% (P5). Entretanto, existem motivos para
que se possa afirmar que essas coincidências não acontecem utilizando o
procedimento experimental descrito anteriormente. No caso de P1 por exemplo,
de modo a obter a espécie dead end isóbara ao peptídeo intermolecular de
interesse (m/z 1574.8) seria necessário que o peptídeo dead end inicial (m/z
46
1843.9) mantivesse intacto à digestão com tripsina por 3 horas tendo como
único sítio de clivagem digerido a primeira arginina (Figura 18). Qualquer outro
produto de digestão em um sítio tríptico levaria a formação de uma espécie
dead end com diferente m/z. Além disso, o espectro de dissociação do peptídeo
intermolecular após 16 horas de digestão é idêntico ao espectro do mesmo íon
após 3h de digestão, o que indica que estes íons correspondem à espécie
intermolecular.
4.1.2. Fragmentação de Espécies Intramoleculares por CID

Espécies intramoleculares são relativamente comuns em experimentos de
ligação cruzada de proteínas, uma vez que, após a reação com o ALC, sua
estrutura torna se mais rígida, tornando a digestão enzimática um pouco mais
difícil que o normal. Como resultado, espécies intramoleculares, formadas por
peptídeos grandes, muitas vezes contendo sítios de clivagem enzimática,
acabam sendo observadas com freqüência.
Além disso, outra espécie que deve estar presente em experimentos de
ligação cruzada, mas pouco estudada, corresponde à reação entre o ALC e a
porção N terminal da proteína. De modo geral essa parte da proteína é flexível e
conhecendo quais resíduos estão próximos a ela podemos ter informação sobre
como essa porção está presente na estrutura da proteína.
Na Figura 19 temos os espectros de MALDI MS/MS das espécies
intramoleculares formadas a partir dos peptídeos P3, P4 e P5. As estruturas de
cada uma dessas espécies e os íons fragmentos atribuídos estão presentes em
seus respectivos espectros. A nomenclatura utilizada para atribuição dos íons
fragmentos foi utilizada conforme Schilling e colaboradores91.
47
(A)
(B)
Figura 19. (Continua).
48
(C)
Figura 19. Espectros de MALDI MS/MS das espécies P3 (A), P4 (B) e P5 (C). As estruturas de
cada uma dessas espécies e os íons atribuídos estão presentes em seus respectivos espectros.
A formação dos íons fragmentos de m/z 222, 239 e 305 (circulados) está descrita no texto. Íons
marcados com * são fragmentos internos.

Espécies intramoleculares formadas a partir de ALCs derivados de
ésteres de NHS, como o DSS utilizado neste estudo, podem comportar se como
peptídeos cíclicos e lineares, uma vez que a reação entre o DSS e a Lys forma
outra ligação amida. Desse modo, foi verificado que a reação ocorre em duas
etapas: primeiro na porção linear e, posteriormente, na porção cíclica do
peptídeo modificado. Íons fragmentos gerados a partir da porção linear de cada
peptídeo (como na porção NDLR do peptídeo P3) são íons b e y convencionais.
Quando a fragmentação atinge a porção cíclica do peptídeo modificado,
ela pode seguir por dois caminhos, uma vez que a ligação peptídeo DSS é
também uma ligação amida: i) na ligação DSS/Lys ou ii) na cadeia do peptídeo.
Se a fragmentação ocorrer na ligação DSS/Lys, o DSS passa a se comportar
como uma extensão da cadeia lateral da lisina, e a fragmentação deve continuar
de forma convencional, ao longo da cadeia peptídica, conforme ilustrado Figura
20, para o peptídeo P3. No caso do peptídeo P3, onde o primeiro resíduo é a
49
Lys (responsável pela ligação com o DSS), o fragmento de m/z 267,1, referente
ao íon y1 pode ser facilmente verificada; os outros íons dessa sequência,
provenientes do caminho da fragmentação onde a clivagem ocorreu entre a Lys
e o DSS, também estão presentes (y2: 324,1; y3: 427,2; y4: 583,3; y5: 712,3; y6:
811.4 e y7: 912,5). Íons referentes a este caminho de fragmentação também
estão presentes nos espectros dos peptídeos P4 e P5, mas com intensidades
inferiores ao P3. O relato deste caminho de fragmentação é de extrema
relevância, pois, uma vez que a modificação por DSS pode se comportar como
uma modificação convencional da cadeia lateral de um resíduo (no caso a Lys),
a identificação destas espécies pode ser facilitada pelo uso de ferramentas de
busca em banco de dados, utilizando o DSS como uma modificação da Lys.
O
DSS O
DSS
HN NH HN
H H NH
O
O
Após fragmentação
da porção linear
KGCREVTKNDLR
KGCREVTK C O
Peptídeo P1
Intramolecular
DSS como
Abertura do Anel: modificação
O Fragmentação entre Lys e DSS
C DSS O
DSS CH
(CH2)5 HN NH2
C O O
NH
Lys (CH2)4 Fragmentação
convencional KGCREVTK C O
H2N CH C O
m/z 267.1
Figura 20. Caminho de fragmentação presente em espécies intramoleculares onde a
fragmentação ocorre entre a Lys e o ALC (no caso DSS). O peptídeo P3 foi utilizado como
exemplo. Primeiro a fragmentação deve ocorrer na porção linear do peptídeo e, uma vez que
atinge a porção cíclica, ocorre a clivagem entre a ligação DSS/Lys e fragmentação segue pela
sequência do peptídeo, onde o DSS comporta se como uma extensão da cadeia lateral da Lys.
50
No outro caminho, a fragmentação ocorre ao longo da cadeia peptídica,
mantendo as duas Lys conectadas pelo DSS (Figura 21). Tendo o peptídeo P3
como representativo, o íon de m/z 1040,5 (Figura 19A) refere se ao fragmento
atribuído a ambos os resíduos de Lys conectados pelo DSS. Uma vez que a
fragmentação atinge a porção cíclica da molécula, a dissociação segue pela
cadeia peptídica, e ocorre a abertura do anel macrocíclico, conforme ilustrado na
Figura 21. O nitrogênio ε da Lys ataca o carbono α do mesmo resíduo, levando a
formação de um anel de seis membros. Esse anel contém um grupo amina,
proveniente do nitrogênio α, que pode ser perdido em forma de NH3, levando a
formação de um anel tetrahidropiridina (representado daqui por diante nos
espectros por {K}). A fragmentação ocorre ao longo dos demais resíduos, até
levar aos íons fragmentos de m/z 222,1; 239,2 e 305,2. É importante notar que
esses íons são compostos pelo DSS e lisina, sendo que a presença deles é um
indicativo da cadeia do DSS ligada à resíduos de lisina. Não existe nenhum íon
b, a ou y, proveniente dos 20 aminoácidos naturais que possua a mesma m/z
desses três íons, reforçando ainda mais a capacidade que desses fragmentos
de serem utilizados como diagnósticos da presença de espécies modificadas por
DSS. Os íons de m/z 222,1 foi primeiramente observado por Seebacher e
colaboradores125, mas o mecanismo de formação não foi proposto. Não há
relatos anteriores para os outros dois íons fragmentos (239,2 e 305,2). O íon de
m/z 305,2 é 83,1 Da maior que o de m/z 222,1 e contém em sua estrutura dois
anéis tetrahidropiridina provenientes das duas Lys ligadas pelo DSS; m/z 222,1
contém um anel tetrahidropiridina de uma das Lys ligado ao DSS e 239,2 refere
se ao anel tetrahidropiridina com um grupo NH2 de uma das Lys ligado ao DSS.
51
O O O O
O O
C C C C
C C
HN NH HN NH NH2
b HN N
a
H
CH NH3
H2N CH C GCREVT NH CH C O H2N CH C GCREVT C O NH
H2N CH C GCREVT C O
O a O
a O
m/z 1040.5
Abertura do Anel:
m/z 1012.5
b8 Lys – Próximo
a8/b7 resíduo
Formação do
anel tetrahidropiridina, {K}
O O
O O
C C
C C
HN N
HN N
Fragmentação H2N CH C O
H2N CH C GCREVT C O
convencional
O m/z 350.2
a8 17/b7/y11
m/z 995.5
a8 17/b7
m/z 239.1759 m/z 222.1494 m/z 305.2229
Figura 21. Caminho de fragmentação presente em espécies intramoleculares onde a

fragmentação ocorre entre a Lys e o resíduo adjacente (ao longo da cadeia peptídica). Nesse
caso ambas Lys permanecem conectadas pelo DSS. O peptídeo P3 foi utilizado como exemplo.
Temos a ciclização da Lys, levando ao anel tetrahidropiridina (representado por {K}). Esse
caminho de fragmentação levou a identificação dos íons diagnósticos de espécies modificadas
por DSS, de m/z 222,1; 239,2 e 305,2.
Embora ambos os caminhos de fragmentação estejam presentes para os

três peptídeos estudados, a preferência por um destes caminho é dependente
da sequência do peptídeo: enquanto para P3 a clivagem entre o DSS/Lys é
preferencial, para P4 e P5 a fragmentação ao longo da cadeia peptídica,
deixando as Lys unidas pelo DSS foi o caminho seguido de forma a gerar
fragmentos mais intensos.
Para o estudo da espécie intramolecular formada entre o N terminal e
Lys, utilizamos o peptídeo PX que possuí o N terminal livre, diferente dos outros,
que possuem o N terminal acetilado. A espécie intramolecular de PX estudada
foi previamente mostrada Figura 17, com [M+H]+ de m/z 897,5. O espectro de
MALDI MS/MS está ilustrado na Figura 22. Neste espectro é possível verificar a
presença do íon fragmento de m/z 464,2; referente ao íon b4, que contém a
52
porção cíclica da espécie intramolecular. A fragmentação deste íon leva a perda
de CO, NH3 e os demais resíduos, até a formação do íon de m/z 222. Neste
caso, o mecanismo alternativo, onde ocorre a clivagem entre o DSS e a Lys é
praticamente ausente. Outra característica interessante dessa espécie é a
ausência do íon fragmento de m/z 305, pois, como mostrado previamente, este
íon é derivado da união de duas lisinas pelo DSS e, nesta espécie, a ligação do
DSS ocorre entre uma lisina e o N terminal do peptídeo.
Figura 22. Espectro de MALDI MS/MS da espécie intramolecular envolvendo uma Lys e o N
terminal do peptídeo PX.
Como consideração em relação as espécies intramoleculares foi possível

notar que, uma vez que a fragmentação atinge a porção cíclica do peptídeo
modificado, ela pode seguir por dois caminhos competitivos, que depende da
sequência do peptídeo. Além disso, a presença de íons diagnósticos (m/z 222,1;
239,2 e 305,2), capazes de auxiliar na identificação de espécies modificadas por
DSS foi notada.
53
O trabalho referente ao estudo de fragmentação de espécies
intramoleculares foi publicado no Journal of the American Society for Mass
Spectrometry126.
4.1.3. Estudo de Espécies Intermoleculares
Como dito anteriormente, espécies intermoleculares, provenientes de

experimentos de ligação cruzada de proteínas, foram reportados na literatura
como os de mais difícil interpretação124, visto que os fragmentos podem ser
oriundos de uma ou ambas as cadeias, além da possibilidade da ruptura das
ligações do próprio ALC. Esses peptídeos são extremamente interessantes do
ponto de vista estrutural, uma vez que conectam resíduos de lisinas distantes na
estrutura primária da proteína ou de diferentes proteínas. Desse modo, essas
informações são extremamente úteis tanto na determinação do tipo de
enovelamento de uma proteína bem como na elucidação da topologia de
complexos protéicos.
Para os experimentos de MALDI e ESI MS/MS de espécies
intermoleculares os seguintes peptídeos foram levados em consideração: P1,
P2, P3, P4 e PX. Como ALCs, foram utilizados DSS, DSSeb e DSG. Com
exceção de PX, todos os outros peptídeos possuem o N terminal acetilado e,
conseqüentemente, o sítio reativo frente aos ALCs devem ser as lisinas. No
caso do PX, conforme ilustrado na Figura 17, o N terminal livre permite a
formação de duas diferentes espécies intermoleculares após a digestão, que
serão denominadas PX1 (peptídeo intermolecular conectado por duas K de m/z
1638.9) e PX2 (peptídeo intermolecular conectado via K e N terminal, m/z
1225.7). PX2 representa uma espécie intermolecular formada entre o N terminal
da proteína e um resíduo de lisina e, embora a fragmentação desse tipo tenha
sido negligenciada na literatura, sua ocorrência em experimentos de ligação
cruzada de proteínas deve ser muito comum, visto que em geral o N terminal
das proteínas é muito flexível. As espécies intermoleculares utilizadas neste
caso foram obtidas de forma similar às espécies intramoleculares, empregando
um tempo maior de digestão enzimática (3 h). Na Figura 23 temos um esquema
54
ilustrando a obtenção das espécies intermoleculares utilizadas neste estudo. As
m/z presentes na Figura 23 correspondem a espécies intermoleculares formadas
utilizando DSS como ALC; os análogos, formado com DSSeb e DSG,
apresentam +28 Da e 42Da, respectivamente.
Ac RKRVWSEKGNMAR Ac RLKRDTYQAGKFHR Ac ARKGCREVTKNDLR

m/z 1659.9 m/z 1817.9 m/z 1687.9
P1 P2 P3
DSS DSS DSS
Ac RKRVWSEKGNMAR Ac RLKRDTYQAGKFHR Ac ARKGCREVTKNDLR

m/z 1797.9 m/z 1956.0 m/z 1825.9
Trysin Trysin Trysin
(3 hours) (3 hours) (3 hours)
H2N KR H2N LKR H2N KGCR
m/z 1617.8 m/z 1775.9 m/z 1574.8
H2N VWSEKGNMAR P1 H2N DTYQAGKFHR P2 H2N EVTKNDLR P3

Ac ARYTKDLSQRAFKGMR H2N AGAKGAERLVKAGVR
m/z 1970.0 PX m/z 1482.8
P4 DSS
DSS
H2N AGAKGAERLVKAGVR
H2N AGAKGAERLVKAGVR
Ac ARYTKDLSQRAFKGMR
m/z 2108.1 m/z 1620.9
H2N AGAKGAERLVKAGVR
Trysin
Trysin
(3 hours)
(3 hours)
H2N YTKDLSQR H2N AGAKGAER HN AGAK
m/z 1857.0
H2N AGAKGAER
m/z 1638.9 m/z 1225.7 m/z 897.5
H2N ARFKGMR P4 PX1 LVKAGVR LVKAGVR PX2
Figura 23. Formação de espécies intermoleculares a partir dos peptídeos P1, P2, P3, P4, PX1 e
PX2. As m/z ilustradas aqui são referents ao uso do DSS como ALC.
Além das espécies de interesse, indicadas por setas no espectro de

MALDI MS da Figura 24, é notada a presença de outros íons. Íons de m/z
maiores do que as espécies intermoleculares de interesse são atribuídos,
principalmente, a formação de espécies contendo dois ALCs hidrolisados (duplo
dead end), por exemplo, o íon de m/z 1794,5 em PX; 1773,8 para P1 e 1730,0
para P3. No caso de PX, o íon de m/z 1897,6 foi atribuído a dois dead ends, um
deles proveniente da hidrólise enquanto no outro, a porção do ALC que não
55
reagiu com o peptídeo não foi hidrolisada mas sofreu ataque do Tris (será
discutido abaixo). A presença de íons de m/z menores do que as espécies
intermoleculares de interesse referem se ao peptídeo intacto, como no caso de
m/z 1482,4 para PX, espécies intramoleculares, como de m/z 1620,9 para PX;
m/z 1556,8 para P3 e 1838,9 para P4; ou espécies do tipo dead end, derivadas
de fragmentos do peptídeo intacto, após a digestão enzimática, como o íon de
m/z 1434,7 de P4, atribuído a sequência Ac ARYTKDLSQR, onde ao Lys foi
modificada pelo ALC hidrolisado. É importante notar que, como os peptídeos
possuem pelo menos três sítios de clivagem enzimátcia, pelo menos três
pequenas espécies dead ends para cada um dos peptídeos podem sem
observadas e, levando em consideração uma digestão enzimática incompleta,
esse número pode ser ainda maior. Observando os espectros de MALDI MS da
Figura 24 é possível notar a complexidade das amostras.
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 24. Espectro de MALDI MS dos peptídeos P1 (A), P2 (B), P3 (C), P4 (D) e PX(D). As
setas indicam as m/z referente às espécies intermoleculares formadas a partir destes peptídeos.
Como previamente discutido, espécies do tipo dead end são geradas

pela hidrólise da porção do ALC que não reagiu com o peptídeo e, quando
utilizando DSS, acarreta em uma modificação de +156 Da em relação a massa
do peptídeo. No entanto, como brevemente mencionado acima, é possível que,
56
ao invés da hidrólise, a porção do ALC que não reagiu com o peptídeo sofra um
ataque nucleofílico proporcionado por uma molécula de Tris, presente no
tampão utilizado para parar a reação entre o ALC e o peptídeo. Esse tipo de
dead end, quando utilizando DSS, acarreta em uma modificação de +259 Da em
relação à massa do peptídeo não modificado. Desse modo, existe uma
competição entre H2O e Tris, capaz de gerar dois tipos de dead end,
aumentando ainda mais a complexidade das amostras. Na Figura 25 temos o
espectro de MALDI MS do peptídeo PX onde, após a reação com DSS (mas
antes da digestão enzimática), temos a presença desses dois dead ends, de m/z
1638,8 e 1741,9 para o produto hidrolisado e que sofreu ataque por Tris,
respectivamente.
Figura 25. Espectro de MALDI MS do peptídeo PX, onde temos as espécies de dead end
formada pela hidrólise (m/z 1638,9) e após o ataque por Tris (m/z 1742,1).
A presença de espécies intermoleculares formadas a partir da reação de

ligação cruzada entre dois peptídeos não foi observada. Como previamente
reportado124, para que haja esse tipo de reação uma concentração de peptídeo
maior do que a utilizada (que foi de 40 µM) é necessária, algo em torno de 4
mM.
57
4.1.4. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por ESI
MS/MS utilizando CID
ESI e MALDI foram utilizados como fontes de ionização para os estudos

de fragmentação de espécies intermoleculares. Os estados de carga mais
intensos de cada uma das espécies intermoleculares foram selecionados para
os experimentos de CID utilizando ESI. Os espectros anotados de ESI MS/MS
das espécies intermoleculares, utilizando DSS como ALC, dos peptídeos P1
(m/z 539,9; [M+3H]3+), P2 (m/z 592,6; [M+3H]3+), P3 (m/z 787,9; [M+2H]2+), P4
(m/z 928,9; [M+2H]2+), PX1 (m/z 546,9, [M+3H]3+) e PX2 (m/z 613,4; [M+2H]2+)
estão presentes na Figura 26.
6.00000000
180509_ESI_P18DSS_DIG6H_539 44 (0.765) M3 [Ev 226119,It50,En1] (0.100,3,Cmp); Cm (42:98) TOF MSMS 539.90ES+
1332.6984 1.31e4
100
y8α
KR β (A)
VWSEKGNMAR α
y5α
548.2701
β
y6α
%
1116.6233
{K}
β b5α
740.4436
159.0938
a2α
524.3618
258.1639 441.2849
b5αy8α y7α
1245.6591
b2α y9α
286.1581
y8α2+
666.8981
y6α 17 1333.7979 1518.7819
1099.6082 1227.6504
666.8095 785.4534
1501.7357 1621.8049
897.4947 1070.5935
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
58
180509_ESI_P19DSS_DIG6H_592 84 (1.445) M3 [Ev 84482,It50,En1] (0.100,3,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (77:150) TOF MSMS 592.60ES+
1775.9708 2.70e3
100
LKR β
(B)
(A)
1268.7747
y6α
DTYQAGKFHRα
y5α
1197.7372
y9α
136.0820
1660.9456
β [M+3H]3+
%
554.3785 β y7α
1396.8386
175.1257
y3α
459.2603 {K} y8α
637.4487 1559.8951
y2α 594.3688
593.4011
312.1865
292.1369 1140.7218
595.4164 1757.9529
1777.1208
689.9441 919.5906 1094.6580
1780.7021 1910.9038
0 mass
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
ESI_P1_DSS 787 83 (1.538) M3 [Ev 115260,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (56:108) TOF MSMS 787.90ES+
100
288.2042
(B)
(C)
3.88e3
y2α
KGCR β
EVTKNDLR α
y1α or y1β
%
{K}
[M+2H]2+
789.4512
175.1205
{K} {K} + 17
239.1764 y5α b5α/b2β 28 1574.8518
222.1489 885.4456
684.3798
y3α y6α β y7α β b5α/b3β

363.2131 403.2125
788.3947
845.4456 α+ 1573.7784
y4α b6α 1576.7744
517.2731
746.4152 b5α 1287.6110
974.5306 1016.5233 1172.6438
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
59
ESI_P3_DSS 929 38 (0.704) M3 [Ev 138862,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Cm (27:67) TOF MSMS 929.00ES+
100
503.2981
(B)1.04e3
(D)
y4α
YTKDLSQR α
y1α or y1β 1856.9634
175.1205
AFKGMR β
β
α
{K} 4α b
α 1354.6700
%
{K} + 17
{K} 239.1710
y5α 1148.6166
222.1500 618.3245 b4αy7α
β {K}
b4αy6α 1191.6156
y3β 847.4438
363.1833 1231.6646
y3α 930.5256 1090.5673
191.1180 390.2100
192.1054
β+ α+ 1355.7295
709.3871 1010.5224
286.1530
a7α or a5β 1857.8656
b5α 1654.9041
1838.9147
1467.7554 1859.0769
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
PX_DSS_DIG_ZT 547 25EV 42 (0.807) M3 [Ev 39701,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,3,Cmp); Cm (2:48)

100
432.2307 (E)
1: TOF MSMS 546.90ES+
(C) 754
y4α
AGAKGAERα
y4β
402.2625
a2α LVKAGVR β
185.1675
y1α
or
y1β
175.1194
y5β
{K}
%
1426.8296
{K} + 17
239.1713
α β
β
y3β 963.6478
α
{K}
331.2231
[M+3H]3+ 897.4921
546.5018
b2β {K} y7α β {K}

213.1664 305.2413 688.3869 y6β
y5α β 980.5873
1525.8956
560.3331
293.2014
529.3879
751.4879
880.6061 1096.6273 y5αy5β 1643.0120
1227.7545 1355.7556
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
60
PX_DSS_DIG_ZT 613 35EV 30 (0.578) M3 [Ev 27142,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (2:39) 1: TOF MSMS 613.40ES+
100
147.1156 y1β (F)
(A) 676
130.0840
129.0985 HN A G A K β
LVKAGVR α
y1α y4α
175.1295 402.2795
HN A
{K}
{K} + 17
%
y3β
275.1936
239.1945 293.2138
b4β b6 α
{K}
y2β 1051.7279
b5α
222.1628
218.1668 y3α b3β
331.2371 {K} a1β 951.6544
923.6533
{K} [M+2H]2+ y5αb2β a2β b2β

613.3870 a1β 44 980.7121
1008.6987
84.0644 685.5018 879.6328
421.3077 567.4010 a3α

739.5018 796.5366
1052.8409 1225.9187
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
Figura 26. Espectros anotados de ESI MS/MS das espécies intermoleculares dos peptídeos P1
3+ 3+ 2+
(m/z 539,9; [M+3H] ), P2 (m/z 592,6; [M+3H] ), P3 (m/z 787,9; [M+2H] ), P4 (m/z 928,9;
2+ 3+ 2+
[M+2H] ), PX1 (m/z 546,9; [M+3H] ) e PX2 (m/z 613,4; [M+2H] ).
A análise dos espectros de ESI MS/MS de P1, P2, P3, P4, P3, PX1 e PX2
obtidos indicam a presença de fragmentos do tipo b e y, comumente
encontrados na dissociação de peptídeos lineares. Em todos os casos é
possível observar a formação de fragmentos nos quais uma das cadeias tem
uma ligação peptídica clivada enquanto a outra cadeia se encontra intacta, por
exemplo, no espectro de P3 o íon b6α indica a clivagem da ligação Asp Leu (D
L), com a manutenção do ALC K K, e a cadeia β permanece intacta; isso
significa que uma das cadeias pode funcionar como se fosse uma modificação
no aminoácido da outra cadeia. No entanto, é interessante notar a origem
desses fragmentos (provenientes de cadeia α ou β) depende de cada uma
dessas espécies. No caso de P1, onde a cadeia β apresenta um tamanho muito
menor que a cadeia α (cadeia β possuí apenas 2 resíduos) é possível notar
somente a formação de fragmentos provenientes da cadeia α, sendo possível
observar os íons a2a (m/z 258,1), b2a (m/z 286,1) e y5a (m/z 548,2) e os íons que
61
contém a cadeia β ligada à cadeia α: y6a (m/z 1116,6), y7a (m/z 1245,6), y8a (m/z
1332,7) e y9a (m/z 1518,8). O mesmo comportamento foi observado para a
espécie intermolecular do peptídeo P2, que apresentam a cadeia β com
tamanho muito inferior ao da cadeia α (a cadeia β possuí 3 resíduos). Nesses
dois casos, como observado nos espectros da Figura 26A e B, a cadeia β
comporta se como uma modificação da cadeia α. Por outro lado, quando ambas
as cadeias possuem tamanhos grandes, como é o caso de P4 e PX1, a
dissociação ocorre em ambas as cadeias α e β. No espectro de ESI MS/MS de
P4 é possível observar a presença dos íons a7α ou a5ββ (m/z 1654,9), b5αα (m/z
1467,8), b4αα (m/z 1354,7) e y3ββ (m/z 363,2) enquanto que para PX1 os íons y4αα
y5αα, y7αα, y3ββ , y4ββ, y5ββ , y6ββ e y7αα foram atribuídos. Uma possível explicação para
esses fatos pode estar na localização do próton quando da dissociação desses
peptídeos: como a fragmentação dessas espécies é dirigida pela carga, a maior
cadeia tende a se fragmentar com maior freqüência, visto que é nesta que o
próton se localizará a maior parte do tempo. Isso explica o porquê da
distribuição homogênea dos fragmentos quando ambas as cadeias apresentam
massas muito próximas (caso de P4 e PX1). A espécie intermolecular, formada
entre a Lys e o N terminal fragmentou de forma similar às espécies formadas a
partir dos outros peptídeos e, como no caso de P4 e PX1, fragmentos oriundos
de ambas as cadeias foram observados.
Outra característica observada nesses espectros que ainda não havia
sido descrita na literatura está relacionada à formação do íon correspondente a
uma das duas cadeias intactas (ruptura da ligação amida entre uma cadeia
peptídica e o ALC). Como exemplo, pode se observar a formação dos íons de
m/z 974,5 referente ao íon α+ de P3, e 1010,5 e 709,3 referentes às espécies α+
e β+ de P4 respectivamente. Esse tipo de fragmentação deve ser esperado, visto
que a ligação entre o DSS e o nitrogênio da lisina é do tipo amida, ligação essa
mais comumente rompida em espectros de CID de peptídeos (levando à
formação dos íons b e y).
Foi verificado ainda a formação preferencial de íons análogos ao imônio
da lisina modificada com DSS (análogo, pois a Lys está modificada pelo ALC).
62
Íons imônios são fragmentos gerados pela dissociação de duas ligações: ligação
amida entre o N terminal do resíduo e o C terminal do resíduo anterior e a
ligação entre o carbono α e o carbono da carbonila dentro do mesmo resíduo.
Embora a formação preferencial de fragmentos derivados de íons imônios já
houvesse sido descrita na literatura, suas estruturas e mecanismos de
fragmentação permaneciam desconhecidos (esses íons foram denominados de
KLα/β – 17, porém nenhuma estrutura foi associada a essa espécie).91 É
interessante notar que sempre que houve a formação do imônio da lisina
contendo DSS, a outra cadeia conectada ao ALC permaneceu intacta. Essas
espécies podem ser observadas nos espectros de P1 (m/z 524,4), P2 (m/z
637,5) P3 (m/z 684,3), P4 (m/z 930,5 e 1148,6), PX1 (m/z 897,4 e 963,6), PX2
(m/z 567,4). Além disso, uma característica interessante associada à formação
dessas espécies está no fato de que quase sempre esses íons estão
acompanhados de uma perda neutra de 83 Da, como no caso de P1 (m/z
441,3), P2 (m/z 554,4), P4 (m/z 847,4 e 1148,6), PX1 (m/z 880,5 e 897,4) e PX2
(m/z 484,2). Em todos esses casos o tamanho relativo das cadeias α e β
influenciam a formação dessas espécies, uma vez que os fragmentos derivados
de ímônios contendo o ALC estão presentes em ambas as cadeias apenas no
caso das espécies que possuem as duas cadeias com tamanho grande, como é
o caso de P4 e PX1. O símbolo {K} refere se ao anel tetrahidropiridina, formado
a partir do fragmento análogo ao íon imônio da Lys, conforme ilustrado no
mecanismo proposto na Figura 27.
63
83,1 Da
anel
tetrahidropiridina
(THP)
Figura 27. Proposta de formação do anel tetrahidropiridina a partir do íon análogo ao imônio de
Lys.
Nessa proposta, ocorre um ataque do nitrogênio da lisina conectada ao

DSS ao carbono α do mesmo resíduo. Esse ataque é favorecido tanto pela
eletrofilicidade desse carbono, uma vez que este está ligado a um átomo de
nitrogênio positivo por uma ligação dupla, quanto pela formação de um anel
estável de 6 membros. Esse íon pode facilmente perder um grupo amônia,
levando a formação de um anel tetrahidropiridina (THP, indicado por {K} nos
espectros de fragmentação). A perda neutra de 83 Da por sua vez é decorrente
da clivagem da ligação C N, com a saída do anel THP, levando a formação do
íon acílio correspondente. É possível notar que a estrutura do anel THP é
composta somente por átomos da lisina; desse modo, essa proposta de
fragmentação é suportada pelo fato de que em espectros de fragmentação de
peptídeos contendo esse resíduo, sempre que há a formação do imônio da
lisina, ocorre também a formação de outro íon de m/z 84, referente ao anel THP
protonado. Como no caso do peptídeo modificado o nitrogênio do anel, após a
perda do grupo amônio, não se encontra ligado a nenhum outro átomo de
hidrogênio, a THP sai como uma espécie neutra, deixando a carga no oxigênio.
A perda neutra de THP no entanto é extremamente interessante, uma vez que
ela é específica para a presença de ALCs, o que leva a indicação de uma
espécie modificada pelo ALC.
64
Ainda com relação a formação do anel THP a partir do rearranjo da
cadeia lateral da lisina, é possível notar que caso a outra extremidade do ALC se
ligue a outra lisina (e não ao N terminal), também é possível que esta se
rearranje do mesmo modo, levando a formação de um íon fragmento cuja
estrutura seria composta por dois anéis THPs separados pela cadeia
espaçadora do ALC, no caso do DSS, de m/z 305,2 conforme ilustrado na Figura
28.
Figura 28. Formação de um íon fragmento cuja estrutura seria composta por dois anéis THPs
separados pela cadeia espaçadora do ALC (as m/z referem se ao uso de DSS) de m/z 305,2; a
perda neutra de um anel THP ( 83 Da) leva a formação do íon de m/z 222,1.
A formação dessa espécie, de m/z 305, representada por {K} {K} nos
espectros da Figura 26 está presente em praticamente todas as espécies
intermoleculares estudadas. Como era esperado, no caso da espécie
intermolecular PX2, formada a partir da união de uma Lys e o N terminal, esse
fragmento não está presente (temos apenas uma Lys). A partir do fragmento de
m/z 305, a perda neutra de um anel THP ( 83 Da) leva a formação do íon de
m/z 222,1 (indicado por {K} nos espectros da Figura 26). Outro íon fragmento
de interesse e proveniente do mesmo caminho é o de m/z 239,2, porém sem a
perda de amônia do rearranjo da cadeia lateral da lisina para formação do anel
THP (segunda etapa da Figura 27). Como era esperado, os fragmentos de m/z
222,1 e 239,2 estão presentes na espécie PX2. Como relatado anteriormente,
65
todos esses íons também estão presentes na fragmentação de espécies
intramoleculares e sua formação foi proposta na Figura 21.
4.1.5. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por MALDI

MS/MS utilizando CID
Os dados de MALDI MS/MS dos peptídeos P1, P2, P3, P4, PX1 e PX2
são mostrados na Figura 29A, B, C, D, E e F, respectivamente. Assim como
quando utilizando ESI como fonte de ionização, as anotações presentes nos
dados de MALDI MS/MS foram realizadas de acordo com a referência 91.
150509_P18_DSS_TRIP6H_1617 53 (1.213) M3 [Ev 261542,It50,En1] (0.100,1,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (29:54)

222.1278
(A)
TOF MSMS 1617.80LD+
5.16e3
100
84.0397
{K} KR β
β 17
β
VWSEKGNMAR α
y6αb5α {K} + 17 {K}
267.1557 239.1568
{K} 507.3187
β 17 {K}
175.0933 {K} 424.2423

y5α β (b9α or b1β)
305.2066 548.2547 1617.7733
β + 18
%
1461.6953
y6αb5α 17
441.2651 524.3425
552.3305
368.2410
β b6α
566.3144
b3α
373.1855 y7α (CO2+18) y6α
1127.5596
960.4974 1616.7074
593.3310 y7α
611.3365 723.3965
922.4381 1443.6809
825.4260 1116.5988
961.5596 1241.5939 1423.6460
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
66
150509_P19_DSS_TRIP6H_1775 25 (0.789) M3 [Ev 67217,It50,En1] (0.100,1,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (6:37) TOF MSMS 1775.90LD+
100
x4 1775.8527
(A)
1.79e3
(B)
y1α
or
y1β LKR β
175.0963
{K}
222.1312
DTYQAGKFHRα
{K} + 17
β
239.1510
β
y3α
y2α {K}
%
459.2399
312.1671
β 17 637.4339
84.0412 481.3329
b3α {K} 1776.9620
380.2452 554.3588
620.4019
b7αy5α 17 (b9α or b2β) + 18
1619.7740
378.2319
722.0079
1774.7512
730.4224 b8α 1601.7710
1758.8972 1777.7574
800.3928 911.0490 1781.9160
928.7789 1504.7466 1783.7902
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
P1_NOVO2_DSS DIG B 1574 38 (1.183) M3 [Ev53620,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,1,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (25:57)

100
(C)(B) TOF MSMS 1574.80LD+
1574.8390 130
KGCR β
EVTKNDLR α
1557.7979
y2α b6α
288.1924 1287.6052 (b3α or b7β)
+ 18
1418.7050
%
84.0401
(a7 α or a3β) 17
1383.7204
{K} + 17 y5α (CO2+CN2H2+ β)

b6α 17
175.0961 1270.5814
1146.5647
y6α (CO2+NH3) 1215.6276
685.3247
y7α CO2 y7α
239.1680 y3α 559.2805 974.5470 1075.5789
403.2055 801.4255
912.4736
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
67
P3 DIG OASIS 1857 52 (1.140) M3 [Ev 48767,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (47:70) (B)
(D)
TOF MSMS 1857.00LD+
1700.7809 985
100
(b7α or b5β)
YTKDLSQR α
+ 18
AFKGMR β
1856.8289
{K} 1796.8304
y1α or y1β
b7αy5βb3β
%
{K} (2x28)
{K} + 17 b7αy5βb3β b7α or b5β

{K}
239.1504 (2x28, 17) 1682.7722
222.1338
y4α b4α
503.2660
b6αy5βb3β 1354.5912
84.0636
(3x28)
y4α 18 a7α or a5β
175.1040
305.2058 1654.7566
1193.5951
485.2560 β+ 1037.4923 1176.5824 1355.6698 1635.7793
531.2497 709.3563 865.4133
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
PX DSS DIG 1639 52 (1.672) M3 [Ev11339,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,1,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Sm (SG, 2x4.00); Cm (43:108)
(C)
(E)
TOF MSMS 1639.00LD+
1482.8711 227
100
(b7α or b6β)
+ 18
AGAKGAER α
1638.9633
LVKAGVR β
1578.9299
{K}
%
{K} {K}
b7α or b6β
b4α 1464.8672
84.0372
b5α
222.1268 b6α a7α or a6β
305.2118
{K} + 17 1436.8833 1639.8563
175.0874
239.1625
{K}
466.2843 523.2751 b4β
421.2434
677.3900
a4α 1308.8098 1641.0747
1179.7362
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
68
7C 1225 20 (0.370) M3 [Ev 3609,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,1,Cmp); Sm (SG, 2x8.00); Cm (15:77) (B)
(F)
TOF MSMS 1225.80LD+
1225.7874 1.63e3
100
HN A G A K β
LVKAGVR α
{K} + 17
b1β
%
{K} {K} b
2β b3αy5αb1β
28
338.4138 β
222.1501
84.0811 293.1890 {K}
b3αy6αb2β {K} b3β+18
1097.6921
239.1754 28
1226.6901
129.1030 350.2135
1227.2002
567.3553 b6 α
466.2788 1208.7490
1051.6859
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
Figura 29. Espectros anotados de MALDI MS/MS das espécies intermoleculares dos peptídeos
1+ 1+ 1+
P1 (A, m/z 1617,8; [M+1H] ), P2 (B, m/z 1775,9; [M+1H] ), P3 (C, m/z 1574,8; [M+1H] ), P4
1+ 1+ 1+
(D, m/z 1857,0; [M+1H] ), PX1 (E, m/z 1638,9; [M+1H] ) e PX2 (F, m/z 1225,7; [M+1H] ).
Em relação aos dados de ESI MS/MS, os espectros de fragmentação de

MALDI das espécies intermoleculares não são tão informativos quanto à
seqüência de aminoácidos, visto que esses contêm um menor número de íons
tipo y e b. Mesmo apresentando menos fragmentos que ESI, é possível notar
que grande parte das características observadas anteriormente também estão
presentes quando utilizando MALDI. Por exemplo, para P1 (Figura 29A), que
possuí a menor cadeia β em relação à cadeia α, a maior parte dos fragmentos
são provenientes da dissociação da cadeia maior: b6α (m/z 287,6), y2α (m/z
288,2), y3α (m/z 403,2) e y7α (m/z 974,5). Quando partimos para espécies com a
cadeia β maior, fragmentação em ambas as cadeias são observadas, como é o
caso de P4 (Figura 29D), onde os íons b4β (m/z 1308,8) e b8α (m/z 911,9) foram
observados. Assim como em ESI MS/MS, fragmentos referentes às cadeias α+ e
β+ foram observados, como a cadeia α+ de P3 (m/z 974,5, Figura 29C) e a
69
cadeia β+ de P4 (m/z 709.4, Figura 29D). A perda neutra de 83 Da, referente ao
anel THP também esta presente em MALDI. A cadeia β de P1 ligada ao anel
THP pelo DSS (m/z 524,3), após a perda de 83 Da leva ao fragmento de m/z
441,3 (Figura 29A). Os íons diagnósticos (m/z 222,1; 239,2 e 305.2) estão
presentes nos espectros de MALDI com intensidade superior aos de ESI. Em
adição às características observadas em ESI, os espectros de MALDI
mostraram a presença de fragmentos internos, como é o do íon fragmento de
m/z 1193,6 de P4, atribuído ao íon y7α ligado ao DSS e aos resíduos internos FK
da β (Figura 29D).
4.1.6. Uso de Diferentes ALCs para Formação de Espécies

Intermoleculares

Com intuito de validar as atribuições realizadas usando DSS e verificar a
influência do ALC na dissociação de espécies intermoleculares, outros dois
ALCs foram utilizados para obtenção de espécies intermoleculares e realização
de novos experimentos de fragmentação. A estrutura dos ALCs utilizados,
incluindo DSS, glutarato de disuccinimidila (DSG) e sebacato de disuccinimidila
(DSSeb) são ilustradas na Figura 30.
DSG
DSS
DSSeb
70
Figura 30. Estrutura dos agentes de ligação cruzada (ALC): glutarato de disuccinimidila (DSG),
suberado de disuccinimidila (DSS) e sebacato de disuccinimidila (DSSeb).
DSG e DSSeb são análogos do DSS: DSSeb possuí dois grupos CH2
adicionais (um aumento de massa de 28 Da em relação ao DSS) e DSG possuí
três CH2 a menos que DSS (menos 42 Da em relação ao DSS). O uso de ALCs
semelhantes permite a identificação de íons de modo similar a experimentos
envolvendo marcação isotópica, de modo que íons que contém DSSeb ou DSG
em sua estrutura devem aparecer com uma diferença de massa de + 28 ou 42
Da, respectivamente; já íons que não contem o ALC devem apresentar a mesma
m/z em qualquer situação. A Figura 31 ilustra dados de ESI MS/MS das
espécies [M+2H]2+ intermolecular de P4 gerados com DSSeb (m/z 942,9; A),
DSS (m/z 928,9; B) e DSG (m/z 908,9; C); íons marcados com estrela não
contém o ALC, e apresentam a mesma m/z nos três espectros; por outro lado,
íons marcados com triangulo são equivalentes mas possuem m/z deslocados,
devido à presença de diferentes ALCs em suas estruturas.
55.00000000
181108_P3_DSSEB_943 75 (1.389) M3 [Ev 130925,It50,En1] (0.100,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (55:97) TOF MSMS 943.00ES+
100
503.3371 (A)
2.33e3
175.1361
1885.1482
1382.8481
%
84.0900
875.5636
495.3105 958.6332 1118.7053 1259.8304
191.1365 1176.7333
363.2118 618.3773
551.3780 1383.7701 1495.0454 1683.0404 1886.2573
439.2454 709.4527 995.7211 1310.9178 1729.0625
757.4790
0
220408 ESI P3 DSS 929 15 (0.278) M3 [Ev17774,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (14:37) TOF MSMS 929.00ES+
100
175.1125 503.2796 (B)
160
1856.8773
136.0693
1354.6200
%
618.3062 847.4220 929.4884

191.1086 390.1970 1090.5178 1231.6067
930.4668 1282.6650 1355.6918
485.2701 699.5041 1466.7258 1654.8179 1700.8424 1857.7883
709.4331
554.3091 725.3981 1019.5706 1465.7662
1551.7728 1860.0458
0
700
181108_P3_DSG_908 134 (2.482) M3 [Ev 4609,It50,En1] (0.100,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (120:134) TOF MSMS 907.99ES+
100
503.3351 1815.0669 (C)
638
175.1351
1312.7286
%
120.0927 618.3767
191.1355 363.2121
805.4789 909.7205 1048.6111 1189.7119 1313.8041
604.3162 709.4331 1106.6449 1424.8821 1815.9600
443.2624 1612.9740 1658.9772
0 mass
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
Figura 31. ESI MS/MS da espécie intermolecular de P4, duplamente carregado, gerados a partir
dos ALCs: DSSeb (m/z 942,9; A), DSS (m/z 928,9; B) e DSG (m/z 908,9; C). Íons marcados com
“estrela” não contém o ALC em sua estrutura e possuem o mesma m/z nos três espectros. Íons
marcados por triângulo apresentam m/z deslocado pois são oriundos dos diferentes ( +28 para o
DSSeb e 42 para o DSG, em relação ao DSS).
71
Íons análogos aos íons diagnósticos gerados a partir do DSS (m/z 222,1;
239,2 e 305,2) também estão presentes quando utiliza se DSSeb e DSG como
ALCs e, como esperado, apresentam m/z deslocadas devido aos diferentes
tamanhos das cadeias espaçadoras do ALC utilizado. Isso faz que, utilizando
DSSeb os íons diagnósticos aparecem com m/z 250,2; 267,2 e 333.3; já com
DSG m/z 180,1; 197,1 e 263,1 (Figura 32).

10.00000000
181108_P3_DSSEB_943 75 (1.389) M3 [Ev 130925,It50,En1] (0.100,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (55:97) TOF MSMS 943.00ES+
100
191.1365 502
192.1224
(A)
237.1469 M3
216.1189 M2 286.1776
303.2047
333.2876
%
201.1414 229.1405
M1 265.1432
267.1490
269.1490
289.1599
189.0872 250.2045 306.1903 321.2508 338.1731
219.1354
202.1043 252.1201 271.1483 295.2349 320.1693
181.0814 244.1461 328.1770
264.1657
0
220408 ESI P3 DSS 929 15 (0.278) M3 [Ev17774,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (14:37) TOF MSMS 929.00ES+
100
191.1086
192.0979
M1 331.0630 45.3
(B)
222.1426
M3
216.0864
237.1154
M2 269.1165
286.1442 293.1757 305.2097
%
239.1801 283.0394
313.0497 338.1385
215.1075 227.0952 242.1312 252.0900
185.0988 201.1257 265.1812 298.1263 326.1328
277.1660 339.1001
204.1298
0
181108_P3_DSG_908 134 (2.482) M3 [Ev 4609,It50,En1] (0.100,2,Cmp); Sm (SG, 2x4.00); Cm (120:134) TOF MSMS 907.99ES+
100
191.1355 108
192.1235 286.1768
(C)
216.1184
M1 M2 225.1455 303.2033
237.1485
M3 338.1755
%
197.1487 268.1676 332.1902

180.1223 308.1914
265.1418
263.1418 269.1500 289.1594
201.1394 227.1226
189.0898 202.1049 282.1663 310.1665 321.1786
247.1318 251.1275 271.1617
204.1484 298.2052
0 mass
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
Figura 32. Região expandida dos espectros ilustrados da Figura 31 (P4 ESI MS/MS). (A) íons
diagnósticos formados quando utilizando DSSeb: m/z 250 (M1), 267 (M2) e 333 (M3); (B) íons
diagnósticos quando utilizando DSS: m/z 222 (M1), 239 (M2) e 305 (M3); (C) íons diagnósticos
quando utilizando DSG: m/z 180 (M1), 197 (M2) e 263 (M3).
A Tabela 1 resume as principais características observadas no estudo de

espécies intermoleculares. Além disso, como verificado na Figura 31, as
características observadas quando DSS é empregado como ALC pode ser
estendida para espécies geradas a partir de outros ALCs provenientes de
ésteres de NHS, semelhantes ao DSS, como é o caso de DSSeb e DSG. Como
pode ser visto na Tabela 1, a perda neutra do anel THP ( 83,1 Da) foi verificada
para grande maioria das espécies geradas por ESI. Além disso, o
comportamento da cadeia β como uma modificação da cadeia α é um efeito
mais pronunciado em ESI do que em MALDI. A presença dos íons marcadores,
72
M1, M2 e M3, referentes aos fragmentos de m/z 222, 239 e 305 para o DSS, e
seus respectivos análogos para DSG e DSSeb, estão presentes tanto em ESI
quanto MALDI.
Tabela 1. Características de fragmentação observadas para as espécies intermoleculares

utilizando MALDI e ESI como fontes de ionização.
MALDI ESI
Perda de 83,1 Da (THP) P1,P2 P1,P2,P4,PX1,PX2
Cadeia β como modificação P1 P1, P2, P3
222,1 (M1) P1,P2,P4,PX1,PX2 P1,P2,P3,P4,PX2
239,2 (M2) P1,P2,P3,P4,PX1,PX2 P1,P3,P4,PX1,PX2
305,2 (M3) P1,P4,PX1 P1,P3,PX1
O estudo de fragmentação de espécies intermoleculares foi submetido ao

periódico Journal of Mass Spectrometry.
4.2. Varredura de Íon Precursor (PIS) para Identificação de

Espécies Modificadas por ALCs
Como previamente discutido nesse trabalho, um dos maiores problemas

em experimentos de ligação cruzada de proteínas e espectrometria de massas é
a identificação das espécies modificadas pelos ALCs. Uma metodologia
baseada em MS que pode auxiliar na identificação de espécies modificadas,
utilizando ALCs convencionais, como DSS, é a varredura de íon precursor
(Precursor Ion Scan – PIS). Experimentos do tipo PIS foram desenvolvidos
inicialmente em instrumentos do tipo Triplo Quadrupolo, e refere se a um
experimento de MS/MS onde o primeiro analisador de m/z realiza a varredura de
todos os íons gerados na fonte, sendo esses fragmentados na cela de colisão. O
segundo analisador de m/z encontra se fixo em uma determinada m/z,
permitindo que apenas fragmentos com essa m/z passem por este analisador
(na Figura 33 temos uma representação de diferentes tipos de experimentos de
MS/MS, inclusive PIS). Desse modo, esse tipo de análise é extremamente
73
vantajoso quando se deseja buscar uma determinada classe de compostos em
uma matriz complexa, desde que esta gere um íon fragmento característico.
Vale ressaltar nesse ponto que PIS é o experimento oposto ao típico Varredura
de Íons Produtos, onde o primeiro analisador seleciona um íon de determinada
m/z, esse é fragmentado e todos os seus fragmentos são varridos no segundo
analisador (Figura 33).
Figura 33. Representação esquemática de experimentos de MS/MS.
PIS em instrumento do tipo Triplo Quadrupolo e Ion Traps Lineares vêm

sendo utilizado em proteômica para determinação de sítios de
fosforilação127,128,129, modificação por aldeído130, identificação e diferenciação de
oligossacarídeos ligados por nitrogênio ou oxigênio em proteínas131,132,133.
74
Em 2002, Bateman propôs a utilização do equipamento Q Tof em um
experimento similar ao PIS134. Em princípio, o experimento de PIS não pode ser
realizado em equipamentos tipo Q Tof, uma vez que analisadores Tof não tem
capacidade de filtrar íons de determinada m/z. O método proposto consiste em
um experimento no qual o quadrupolo transmite íons continuamente, enquanto o
Tof adquirie espectros alternados com e sem fragmentação (isso é feito
alterando se a energia de colisão com o gás). Caso o fragmento de interesse
seja gerado na colisão, um espectro de varredura de íons produtos é adquirido
para identificar o precursor que gerou o fragmento. Esse tipo de experimento
traz as vantagens de equipamentos tipo Q Tof quando comparados a triplo
quadrupolos, como alta velocidade de aquisição de espectros aliada a alta
sensibilidade e exatidão de massas. Desde então, PIS em equipamentos tipo Q
Tof tem sido utilizado para identificação e quantificação de fosfopeptídeos135,136,
detecção e diferenciação de dimetilação em arginina137 e na detecção de
peptídeos glicosilados138.
Como mencionado acima, para realização de experimentos de PIS, é
necessário a presença de íon diagnóstico no espectro de Varredura de Íons
Produtos, ou seja, um fragmento característico de uma determinada classe de
compostos. Com base nos estudos de fragmentação de peptídeos contendo
ALCs, foi possível identificar três íons característicos para cada ALC. Quando
utilizando DSS temos os seguintes íons 222,1494; 239,1759 (peptídeos
contendo DSS) e 305,2229 (peptídeos contendo DSS conectados por duas
lisinas), ilustrados na Figura 34. Para DSSeb temos os seguintes íons 250,1807;
267,2072 (peptídeos contendo DSSeb) e 333,2542 (peptídeos contendo DSSeb
conectados por duas lisinas). Para DSG temos os seguintes íons 180,1025;
197,1290 (peptídeos contendo DSG) e 263,1760 (peptídeos contendo DSG
conectados por duas lisinas). Esses íons apresentam grande potencial para sua
utilização em experimentos de PIS envolvendo ligação cruzada de proteínas
utilizando qualquer um desses ALCs, uma vez que suas m/z não coincidem com
nenhuma combinação de íons tipo a, b ou y (íons mais comuns na fragmentação
de peptídeos por colisão) dos 20 aminoácidos naturais. Esse dado, aliado à alta
75
exatidão de massas do Tof, pode conferir alta especificidade para esse tipo de
análise.
Figura 34. Estrutura dos íons diagnósticos gerados a partir do DSS (222,1494; 239,1759 e
305,2229). Os análogos, gerados a partir do DSG apresentam três grupos CH2 a menos (m/z
180,1025; 197,1290 e 263,1760). Os análogos, gerados a partir do DSSeb apresentam dois
grupos CH2 a mais (m/z 250,1807; 267,2072 e 333,2542 ).
O primeiro experimento realizado consistiu na análise da amostra gerada

a partir da reação com o peptídeo PX e o DSS, de modo que várias espécies
modificadas pelo ALC são esperadas (intra e intermoleculares, além dos dead
end). A Figura 36 apresenta o cromatograma da amostra PX com baixa energia
de colisão (sem fragmentação), de modo que espécies mais intensas estão
indicadas no cromatograma e foram alvo dos estudos de fragmentação de
espécies intramoleculares e intermoleculares. A Figura 36 apresenta os
cromatogramas de íons selecionados de alta energia de colisão (houve
fragmentação) para os íons diagnósticos com alta exatidão (m/z 222,1494;
239,1759 e 305,2229 ± 0,02 Da).
76
Figura 35. Cromatograma da amostra proveniente da reação entre o peptídeo PX e DSS (após
digestão enzimática) com baixa energia de colisão (sem fragmentação). As espécies mais
intensas estão indicadas.

Figura 36. Cromatograma de íons selecionados da amostra PX com alta energia de colisão,
indicando a presença dos íons de m/z 222,1494 (A), 239,1759 (B) e 305,2229 (C) utilizando erro
de 0,02 Da.
77
É possível observar no cromatograma de baixa energia de colisão (Figura
36) a presença de várias outras espécies além das indicadas na Figura. Além
disso, quando fragmentadas essas espécies dão origem aos fragmentos dos
íons marcadores, o que indica que todos esses sinais são referentes a espécies
contendo DSS em sua estrutura. Isso já era esperado, uma vez que após a
reação com o DSS e digestão com tripsina, várias espécies foram formadas
(como é verificado no espectro de MALDI MS do produto da reação, Figura 17,
além das mencionadas anteriormente: espécies contendo somente dead end ou
dead end mais ligações intra ou intermolecular, produtos de digestão
incompleta, dentre outros). Desse modo, é interessante notar o grande potencial
do uso de PIS para detecção de peptídeos modificados por ALCs.
Baseado na Figura 36, é possível verificar a importância da utilização de
mais do que apenas um dos três íons diagnósticos, uma vez que, alguns
peptídeos modificados pelo ALC geram apenas um deles. Além disso, a
detecção simultânea desses íons fragmentos no mesmo experimento é possível
em equipamentos Q Tof sem perda de sensibilidade (diferentemente de
equipamentos triplo quadrupolos, onde cada canal adicional a ser monitorado
diminui a sensibilidade).
Com o intuito de simular uma amostra envolvendo proteínas, foi realizado
outro experimento onde uma alíquota da amostra do peptídeo PX (mesma
utilizada anteriormente) foi adicionada a um digesto da proteína hemoglobina em
quantidades estequiométricas. A Figura 37 apresenta o cromatograma adquirido
com baixa energia de colisão das amostras controle (digesto de hemoglobina) e
experimento (digesto de hemoglobina + PX). É clara a presença de um maior
número de picos cromatográficos devido à presença de picos referentes amostra
PX. A Figura 38 apresenta os cromatogramas de íons selecionados de alta
energia de colisão (íons diagnósticos que indicam a presença de peptídeos
modificados por DSS); e uma das principais características desses
cromatogramas refere se à especificidade dos íons marcadores, ou seja, com a
alta exatidão de massas de um Tof, nenhum peptídeo da hemoglobina quando
fragmentado gera um dos íons diagnóstico.
78
Figura 37. Cromatogramas adquiridos com baixa energia de colisão para a hemoglobina
digerida com (linha verde) e sem PX (linha vermelha).

Figura 38. Cromatogramas de íons selecionados com alta energia de colisão para as amostras
contendo hemoglobina + PX (traço superior) e somente hemoglobina (traço inferior), indicando a
presença dos íons diagnósticos, de m/z 222,1 (A); 239,1 (B) e 305,2 (C).
79
O próximo passo na utilização de PIS como método de detecção de
peptídeos contendo DSS foi realizar um experimento de ligação cruzada com
proteína. Com isso, o alvo escolhido foi a proteína lisozima, uma proteína
modelo pequena e com estrutura resolvida por Cristalografia de Proteínas e por
Ressonância Magnética Nuclear. Além disso, essa proteína tem um grande
número de resíduos de lisina, o que a torna um bom alvo para a validação do
método apresentado. A Figura 39 indica os cromatogramas referentes aos íons
diagnósticos de peptídeos modificados por DSS tanto do controle (lisozima
digerida) quanto do experimento (lisozima + DSS digerida). Mais uma vez é
notável a excelente especificidade dos íons marcadores, visto que são muito
poucos os íons no controle que geram os marcadores. Essa figura indica
também que a utilização dos 3 íons simultaneamente é extremamente
interessante, uma vez que aumenta a especificidade da técnica sem a perda de
sensibilidade (em equipamentos tipo Q Tof).

Figura 39. Cromatogramas com alta energia de colisão para a lisozima controle (sem DSS, traço
inferior) e experimento (com DSS, traço superior), dos íons diagnósticos de m/z 222,1 (A); 239,1
(B) e 305,2 (C).
80
Para cada um dos picos cromatográficos acima nos quais havia a
presença dos íons diagnósticos de m/z 222,1 e 239,1, os respectivos espectros
de MS de baixa energia de colisão foram processados para identificação de
peptídeos modificados com DSS. Esses espectros foram deconvoluídos e as
m/z dos possíveis precursores monocarregados foram carregados no software
xBobcat139, que cria uma lista teórica de possíveis peptídeos modificados
baseados somente em dados de MS. Os peptídeos atribuídos tiveram sua
identificação manualmente confirmada por espectros de fragmentação. A Figura
40 apresenta um exemplo de identificação de um peptídeo do tipo dead end;
nesse caso, é interessante notar a presença dos íons 222,1 e 239,1 e a
ausência do íon 305,2, fato esperado para peptídeos desse tipo.
Figura 40. (A) Cromatogramas de alta energia de colisão de íons selecionados para as m/z
222,1494 e 239,1759 (± 0,02 Da), em vermelho e verde respectivamente. O retângulo destaca o
pico cromatográfico referente ao espectro de MS (baixa energia de colisão) apresentado em (B).
Em (C) temos o espectro de fragmentação anotado do íon de m/z 381,7, referente ao peptídeo
N terminal da lisozima modificado com DSS (dead end). Em (D), ampliação do espectro (C),
destacando a presença dos íons marcadores.
Com base na descoberta dos íons diagnósticos, foi possível construir um

fluxograma capaz de auxiliar na identificação de peptídeos modificados por ALC
(Figura 41). No caso do DSS, o primeiro passo é verificar a presença dos íons
81
fragmentos de m/z 222,1 e 239,2 no espectro de fragmentação. Se nenhum
destes íons está presentes no espectro, não temos uma espécie modificada pelo
ALC. Caso pelo menos um deles esteja presente, passamos a verificar o
fragmento de m/z 305,1 para DSS. Se o espectro não apresenta o fragmento de
m/z 305,2 devemos ter uma espécie do tipo dead end (peptídeo ligado ao DSS
por uma lisina). Caso o íon de m/z 305,1 esteja presente devemos ter uma
espécie intramolecular ou intermolecular (em ambos os caso temos DSS ligado
por duas lisinas). Caso seja possível observar no espectro de dissociação as
m/z 147,1 e 175,1, referentes aos y1 de lisina e arginina respectivamente, isso
indicaria a presença de dois resíduos diferentes na porção C terminal. Esse fato
só seria possível se dois peptídeos diferentes estivessem conectados, ou seja,
se essa fosse uma espécie intermolecular. Por outro lado, a presença de
somente um desses íons seria inconclusiva, uma vez que poderia indicar tanto a
presença de somente um C terminal (e conseqüentemente uma espécie
intramolecular) quanto dois C terminais idênticos (peptídeo intermolecular).
A Figura 41 ilustra o fluxograma quando DSS é utilizado como ALC, mas
ele pode ser aplicado quando outros ALC derivados de ésteres de NHS forem
utilizados, como DSSeb ou DSG. Caso DSG seja utilizado, verificamos
primeiramente a presença dos análogos aos fragmentos de m/z 222,1 e 239,1
de m/z 180,1 e 197,1; já com DSSeb, m/z 250,2 e 267,2. Se DSG ou DSSeb
forem usados verificamos os fragmentos de m/z 263,2 ou 333,3,
respectivamente, para fragmentos análogos ao m/z 305,2.
82
Não Peptídeo não
222,1494 ou
222.1494
Espectro de CID modificado
or239,1759
239.1759
por DSS
Sim
222.1494 Não Hidrolisado

305,2229
or 239.1759 (Dead end)
Sim
Não
147.1134
222.1494 Inter ou
eor175.1195
239.1759
Intramolecular
Sim
Intermolecular
Figura 41. Fluxograma de interpretação de dados obtidos de um experimento de PIS para

detecção de peptídeos contendo ALC derivados de diésteres de NHS (os valores de m/z
presentes referem se ao DSS, mas caso outro ALC seja utilizado, é só usar o m/z do ALC
empregado).
Após empregar esse fluxograma, somente os espectros de dissociação

dos íons precursores de interesse seriam analisados para verificar outras
características que permitissem a identificação inequívoca dos peptídeos
envolvidos no experimento de ligação cruzada.
O trabalho referente ao estudo de Varredura de Íon Precursor (PIS) para
auxiliar na identificação de peptídeos modificados por ALC foi publicado no
periódico Analytical Chemistry140.

83
4.3. Estudo de Fragmentação de Espécies Intermoleculares
por IRMPD e ECD
4.3.1. Formação de Espécies Intermoleculares para os Estudos

de IRMPD e ECD

Diferente das espécies intermoleculares utilizadas anteriormente, nesta
parte do trabalho estas espécies foram formadas pela reação entre dois
peptídeos e o ALC, conforme ilustrado na Figura 42. Embora essa abordagem
necessite de uma concentração muito maior de peptídeo e o rendimento da
reação seja muito inferior, ela permite a formação de espécies intermoleculares
grandes, capazes de apresentar um maior estado de carga. Neste caso os
seguintes peptídeos foram utilizados Ac ARAKGAEFAVYAGVR (P6); Ac
ARAKGAEFAVHAGVR (P7); Ac ARAKGAEFAVSAGVR (P8); Ac ARAYVALKA
(P9) e Ac ARAHVALKA (P10), todos com N terminal acetilado, para evitar a
reação nessa parte da molécula e com apenas um sítio reativo (lisina) frente aos
ALCs. Os ALCs utilizados foram DSS, DSG e DSSeb. As espécies
intermoleculares levadas em consideração neste estudo foram formadas entre
os seguintes peptídeos P6 P7; P8 P9; P8 P10; P6 P8 e P7 P8, utilizando os três
ALCs. Neste estudo foi avaliado o uso de métodos alternativos de dissociação
para estudos de espécies intermoleculares, bem como a presença do N terminal
livre ou bloqueado (acetilado), a influência do estado de carga, a identidade do
ALC e o na dissociação dessas espécies pelos métodos de IRMPD e ECD.
Dois peptídeos diferentes Espécie Intermolecular

+ ALC
Ac XRXXXXKXXXXX
+ Ac XRXXXXKXXXXX
} ALC } ALC
+ Ac URUUUKUUUU
Ac URUUUKUUUU
Figura 42. Formação de espécies intermoleculares a partir de dois peptídeos e ALC para
estudos de IRMPD e ECD.
84
4.3.2. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por IRMPD
O estado de carga mais elevado de cada peptídeo foi selecionado para

experimentos de IRMPD. Para ilustrar as características observadas para todas
as espécies intermoleculares estudadas temos na Figura 44A, B e C os
espectros de IRMPD do estado de carga [M+5H]5+ da espécie formado entre os
peptídeos P6 e P7 utilizando os três ALCs: DSG (A, m/z 657,75), DSS (B, m/z
666,16) e DSSeb (C, m/z 671,77), da região de m/z 680 até 1150 (essa é a
região mais povoada de cada espectro total, ilustrada aqui para facilitar a
visualização das atribuições dos fragmentos formados). A fragmentação de P6
ALC P7 (ALC = DSG, DSS ou DSSeb) por IRMPD mostra a formação de íons b
e y convencionais, de ambas as cadeias, α e β (nos espectros temos a
atribuição de cada fragmento bem como seu estado de carga). A primeira
característica notada aqui é que a fragmentação ocorre exclusivamente em uma
cadeia, enquanto a outra permanece intacta, e esse comportamento é
observado para ambas as cadeias. Por exemplo, os íons fragmento b6α e y13α
(para qualquer um dos ALCs), contêm o ALC e a cadeia β intacta em sua
estrutura. De modo similar, os fragmentos b4β e y13β apresentam o ALC utilizado
e a cadeia α intacta. A ausência de fragmentação paralela das cadeias faz com
que grande parte dos íons fragmentos seja grande, pois contém ambas as
cadeias em sua estrutura, e apresentem elevado estado de carga. Como
previamente mostrado neste trabalho, esse fato vai contra a fragmentação de
espécies intermoleculares utilizando CID, onde fragmentação paralela foi
observada, especialmente quando ambas as cadeias possuem tamanhos
semelhantes. Outra característica observada é a presença de fragmentos
referentes às cadeias intactas: m/z 804,43 (2+) para a cadeia α e m/z 791,43
(2+) para cadeia β. Esta característica é mais acentuada no espectro da espécie
P6 DSS P7 (Figura 44B), embora também esteja presentes para P6 DSG P7 e
P6 PSSeb P7 em intensidade menor.
85
`® 0.00000000
P68 DSG 657 IRMPD 1 (0.100) Scan ES+
100
916.4669 3.07e4
(A)
916.8027
b9β3+ b10β3+
883.4506
b7β3+ 883.7816
810.7460
b9α3+
811.0806 874.7820
b6β3+ b10α3+
907.8000 917.1388
767.7363
%
810.4117
b8β3+ 884.1176
907.1417
y7α1+ 768.0720
874.4485
767.4010 811.4154
859.7727
b7α 3+
b11α or β4+ 917.4701 y13α3+
b10α 4+ 721.8705 b8α3+ b11α or β3+
b12α or β4+ 768.4045 906.8079
y11β1+
681.1051 859.4371 884.4491 b13α or β3+
681.3549 739.8772
b6α3+ 802.0852 811.7504 957.4739 1042.5220 y11α
681.6051 y7α 1+ 801.7504 917.8066
992.9908 1042.0220 1043.0225
768.7373
850.7708
819.9253
992.4895 993.4868
1043.5234
1+
709.4027 1007.5087 1139.5645
0 m/z
680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140

`®
P68 DSS 666 1 (0.100)
0.00000000 (B)
Scan ES+
100 897.4758 930.4980 3.94e4
b9β3+ b10β3+
930.8286
897.8076
α2+
chain
b9α3+
b7β3+ 888.8041
824.7733
b10α3+
b5β3+ β2+ b6β3+ 921.4984 931.1644
781.7590 825.1072
y8α1+
%
chain
b8β3+888.4740
824.4399
b11α or β3+ b13α or β3+
782.0924
781.4260
b8α3+ b12α or β3+
b11α or β 4+ 825.4413
b13α or β 4+ 3+ 920.8304
b7α 873.4618
931.5006
y10α1+
y7 1+ 782.4260 1+
y8β865.1277 y91+
1+
735.4111
b6α3+ 816.1064 978.5068 1063.5547
y7 β
4+
772.4299
815.7723
856.4763
978.0090 1014.0242 1063.0593 1064.0618 y11α1+
b10α 709.4064
772.0936
825.7756 931.8318
979.0059
1014.5269 1139.5791
691.6244 736.4180 979.5109 1049.5601 1064.5625
1113.0903
0 m/z
675 700 725 750 775 800 825 850 875 900 925 950 975 1000 1025 1050 1075 1100 1125 1150
86
`® 0.00000000
P68 DSSEB 671 IRMPD 1 (0.100) Scan ES+
939.8253 2.22e4
100
b10β 3+
(C)
b9β3+ 940.1625
b7β3+ 906.8065
834.1064
907.1404
b9α3+
898.1399
b10α3+
834.4395 931.1594
833.7737 940.4945
%
b8β3+ 930.8287
y7α1+ b4β3+ 883.1279
b7α 3+
3+ 834.7770 930.4983 y9α1+
b11α4+ b 4+ b 6β 882.4717
13α 791.0930
b8α3+
4+
790.7596
791.4305
874.4611
940.8320
b13α3+
b10α 825.4414 930.1680
b11α or β3+
b
739.388712α
4+ 825.1073 835.1105 y11α
856.4708 941.1646
709.4000
757.1487
781.4333
824.7773
968.0139
992.5117 1028.5320 1042.0469
1077.5598
1078.0593
1+
1139.5698
0 m/z
700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980
5+
1000 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140
Figura 443. Espectro de IRMPD do estado de carga [M+5H] das espécies formadas entre os
peptídeos P6 e P7 utilizando os três ALCs: DSG (A, m/z 657,75), DSS (B, m/z 666,16) e DSSeb
(C, m/z 671,77), da região de m/z 680 até 1150.
A Figura 45 ilustra a cobertura obtida por IRMPD para o estado de carga

[M+5H]5+ da espécie P6 ALC P7 utilizando DSG (linha tracejada), DSS (linha
preta) e DSSeb (linha cinza). Com base nesta figura é possível notar que a
identidade do ALC não influencia a fragmentação por IRMPD. Para este mesmo
estado de carga, cobertura semelhante foi obtida para as demais espécies
intermoleculares.
b1 b2 b3 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13

α chain
ARAKGAEFAVYAGVR DSS
y13 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13 XL = DSSeb
DSG
ARAKGAEFAVHAGVR
β chain
y13 y11 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
5+

Figura 45. Cobertura obtida por IRMPD para o estado de carga [M+5H] da espécie P6 ALC P7
utilizando DSG (linha tracejada), DSS (linha preta) e DSSeb (linha cinza).
87
Para os estudos de influência do estado de carga foi observado que os
espectros da espécie P8 DSS P10 (Figura 46) com três cargas (m/z 883,16) em
A de m/z 175 a 975 e B de m/z 880 a 1190 e com quatro cargas (m/z 662,63). A
cobertura obtida para essa espécie nos dois estados de carga esta presente na
Figura 47 e, como pode ser observado, com exceção dos íons fragmentos y14α,
y5β, y6β e y7β de [M+3H]3+ e b11α e b12α de [M+4H]4+, todos os demais fragmentos
estão presentes em ambos os espectros de IRMPD e esses dois estados de
carga apresentam coberturas semelhantes. Fragmentos com duas cargas são
dominantes para o precursor triplamente carregado, enquanto que a espécie
com quatro cargas gera fragmentos com duas e três cargas com quantidades
semelhantes. A mesma comparação, em relação a influência do estado de
carga, foi realizada paras as demais espécies intermoleculares e resultados
idênticos foram obtidos.
88
€® 0.00000000
P10 P13 DSS IRMPD 883 1 (0.100) TOF MSMS 0.00ES+
175.1185 2.64e4
100
z1α 1+ (A)
c2α or β1+
270.1555
806.4501
z8α1+
%
c7β1+
c4β1+ z14α3+
807.4518
c5α2+
z5α 1+ c7β1+ 778.4657
c3α or β1+ z4α1+ 461.2237 489.2773 c5β1+ 761.4418
z8β3+ 856.9977
577.3201 c6β1+
341.1920 402.2452
228.1339
281.1604
560.2936
z6α1+631.3302
648.3567 z7α1+ 853.8146
209.1393 308.1712 549.3253 659.3817

358.2195 454.2398 588.3464 733.4457
192.1128 532.2993 663.7043
0 m/z
175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 800 825 850
€® 0.00000000
1190.1660 5.81e3
100
(B)
c6α2+ z13α or 7β2+
921.5162
1189.6687
z11α1+
1063.5496
z4β2+ z13α 182+

%
1036.0864
c13α2+
917.4814
c8α 2+ z12α or 6β2+
1064.5510
922.5188 z3β2+ 1031.0723 1154.6519
c2β2+ c9α2+ z5β2+ 2+

1154.1514 1181.1584
912.5121
z 1+
1030.5701
1037.0889 z12α 181145.6465
z9α1+944.0242 c7α 2+ 10α
1066.6138
1080.6074
1145.1382
1180.6597
1006.5273
889.5339 983.0594 1027.5857 1086.6199
935.0168
908.0203 995.5516 1045.5388 1114.6194 1159.6389
1027.0750 1090.6101
907.5201 1115.1140
965.5361
0 m/z
900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180
89
€® 0.00000000
100
662.8647 9.34e4
(C)
663.1150
662.6146
z7α1+
%
663.3654
z5α 1+ c6β1+
z3α1+ z6α1+ c9α3+
324.6801 489.2725
z1α1+ 331.2061 c4β1+
588.3417
c8β 4+ 664.0325
687.7104
175.1177 c2α or β1+ z4α1+ 3+ 634.3521
478.2488 c5α
289.1619
402.2424 c5β1+ 547.7992 634.0183
658.0304 688.0458
z2α1+ 270.1542
c7α3+
c3α or β1+ 583.3179
690.4253
381.2216 615.0120
296.1694 490.2784 577.3154
341.1910 409.7455
187.1064 461.2236 548.8024
0 m/z
180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
€® 0.00000000
778.4623 6.26e4
100
c7β1+ (D)
%
z7β 1+
c11α 3+ 779.4656
c12α
c10α3+ 3+
743.7402
767.4161
c13α3+ z8α1+ z2β2+ c9α2+ z4β2+
761.4349 877.4851 944.5176
2+ 922.0118
c14α3+ c6α
792.4282 806.4427 944.0154 947.5205
743.4053 1031.0618
1030.5662
721.0657
744.4075 825.4486
857.4928
877.9844
922.5166 948.5275 c8α2+ z3β2+ 1031.5642
z11α1+
835.4473 857.9963 986.5389
721.3995 913.9935 995.54491001.0618 1036.5769
836.4502 889.5305 956.5337
0 m/z
720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060
Figura 46. Espectros de IRMPD da espécie P8 DSS P10 com três cargas (m/z 883,16) em (A)
de m/z 175 a 975 e (B) de m/z 880 a 1190; e com quatro cargas (m/z 662,63) em (C) de m/z 175
a 710 e (D) de m/z 720 a 1070.
90
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12 b13 b14
Ac A R A K G A E F A V S A G V R α chain
y14 y13 y y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
12 y11
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 XL = DSS
[M+4H]4+
Ac A R A H V A L K A
[M+3H]3+
y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2
β chain
Figura 47. Cobertura obtida para P8 DSS P10 com três (traços cinza) e quarto cargas (traços
pretos).
Para verificar se N terminal bloqueado ou livre influencia a dissociação

por IRMPD, as espécies intermoleculares P6 DSS P7, P6 DSS P8 e P7 DSS P8
foram digeridas com tripsina, tornando o N terminal livre, e o maior estado de
carga ([M+4H]4+) foi submetido a experimentos de IRMPD. Na Figura 48 temos
os espectros de IRMPD desses peptídeos bem como a cobertura obtida para
cada um deles e, como verificado nesta figura, é notado que o padrão de
fragmentação para as espécies intermoleculares, com N terminal livre, ou não,
influencia de modo significativo a fragmentação por IRMPD.
91
À® 0.00000000
P6P8 IRMPD 698 1 (0.100) Scan ES+
820.4185 2.26e5
100
b10α3+ (A)
820.7529
b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12
839.4257
b11α3+ A K G A E F A V Y A G V R α chain
[M+4H]4+ 839.7587
y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
698.8765 XL = DSS
b1 b9 b10 b11 b12
A K G A E F A V H A G V R β chain
b8α3+
%
y11 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
742.3885 b2α2+
y5α1+ b7α3+
565.3019 820.0844 840.0920
b12α3+
742.7225 872.4481
y11β2+ y6α1+ b6α3+ 872.7802 b4α2+
y7α1+ b9α3+
685.6882 796.7402 y8β1+
b2α3+
b5α3+ 743.0568 b3α2+873.1171 b6α2+
566.3042 636.6683 790.4279
883.4698 b5α 2+ y9α1+ y11α1+
593.9888 954.4911 1011.5031
743.3914 1139.5581
b4α3+
0 m/z
550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150

x® 0.00000000
P6P10 IRMPD 685 1 (0.100) Scan ES+
685.6191 x4 1.49e4
100
b2 b3 b5 b7 b8 b9 b10 b11 b12 (B)
[M+4H]4+ A K G A E F A V Y A G V R α chain
y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
XL = DSS
b1 b9 b10 b11 b12
685.3687 A K G A E F A V S A G V R β chain
2+ y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b2α
b10α3+
b5α2+
%
b3α2+
793.9121 b7α2+
y7α1+ b11α3+ b8α2+
735.4141 b9α3+ 822.7642
y5α1+ y9α1+ y9α1+
1+ 910.9598 960.9952 1068.5444
565.3071 y6β 1+ 744.3792 y8α
y6α1+ 685.8698 843.4469 882.4819 1004.0101
y11α1+
588.3455 708.8582
664.3765
y7β 1+ b12α3+ 939.9760 1118.0732 1146.5835
659.3804 b8α3+ 1147.0854
0 m/z
550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150
92
À® 0.00000000
P8P10 IRMPD 679 1 (0.100) Scan ES+
795.0667 3.66e4
100
b10α3+ (C)
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9 b10 b11 b12
794.7336
[M+4H]4+ A K G A E F A V H A G V R α chain
679.1023 y11 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b11α3+ XL =
b7β3+ b8β3+ 814.0748
b1 b9 b10 b11 b12
DSS
709.3607 742.3811
3+
b12α3+
678.8511 b9α 847.0947
677.8478 771.3904 A K G A E F A V S A G V R β chain
y8 y6 y5 y4 y3 y2 y1
%
y6α1+
y6β1+ b6β3+
588.3329
b5β3+y7β1+ 847.4296 y8α1+
636.3268
557.2821
b4β3+ y8β1+
b2β3+ 636.6604
593.6487
y7β1+ y11β1+
659.3673
847.7645
y9β1+
b3β3+ 853.9424
935.4598 953.9769
1+
1063.5061
593.9840 y
10β 1028.0081
1078.0396
0 m/z
550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150
4+

Figura 48. Espectro de IRMPD e coberturas obtidas para estado de carga [M+4H] das
espécies com N terminal livre das espécies P6 DSS P7 (A), P6 DSS P8 (B) e P7 DSS P8 (C).
4.3.3. Fragmentação de Espécies Intermoleculares por ECD
Assim como para IRMPD, o maior estado de carga de cada espécie

intermolecular foi submetido a experimentos de ECD. De modo geral, ECD
apresenta uma baixa eficiência de dissociação, fornecendo fragmentos com
intensidade muito menor do que o precursor, fato descrito na literatura e
comumente observado em ECD de proteínas105,141,142. Desse modo, em
espectros de ECD, com exceção do íon precursor, o íon mais intenso
normalmente corresponde ao íon referente à captura de um elétron pelo
precursor multicarregado, levando a formação da espécie [M+nH](n 1)+., sendo
também comumente presente, mas com intensidade inferior um íon referente a
captura de dois elétrons, gerando a espécie [M+nH](n 2)+... Na Figura 49 temos os
espectros de ECD dos precursores com cinco cargas das seguintes espécies
intermoleculares P6 DSG P7 (A), P6 DSS P7 (B) e P6 DSSeb P7 (C) (m/z
658,15; 666,55 e 671,71, respectivamente) e, em todos os casos, o íon mais
intenso é o precursor, seguido pela espécie [M+nH](n 1)+..
93
`® 0.00000000
P68 DSG 657 ECD 1 (0.100) Scan ES+
100
x24 658.1554 658.3549 (A)
6.40e5
822.4436
822.9478
822.1937
%
790.1765
329.0801 823.1980
659.1591 967.8491 1000.8678 1043.5608
328.9799 657.6364 741.0776
329.1805 386.2270 856.7952 1077.2424
328.8802 659.3591 967.5201
159.0999 258.1682
1077.9175
0
P68 DSS 666 ECD 1 (0.100) Scan ES+

100
x10 666.5648 666.7639
(B)
6.66e5
833.2053
667.3677
287.1823
358.2197 386.2270 832.7052 833.4576
%
159.1001 833.7059
719.3958 755.0917 981.8636 1090.9224
258.1682 315.1901 387.2306 871.1432
60.0555 175.1188 523.2865 549.2897 648.3604 1091.5930
1167.6545
0
P68 DSSEB 671 ECD 1 (0.100) Scan ES+

100
x24 672.1710 672.3708
840.2140 (C)
7.51e5
840.4663
671.7499 839.7140
%
840.7145 991.2122
673.1741 1067.2573 1100.2712
764.4363 880.1521 990.8732
386.2270 671.6980 1100.6011
159.0999 258.1682 287.1823 671.4303 745.4305
549.2915 1119.9514
0 m/z
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150
Figura 49. Espectros de ECD dos precursores com cinco cargas das espécies intermoleculares
P6 DSG P7 (A), P6 DSS P7 (B) e P6 DSSeb P7 (C). Em todos os casos, o íon mais intenso é o
(n 1)+.
precursor, seguido pela espécie [M+nH] .
Para facilitar a visualização da atribuição realizada em todas as espécies

temos na Figura as expansões do espectro atribuído de ECD para a espécie
P6 DSS P7: de m/z 150 a 660 (A), 670 a 790 (B) e 1000 a 1610 (C). Como
esperado, temos apenas a presença de íons fragmentos c e z., além de íons
correspondentes às cadeias α (m/z 1607,9; 1+) e β (m/z 1581.9; 1+ e m/z 791,5;
2+). Verificamos um grande número de íons fragmentos, sendo que

praticamente todos foram atribuídos; muitos deles estão presentes em diferentes
estados de carga, que varia de 1+ até 4+. Como presente na Figura 49, todos os
espectros de ECD são muito similares, apresentando o mesmo padrão de
fragmentação e atribuição para as outras espécies estudas.
94
`® 0.00000000
P68 DSS 666 ECD 1 (0.100) Scan ES+
100
287.1823 4.17e4
c 2 α or β1+ (A)
z .4 α or β1+
386.2270
c 3 α or β1+
358.2197
z .1 α or β1+
159.1001
%
z .2 α or β1+ z . 1+
258.1682
3 α or β
315.1901
z .5α1+
387.2306
z .5β1+
549.2897
z .6α1+
y1 α or β1+ 288.1858 359.2227 648.3604
175.1188 333.2849
523.2865
z .6β1+
243.1686 314.2058 333.4855
402.2453 550.2928 622.3552
274.1873
0 m/z
160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660
`® 0.00000000
P68 DSS 666 ECD 1 (0.100) Scan ES+
100
833.2053 5.16e4
[M+5H]4+. (B)
z.α or β Ac4+
c13 α or β3+
c7α 3+
β2+
833.4576
chain
832.7052
z. 14 α or β
4+
800.6873
c6β3+ 800.4388 z.8β1+ z.12 α or β3+
%
828.9510
c9β 3+ c14 α or β3+
c5β3+ c 11 α or β3+
z.8α1+ z.13 α or β3+
z.7α1+ c5α3+ 833.7059
c8α3+
866.4666 c20β3+ 981.8636
z.14 α or β3+
755.0917 c6α 3+ 840.4620
z.7β1+ 719.3958 c 12 α or β 3+ 982.2024
754.7568 778.7720
800.1866 870.8079
871.1432
c10α3+ 1014.8820
991.2003
1057.9097
693.3928
c4α c 3+ 3+ 755.4268 c8β 3+
995.5092
z.10β1+ 1066.5474
4β 778.4379 779.1063
3+
981.5310
z .9α1+ z.9 β1+ 1015.5499

1067.5815
744.7546
841.4644 879.4771
c 9α 969.5028 1057.2390
694.3960
755.7621 y14 α or β 860.4789
879.8098 927.5129
894.8197
928.1803
1040.5420
1067.9199
927.1744 1068.2517
4+ 936.1797
0 m/z
680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080
95
`® 0.00000000
P68 DSS 666 ECD 1 (0.100) Scan ES+
100
1090.9224 1.73e4
z.α or β Ac3+
(C)
1091.2612
α1+
Prec NH33+ z . 1+ chain
11β
[M+5H]3+..
β1+
1091.5930
z . 13 α or β2+
%
1522.3193
chain
1110.9465
c12 α or β2+ z. 12 α or β2+ 1522.8247
y11β1+ 1486.8013
c13 α or β2+
1111.2754 z .11α1+ 1487.3103
1123.5637
c7α2+ c8β2+ 1486.3062
1521.8281 1523.3306
c 2+ 1487.8062
c5α2+ c6α2+ 1232.1807
c7β2+ c8α2+ 2+ 11 α or 1472.2974
β
c9α2+ c10β
1232.6775
1167.6545 1231.6750
1245.1807 1305.7097 1523.8225 c14 α or β2+
1167.1511 1168.1584
c5β2+ c6β2+
1180.6548
1245.6787 1306.2161
1305.2144 1306.7122
c10α2+ 1443.2764 1471.7986 1507.8196 1586.3674
1564.3633 1586.8706
1181.1616 1246.1770
0 m/z
1100 1125 1150 1175 1200 1225 1250 1275 1300 1325 1350 1375 1400 1425 1450 1475 1500 1525 1550 1575 1600
Figura 49. Espectro atribuído de ECD para a espécie P6 DSS P7: de m/z 150 a 660 (A), 670 a
790 (B) e 1000 a 1610 (C).
A cobertura obtida, de praticamente 100%, para o precursor com cinco

cargas, baseada em íons c e z. da espécie formada entre P6 e P7, com os três
ALC: DSG (linha tracejada), DSS (linha preta) e DSSeb (linha cinza) está
ilustrada na Figura 50 e, assim como em IRMPD e CID, a identidade dos ALCs
utilizados neste estudo não influência na dissociação de espécies
intermoleculares. Cabe salientar que os ALCs possuem estruturas semelhantes,
diferenciando se apenas pelo tamanho da cadeia alifática.
c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12 c13

α chain
ARAKGAEFAVYAGVR
DSS
z14 z13 z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12 c13 c14 XL = DSSeb
DSG
ARAKGAEFAVHAGVR
β chain
z14 z13 z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
Figura 50. Cobertura obtida para o precursor com cinco cargas, da espécie formada entre P6 e
P7, com os três ALC: DSG (linha tracejada), DSS (linha preta) e DSSeb (linha cinza).
96
Assim como no caso de IRMPD, como pode ser verificado nos espectros
atribuídos e as respectivas coberturas obtidas presentes na Figura 51 para as
espécies P6 DSS P7 (A), P6 DSS P8 (B) e P7 DSS P8 (C), o fato do N terminal
aparecer bloqueado ou não, não influencia na dissociação dessas espécies.
À® 0.00000000
P6P8 ECD 698 1 (0.100) Scan ES+
930.8370 c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12 1.03e5
100
[M+4H]3+. (A)
931.1730
A K G A E F A V Y A G V R α chain
z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
XL = DSS
c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12
[M+4H]3+. 17 A K G A E F A V H A G V R β chain
z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
925.1622
c9β2+ c12α2+
1316.7036
1203.1418
1317.2078
%
z. 8α
1+ 931.5039 1203.6418
c5β2+ c6β2+
c4β2+ 976.0289 z. 11α
1+
1387.7410
c2β2+ c 2+
c10β2+
1317.7124
847.4749 3β z.10α1+
1202.6423 1204.1509
. 2+
1316.2104 z 12α
1388.7449
z.7α1+ 847.9797 z.12α3+ 976.5311
c11α2+
719.3975 834.4755 1036.5620 1097.5632 1121.6157
1267.1777 1396.2607
833.9740 z.9α 1+ 1037.0635 1122.1113 1318.2068
1397.7739
720.3987 812.4662
0 m/z
700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400
À® 0.00000000
P6P10 ECD 685 1 (0.100) Scan ES+
1178.1257 3.96e3
100
c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12 c9α2+ (B)
A K G A E F A V Y A G V R α chain
c12α2+
1291.6934
z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
XL = DSS
c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12
z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
[M+4H]3+. 17
1177.6299
[M+4H]3+.
c3α2+ 2+
%
c4α c5β2+ c6β2+ 1291.1885 z.12α2+

976.0289
790.4323 z.10α1+ 1292.19901362.7266
908.1511
908.8209
2+ z.9α1+ c8β2+ 1178.6304
c5α
835.3326
z.8α1+ c8α2+
z.7α1+
913.8257
c6α2+ c 2+
719.3944
866.4651
937.5125 1096.6011 2+ 11α
c10α1242.1533 1362.2319 1363.2329
c2α 2+
1011.5477 1096.0989
2+
c7α . z 11α 1+
737.4025 1341.2183
1373.7700
0 m/z
700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400

97
À® 0.00000000
P8P10 ECD 679 1 (0.100) Scan ES+
100
905.4965 c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12 (C)5.09e4
[M+4H]3+.
A K G A E F A V H A G V R α chain
z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
905.8293 XL = DSS
905.1589 c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12
[M+4H]3+. 17 z12 z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
z.9β1+ 2+
c9α
1165.1316 c12β2+
1278.6890
%
c3α2+ c5β2+
899.4833 c6β2+ c7α2+ 1279.1941
963.0266
c6α 2+
c2α 2+ c4α2+ c5α2+ 1164.6301 1278.1941
1165.6333
z.8β1+ 808.9592
938.0131 z.9α1+ z.11α1+c8β2+ c11 β2+ 1349.7263
790.4323 809.4629 z.10α1+ c10α2+ 1350.2341

963.5267 c8α2+ 1349.2300
712.4011
876.1387 1097.5632 1166.1355
1036.5620 1350.7312
712.9025
1037.0635
1098.5637 z.12α1+ 1357.7397
713.4015
1359.2488 1474.7546
0 m/z
700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450
Figura 51. Espectros atribuídos e as respectivas coberturas para as espécies P6 DSS P7 (A),
P6 DSS P8 (B) e P7 DSS P8 (C) com N terminal livre.
Diferente de IRMPD, o estado de carga mostrou grande influência na

dissociação por ECD. Este fato é verificado em todas as espécies e esta
ilustrado nos espectros (Figura 52) e nas coberturas (Figura 53) obtida para a
espécie P8 DSSeb P10 com três (A, m/z 892,5; traços cinza) e quatro (B, m/z
669,6; traços pretos) cargas. Como mostrado nos espectros, o estado de carga
+4 apresentou um número muito maior de fragmentos, que aparecem
normalmente com duas e três cargas, enquanto que para o precursor com três
cargas gerou um número inferior de fragmentos, quase sempre
monocarregados. Assim como no caso do precursor com cinco cargas, a
cobertura obtida para a espécie com quatro cargas foi de praticamente 100%
enquanto que com três cargas uma cobertura muito inferior foi observada,
especialmente para a série de íons z.3β a z.6β e de c8α to c14α.
98
€® 0.00000000
P10 P13 DSSEB ECD 892 1 (0.100) TOF MSMS 0.00ES+
100
x6 x4 6.80e4
[M+3H]3+ (A)
1339.2620
c2 α or β1+ [M+3H]2+.
287.1822 893.1787
892.5076
1338.7625
1339.7620
z.8α1+
791.4414
[M+3H]2+. Ac
%
z .5α1+ c6β1+ 1274.2305
893.9960
c 3 α or β1+ z.4 α1+ 1273.7290

c7α1+
387.2350 c5β1+ 790.4336 1340.2729
594.3472 665.3854
c6α1+1887.0852
1787.9949
c4β1+ 778.4670 792.4442 z.11α1+ 1888.0994
495.2786 1048.5442 1259.7158

c4α1+ 1886.0935
1629.9985
474.2662 1047.5332 1340.7737
891.4475 1628.9854 1630.9968 1889.0930
244.1765 666.3871 1049.5439 1259.2163
593.3391 920.4857 1531.8386 1758.0481 1901.0779
890.9905
0 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
€® 0.00000000
P10 P13 DSSEB ECD 669 1 (0.100) TOF MSMS 0.00ES+
x10 x6 9.79e4
100
[M+4H]4+
3+. (B)
[M+4H]
893.1786
670.1329
893.5121
c2 α or β1+ 669.6329 892.8453
287.1822
[M+4H]3+. Ac
944.5503
z. 1+
%
4α
c3 α or β1+ 670.3860
873.4980
z.13 α2+
358.2195 z.8α1+
z.1 α1+ 790.4336 945.0531 c11α2+ c14α2+
159.1000
1+ c5β
1+ z.13α3+ 1146.6521
1309.7388
z.13 α2+
z.3α z.7α1+ c8α2+
z.5α 1+643.3655 1146.1506
1310.7473
c4β 670.6365
1018.0858 c 4α1+ c 5α1+c 6α1+c 7α1+
495.2786 1339.7727
1042.5920
258.1685
60.0555
1474.6382
63.4768 550.3330
0 m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
Figura 52. Espectros anotados de ECD da espécie P8 DSSeb P10 com três (A, m/z 892,5) e
quatro (B, m/z 669,6) cargas.

c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10 c11 c12 c13 c14
Ac A R A K G A E F A V S A G V R α chain
z14 z13 z z11 z10 z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2 z1
12
c2 c 3 c4 c5 c6 c7 c8 XL = DSSeb
[M+4H]4+
Ac A R A H V A L K A β chain [M+3H]3+
z8 z7 z6 z5 z4 z3 z2

Figura 53. Cobertura obtida para P8 DSSeb P10 com três (traços cinza) e quarto cargas (traços
pretos).
99
De modo geral tanto IRMPD quanto ECD apresentaram uma ótima
cobertura das sequências das espécies intermoleculares estudadas quando
comparado com CID, dando destaque para ECD de precursores com estado de
carga +4 ou maior sendo, nesses casos, capaz de gerar fragmentos referentes a
praticamente todos os possíveis íons c e z.. Ambas as técnicas de dissociação
mostraram se robustas, de modo que as coberturas obtidas foram praticamente
as mesmas, independente se o N terminal apresenta se bloqueado ou não, ou
ainda quando utilizando diferentes ALCs. Como anteriormente mencionado, não
foi observado fragmentação paralela nas cadeias, e íons referentes às cadeias α
e β mostraram se presente em ambos as técnicas.
ECD apresentou se mais sensível aos diferentes estados de carga, de
modo que íons precursores triplamente carregados não forneceram cobertura de
sequência tão boa quanto os estados de carga mais elevados. Cabe salientar
que em estudos proteômicos convencionais, que utilizam tripsina como enzima,
cada peptídeo gerado deve apresentar dois sítios básicos de protonação: o N
terminal e o C terminal (lisina ou arginina), fornecendo peptídeos com estados
de carga 2+ ou 3+; por outro lado, em estudos de ligação cruzada de proteínas,
as espécies intermoleculares devem apresentar quatro sítios de protonação:
dois N terminais e dois C terminais, o que deve acarretar em íons precursores
com maior estado de carga (4+ ou maior). Desse modo o uso das técnicas de
fragmentação ECD ou ETD deve facilitar a identificação de espécies
intermoleculares, as de maior interesse em experimentos de ligação cruzada de
proteínas, trazendo uma grande vantagem para esse campo de estudo. Embora
os estudos realizados neste trabalho fizeram uso de ECD, a técnica de ETD
deve apresentar as mesmas características observadas aqui, trazendo como
vantagem o uso de uma tecnologia presente em instrumentos mais acessíveis
do que FT ICR.
O estudo referente à fragmentação de espécies intermoleculares por
IRMPD e ECD foi recentemente aceito para publicação no periódico Journal of
Mass Spectrometry143.
100
4.4. Estudo de Mobilidade Iônica de Peptídeos Modificados
por ALC

4.4.1. Separação de Espécies Isoméricas do Tipo Dead end
Os experimentos de separação de isômeros de espécies do tipo dead

end foram conduzidos no instrumento Synapt HDMS, utilizando ESI como fonte
de ionização. Como relatado previamente, trata se de um instrumento do tipo Q
Tof modificado, com uma cela capaz de realizar separação por mobilidade iônica
entre os analisados quadrupolo e Tof, conforme ilustrado na Figura 54.
Transferência
IMS (Ar)
(N2) TOF
Aprisionamento
(Ar)
Quadrupolo
Fonte (ESI)
TOF
Quadrupolo
Figura 54. Esquema do instrumento Synapt HDMS utilizado nos experimentos de separação por
mobilidade iônica de isômeros do tipo dead end. Na ampliação é mostrada a cela de mobilidade
(IMS), localizada entre o quadrupolo e o Tof. Logo após o quadrupolo temos a cela responsável
pelo aprisionamento, seguida pela cela de IMS e posteriormente a cela de transferência. Tanto a
cela de aprisionamento quanto a cela de transferência possibilitam a fragmentação de íons
(ambas são preenchidas com Ar, enquanto que a cela de IMS é preenchida com N2).
101
Para realização dos experimentos de mobilidade iônica de isômeros do
tipo dead end os produtos de reação dos peptídeos Ac RKRVWSEKGNMAR
(P1), Ac ARYTKDLSQRAFKGMR (P4), Ac ARAKGAEFAVKAGVR (P11) e
AGAKGAERLVKAGVR (PX) após a reação com DSS foram infundidos
diretamente no instrumento Synapt HDMS. Com exceção de PX, todos os
demais peptídeos apresentam o N terminal acetilado e duas lisinas em sua
sequência, de modo que a reação com o peptídeo deve ocorrer em um desses
dois resíduos, gerando então os dois isômeros. No caso de PX, além das duas
lisinas, temos o N terminal como sítio reativo, e três isômeros são esperados.
Para cada uma das amostras o quadrupolo foi utilizado para seleção das m/z
referentes às espécies dead end triplamente carregadas de cada peptídeo, a
separação ocorreu na cela de mobilidade (IMS) e a energia de colisão da cela
de transferência foi gradualmente aumentada até obter uma fragmentação
satisfatória dos precursores de interesse. Essa metodologia permite realizar a
separação de espécies isoméricas (de mesma m/z) na cela de IMS, seguida por
posterior fragmentação na cela de transferência, fazendo com que os
fragmentos de cada isômero apresentem o mesmo tempo de chegada (ATD –
arrival time distribution) de seus respectivos precursores (que foram previamente
separados).
Para distinguir entre os diferentes isômeros, após a aquisição com
fragmentação na cela de transferência, um espectro de íons produtos obtido
após o acumulo do ATD total foi gerado; a corrente iônica de íons fragmentos
referentes aos íons contendo ou não a modificação por DSS, ou seja do tipo
yn/yn+156 (156 Da refere se à modificação proporcionada pelo DSS hidrolisado),
foram traçados e o ATD separado de cada um destes fragmentos (yn ou yn+156)
representam os isômeros com modificação na primeira lisina (yn) ou na segunda
lisina (yn+156). Se a modificação ocorreu na primeira lisina, devemos ter uma
série inicial de íons y que não contém a modificação e, por outro lado, quando a
modificação ocorre na segunda lisina, os íons y iniciais, que contém a última
lisina em sua estrutura devem aparecer modificados por + 156 Da. Desse modo,
quando ocorre separação por IMS, mesmo quando não é possível observar uma
102
clara separação entre os diferentes isômeros, quando acumulamos as
extremidades do ATD total obtemos dois espectros de íons produtos distintos,
um de cada isômero.
Para ilustrar o procedimento empregado temos na Figura 55 o estudo
referente ao peptídeo P11. Na Figura 55A temos o ATD total, onde é possível
verificar a presença de dois picos não resolvidos na linha base. Quando
acumulamos as extremidades deste ATD, regiões 1 e 2 da Figura 55A, temos os
espectros de íons produtos presentes em C e D, respectivamente. Analisando
estes espectros é possível verificar que estes são provenientes de espécies
diferentes e, como pode ser visto pelas atribuições realizadas para cada um
deles, o espectro presente na Figura 55C (região 1) refere se ao isômero com
modificação na segunda lisina, enquanto que na Figura 55D (referente a região
2), temos o espectro do isômero com modificação na primeira lisina. De acordo
com as sequências dos isômeros, ambos apresentam até o íon y4 fragmentos de
mesma m/z; no entanto, a partir do íon y5 (quando séria de íons y atinge a
primeira lisina) o isômero com modificação na última lisina (região 1) apresentou
a m/z referente a este fragmento acrescido de 156 Da (íons contendo a
modificação estão anotados com um *). Para esta espécie, o mesmo
descolamento de massa está presente na série de íons y5 até y8 (ilustrados
neste espectro como y5*, y6*, y7* e y8*). Já quando temos o espectro referente à
modificação na primeira lisina (Figura 55D) vemos a série de íons y5 até y9 sem
o deslocamento de massa referente à modificação causada por DSS, indicando
que a reação com DSS ocorreu na primeira lisina. Quando extraímos os ATDs
dos íons y5, de m/z 530,3; e y5*, de m/z 686,4 (Figura 55B), verificamos
claramente a presença dos dois isômeros.
103
Figura 55. Distribuição por tempo de chegada (ATD) e espectros de íons produtos dos isômeros
dead end do peptídeo P11. (A) ATD total, em cinza temos as regiões acumuladas para fornecer
os espectros de íons produtos presentes (C) e (D). Em (B) temos os ATDs extraídos dos íons
fragmentos y5 (não modificados, reação com DSS ocorreu na primeira lisina) e y5* (modificado,
indicando que a reação ocorreu na segunda lisina). Em (C) temos o espectro de íons produtos
anotado do isômero onde a modificação ocorreu na segunda lisina; e em (D) o espectro de íons
produtos anotado do isômero onde a modificação ocorreu na primeira lisina.
O procedimento de traçar a corrente iônica de íons fragmentos

específicos para cada isômero permitiu a separação da mistura isomérica
mesmo quando o ATD total apresenta um único pico largo. Por exemplo, no
caso de P1 (Figura 56A) o ATD total apresenta um único pico, mas, quando
acumulamos as extremidades (regiões 1 e 2), os espectros de fragmentação
obtidos (Figura 56C e D, respectivamente) nos mostram a presença dos dois
isômeros e, quando traçamos a corrente iônica de fragmentos específicos para
cada isômero, obtemos dois picos, com ATDs diferentes, referentes a cada um
destes isômeros (Figura 56B): a espécie com modificação na primeira lisina
apresenta uma mobilidade maior, identificada pela corrente iônica do íon
fragmento y6, específico para este isômero, de m/z 676,3; já a espécie com
104
modificação na segunda lisina apresentou um maior mobilidade, identificada,
pelo íon y6*, m/z 832,4.
dead end do peptídeo P1. (A) ATD total, em cinza temos as regiões acumuladas para fornecer
fragmentos y6 (não modificados, reação com DSS ocorreu na primeira lisina) e y6* (modificado,
indicando que a reação ocorreu na segunda lisina). Em (C) temos o espectro de íons produtos
anotado do isômero onde a modificação ocorreu na segunda lisina; e em (D) o espectro de íons
produtos anotado do isômero onde a modificação ocorreu na primeira lisina.
O mesmo comportamento observado para P1 foi verificado para P4, ou

seja, mesmo apresentando apenas um único pico, após traçar a corrente iônica
de íons fragmentos específicos para cada isômero foi possível verificar a
separação da mistura. O menor grau de separação entre os isômeros de P1 e
P4 podem ser explicados pois, para ambos os peptídeos, os isômeros de dead
end devem assumir estrutura terciárias com seções de choque próximas, o que
impossibilita uma separação tão boa quanto a observada para P11. No entanto,
uma vez que sabemos quais íons fragmentos são característicos de cada
105
isômero podemos traçar as correntes iônicas desses fragmentos, e obter os
ATDs referentes a cada isômero. O último peptídeo estudado, PX, apresentou o
maior desafio, pois, após a reação com DSS, temos três isômeros: um que
reagiu no N terminal e outros dois que reagiram em cada uma das lisinas. A
Figura 57A apresenta o ATD total deste peptídeo e, como pode ser visto, um
único pico está presente. O acúmulo da região 1 gera o espectro de íons
fragmentos ilustrado em Figura 57C e o íon y5* (m/z 686,4; que contém a
modificação) indica o isômero onde a modificação ocorreu na última lisina. Já
quando acumulamos a região 2 verificamos íons dos dois isômeros restantes, de
modo que distinguir a separação entre os isômeros que reagiram no N terminal
ou na primeira lisina (Figura 57D), isso indica que esses dois isômeros
apresentam conformações muito semelhantes, enquanto o isômero em que o
DSS reagiu na última lisina deve assumir uma conformação com seção de
choque diferente dos outros dois (Figura 57B).
Uma vez que a análise por mobilidade é capaz de revelar qual lisina está
modificada pelo DSS, estes experimentos foram aplicados no estudo da
reatividade intrínseca de lisinas: a reação de ligação cruzada entre os peptídeos
e o ALC foi realizada em três diferentes pHs, para avaliar se o pH influência na
reatividade das diferentes lisinas. Até o momento as análises foram realizadas
para os isômeros obtidos após a reação com pH 7,0; além destes, outros dois
pHs foram avaliados: pHs 6,0 e 8,0. Como exemplo representativo temos os
dados de mobilidade do peptídeo P1 ilustrado na Figura 58. Nesta figura temos
os ATDs referentes às correntes iônicas dos íons y6, proveniente do isômero
onde a modificação ocorreu na primeira lisina e y6*, onde a modificação ocorreu
na segunda lisina, nas três condições (três diferentes pHs). Com base nos ATDs
destes dois íons, quando mantemos fixa a intensidade do íon y6, verificamos que
há uma diminuição, em relação a ela, do íon y6* conforme há um aumento do
pH. O mesmo estudo foi realizado para os demais peptídeos e diferentes
resultados foram obtidos para cada um deles, ou seja, o pH influência sim a
reatividade de cada lisina, para cada peptídeo mas, em cada um deles, o
aumento ou diminuição do pH altera de modo particular a reatividade das lisinas.
106
Foi verificado que a reatividade das lisinas é dependente da sequência dos
peptídeos analisados, de modo que não foi possível generalizar a influência do
pH na reatividade de lisinas frente ao DSS localizadas em diferentes posições
na sequência peptídica.
dead end do peptídeo PX. (A) ATD total, em cinza temos as regiões acumuladas para fornecer
fragmentos y5 (não modificados, reação com DSS ocorreu no N terminal ou na primeira lisina) e
y5* (modificado, indicando que a reação ocorreu na segunda lisina). Em (C) temos o espectro de
íons produtos anotado do isômero onde a modificação ocorreu na segunda lisina; e em (D) o
espectro de íons produtos anotado dos isômeros onde a modificação ocorreu no N terminal ou
na primeira lisina, de modo que não foi possível observar separação entre esse dois isômeros.
107
Figura 58. ATDs referentes às correntes iônicas dos íons y6, proveniente do isômero onde a
modificação ocorreu na primeira lisina e y6*, onde a modificação ocorreu na segunda lisina, nas
três condições (três diferentes pHs). Com base nos ATDs destes dois íons, quando mantemos
fixa a intensidade do íon y6, verificamos que há uma diminuição, em relação a ela, do íon y6*
conforme há um aumento do pH.
O trabalho referente ao estudo de mobilidade iônica de espécies do tipo

dead end presente em experimentos de ligação cruzada de proteínas foi
publicado no periódico Journal of the American Society for Mass
Spectrometry144.
4.4.2. Uso de Mobilidade Iônica para Separação Entre Peptídeos

Modificados por ALCs e Peptídeos Lineares

Como relatado na introdução, esta parte do trabalho foi realizada na

Universidade de Edimburgo, Escócia, sob orientação dos profs. Juri Rappsilber,
que possuí ampla experiência na área de ligação cruzada de proteínas e
espectrometria de massas e Perdita Barran, que têm a espectrometria de
mobilidade iônica como foco principal de seu grupo de pesquisa.
108
O foco principal foi verificar a possibilidade de separação entre peptídeos
modificados por ALCs e peptídeos lineares, através do uso de mobilidade iônica.
A primeira parte desta etapa foi realizada com dois peptídeos modelos, de modo
que as diferentes espécies modificadas por ALC fossem obtidas, utilizando um
instrumento construído pelo grupo de pesquisa da Profa. Barran, dotado de uma
cela de mobilidade convencional (similar a presente na Figura 10) antes do
quadrupolo de um instrumento do tipo Q Tof. Uma descrição detalhada deste
equipamento é feita na referência 123. Posteriormente, realizamos experimentos
envolvendo misturas mais complexas, composta por diversos peptídeos
modificados e não modificados; esta última etapa foi realizada pela empresa
Waters Co., em Manchester, Inglaterra, devido a colaboração entre esse grupo e
o laboratório da Profa. Perdita Barran.
Tendo como base os peptídeos LR16 e TR20 as espécies lineares, dead
end (mono e dihidrolisadas), intramolecular e intermolecular (apenas para LR16)
foram obtidas e analisadas por IMMS. A Figura representa a abordagem
utilizada para obtenção das espécies de interesse (o ALC BS3 possuí a mesma
cadeia espaçadora do DSS).
109
Fmoc xxxKxxxRxxxxKxxxxR
Reação com BS3
Desproteção do grupo Fmoc
(LR16 e TR20)
OH OH OH OH
xxxKxxxXxxxKxxxxR xxxKxxxXxxxxKxxxxR xxxKxxxXxxxxKxxxxR
monohidrolisado monohidrolisado dihidrolisado
xxxKxxxRxxxxKxxxxR xxxKxxxxxxxxKxxxxR
linear intramolecular
Digestão enzimática
Com tripsina (apenas LR16)
xxxKxxxR
xxxKxxxxR
intermolecular
Figura 59. Obtenção de espécies modificadas e lineares para os peptídeos LR16 e TR20. O
ALC BS3 possuí a mesma cadeia espaçadora do DSS.
A seção de choque de cada espécie, para todos os estados de carga

observados, foi calculada com base na equação de mobilidade utilizando os
parâmetros experimentais empregados (temperatura em 300 K) e He como gás
(pressão em 3,2 torr).
qπm M

NkbTmMK
K = d_
td E
Todos os estados de carga observados para as espécies de ambos os

peptídeos foram levadas em consideração. Para o peptídeo TR20, observamos
110
todas as espécies com duas e três cargas: linear (m/z 1077 e 719, com duas e
três cargas); monohidrolisado (m/z 1155 e 770, com duas e três cargas);
dihidrolisado (m/z 1233 e 823, com duas e três cargas) e intramolecular (m/z
1146 e 764, com duas e três cargas). Para o peptídeo LR16 todas as espécies
foram observadas com duas, três e quatro cargas: linear (m/z 928, 619 e 464,
com duas, três e quatro cargas); monohidrolisado (m/z 1007, 671 e 504, com
duas, três e quatro cargas), dihidrolisado (m/z 1085, 724 e 543, com duas, três e
quatro cargas), intramolecular (m/z 998, 666 e 499, com duas, três e quatro
cargas) e intermolecular (m/z 1007, 671 e 504, com duas, três e quatro cargas).
Para todas as espécies, foram realizados experimentos em triplicata. Os
resultados das seções de choque (CCS) obtidos para todas as espécies geradas
a partir do peptídeo TR20 estão na Tabela 2 e para o peptídeo LR16 na Tabela
3, em Å2.
2
Tabela 2. Seção de choque para as espécies modificadas por BS3 do peptídeo TR20 (em Å ).
Linear Monohidrol. Dihidrol. Intra
Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio
2 408 9,5 429 4,6 432 9,0 449 3,0

3 479 8,7 453 15,4 511 9,7 509 4,9
2
Tabela 3. Seção de choque para as espécies modificadas por BS3 do peptídeo LR16 (em Å ).
Linear Monohidrol. Dihidrol. Intra Inter
Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio Média Desvio
2 392 16,2 406 1,5 412 1 419 7 419 1

3 396 8,2 409 17,9 415 12,1 452 17,3 397 6,4
4 461 4,4 457 1,5 483 0,6 491 10,7 495 5,5
Com base nos dados das tabelas 1 e 2 foram construídos os gráficos da

Figura 59A e B, respectivamente.
111
Linear
520
Intra
Hydrolyzed
500 Hydrolyzed (2x)
CCS 480
460
440
420
400
2 3
Charge State

600 Linear
Intra
Hydrolyzed (1x)
550 Hydrolyzed (2x)
Inter
500
450
CCS
400
350
300
2 3 4
C harge State
Figura 60. Gráficos de seções de choque (CCS) obtidas para cada um dos estados de carga das
espécies provenientes dos peptídeos TR20 (A) e LR16 (B). As espécies estão atribuídas por
diferentes cores em cada gráfico.
Com base nos dados mostrados nas tabelas e gráficos acima, para os
peptídeos TR20 e LR16, diferentes espécies, com mesmo estado de carga,
apresentam seções de choque semelhantes. Desse modo, para um mesmo
estado de carga, e ao contrário do que se esperava, parece não ser possível
separar, com base nas seções de choque, as diferentes espécies modificadas
112
po ALC de peptídeos lineares. No entanto, analisando os dados obtidos e a
equação de mobilidade, o estado de carga influencia a seção de choque. Desse
modo, podemos utilizar o estado de carga para diferenciar peptídeos contendo
ALC, em especial as espécies intermoleculares, de peptídeos lineares. Devemos
lembrar agora que as espécies intermoleculares devem apresentar pelo menos
quatro sítios básicos: dois N terminais e dois resíduos básicos no C terminal
(quando utilizado tripsina como enzima); já peptídeos lineares convencionais,
devem apresentam apenas dois sítios básicos (um N terminal e um C terminal).
Vale salientar aqui que as espécies lineares analisadas para esses peptídeos
não se tratam de peptídeos convencionais, comumente encontrados em
experimentos de ligação cruzada, uma vez que possuem sítios de clivagem na
sequência (deveriam ter sido clivados pela tripsina). Além disso, as espécies
intermoleculares são as de maior interesse em experimentos de ligação cruzada,
uma vez que fornecem informação estrutural de peptídeos que podem estar
distantes na sequência primaria de uma proteína, mas próximos na estrutura
terciária ou ainda, podem ser provenientes de duas proteínas diferentes.
Como relatado anteriormente e verificado também nas analises por LC
IMMS, realizadas no instrumento Synapt G2, acoplado à cromatografia líquida
de ultra pressão (UPLC), espécies intermoleculares, oriundas de experimentos
de ligação cruzada possuem seção de choque similar a espécies lineares (para
uma m/z similar e mesmo estado de carga). Desse modo, passamos a utilizar o
estado de carga com intuito de enriquecer espécies intermoleculares, que são as
de maior interesse em experimentos de ligação cruzada, em amostras
complexas. Essa abordagem deve ser de extrema importância em experimentos
de ligação cruzada envolvendo proteínas, em especial quando temos complexos
protéicos e misturas muito complexas.
Para os experimentos de LC IMMS três amostras foram consideradas:
digesto tríptico de E. coli (chamada de Ecoli), amostra contendo o produto da
reação entre 20 peptídeos, gerando mais de 200 espécies intermoleculares
(amostra denominada XL) e, finalmente, a mistura na proporção molar de 5:1 de
E.coli com a amostra XL (denominado Ecoli:XL). Esta ultima amostra tem como
113
objetivo simular experimentos reais de ligação cruzada de proteínas; trata se de
uma amostra extremamente complexa e as espécies intermoleculares estão em
quantidade muito inferior à maioria dos peptídeos de E.coli.
É importante salientar que em um experimento do tipo LC IMMS temos
como resultado um gráfico em quatro dimensões: m/z (proveniente do MS),
mobilidade (proveniente do IM), tempo de retenção (proveniente do LC) e
intensidade. Para facilitar a visualização dos dados gerados, representamos na
Figura 60 apenas a mobilidade iônica VS. m/z das amostras XL (A), Ecoli (B) e
Ecoli:XL (C). A coloração verde, amarela e vermelha representa a escala de
intensidades dos íons (vermelho mais intenso verde, menos).
4665_004.raw : 1
m/z (A)
mobilidade
114
4665_014.raw : 1
m/z 3+ ou mais 2+ (B)
1+
mobilidade

4665_014.raw : 1
m/z (C)
mobilidade

Figura 60. Gráficos de mobilidade iônica VS. m/z das amostras XL, rica em espécies
intermoleculares (A), Ecoli, digesto tríptico de um extrato de E. coli (B) e a mistura Ecoli:XL (C).
Para a amostra Ecoli foram adicionados manualmente linhas para ilustrar a presença de nuvens
referentes a espécies monocarregadas (1+), dicarregadas (2+) e com três ou mais cargas (3+ ou
mais).
115
Analisando os gráficos da Figura 60 notamos a presença de, pelo menos,
três nuvens muito bem definidas (linhas manualmente inseridas na Figura 60B,
para ilustração). Quando extraímos os espectros de massas de cada uma
dessas nuvens verificamos que, em cada uma delas, íons com estados de carga
específicos estão presentes. Como já relatado brevemente, o estado de carga
influência na mobilidade dos íons e, íons com m/z similares, mas em diferentes
estados de carga, possuem mobilidades diferentes. Esse fato é facilmente
verificado nos gráficos da Figura 60, onde íons com mesmo estados de carga
agrupam se em nuvens. Devemos lembrar agora que, em experimentos de
ligação cruzada, temos uma grande maioria de peptídeos lineares que, caso
tripsina tenha sido utilizada como enzima para digestão, devem possuir dois
sítios de carga; já as espécies intermoleculares, devem possuir quatro. Desse
modo, podemos utilizar o estado de carga dos íons para enriquecer o número de
peptídeos intermoleculares presentes em amostras provenientes de
experimentos de ligação cruzada de proteínas; o instrumento Synapt G2 permite
que apenas íons presentes em determinada nuvem sejam selecionados para
análises de fragmentação e todos os demais íons não são enxergados pelo
instrumento. Desse modo, para a amostra Ecoli:XL podemos fazer com que o
instrumento leve em consideração para análise apenas íons em maiores estados
de carga (representada por linhas pontilhadas na Figura 60C). Isso faz com que
haja uma redução do número de íons em, aproximadamente, 60%, aumentando
muito a chance de que espécies intermoleculares sejam selecionadas para
experimentos de fragmentação e posterior identificação dessas espécies. Em
outras palavras, o uso da mobilidade iônica funciona como um enriquecimento
de espécies mais carregadas por cromatografia de troca iônica, com a grande
vantagem de que essa separação ocorre dentro do espectrômetro de massas,
diminuindo o manuseio e perda de amostra.
É importante salientar que esses resultados foram obtidos em um
instrumento comercial e, diferente da maioria dos estudos de mobilidade, onde
instrumentos home made são empregados, outras pessoas poderão reproduzir e
empregar os fatos aqui verificados.
116
Em relação ao uso de mobilidade iônica em experimentos de ligação
cruzada de proteínas duas conclusões foram obtidas:
1. Peptídeos modificados por ALC e peptídeos lineares, com m/z
similares e mesmo estados de carga possuem mobilidade iônica (seção de
choque) similares, e não podem ser separados.
2. No entanto, com o uso do Synapt G2 e experimentos de LC IMMS
podemos utilizar o estado de carga para enriquecer amostras provenientes de
experimentos de ligação cruzada. Devemos lembrar que espécies
intermoleculares, as de maior interesse, possuem um mínimo de quatro sítios de
protonação e devem aparecer em elevados estados de carga.
Os resultados obtidos neste estágio no exterior foram apresentados no
congresso “Analytical Research Fórum 2010”, da Sociedade Real de Química,
que ocorreu na Universidade de Loughborough, em Loughborough, Reino Unido,
no período de 26 a 28 de julho de 2010 com o título de “Ion mobility mass
spectrometry of crosslinked peptides”. Além disso, um manuscrito referente ao
trabalho está sendo redigido em conjunto com os professores Rappsilber e
Barran.
117
5. CONCLUSÕES
Os estudos detalhados de fragmentação de peptídeos contendo agentes

do ligação cruzada (ALC), tanto das espécies intra quanto intermoleculares,
utilizando dissociação induzida por colisão (CID), dissociação multifotônica por
infravermelho (IRMPD) ou dissociação por captura de elétrons (ECD),
permitiram o estabelecimento de um padrão de fragmentação que auxiliou na
interpretação de seus espectros de fragmentação. O conhecimento adquirido
permite posterior aplicação deste padrão de dissociação em sistemas reais,
envolvendo proteínas e complexos protéicos.
Experimentos de varredura de íon precursor (PIS), tendo como alvo os
íons diagnósticos observados nesse estudo, permitiem uma identificação
sensível e seletiva de espécies modificadas por ALCs. Esse procedimento
passou a ser empregado de modo rotineiro em análises provenientes de
experimentos de ligação cruzada realizados em nosso laboratório, o que
demonstra a grande importância deste estudo.
As técnicas modernas de dissociação, como IRMPD e ECD, apresentam
grandes vantagens para o estudo de espécies de alta massa e múltiplas cargas,
dois fatores presentes em espécies intermoleculares que, de modo geral, são as
que geram maior número de informação em experimentos de ligação cruzada.
Experimentos de mobilidade iônica permitiram a obtenção de informações
adicionais sobre a estrutura dos peptídeos e, em casos pontuais, foi capaz de
separar isômeros.
Embora peptídeos modificados por ALC e peptídeos lineares
apresentaram seções de choque próximas, foi possível utilizar o estado de carga
para o enriquecimento de espécies intermoleculares, que aparecem em estados
de carga elevado.
De modo geral, o uso combinado de todas essas técnicas deve trazer
grandes benefícios aos experimentos de ligação cruzada acoplada a
espectrometria de massas.
118
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Cambridge, W. H. Freeman, 2004.
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The Enzymes, 2nd ed., 443–510, Academic Press, New York, 1959.
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477, 2008.
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Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 2062 2069, 2010.
124

Santos LuizFernandoArruda D

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Universidade Estadual de Campinas

Luiz Fernando Arruda Santos

Uso de Espectrometria de Massas e

Orientador: Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo

But I would walk 500 miles

When I'm working, yes I know I'm gonna be

(The Proclaimers I'm Gonna Be (500 Miles))

Dedico este trabalho aos meus pais, Marilda e José Carlos.

Não sei o que faria sem o apoio deles…

Obrigado por tudo.

Ao meu orientador e amigo, Prof. Fábio Cesar Gozzo, pela orientação e

Aos amigos do grupo, Pilau, Alex, Alana e Mariana, pelo companheirismo e

Aos Profs. Juri Rappsilber e Perdita Barran, da Universidade de Edimburgo,

Aos amigos de república, Pablo e Indaia; e do futebol, Almir.

Ao Prof. Marcos Eberlin, por ceder tempo e espaço de laboratório para os

A todos aqueles que de uma forma ou outra contribuíram para a realização

Ao Instituto de Química da UNICAMP e o LNLS, pela infra estrutura

À CAPES, CNPq e FAPESP pelo auxílio financeiro.

03/2005 – 12/2006, Mestrado em Química Orgânica

03/2005 – 12/2006, Licenciatura em Química

03/2001 – 12/2004, Bacharelado em Química

Palavras Chave: Espectrometria de Massas, Ligação cruzada, Fragmentação,

A função de uma proteína está diretamente relacionada com sua estrutura e

Keywords: Mass Spectrometry, Protein Cross linking, Peptide Fragmentation, Ion

ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS............................................................. xix

ACN .................................................................................................... Acetonitrila

Tabela 1. Características de fragmentação observadas para as espécies

Tabela 2. Seção de choque para as espécies modificadas por BS3 do peptídeo

Tabela 3. Seção de choque para as espécies modificadas por BS3 do peptídeo

Figura 1. Estrutura de proteínas: (A) estrutura primária, (B) secundária, (C)

1.2. Caracterização Estrutural de Proteínas por Técnicas

No fim da década de 80, com o desenvolvimento das técnicas de

1.3. Ligação Cruzada e Espectrometria de Massas

O fenômeno de ligação cruzada (cross linking) refere se à união de duas

n Nome Distância (Å)

Em 2000, Young e colaboradores propuseram pela primeira vez a

A união das técnicas de ligação cruzada e MS têm sido extensivamente

Cada uma dessas espécies fornece informações úteis sobre a estrutura

1.4. Análise de Peptídeos por Dissociação Induzida por

Para explicar a fragmentação de peptídeos, Wysocki e colaboradores

Embora experimentos de fragmentação de peptídeos lineares estejam

O método de dissociação multifotônica por infravermelho (infrared

1.6. Dissociação por Captura de Elétrons ECD

Dissociação por captura de elétrons (electron capture dissocation – ECD)

1.7. Espectrometria de Mobilidade Iônica – IMS

A espectrometria de mobilidade iônica (ion mobility spectrometry – IMS)

Entrada de Íons Gás

Região de Entrada Pulsada

Onde q é a carga do íon, N é a densidade do gás, m a massa do gás, M a

Tendo em vista o potencial de separação e de análise estrutural

O objetivo geral deste trabalho consistiu em explorar a fragmentação e

Os objetivos específicos deste projeto são:

Todos os peptídeos utilizados neste estudo foram adquiridos da

3.2. Estudo de fragmentação de peptídeos contendo ALC por

3.2.1. Espécies Intramoleculares

Para o estudo de fragmentação de peptídeos de espécies

3.2.2. Espécies Intermoleculares

Para o estudo de fragmentação de peptídeos de espécies

3.2.3. Reação de Ligação Cruzada

Os peptídeos foram dissolvidos em tampão fosfato de sódio 50 mM pH

3.2.4. Análise de Espécies Intra e Intermoleculares por MS

3.3. Estudo de Varredura de Íon Precursor (PIS) para Auxiliar

3.3.1. Preparação de Amostras