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Artigo em vídeo

Coleta e identificação de helmintos da vida selvagem

Maria S Sepúlveda1 , John M Kinsella2
1
Departamento de Silvicultura e Recursos Naturais, Universidade de Purdue
2
Laboratório Helm West

Correspondência para: Maria S Sepulveda em mssepulv@purdue.edu

URL: http://www.jove.com/video/51000 DOI:

doi: 10.3791 / 51000

Palavras-chave: Ciências Ambientais, Edição 82, Helmintos, parasitas eucarióticos, vermes, nematódeos, cestóides, trematódeos, acantocéfalos, fauna

Data de publicação: 14/12/2013

Citação: Sepulveda, MS, Kinsella, JM Helminth Collection and Identification from Wildlife. J. Vis. Exp. (82), e51000, doi:10.3791/51000 (2013).

Resumo

Os animais selvagens são comumente parasitados por uma grande variedade de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "vermes redondos" (nematóides),
"vermes espinhosos" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestódios). O método ideal para coletar helmintos é examinar um hospedeiro que esteja morto há
menos de 4-6 horas, pois a maioria dos helmintos ainda estará viva. Uma necropsia completa deve ser realizada e todos os principais órgãos examinados. Os órgãos são
lavados em uma peneira de 106 ÿm em água corrente e o conteúdo examinado sob um microscópio estéreo. Todos os helmintos são contados e um número representativo é
fixado (em etanol a 70%, formalina tamponada a 10% ou álcool-formalina-ácido acético). Para a identificação das espécies, os helmintos são clareados em lactofenol (nematóides
e pequenos acantocéfalos) ou corados (trematódeos, cestóides e grandes acantocéfalos) usando hematoxilina de Harris ou carmim de Semichon. Os helmintos são classificados
em espécies examinando diferentes estruturas (por exemplo , espículas masculinas em nematóides ou o rostelo em cestóides). Os protocolos descritos aqui podem ser aplicados
a qualquer animal vertebrado. Eles exigem alguma experiência em reconhecer os diferentes órgãos e ser capazes de diferenciar helmintos de outros detritos de tecido ou
conteúdo intestinal. Coleta, preservação e coloração são técnicas simples que requerem equipamentos e reagentes mínimos. A identificação taxonômica, especialmente para
espécies, pode ser muito demorada e pode exigir o envio de espécimes a um especialista ou análise de DNA.

Link de vídeo

O componente de vídeo deste artigo pode ser encontrado em http://www.jove.com/video/51000/

Introdução

Os vertebrados são parasitados por quatro grandes grupos de helmintos (vermes). Dois dos grupos, trematódeos, ou vermes, e cestodes, ou tênias, se enquadram no Filo
Platyhelminthes. Os outros dois grupos são os nematóides, ou lombrigas (Nematoda) e os acantocéfalos, ou vermes de cabeça espinhosa (Acanthocephala). Muitos desses
parasitas foram documentados como causas de morbidade e mortalidade em aves e mamíferos selvagens1,2 .

A maioria dos helmintos tem ciclos de vida complexos envolvendo mais de um hospedeiro1,2 . Por exemplo, os trematódeos têm um ou dois hospedeiros intermediários
(geralmente invertebrados) e um hospedeiro final. Todos os hospedeiros precisam estar disponíveis para que o ciclo seja concluído e, portanto, para que os helmintos adultos
estejam presentes nos hospedeiros finais (que são o tema deste manuscrito). Portanto, é importante ter em mente que podem ocorrer flutuações sazonais na prevalência e
intensidade de algumas espécies de helmintos e o monitoramento de longo prazo é desejável para capturar o helminto completo da auna de um determinado hospedeiro.

O método ideal para coletar helmintos é examinar um hospedeiro que foi sacrificado. Isso permite a coleta de helmintos ainda vivos e seu relaxamento e fixação adequados.
O material de hospedeiros que morreram há mais de 24 horas, ou que foram congelados e descongelados para exame, é muitas vezes inferior e difícil de identificar.
Trematódeos e cestóides de hospedeiros congelados ou formalizados são frequentemente mal contraídos e perderam estruturas cruciais para a identificação, como espinhos
orais em trematódeos ou ganchos no escólex de tênias. No entanto, a realidade é que a maior parte do material disponível de hospedeiros vertebrados atualmente está congelado
ou preservado.

Bancos de dados contendo informações de sequências de DNA para helmintos estão crescendo rapidamente e, portanto, a identificação taxonômica já é possível para
muitas espécies. Portanto, os helmintos devem ser preservados o máximo possível para possíveis análises de DNA. No entanto, o DNA de boa qualidade não é possível se as
amostras forem fixadas em formalina. Os métodos descritos aqui para coletar e matar helmintos produzirão material adequado para extração de DNA e análises genéticas.

Abaixo, descrevemos métodos detalhados sobre como necropsiar vertebrados (anfíbios, répteis, aves e mamíferos; trematódeos monogênicos de peixes não estão incluídos)
para a coleta de helmintos, seguidos de procedimentos sobre como preservá-los e processá-los para identificação taxonômica.

Protocolo

Os animais utilizados nas seguintes experiências foram encontrados mortos como atropelamentos.

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1. Necropsia Animal e Triagem dos Principais Órgãos para Coleta de Helmintos

1. Posicione o animal em uma superfície plana e examine todas as aberturas externas incluindo orelhas, cavidade oral e olhos com uma lupa para a presença de nematódeos (redondos)
e trematódeos (planos e não segmentados) (ver Figura 1).
2. Se estiver trabalhando com aves, lave com água da torneira para umedecer as penas antes de dissecar.
3. Usando uma lâmina afiada ou faca e com o auxílio de uma pinça de dissecação, faça uma incisão sobre a cavidade abdominal, tomando cuidado para não romper nenhum órgão. Para
tartarugas com carapaça dura, use uma serra manual para cortar o osso na área da ponte entre os escudos peitorais e abdominais.

4. Abra a cavidade torácica como acima; para animais grandes, cortadores de ossos ou uma pequena serra de mão podem ser necessários para cortar as costelas.
5. Se estiver trabalhando com aves, examine os sacos aéreos in situ antes de remover quaisquer órgãos. Use uma lupa, se necessário.
6. Examine ambas as cavidades para vermes filariais e grandes trematódeos.
7. Antes de remover o trato gastrointestinal da cavidade abdominal, amarre um fio próximo ao início do esôfago e outro no
a extremidade do intestino grosso (reto).
8. Separe os seguintes órgãos torácicos em placas de Petri (ou bandejas de vidro se os órgãos forem muito grandes) para exame sob um microscópio estéreo (10-30X): coração e vasos
sanguíneos principais, traqueia e pulmões.
9. Remova o fígado, vesícula biliar e ducto, pâncreas, baço, rins e bexiga urinária e examine conforme descrito na etapa 1.8.
10. Remova todo o sistema digestivo e coloque cada seção em pratos/bandejas de vidro.
11. Após a remoção dos órgãos, lave a cavidade do corpo com uma mangueira ou frasco de esguicho cheio de solução salina a 0,9% em uma peneira de malha de 106 ÿm e
examinar o conteúdo da peneira sob um microscópio estéreo para a presença de vermes filariais ou trematódeos do sangue.
12. Abra cada seção do trato digestivo com uma tesoura, raspe a mucosa e examine cuidadosamente a presença de parasitas grandes (>1 cm). Use uma lupa, se necessário. A probóscide
dos acantocéfalos geralmente está profundamente embutida na parede do intestino e pode ter que ser cuidadosamente retirada do tecido com fórceps e/ou tesoura pequena.

13. Coloque cada seção aberta em água corrente e lave todo o conteúdo em uma peneira de 106 ÿm conforme descrito na etapa 1.11.
14. Abra o coração e os principais vasos sanguíneos (pulmonar e aorta), traqueia e vesículas urinárias e biliares e examine o conteúdo no mesmo
caminho.

15. Corte e separe órgãos sólidos como pulmões, fígado, rins, baço e pâncreas usando uma lâmina afiada e uma pinça. Lave-os em água corrente em uma peneira de 106 ÿm conforme
descrito na etapa 1.11.
16. Registre os tipos de parasitas encontrados, o número de cada tipo e o(s) órgão(s) em que são encontrados. Os métodos de fixação e coloração são
listado abaixo.
17. Rotule os frascos/frascos colocando um pequeno pedaço de um cartão de índice simples escrito a lápis (tinta e cartões de índice pautados "escorrerão" em álcool e mancharão
espécimes).

2. Preservação de Helmintos

1. Para helmintos que precisam ser preservados para estudos genéticos posteriores, coloque-os diretamente em etanol 80-90% (sem glicerina). O etanol
deve ser feita diluindo-se etanol a 95%, preferencialmente grau reagente (Tabela 1). Nunca permita que essas amostras sejam expostas à formalina, pois a formalina degrada o
DNA para um estado inutilizável.
2. Coloque trematódeos vivos em uma lâmina de microscópio de vidro em uma gota de solução salina, coloque uma lamínula de vidro e passe a lâmina sobre uma chama sem ferver
a salina.
1. Coloque a lâmina em uma placa de Petri contendo AFA (álcool-formalina-ácido acético, consulte a Tabela 1) e deixe a tampa deslizar.
2. Fixe em AFA por um a vários dias, lave com água da torneira e transfira para frascos de vidro de 5 ml (ou frasco/frasco de vidro maior, dependendo do tamanho e quantidade de
parasitas) cheios de etanol a 70% para armazenamento a longo prazo.

3. Fixe os trematódeos mortos em AFA ou formalina tamponada a 10% por 48 horas e, em seguida, transfira para frasco/jarro cheio de etanol a 70% para armazenamento a longo prazo.
4. Relaxe os cestóides vivos em uma placa de Petri derramando água quase fervente sobre eles e depois transfira para o frasco/jarro cheio de etanol a 70% por longo prazo
armazenar.
5. Relaxe os acantocéfalos vivos colocando-os em uma placa de Petri por uma a várias horas em água da torneira na geladeira (~4°C) até que a probóscide esteja
totalmente evertida (isso pode levar até 24 horas). Transfira para o frasco/jarro cheio de etanol 70% ou AFA para armazenamento a longo prazo.
6. Trate os cestódeos e acantocéfalos mortos da mesma forma que os trematódeos mortos (veja acima).
7. Matar nematóides vivos pequenos (<5 mm ou frágeis (por exemplo , tricostrongilídeos, capilares) em etanol 70% quente (próximo da ebulição) e preservar em frasco/jarra
preenchido com etanol 70% com glicerina 5% (Tabela 1) adicionado para preservar os vermes em caso de evaporação.
8. Matar (e limpar) nematóides médios a grandes (> 5 mm) (por exemplo , ascarídeos, espirurídeos, oxiurídeos, filarídeos) colocando em uma placa de Petri com ácido acético glacial frio
(Tabela 1) e após 15 min transferir para frasco/jarra preenchido com 70% de etanol e 5% de glicerina. O ácido acético pode ser usado repetidamente desta maneira.

9. Coloque os nematóides mortos diretamente no frasco/frasco cheio com 70% de etanol e 5% de glicerina.

3. Identificação Taxonômica de Helmintos

1. Prepare a hematoxilina de Harris dissolvendo a hematoxilina em álcool e dissolvendo o sulfato de alumínio e amônio em água com calor. Misture os dois
soluções e deixe ferver.
1. Adicione iodato de sódio e ferva por 2-3 min. Filtre a solução (papel de filtro 541) depois de voltar à temperatura ambiente.

2. Colorir trematódeos, cestóides e acantocéfalos deixando-os em hematoxilina de Harris diluído (1:10) ou carmim de Semichon durante a noite
(ver Tabela 1).
1. Descolorir usando etanol ácido 70% até que os órgãos fiquem visíveis (pode levar entre alguns segundos a mais de uma hora e deve ser
observado).
2. Interrompa a descoloração transferindo as amostras para etanol básico a 70% por pelo menos 30 min. Em seguida, desidratá-los em uma série de graduações
etanol (80%, 95%, 100%) e limpá-los em xileno ou salicilato de metila.

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3. Monte as amostras em uma lâmina de microscópio após adicionar uma gota de bálsamo do Canadá e uma lamínula. Deixe secar durante a noite.

3. Limpar nematódeos e acantocéfalos pequenos a médios por 15-30 min em montagens temporárias de lactofenol em uma lâmina de microscópio com um
lamínula.
1. Use fenol a 80% por até 60 min para grandes nematoides (ascarídeos e espirurídeos) e acantocéfalos. Examinar sob uma luz
microscópio (40-400X) para avaliação de estruturas menores (espículas masculinas e ganchos).

4. Use as seguintes abordagens para o exame de estruturas especiais.

1. Para cestódeos, corte o escólex e coloque em uma lâmina de microscópio em lactofenol e "abóbora" com uma lamínula para medição e contagem de ganchos
rostelares (ver Figura 1B).
2. Para nematóides, corte a extremidade anterior e monte de frente em uma lâmina de microscópio em algumas gotas de lactofenol (sem lamínula) ou em geleia de glicerina
para uma montagem permanente (com lamínula) e observe as peças bucais sob um microscópio de luz (35 -400X) (veja a Figura 1D).
3. Corte as caudas de grandes nematóides e monte em uma lâmina de microscópio em lactofenol com uma lamínula para observar as papilas ventrais
e morfologia espícula de machos sob um microscópio de luz (ver Figura 1D).

5. Identifique parasitas em espécies usando uma combinação de literatura primária e referências taxonômicas padrão, como:
3,4 5-7 e Gibson et al.
1. Trematódeos: Yamaguti (1958, 1971)
8
2. Acantocéfalos: Yamaguti
9 11
3. Cestóides: Yamaguti 4. , Schmidt10 e Khalil et al.
12
Nematóides: Yamaguti 13 e Anderson et al.

4. Depositário de Helmintos na Coleção Nacional de Parasitas dos EUA

1. Deposite espécimes representativos de helmintos na Coleção Nacional de Parasitas dos Estados Unidos (USNPC). Isso é obrigatório para a maioria dos periódicos de parasitas.
Após a submissão, cada espécie de helminto recebe um número de acesso para inclusão nos manuscritos.
2. Incluir as seguintes informações ao enviar os espécimes: 1) Nome científico do parasita; 2) informações do hospedeiro (espécie, longitude/latitude
coordenadas de localização geográfica); 3) órgão encontrado no hospedeiro; 4) nome de quem coletou os espécimes e data da coleta; 5) tipo de fixador, corante ou meio de
limpeza/montagem utilizado; 6) localização de outras coleções (museu e números de acesso) se espécimes adicionais forem apresentados em outro lugar; e 7) informações
sobre publicação e periódico. Esses dados também devem ser enviados junto com as amostras e em capa separada.

3. Embale as amostras em recipientes fortes com material absorvente à prova de choque. Tape/tampas de parafilme em frascos de vidro e coloque cada frasco em
um saco plástico separado. Enrole as lâminas em papel e coloque em uma caixa de lâminas com material absorvente de choque entre elas.
4. Envie os espécimes e uma carta separada com informações sobre os espécimes para: US National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300
Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Resultados representativos

Usando os métodos descritos acima, um levantamento dos helmintos do musaranho mascarado, Sorex cinereus, foi realizado no condado de Missoula, Montana, entre 2007-2011.
Um total de 56 musaranhos foram coletados de armadilhas de queda e examinados dentro de 2 horas após a morte. A prevalência geral de infecção foi de 96%; apenas 2 musaranhos
estavam livres de parasitas. Quinze espécies de helmintos foram identificadas, incluindo 9 espécies de cestóides e 6 espécies de nematóides. Uma espécie do gênero de cestode
Staphylocystoides não foi descrita anteriormente. Os órgãos encontrados infectados incluíram o intestino delgado (9 cestodes, 3 nematoides), estômago (1 nematoide), pulmões (1
nematoide) e bexiga urinária (1 nematoide). As intensidades totais de infecção variaram de 7-234 vermes por hospedeiro infectado. A riqueza de espécies (o número de espécies de
helmintos por hospedeiro infectado) variou de 1-8 com média de 4,1 (Figura 2).

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Figura 1. Desenhos e fotografias representativas de grupos de helmintos mostrando as principais características anatômicas de cada filo: A)
Trematoda; B) Cestoda; C) Acantocéfala; e D) Nematoda. Para as fotografias, informações sobre o nome científico, órgão e hospedeiro são
incluído. Trematódeos e cestóides são hermafroditas. Os desenhos não estão necessariamente na mesma escala.Clique aqui para ver a imagem ampliada.

Figura 2. Resumo dos dados preliminares de helmintos de musaranhos mascarados, Sorex cinereus coletados no condado de Missoula, Montana
entre 2007-2011. Clique aqui para ver a imagem ampliada.

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Discussão

É extremamente difícil identificar helmintos parasitos, mesmo para gênero, com base em material pobre. Cestodes e trematódeos, em particular, tendem a morrer e se
deteriorar rapidamente após a morte do hospedeiro. A taxonomia dos cestóides depende muito do número, tamanho e forma dos ganchos rostelares, que muitas vezes se
perdem no material congelado. O mesmo se aplica a certos trematódeos com espinhos ao redor da ventosa oral, como equinostômios e heterofídeos, que também são
frequentemente perdidos. Por causa de suas cutículas grossas, nematóides e acantocéfalos são um pouco mais resistentes, mas ainda podem ser contraídos ou ter a
probóscide retraída. Portanto, a importância de obter o material mais fresco possível não pode ser subestimada. Idealmente, os hospedeiros ativos devem ser capturados,
sacrificados e examinados imediatamente. Caso contrário, os hospedeiros devem ser examinados dentro de 3-4 horas após a morte ou congelados o mais rápido possível. A
remoção de tratos intestinais imediatamente após a coleta de hospedeiros e o congelamento rápido com nitrogênio líquido rendeu um excelente material. Se mesmo alguns
hospedeiros puderem ser examinados a fresco e os helmintos devidamente identificados, isso pode permitir a classificação de espécies coletadas de material congelado
subsequente. Os helmintos podem se mover dentro de um hospedeiro após a morte, e isso precisa ser levado em consideração ao descrever a localização dos parasitas durante a
necropsia.

O uso de uma peneira para filtrar o conteúdo intestinal e lavar o sangue de outros órgãos é uma melhoria significativa em relação aos métodos anteriores de necropsia.
Aumenta muito as chances de encontrar os helmintos menores e melhora a análise quantitativa. Matar cestóides e trematódeos em água quente produz espécimes que são melhores
para coloração do que aqueles obtidos anteriormente relaxando em água fria da torneira em um refrigerador.

A etapa crítica na coloração de helmintos está no processo de descoloração em etanol ácido e isso está diretamente relacionado ao tipo de parasita e seu tamanho. Se a amostra
não for suficientemente corada, os órgãos podem não ser diferenciados e se for muito corado, os órgãos podem nem ser visíveis. Há uma certa arte nesse processo e a única
maneira de aprendê-la é por tentativa e erro. As amostras precisam ser monitoradas cuidadosamente sob o escopo de dissecação durante a descoloração. Quando vários
espécimes de uma espécie estão disponíveis para serem corados, alguns podem ser removidos do etanol ácido em intervalos para obter uma série graduada e os melhores
espécimes selecionados após o clareamento. Se as amostras parecerem muito coradas, todo o processo pode ser repetido, colocando-as de volta no corante durante a noite.

O futuro da taxonomia de helmintos será fortemente influenciado por estudos de DNA. O banco de dados de DNA para espécies de helmintos está se expandindo
rapidamente e permite que espécimes coletados hoje sejam identificados no futuro. Portanto, é importante preservar (em fixador livre de formalina) um subconjunto de
espécimes em etanol para extração de DNA. Os métodos descritos aqui para coletar e matar helmintos produzirão material adequado para extração de DNA e análises genéticas.

Divulgações

Não temos nada a divulgar

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Joe N. Caudell, Biólogo de Doenças do Programa Indiana USDA APHIS Wildlife Services da Purdue University, por fornecer
espécimes usados para a coleta de helmintos para a produção deste vídeo. Jennifer Serafin preparou todas as soluções químicas.

Referências

1. Atkinson, CT, Thomas, NJ, & Hunter, DB (eds.). Doenças Parasitárias de Aves Silvestres. John Wiley & Sons, Blackwell Press, Hoboken, Novo
Jersey, EUA (2009).
2. Samuel, WM, Pybus, MJ, & Kocan, AA (eds.). Doenças Parasitárias de Mamíferos Selvagens. Segunda edição. Imprensa da Universidade Estadual de Iowa, Ames,
Iowa, EUA (2001).
3. Yamaguti, S. Systema Helminthum. Volume I. Partes 1 e 2. Os trematódeos digenéticos de vertebrados. Interscience Publishers Inc., Novo
York, Nova York, EUA (1958).
4. Yamaguti, S. Sinopse de Trematodes Digenéticos de Vertebrados. Volumes I e II. Keigaku Publishing Company, Tóquio, Japão (1971).
5. Gibson, DI, Jones, A., & Bray, RA Keys to the Trematoda. Volume 1. CAB International Publishing e Museu de História Natural,
Wallingford, Oxfordshire, Reino Unido (2002).
6. Jones, A., Bray, RA, & Gibson, DI Keys to the Trematoda. Volume 2. CAB International Publishing e Museu de História Natural,
Wallingford, Oxfordshire, Reino Unido (2005).
7. Bray, RA, Gibson, DI, & Jones, A. Keys to the Trematoda. Volume 3. CAB International Publishing e Museu de História Natural,
Wallingford, Oxfordshire, Reino Unido (2008).
8. Yamaguti, S. Systema Helminthum. Volume V. Acanthocephala de vertebrados. Interscience Publishers Inc., Nova York, Nova York, EUA
(1963).
9. Yamaguti, S. Systema Helminthum. Volume II. Os Cestodes dos Vertebrados. Interscience Publishers Inc., Nova York, Nova York, EUA (1959).
10. Schmidt. Manual GD CRC de Identificação de Tênias. Chaves para os parasitas Cestode de vertebrados. CRC Press Inc., Boca Raton,
Flórida, EUA (1986).
11. Khalil, LF, Jones, A., & Bray, RA Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. CAB International Publishing e The Natural History
Museu, Wallingford, Oxfordshire, Reino Unido (1994).
12. Yamaguti, S. Systema Helminthum. Volume III. Os nematóides dos vertebrados. Partes 1 e 2. Interscience Publishers Inc., Nova York, Nova
York, EUA (1961).
13. Anderson, RC, Chabaud, AG, & Willmott, S. Chaves para os parasitas nematóides de vertebrados: Volume de arquivo (Nos. 1-10). CAB International Publishing e
The Natural History Museum, Wallingford, Oxfordshire, Reino Unido (2009).

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