Neste projeto buscou-se inserir pelo sistema Agrobacterium o gene vip3A

(ESTRUCH, J.J., et al., 1996) em Eclipta alba, uma planta medicinal utilizada como
modelo, com o objetivo de produzir um bioinseticida e estabelecer uma metodologia
com melhores índices de transformação para essa espécie vegetal.
A transformação foi mediada por Agrobacterium tumefaciens estirpe GV 310. O
delineamento experimental foi um fatorial 3X3 efetuado da seguinte forma: 0, 45 e 96
horas de exposição dos explantes à bactéria e três pulsos de ultrassom (0, 10 e 15
segundos). Foram avaliados 450 explantes.
A comprovação da transgenia foi realizada por três metodologias distintas:
seleção das plântulas em meio de cultura contendo uma dose letal de 500mg/l de
canamicina, PCR qualitativa e hibridação com sonda biotilada.
Considerando todas as análises realizadas, foram positivos 17 eventos
distribuídos nos diferentes tratamentos.
A melhor frequência de transformação gênica (14%, Tabela 1) foi obtida com a
combinação da exposição dos explantes a um pulso de ultrassom de 10 segundos
seguido de 96 horas de contato com as bactérias, o que é uma frequência
excepcionalmente elevada para esse método de transferência de genes.

Tabela 1 – Frequências de transformação

TEMPO DE
TEMPO DE EXPOSIÇÃO AO
CÓDIGO TOTAL DE CONTATO COM A ULTRASSOM NÚMERO DE % DE
TRATAMENTO EXPLANTES BACTÉRIA (horas) (segundos) TRANSFORMANTES TRANSFORMAÇÃO
T1 50 96 0 0 0
T2 50 96 10 7 14
T3 50 96 15 1 2
X1 50 45 0 4 8
X2 50 45 10 4 8
X3 50 45 15 1 2

Como se pode observar, pela análise dos dados da Tabela 1, as demais

combinações “bactéria+sonicação” não foram tão efetivas quanto ao par “96+10”. Isto
leva a pensar que a transferência de genes vip da célula bacteriana para o genoma
vegetal, obedece a uma harmonização dessas duas variáveis. Existiria um número ideal
de bactérias, associado a um número também ideal de pulsos de ultrassom, que
facilitaria a transferência dos genes. A presença de uma quantidade de bactérias
fisiologicamente equilibrada, de tal forma que as condições ideais de seu micro
ecossistema fossem respeitadas, teria um papel decisivo nesse processo. Por outro lado,
o ultrassom provocaria uma quantidade de fissuras, quebra de paredes celulares,
formação de correntes aquecidas de seiva no floema e no xilema, que facilitaria
grandemente a circulação das bactérias. Ultrapassados esses limites ideais, os tecidos
vegetais e as bactérias, começariam a estressar-se e todo processo perderia eficiência. O
mesmo raciocínio é válido quando algum desses parâmetros ficasse aquém do ideal. É
uma hipótese que merece consideração, e que os nossos dados confirmam.
O DNA dessas plantas foi extraído e utilizado nos experimentos de
amplificação, para confirmação da integração do inserto ao seu genoma.
Após as reações de amplificação uma alíquota de 20µl de cada amostra, foi
analisada em gel de agarose 1%, em tampão TAE 1X (Tris acetato 0,04 M e EDTA 1
mM ) à 100V. Todas as plantas foram avaliadas, e uma parte dos resultados obtidos está
representada na Figura 1, onde é possível verificar, a presença de duas bandas do
tamanho esperado de 2.370 pb e outras duas, de 4.740 pb, nos mesmos clones (T2-39 e
T3-5).

T239 T35 vip λ

4.740 pb

2.370 pb

Figura 1 – Eletroforograma mostrando o resultado da amplificação de algumas amostras de

DNA de E. alba via PCR; T2-39, T3-5: amostras; vip: reação de amplificação do gene vip3A
(controle positivo); λ: padrão de peso molecular DNA lambda Eco-Hind; retângulo pontilhado
em vermelho: evidenciação de possível entrada do gene vip em tandem nos clones identificados;
retângulo pontilhado em amarelo: entrada de uma única cópia do gene vip em outro ponto do
genoma dos clones T2-39 e T3-5; Foram omitidas as amostras onde não houve amplificação.

A metodologia de transgenia utilizada no projeto nunca havia sido testada em E.

alba. Além do que já foi destacado relativamente à ação conjunta
“bactéria+ultrassom”, notou-se que a influência deste, mesmo isoladamente, foi
grande. Levando-se em consideração as porcentagens em conjunto, os grupos que
receberam esses pulsos de alta frequencia (T2, T3, X2 e X3), apresentaram número de
transformantes bem maior (13 clones).
Embora tenha-se identificado relativamente poucos eventos positivos (17 em
161 explantes), o índice de transformação conseguido com o tratamento T2 (14%) foi
muito superior ao comumente observado utilizando-se o sistema Agrobacterium (Tabela
2).

Tabela 2 – Frequências de transformação utilizando A. tumefaciens em diversos cultivares.

CULTIVAR (%)TRANSF. AUTORES REVISTA

Plant Science, Volume 172, Issue 2,

CEVADA 3-7 Shrawat, A. K. et al
February 2007, Pages 281–290

Plant Science, Volume 172, Issue 4, April

FEIJÃO-FRADINHO 1 Chaudhury, D. et al,
2007, Pages 692–700

Plant Science, Volume 136, Issue 1, 7

MENTA 10 Diemer, F. et al.
August 1998, Pages 101–108

Plant Science, Volume 162, Issue 5, 1

BEGÔNIA 0-3 Kishimoto, S. et al.
May 2002, Pages 697–703

Shujie Dong, Rongda Plant Science, Volume 168, Issue 6, June

FESTUCA 8
Qu 2005, Pages 1453–1458

Pesq. agropec. bras. vol.42 no.11

LARANJA VALENCIA 7 Paoli, L. G. et al.
Brasília Nov. 2007

REFERÊNCIAS

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transformation of an Indian cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.) cultivar and
transmission of transgenes into progeny Plant Science, Volume 172, Issue 4, April
2007, Pages 692–700

DONG S., QU R. High efficiency transformation of tall fescue with Agrobacterium

tumefaciens Plant Science, Volume 168, Issue 6, June 2005, Pages 1453–1458

ESTRUCH, J.J., et al. Vip3a, a novel B. thuringiensis vegetative insecticidal protein

with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 93, 5389-5394, 1996.

F. DIEMER, F. JULLIEN, O. FAURE, S. MOJA, M. COLSON, E. MATTHYS-

ROCHON, J.C. CAISSARD High efficiency transformation of peppermint (Mentha ×
piperitaL.) with Agrobacterium tumefaciens Plant Science,Volume 136, Issue 1, 7
August 1998, Pages 101–108
KISHIMOTO S., AIDA R., SHIBATA M. Agrobacteriumtumefaciens-mediated
transformation of Elatior Begonia (Begonia×hiemalis Fotsch) Plant Science, Volume
162, Issue 5, 1 May 2002, Pages 697–703

PAOLI, L. G. et al. Transformação genética de laranja 'Valência' com o gene cecropin

MB39 Pesq. Agropec. Bras. vol.42 no.11 Brasília Nov. 2007

SHRAWAT A. K., BECKER D., LÖRZ H. Agrobacterium tumefaciens-mediated

genetic transformation of barley (Hordeum vulgare L.) Plant Science, Volume 172,
Issue 2, February 2007, Pages 281–290